CN1982462A - 用于增强编码序列基因表达的分离的d n a分子，包含所述分子的片段、基因变体、表达盒、载体、细胞、植物和种子 - Google Patents
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Abstract
一种用于增强编码序列基因表达的分离的DNA分子，含有所述分子的片段、基因变体、表达盒、载体、细胞、植物和种子，其中所述分子包括用于诱导转基因表达水平提高的内含子，其可用于转化植物细胞的DNA构建体，其中所述细胞或植物含有构建体，所述构建体含有这些内含子之一，所述内含子处于启动子控制下并位于编码序列上游，所述构建体稳定地整合在细胞或植物的基因组中，与非转化细胞或植物相比，或者与缺少本发明的内含子的构建体转化的细胞或植物相比，所述细胞或植物表现出较高的表达水平，其中上述基因的5′－非编码序列的序列还包括DNA构建体中的启动子和外显子序列，其表现出与内含子所产生的作用的协同作用，且其中当缺少所述内含子的COX5c基因的5′－非编码序列被包括在用于植物转化的DNA构建体中时，其促进了花粉中的组织特异性表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及植物基因工程。本发明提供了调节植物中重组基因表达的有用的DNA序列和构建体。更具体地，本发明提供了来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)COX5c-1、COX5c-2和COX5c-3基因的新型调节序列。
背景技术
植物生物技术中的基因工程在新产品的研究和生产领域中取得了惊人的进展。
基因工程研究需要获取各种可用于调节转基因的序列。所述元件的两个实例是：内含子和启动子。
为了植物生物技术的成功，分子生物学必须实现的最大挑战之一是选择控制或者引导一种或多种基因转录水平的启动子。
因此，最近二十年来，人们已致力于寻找能够根据各个转基因的需要保证表达的启动子和其它序列。不同物种的几种启动子已被用于制备转基因植物的研究，包括植物性的、病毒性的、来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti和Ri质粒的以及天然的外显子和内含子，亦即玉米乙醇脱氢酶-1(maizealcohol dehydrogenase-1)基因的第一内含子(Callis等，1987)或水稻肌动蛋白-1(actin-1)基因的第一外显子/内含子(McElroy等，1991)。
基因转录由启动子区(顺式元件)和多个调节蛋白质(反式因子)调节。基因工程项目需要同时使用几个启动子。第一启动子可在兴趣基因的上游使用，而第二启动子可用于表达选择标记。
真核基因通常被非编码序列即内含子间隔。真核基因首先转录为前体-RNA(pre-RNA)，其序列中包含内含子。内含子随后在剪接过程中被除去，终产物即mRNA被翻译为蛋白质。
已表明，内含子涉及植物中基因表达的调节。玉米酶乙醇脱氢酶-1(Adh-1)基因的第一内含子能够增加厌氧生活中的转录(Callis等，1987)。内含子还能促进需氧条件下的转录，只是程度较小。已有人指出，基因表达的增强要归因于由内含子产生的前体-RNA的稳定化。也已有报道指出，当存在玉米乙醇脱氢酶的第一内含子时，CAT基因的表达显著增加(12-20倍)(Mascarenhas等，1990)。还有报道指出，这些效应是在转录水平上产生的。
天然存在的带有其毗邻序列的内含子已用于提高转录，尤其是当内含子位于基因的5′端附近时。还有报道指出，内含子介导的mRNA累积(intron-mediatedmRNA accumulation，IME)的增强取决于内含子起源、侧接所述内含子的外显子区域和细胞类型。IME的分子机制尚未完全揭示(Simpson等，1996；Lorkovic等，2000)。
已有报道指出，内含子可使玉米和其它单子叶植物(参见WO98/5921，还可参见Callis等，1987；McElroy等，1990；Christensen等，1992；Xu等，1994；Jeon等，2000；Morello等，2002)和双子叶植物(Norris等，1993；Gidekel等，1996；Rose和Last，1997；Plesse等，2001；Mun等，2002)中的几个基因的表达增强。影响表达的内含子在非编码区内通常位于翻译起始位点附近，如COX5c基因即是如此。内含子在促进表达水平提高中的确切作用尚不清楚。某些内含子似乎包含转录活性调节元件(Gidekel等，1996)，而其它内含子似乎在转录后起作用(Rose和Last，1997)，这提示存在不同的作用机制。最近指出，很多内含子通过增加转录机制的持续性而起作用(Rose，2004)。除了增加表达量外，某些内含子还介导组织特异性的表达模式(Bolle等，1996；Jeon等，2000)。在某些青况下，如牵牛花肌动蛋白-解聚因子(Mun等，2002)、水稻α-微管蛋白OstubAl(Jeon等，2000)和拟南芥聚泛素(polyubiquitin)UbilyUbi4基因(Plesse等，2001)的表达模式，在脉管组织和/或代谢活跃的分裂细胞中特异地观察到表达。这些表达模式与本文所发现的COX5c基因的表达模式相似，可能表明这些内含子以相似的机制发挥作用或对相似的因子响应。
虽然内含子在翻译中的作用似乎是意料之外的结果，但在动物和植物系统中已发现了类似情况(LeHir等，2003；Rose，2004)。已有报道指出，由内含子导致的翻译效率的增加涉及随后增加核糖体与mRNA的相互作用的、剪接期间外显子-外显子连接处附近的蛋白质的位置的位置(Wiegand等，2003，Nott等，2004)。
细胞色素c氧化酶(COX)是由若干不同亚基组成的多体复合物，亚基中的两个或三个由线粒体基因组编码而其余的亚基在细胞核中编码(Grossman等，1997；Jnsch等，1996)。
通过与酵母和动物类似物的序列比对，在植物中鉴定出三个不同的核编码的亚基，COX5b、COX6a和COX6b(Kadowaki等，1996；Ohtsu等，2001；Curi等，2003)。
第四个亚基，COX5c，是最小的COX植物亚基，且已通过蛋白质纯化研究得以发现(Nakagawa等，1987，1990)。近来，采用双向凝胶电泳联合质谱法的研究表明存在其它植物特异性亚基(Millar等，2004)。
COX5c是大约63个氨基酸的多肽，其序列与酵母COX VIIa和哺乳动物COX VIII相似(Nakagawa等，1990)。已经从甘薯、水稻和向日葵中分离出COX5c cDNA(Nakagawa等，1990；Hamanaka等，1999；Curi等，2002)，来自其它物种的EST也是可获得的。第一个COX5c基因也是从甘薯中分离的(Nakagawa等，1993)，在拟南芥、水稻和百脉根(Lotus corniculatus)的全部或部分测序的基因组中可以探测到相关序列。在水稻和向日葵中的表达研究表明，COX5c基因在整个植株中均有不同水平的表达(Hamanaka等，1999；Curi等，2002)。但是，目前尚没有利用任一植物的COX5c基因实施表达的组织特异性或介导该表达所涉及的基因序列的详细的分析。
通常认为，植物线粒体呼吸链组分的表达必须以某种方式进行协调。目前众所周知的是，大多数线粒体组分在花中表现出表达增强(Huang等，1994；Landschütze等，1995；Felitti等，1997；Heiser等，1997；Zabaleta等，1998)。如原位杂交试验所示，花中的表达主要位于花药中(Smart等，1994；Ribichich等，2001；Elorza等，2004)。在拟南芥中的表达研究表明对于编码细胞色素c和COX5b、6a和6b亚基的细胞核基因而言存在相似反应(Welchen等，2002；Curi等，2003)。特别地，至少在向日葵中，对于编码COX5c亚基(COX5c)的基因已发现不同的作用方式(Curi等，2002)。但是，目前对于来自任意物种的COX5c基因表达所需的顺式作用序列尚未进行功能性研究。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列内含子：COX5c-1基因内含子，如SEQ No 3所示，优选从COX5c-1起始密码子开始的22～698位核苷酸；COX5c-2基因内含子，如SEQ No 7所示，优选从COX5c-2起始密码子开始的12～591位核苷酸；COX5c-3基因内含子，如SEQ No11所示，优选从COX5c-3起始密码子开始的25～1058位核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当置于处于非相关性启动子的控制下的构建体中并位于至少一个编码序列的上游时，所述序列保留在植物细胞中增强基因表达的能力。
本发明的另一目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5c-1启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 1-2-3-4，优选COX5c-1的1～1211位核苷酸；COX5c-2启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No5-6-7-8，优选从COX5c-2非编码区上游起始密码子开始的1～1153位核苷酸；COX5c-3启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 9-10-11-12，优选COX5c-3的1～2205位核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，所述序列保留增强兴趣基因的至少一个编码序列的基因表达的能力。
本发明的另一目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5c-1基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 2-3-4，优选从COX5c-1起始密码子开始的1～741位核苷酸；COX5c-2基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 6-7-8，优选从COX5c-2起始密码子开始的1～640位核苷酸；COX5c-3基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 10-11-12，优选从COX5c-3起始密码子开始的1～1123位核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当置于处于非相关性启动子的控制下的构建体中并位于至少一个兴趣编码序列上游时，所述序列保留在植物细胞中增强基因表达的能力。
本发明的另一目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5c-1启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 1-2-4，优选与COX5c-1起始密码子下游的699～1211位碱基序列连接的COX5c-1起始密码子上游的1～21位碱基；COX5c-2启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 5-6-8，优选与COX5c-2起始密码子的592～1153位碱基的序列连接的COX5c-2起始密码子上游的1～11位碱基；COX5c-3启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 9-10-12，优选与COX5c-3起始密码子上游的1059-2205位碱基序列连接的COX5c-3起始密码子上游的1～24位碱基；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当这些序列中的某些置于兴趣基因的至少一个异源编码序列的上游时，所述序列保留在植物细胞中增强组织特异性基因表达的能力。
因此，本发明的目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列内含子：COX5c-1基因内含子，如SEQ No 3所示，优选从COX5c-1起始密码子开始的22～698位核苷酸；COX5c-2基因内含子，如SEQ No 7所示，优选从COX5c-2起始密码子开始的12-591位核苷酸；COX5c-3基因内含子，如SEQ No11所示，优选从COX5c-3起始密码子开始的25～1058位的核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当置于处于非相关性启动子的控制下的构建体中并位于至少一个编码序列的上游时，所述序列能够保留在植物细胞中增强基因表达的能力，其中所述分子包括：与序列SEQ No 3的22和698位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 7的12～591位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 11的25和1058位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
本发明的再一目的是提供分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5C-1启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 1-2-3-4，优选COX5C-1的1～1211位核苷酸；COX5C-2启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No5-6-7-8，优选从COX5C-2非编码区上游的起始密码子开始的1～1153位核苷酸；COX5C-3启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 9-10-11-12，优选COX5C-3的1～2205位核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，所述序列保留增强兴趣基因的至少一个编码序列的基因表达的能力，其中所述分子包括：与序列SEQ No 1-2-3-4的1和1211位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 5-6-7-8的1和1153位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 9-10-11-12的1和2205位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
本发明的另一目的是提供一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5c-1基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 2-3-4，优选从COX5C-1起始密码子开始的1～741位核苷酸；COX5c-2基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 6-7-8，优选从COX5C-2起始密码子开始的1～640位核苷酸；COX5c-3基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 10-11-12，优选从COX5C-3起始密码子开始的1～1123位核苷酸；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当置于处于非相关性启动子的控制下的构建体中并位于至少一个编码序列的上游时，所述序列保留在植物细胞中增强基因表达的能力，其中所述分子包括：与序列SEQ No 2-3-4的1和741位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 6-7-8的1和640位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 10-11-12的1和1123位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
本发明的另一目的是提供分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：COX5c-1启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 1-2-4，优选与COX5c-1起始密码子下游的699～1211位碱基序列连接的COX5c-1起始密码子上游的1～21位碱基；COX5c-2启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 5-6-8，优选与COX5c-2起始密码子的592-1153位碱基序列连接的COX5c-2起始密码子上游的1-11位碱基；COX5c-3启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 9-10-12，优选与COX5c-3起始密码子上游的1059-2205位碱基序列连接的COX5c-3起始密码子上游的1～24位碱基；或其部分，亦即至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当这些序列中的某些置于兴趣基因的至少一个异源编码序列的上游时，保留在植物细胞中增强组织特异性基因表达的能力，其中所述分子包括：与序列SEQ No 1-2-4的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No 5-6-8的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ No9-10-12的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
本发明的另一目的是提供一种构建体，其自5′～3′包括：a)植物功能性启动子，b)COX5c内含子，c)编码序列，d)3′UTR。
本发明的另一目的是提供一种构建体，其自5′～3′包括：a)COX5c启动子-外显子1-内含子-外显子2，b)编码序列，c)3′UTR。
本发明的另一目的是提供一种构建体，其自5′～3′包括：a)植物功能性启动子，b)COX5c基因外显子1-内含子-外显子2，c)编码序列，d)3′UTR。
本发明的另一目的是提供一种构建体，其自5′～3′包括：a)COX5c启动子-外显子1-外显子2，b)编码序列，c)3′UTR。
本发明的另一目的是提供一种植株及其子代，在其至少一个细胞中含有在植物功能性启动子控制下的上述序列、其活性片段、缺失或基因变体，其中植物是单子叶植物或双子叶植物，且其属于包括水稻、玉米、小麦、苜蓿、大豆、烟草和棉花的组的物种。
本发明的再一目的是提供一种在严谨条件下能够与至少一个上述序列杂交的DNA分子。
结合附图及说明书描述将会对本发明的上述和其它目的、特征以及优点作出更好的理解。
附图说明
通过下列附图中的实施例对本发明进行说明，其中：
图1显示在5′-非编码区中含有内含子的COX5c基因图谱(A，上栏)和(B，下栏)。
(A)获自数据库的六个已测序的COX5c基因的图谱：三个来自拟南芥的基因(AtCOX5c)和各一个来自甘薯(Ipomoea batatas、)的基因(IbCOX5c)、来自水稻(Oryza sativa)的基因(OsCOX5c)和来自百脉根的基因(LcCOX5c)。所有基因均包含位于5′-非编码区中的单一内含子(白色框)。由于其长度(2.4kbp)的原因，所述的OsCOX5c内含子未按比例在图上标出。外显子的非编码区和编码区分别用浅灰色和深灰色进行标示。
(B)用于分析表达所需的COX5c区域的不同构建体图谱。将COX5c-1和COX5c-2基因的不同区域，包括5′非编码区(黑色框)，位于起始密码子上游的外显子1和2的非编码区(浅灰色框)，和前导内含子(白色框)，融合到gus编码区，并引入植物中。通过相似的方式，将COX5c-2非翻译前导序列从两个方向融合至COX5b-1启动子(条纹框)。
图2显示以携带有与gus融合的COX5c-2基因的不同部分的构建体转化的拟南芥植株中GUS活性的组织化学定位。分析了用包含非转录上游区加上完全转录的5′-非编码区(A-J)、仅外显子1序列(K-O)，或无内含子的5′-非编码区(P-T)转化的植物。显示了2-(A)、3-(B、K、P)、15-(D、F)和20-(C、E)日龄植物。还显示了来自成年植株的叶子(G、L、Q、R)、花(H、I、M、N、S)、花药(T)和果实(J、O)。
图3显示去除COX5c内含子引起报告基因表达显著降低的柱形图。采用荧光底物MUG和由20日龄植株的花结制备的蛋白质提取物检测来自植物的提取物的GUS特异性活性，所述植物用构建体pBI5c2(5c2+I)或用分别除去内含子和部分外显子2(5c2-I/E2)或仅除去内含子(5c2-I)的构建体进行转化。在来自非转化植株(wt)或来自携带无启动子的gus基因(pBI101)或处于CaMV35S启动子控制下的gus基因(pBI121)的植株的提取物中也检测了GUS活性。误差柱代表采用来自各构建体的一个代表株系的三次独立测量的标准差。采用不同的独立株系可获得相似结果。嵌入图显示与表现低GUS活性值的植株对应的柱的放大图。
图4显示用与COX5c-2前导内含子融合的COX5b-1启动子转化的拟南芥植株中GUS活性的组织化学定位。(A，B)用609bp COX5b-1启动子片段转化的3日和15日龄植物。(C-F)采用以正义(D，E)或反义(C，F)方向与COX5c-2前导启动子融合的相同启动子片段转化的类似植株。(G-L)来自仅携带启动子(G，J)或带有正义(H，K)或反义(I，L)方向的内含子的成年植株的叶子。(M-P)来自采用没有(M，N)或具有COX5c-2内含子(O，P)的COX5b-1启动子片段转化的植物的花和果实。
图5显示COX5c-2前导内含子增加来自不相关COX5b-1启动子的表达。采用荧光底物MUG检测来自植物的提取物的特异性GUS活性，所述植物用与gus(5b)融合的609bp COX5b-1启动子片段进行转化或用其中以正义(5b+Is)或反义(5b+Ias)方向在启动子和gus编码区之间插入COX5c-2前导内含子的相似构建体进行转化。在来自非转化植物(wt)或来自携带无启动子的gus基因(pBI101)或处于CaMV 35S启动子控制下的gus基因(pBI121)的植物的提取物中也检测了GUS活性。误差柱代表采用来自各构建体的一个代表株系的三次独立测量的标准差。采用不同的独立株系可获得相似结果。
图6显示采用来自植物的总RNA的gus稳态转录水平的northern印迹分析，所述植物用含有与gus融合的COX5c-2基因的不同部分的构建体转化。从下列植物中获得总RNA(20μg)，所述植物用含有COX5c-2非转录上游区和完全转录的5′-非编码区(泳道1)、仅外显子1序列(泳道2)或无内含子的5′-非编码区(泳道3)的片段进行转化。泳道4、5和6含有来自下列植物的RNA，所述植物用609bp COX5b-1启动子片段或用分别以正义或反义方向与COX5c-2前导内含子融合的相同片段进行转化。还分析了用无启动子gus基因转化的植物(泳道7)、非转化植物(泳道8)和用处于CaMV 35S启动子控制下的gus基因转化的植物(泳道9)。
图7显示本发明中分离的DNA序列：
SEQ No 1：COX5c-1启动子；
SEQ No 2：COX5c-1外显子1；
SEQ No 3：COX5c-1内含子；
SEQ No 4：COX5c-1外显子2
图8显示本发明中分离的DNA序列：
SEQ No 5：COX5c-2启动子；
SEQ No 6：COX5c-2外显子1；
SEQ No 7：COX5c-2内含子；
SEQ No 8：COX5c-2外显子2
图9显示本发明中分离的DNA序列：
SEQ No 9： COX5c-3启动子；
SEQ No 10：COX5c-3外显子2；
SEQ No 11：COX5c-3内含子；
SEQ No 12：COX5c-3外显子2
具体实施方式
以下详细描述本发明，涉及从拟南芥中分离的DNA分子(可用于构建在植物，其子代、种子、细胞中的表达盒和载体)，其中由本发明人提供的一些序列增强在完整植物中的基因表达(内含子、外显子、启动子)，而另外一些则在花粉中以组织特异性的方式产生所述效应。
所述分离的DNA分子可包括分别对应于COX5c-1、-2和-3内含子的SEQNo 3、SEQ No 7或SEQ No 11，或保留在植物细胞中增强基因表达能力的其片段、基因变体或缺失。
所述分离的DNA分子可包括分别对应于COX5c-1、-2和-3基因启动子-外显子1-内含子-外显子2的SEQ No 1-2-3-4、SEQ No 5-6-7-8或SEQ No9-10-11-12，或保留在植物细胞中增强基因表达能力的其片段、基因变体或缺失。
所述分离的DNA分子可包括分别对应于COX5c-1、-2和-3基因外显子1-内含子-外显子2的SEQ No 2-3-4、SEQ No 6-7-8或SEQ No 10-11-12，或保留在植物细胞中增强基因表达能力的其片段、基因变体或缺失。
本发明公开了位于上述三个驱动花粉中的组织特异性表达的拟南芥COX5c基因起始密码子上游的序列，以及位于全部COX5c基因5′-非编码区中的内含子，同样地，其与在组织中观察到的高水平基因表达直接相关。
所述分离的DNA分子可包括分别对应于COX5c-1、-2和-3基因启动子-外显子1-外显子2的SEQ No 1-2-4、SEQ No 5-6-8或SEQ No 9-10-12，或保留在植物细胞中增强基因表达能力的其片段、基因变体或缺失。
在整个发育过程中均观察到表达，尤其是在脉管和分生组织中，以及在花粉粒和果实中。COX5c表达的组织特异性模式可能是对细胞特异性因子或对经历稳定细胞增殖的这些组织的代谢状态的反应的结果。
令人注目的是，除去前导内含子显著降低两种基因的表达水平，使得除在花粉粒中之外报告基因活性几乎无法检测。
拟南芥Heyhn.哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana heyhn.EcotypeColumbia)(Col-0)购自Lehle Seeds(Tucson，AZ)。将植物植于以大约为200μEm-2s-1的强度在长日照光周期(通过冷白灯和GroLux荧光灯相混合进行16小时照明)下22～24℃的生长室的土壤中。在含有0.5×Murashige和Skoog培养基和0.8％的琼脂的培养皿中培养用于不同处理的植物。所述培养皿于4℃下保存2日，然后转移至生长室条件并在完全黑暗中放置7日。
基因组克隆的分离实施如下：编码COX5c-1和COX5c-2的拟南芥EST克隆(克隆245H10T7，登录号.N97140和克隆248L23T7，登录号.AA713295)获自ABRC。为了分离基因组克隆，使用这些cDNAs混合物从拟南芥基因组文库中筛选1×105pfu(Voytas等，1990)。过夜杂交后，将噬菌体DNA转移至Hybond-N，洗涤滤膜然后曝光于X射线胶片。通过连续次数的平板接种和杂交纯化阳性克隆。从纯化的克隆中分离的噬菌体DNA通过限制性分析和杂交进行定性分析。将包含完整转录的区域和上游序列的来自COX5c-1的1.8kbp EcoRI片段和来自COX5c-2的3.2kbp EcoRI/NheI片段分别亚克隆至用EcoRI或用EcoRI和XbaI酶切消化的pBluescript SK-中。通过部分测序检验阳性克隆，并命名为VCAT1和VCAT2。
为了分析转基因植物，按照Carpenter和Simon(1998)所述分离总RNA。为了northern印迹分析，将特定量的RNA通过1.5％(w/v)琼脂糖/6％甲醛凝胶进行电泳。RNA的完整性和上样RNA的等同性通过溴化乙啶染色进行验证。将RNA转移至Hybond-N尼龙膜(Amersham公司)，并在含有6×SSC、0.1％(w/v)聚乙烯基吡咯酮、0.1％(w/v)BSA、0.1％(w/v)Ficoll、0.2％(w/v)SDS和10％(w/v)聚乙二醇8000的缓冲液中，与包括从pBI101.3载体分离的完整GUS编码区的32P标记的cDNA探针于68℃下杂交过夜。滤膜采用2×SSC加0.1％(w/v)SDS于68℃下洗涤(4次，每次15分钟)，0.1×SSC加0.1％(w/v)SDS于37℃下洗涤15分钟，干燥，然后曝光于Kodak BioMax MS胶片。为了检查上样于各泳道中的总RNA量，然后将滤膜用来自蚕豆(Vicia faba)的25SrRNA在上述相似条件下(不同之处在于，杂交在62℃下进行，并且省略了用0.1×SSC洗涤)再次进行探测。
报告基因构建和植物转化实施如下：采用寡核苷酸COXC32：5′-GGC
AGATCTCTCTTCTTTCTTCTTCTC-3′(BglII位点用下划线标出)和通用引物-40，从VCAT1克隆中扩增1.3kbp的BglII/SalI片段，所述片段包括来自COX5c-1的ATG起始密码子的上游序列(即外显子1、内含子和部分外显子2，加上非转录的上游序列)，并将所述片段在用BamHI和SalI酶切消化的质粒pBI101.3中克隆。通过采用引物COXC41：
5′-GCG
TCTAGATTCTTCTCAACCTAGCAC-3′(XbaI位点用下划线标出)和-40从VCAT2中扩增2.2kbp的片段并在用XbaI和HindIII酶切消化的质粒pBI101.3中克隆制备类似的COX5c-2构建体。含有外显子1和上游序列的构建体通过相似方法制得，即采用COXC33：
5′-GGC
GGATCCCAAGTCGGAGTGTGGAGG-3′(COX5c-1)或COXC42：
5′-GGC
GGATCCCGAGTCAGATTGTGTAGA-3′(COX5c-2)进行扩增，然后分别在质粒pBI101.3的SalI/BamHI和HindIII/BamHI位点克隆。通过采用引物COXC45：5′-GCG
TCTAGATTCTTCTCAACCGAGTCAGATTGTGTAGA-3′和-40进行扩增，然后在质粒pBI101.3的XbaI和HindIII位点克隆制得含有无内含子的完整COX5c-25′-非编码区的构建体。为了检测内含子对外源性启动子的作用，采用引物COXC44：5′-GGC
TCTAGAGTTTTCGTCGTGAGCTTC-3′和COXC41扩增COX5c-2内含子和转录的5′-非编码序列，然后以双方向克隆至含有与gus融合的来自COX5b-1基因的609 bp启动子片段的构建体的XbaI位点(Welchen等，2004)。以这种方式，将内含子置于COX5b-1启动子和gus编码区之间。将不同的构建体导入根癌农杆菌GV2260中，然后通过浸花法(floral dipprocedure)(Clough和Bent，1998)采用转化的细菌制备转基因拟南芥植株。根据卡那霉素抗性以及针对基因组DNA实施的采用特异于COX5c-1或-2的引物和gus-特异性引物5′-TTGGGGTTTCTACAGGAC-3′的阳性PCR选择转化的植株。另外繁殖5～10个独立株系(视构建体的情况而定)并将纯合T3和T4植株用于分析gus表达。以相似方法制备采用pBI101.3或pBI121转化的植株，并分别用作表达的阴性或阳性对照。
按照Hull和Devic(1995)所述，采用显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)通过组织化学染色法分析转基因植物的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性。将完整植株或离体组织浸入pH7.0的100mM磷酸钠溶液中的1Mm的X-gluc溶液和0.1％的Triton X-100中的，且在施加真空5分钟后，将其置于37℃培养，直至观察到满意的染色。将组织浸入70％乙醇中清洗。
基本上按照Jefferson等(1987)所述，采用荧光发生底物4-甲基伞形基β-D-葡糖醛酸(4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide，MUG)所述检测蛋白质提取物中的特异性GUS活性。总蛋白质提取物制备如下：在含有0.1％(w/v)SDS和1％Triton X-100的提取缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.0，10mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇)中研磨组织，随后以13000g离心10分钟。在含有1mM MUG和20％甲醇的提取缓冲液中检测上清中的GUS活性。用0.2M Na2CO3终止反应，并通过将相对荧光单位与已知浓度的标准物的相对荧光单位相关联来计算4-甲基伞形酮的量。按照Kruger(1996)所述测定提取物的蛋白质浓度。
对位于翻译起始位点上游的区域与编码线粒体细胞色素c氧化酶的5c亚基的两个拟南芥核COX5c基因的表达的相关性进行了分析。分析发现，包含前导内含子的这些区域主要在根和芽分生组织、活跃生长的组织和脉管线中介导gus报告基因的组织特异性表达。重要的是注意到，基于COX5c基因的序列和起源的相似性，预计针对COX5c-1和COX5c-2所获结果应与针对COX5c-3或其任一片段所获结果一致。
在花，尤其是在花药、柱头和花托中，以及在发育的种子中也可观测到表达。
在来自转化植物的蛋白质提取物中，GUS活性检测表明表达水平高于采用组成型CaMV 35S启动子所观察到的水平。
除去前导内含子导致表达显著降低至仅微弱高于采用无启动子gus基因观察到的值。
用无内含子构建体转化的植物的组织化学染色显示，表达仅在花粉中，这提示能够介导花粉特异性表达的调节元件存在于内含子的上游。
COX5c-2内含子在以正确的方向与非相关COX5b-1基因的启动子融合时，也提高GUS表达水平。值得注意的是，本发明包括与多种启动子融合的一种COX5c内含子，如引入作为参考的是专利第PCT/US 03/13770号的Hahb-4启动子序列。由植物中异源基因的表达所获得的效应依赖于其表达的动力学和表达所达到的最终水平。因此，本发明的序列可用于转化植物。尤其是本发明序列增强的与增进由Hahb-4诱导的对盐度和干旱的耐受性的转化相关的Hahb-4的表达，引起更高的转化植物的存活水平，以及植物抵抗环境压力的更快速的反应。
将GUS活性值和转录水平进行比较，提示出内含子还提高了相应mRNA的翻译效率。所得结果表明在所有已知COX5c基因的5′非编码区中存在的内含子在介导这些基因在植物中表达中的重要作用。
参考下述实施例可以更好地理解本发明，下述实施例并不限制或限定保护范围。相反地，必须清楚地理解，在阅读本说明书后，在不背离本发明的实质和/或所附权利要求的范围的情况下，本领域技术人员可建议与本发明的要素等价的多种其它实施方式、修饰和改变。
实施例
实施例1：拟南芥基因组中COX5c相关序列
采用向日葵COX5c蛋白质序列和TBLASTN程序在拟南芥基因组中搜索COX5c编码区(Curi等，2002)，显示出存在可推导出具有COX5c相关序列的蛋白质的四个基因组区域。对于其中三个(At2g47380、At3g62400和At5g61310)，mRNA序列也记录在数据库中，表明其被表达。第四个区域，位于5号染色体，编码尚未检测到转录本的具有更远缘相关性的蛋白质，这提示其可能是一个假基因。因此，存在于2号、3号和5号染色体的基因，已分别强制命名为COX5c-1、COX5c-2和COX5c-3。通过比较相应的基因组和cDNA序列，可以得出：三个拟南芥COX5c基因含有与ATG起始密码子距离不同的、位于5′非编码区内的单个内含子(图1A)。相同位置的内含子也存在于其它序列已知的COX5c基因、来自水稻(Oryza sativa；BAC克隆登录号AB027123)、甘薯(Ipomoea batatas；Nakagawa等，1993)和百脉根(BAC克隆登录号AP006137)的单基因。
实施例2：COX5c-1和COX5c-2翻译起始位点的上游序列促进特异性细胞
类型中报道基因的高水平表达
通过直接从文库筛选，分离含有COX5c-1和-2基因和其它基因组区域的两个拟南芥克隆，筛选中使用由这些基因得出的EST混合物。这些λ克隆的亚克隆用于扩增导入载体pBI101.3中gus编码区之前、含有位于翻译起始位点上游的序列的片段(图1B)。通过农杆菌介导的转化，将这些构建体(对于COX5c-1和-2分别为pBI5c1和pBI5c2)通过土壤杆菌介导的转化导入拟南芥中。通过组织化学实施卡那霉素抗性株系的初始筛选，以定义其中大多数共有的表达特性。然后详细分析携带各构建体的来自至少5个独立的代表性转基因株系的植株。对所有携带pBI5c1或pBI5c2的被分析的植株的结果基本上相同。
在培养皿的MS培养基上生长的幼苗沿根和下胚轴显示了强染色，而子叶中的活性仅在萌发后超过三日的植株中检测到(图2A，B)。根中的活性在生长期间进行性地定位至脉管柱和根分生组织(图2B)。15日后，在发育的次生根中也可检测到强表达(图2C)。在下胚轴中，活性在发育期间也进行性地定位至脉管组织(图2D)。子叶在叶片和尤其是脉管组织中显示GUS活性(图2D，E)。类似的表达模式明显见于发育的叶中(图2D，E)。强活性还可见于芽顶端分生组织中(图2F)。
生长于土壤上的成年植株(45日龄)在根、叶和花中显示出活性。在根中的表达与对于较幼植株所描述的情况是相似的。在叶中，脉管组织和叶肉组织被染色(图2G)，其中叶肉组织染色程度较轻。在花中，在花药，特别在生殖组织和刚刚形成的花粉粒中可检测到强表达(图2H，I)。在柱头、花托、和花瓣和萼片，以及在果实和发育的种子中也检测到活性(图2I，J)。
为了估计由两种构建体产生的相对表达水平，针对来自转化的20日龄植株的蛋白质提取物实施GUS活性的荧光检测。用pBI5c1和pBI5c2转化的植株分别显示35000pmol min-1mg-1和66000pmol min-1mg-1的活性。这些数值甚至高于用pBI121(即gus基因处于强组成型CaMV 35s启动子的控制下)转化的植物中观察到的值，18000pmol min-1mg-1，表明构建体中含有的序列介导高水平表达。使用来自不同器官的提取物的活性检测表明，在叶中的表达最高，其次是花、果实和根(未显示)。
实施例3：除去前导内含子启动植物花粉特异性表达
在前导区中存在保守的内含子引发了对其在COX5c基因表达中的作用的研究。当通过组织化学染色法分析时，用构建体(其中来自COX5c-1或COX5c-2的各前导启动子和下游序列已被除去)转化的植株的幼苗(图1B中5c1-I/E2和5c2-I/E2)未显示GUS活性(图2K)。对成年植株的分析显示仅在花粉粒中存在GUS活性(图2M，N)，而在叶、果实或花器官(花药除外)中未染色(图2L-O)。研究的两个基因均观察到相似的结果，表明前导内含子对介导在整个植株中高水平表达是至关重要的。实际上，由于为了达到相似的染色需要更长的培养时间，花粉中的活性在这些植株中也减少了：用无内含子构建体转化的植株为18小时，而对于用完整片段转化的植株为3～5小时。用无内含子构建体转化的植株，其蛋白质提取物中GUS活性水平极低：对于COX5c-1和COX5c-2，分别为800和1400 pmol min-1mg-1，比当存在内含子时所观察到的值低40-50倍。
Zabaleta等(1998)已经研究了参与编码NADH脱氢酶(复合物I)的组分的三个基因在花粉/花药中的表达的启动子区。在这些区域中，他们已经鉴别了与在花粉中表达的其它基因中发现的元件相似的保守的富含GT的元件。他们假定这些模体与上述三个基因的协同表达有关。对两个COX5c基因的启动子区的分析显示存在富含GT的组分(COX5c-1和-2的TGTGGTT和TGTGTTG)，分别位于自假定转录起始位点开始的-208和-210位上。这些成分的第一个与在复合物I基因之一以及在番茄LAT52和LAT56基因中观察到那些完全相同，尤其是在花粉中表达的(Twell等，1991)。两个基因还具有两个位点II元件(TGGGC/T)的封闭拷贝，其分别位于-109/-90和-84/-71，已知其存在于优选周期细胞中表达的基因(Kosugi等，19954；Trémousaygue等，2003)。这些序列的功能重要性必须通过诱变实验进行评价。
实施例4：非翻译外显子序列影响gus表达
GUS活性与各转录本水平的对比表明COX5c 5′-非编码序列也可提高翻译效率。可使用含有COX5c前导内含子的构建体观察到，但不采用仅携带非编码外显子序列的构建体观察不到，因为后者产生低表达水平。应该强调的是，影响翻译效率的起始密码子，在所有分析的构建体中均是相同的，因为它们采用了由位于在克隆位点下游几个核苷酸的、pBI101.3载体提供的ATG。由此，内含子本身或5′-非编码区域中翻译增强子的存在导致翻译效率的差异。至今为止，在COX5c非翻译区内与其它已知翻译增强子(Yamamoto等，1995；Dickey等，1998)的相似性尚未观察到。
还分析了5′非翻译外显子区对表达的影响。为此目的，用构建体转化植株，所述构建体中除去了COX5c-2前导内含子，但保留了启动子和来自外显子1和2的5′-非编码序列(图1B中5c2-I)。与携带含有内含子的构建体的植株相比，这些植株显示出显著降低的GUS活性水平(图3)。然而，它们始终显示出比仅含有与gus融合的启动子和外显子1的植株略高的活性(图3，嵌入图)。通过组织化学染色也观察到由包含外显子2非编码序列产生的不同表达。实际上，虽然活性很低，但在子叶脉管和顶端还有叶脉、毛状体和排水孔中均检测到活性(图2P-R)。当采用除去了内含子和外显子2的构建体时，在生殖组织中，表达仅见于花粉中(图2S，T)。这些结果，一方面，证实了前导内含子在决定高水平表达中的重要性，另一方面，表明非编码外显子序列也影响基因表达，虽然影响轻微。
实施例5：COX5c-2前导内含子和邻接区段提高非相关启动子的表达
对包含处于非相关基因的启动子和gus编码区之间的COX5c-2内含子的作用也进行了检测。为此目的，以正义或反义方向，将包含来自COX5c-2的完整内含子和邻近非翻译转录序列的区域插入到拟南芥基因COX5b-1和gus编码区之间(图1B中，分别为5b+Is和5b+Ias)。所使用的COX5b-1启动子部分(各转录起始位点的-1至-609)在分生组织、根和子叶脉管组织、叶中央脉管和花药中介导相对低的表达(Welchen等，2004)。当包含正确取向的COX5c-2内含子时引起整个植株中显著更高的表达水平，其模式与采用COX5c-1和COX5c-2启动子加内含子片段时所观察到的相似(图4)。结果，当对仅包含无内含子的COX5b-1启动子片段的植株观察时(图4A，B，G，J，M，N)，GUS活性从脉管组织和花药扩展至子叶和叶的叶片(图4D，E，H，K)以及花瓣和果实(图4O，P)。在转化植物的蛋白质提取物中的GUS活性检测显示，内含子将经由COX5b-1启动子的表达水平提高了6倍。
当把内含子以相反方向置于相同位置时，通过组织化学(图4C，F，I，L)或荧光法(图5)，在任何组织或发育阶段中均未能检测到GUS活性。假设当内含子以相反方向存在时内含子剪接未发生是合乎逻辑的。在转录本的5′区存在大的非编码序列可能影响其稳定性或其翻译效率。当以相反方向放置内含子时会导入6个伪ATG密码子，因此可能影响翻译机制对正确密码子的识别。此外，众所周知的是，含有与起始密码子同相的未成熟终止密码子的转录本会被称为无义介导的mRNA衰变的过程降解(Baker和Parker，2004)。
实施例6：COX5c前导内含子和邻接区段提高翻译效率
当分析由来自COX5c-1和COX5c-2的各片段控制的gus基因的转录水平时，同样观察到存在内含子时促进表达提高。图6说明采用gus探针和来自携带COX5c-2基因的不同部分的植株的总RNA的northern杂交，。虽然使用来自于携带无内含子的构建体的植株的总RNA的northern印迹中没有得到或仅得到极其微弱的信号(图6，泳道2，3)，但在来自于具有含有COX5c-2内含子的构建体的植株的样品中可见明显的条带(图6，泳道1)。但是，这些植株中的转录水平显著低于在用质粒pBI121的T-DNA区转化的植株中观察到的转录水平，所述质粒含有在CaMV 35S启动子控制下的gus基因(图6，泳道9)。与采用rRNA探针得到的信号进行比较，各个条带的密度分析表明用CaMV 35S启动子融合体转化的植株中gus转录水平高7倍。由于采用完整COX5c片段转化的植株的GUS活性比后者高3.5倍(如前)，这提示含有COX5c 5′-非编码序列的转录本被更有效率地进行翻译，使蛋白质/转录物比提高25倍。虽然蛋白质水平没有直接定量，但可以认为酶活性检测构成一种适宜的估测，因为所有构建体必须产生具有相同氨基酸序列的蛋白质。在分析采用含有或不含有COX5c-2内含子的COX5b-1基因启动子转化的植株的转录水平时同样可观察到内含子对翻译的作用(图6，泳道4、6)。在这种情况下，与在采用正确取向的内含子所转化的植株中观察到的GUS活性提高了6倍的情况相比，由内含子的存在而促进的转录水平的提高是非常低的。另一方面，在含有反义方向内含子的植株中无法检测到gus转录水平(图6，泳道5)。虽然这可能是由于较低的转录效率，但更为可能的解释是未剪接的RNA被迅速地降解。
已说明和描述本发明的优选实施方式，对本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离如所附权利要求中限定的本发明范围的情况下，可以在其中作出多种改变和修饰。
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<120>用于增强编码序列基因表达的分离的DNA分子，包含所述分子的片段、基因变体、表达盒、载体、细胞、植物和种子
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<210>1
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<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
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TGTGAGCAGGAGAGTGGCAAAGAG
Claims (72)
1、一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列内含子：
-COX5c-1基因内含子，SEQ No3；
-COX5c-2基因内含子，SEQ No7；
-COX5c-3基因内含子，SEQ No11，
或其部分。
2、权利要求1的分子，其中
内含子序列SEQ No3是从COX5c-1起始密码子开始的22～698位核苷酸；
内含子序列SEQ No7是从COX5c-2起始密码子开始的12～591位核苷酸；
内含子序列SEQ No11是从COX5c-3起始密码子开始的25～1058位核苷酸；
且其中所述部分包含至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当置于构建体中处于非相关性启动子的控制下并位于至少一个编码序列上游时，所述序列保留在植物细胞中增强基因表达的能力。
3、权利要求2的DNA分子的片段、基因变体或缺失，其中所述分子包括：与序列SEQ ID No3的22和698位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No7的12和591位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQID No11的25和1058位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
4、用于促进至少一个编码序列高表达水平的表达盒，其中所述表达盒包含至少一个与编码序列和基因表达调节元件相连的权利要求1的内含子。
5、包括权利要求4的表达盒的植物表达载体。
6、权利要求5的植物表达载体，其中所述表达盒在整个植株中产生作用。
7、包括权利要求5的载体的细胞和该细胞的任何子代。
8、权利要求7的细胞，其中所述细胞是细菌。
9、权利要求7的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
10、权利要求9的细胞，在权利要求4的表达盒所含有的启动子控制下表达编码序列。
11、权利要求9的细胞，其包括稳定地整合在其基因组中的权利要求4的表达盒。
12、权利要求9的细胞，其包括稳定地整合在其基因组中的权利要求5的载体。
13、一种转基因植物以及其任何种子和子代，其中所述植物由权利要求11的植物细胞再生。
14、权利要求13的转基因植物，在权利要求4的表达盒的控制下，在其至少一个细胞中表达编码序列。
15、权利要求13的植物，其中所述植物是单子叶植物。
16、权利要求13的植物，其中所述植物是双子叶植物。
17、一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：
-COX5c-1启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 1-2-3-4；
-COX5c-2启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 5-6-7-8；
-COX5c-3启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 9-10-11-12，
或其部分。
18、权利要求17的DNA分子，其中：
所述COX5c-1启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 1-2-3-4是COX5c-1的1～1211位核苷酸；
所述COX5c-2启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 5-6-7-8是从COX5c-2非编码区上游的起始密码子开始的1～1153位核苷酸；以及
所述COX5c-3启动子-外显子1-内含子-外显子2，SEQ No9-10-11-12是COX5c-3的1～2205位核苷酸，
且其中所述部分包括至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，所述序列保留增强兴趣基因的至少一个编码序列的基因表达的能力。
19、权利要求18的DNA分子的片段、基因变体或缺失，其中所述分子包括：与序列SEQ ID No 1-2-3-4的1和1211位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 5-6-7-8的1和1153位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 9-10-11-12的1和2205位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
20、一种表达盒，其包含与编码序列相连的权利要求17的DNA分子。
21、包含权利要求20的表达盒的植物表达载体。
22、权利要求21的植物表达载体，其中所述表达盒在整个植株中产生作用。
23、用权利要求21的载体转化的细胞和其任何子代。
24、权利要求23的细胞，其中所述细胞是细菌。
25、权利要求23的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
26、权利要求25的植物细胞，在权利要求20的表达盒包括的启动子控制下表达编码序列。
27、权利要求25的细胞，其中所述细胞具有稳定地整合在其基因组中的权利要求20的表达盒。
28、一种转基因植物以及其任何种子和子代，其中所述植物由权利要求27的植物细胞再生。
29、权利要求28的转基因植物，在权利要求20的表达盒控制下，在其至少一个细胞中表达编码序列。
30、权利要求29的植物，其中所述植物是单子叶植物。
31、权利要求29的植物，其中所述植物是双子叶植物。
32、一种分离的DNA分子，其包含权利要求1的内含子，所述内含子位于至少一个下列序列中：
-COX5c-1基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 2-3-4；
-COX5c-2基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 6-7-8；
-COX5c-3基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 10-11-12，
或其部分。
33、权利要求32的分离的DNA分子，其中：
所述COX5c-1基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 2-3-4是从Cox5C-1的起始密码子开始的1-741位核苷酸；
所述COX5c-2基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 6-7-8是从Cox5C-2的起始密码子开始的1-640位核苷酸；
所述COX5c-3基因外显子1-内含子-外显子2，SEQ No 10-11-12是从Cox5C-3的起始密码子开始的1-1123位核苷酸，
其中所述部分包含至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，所述片段、基因变体或缺失当被置于构建体中处于非相关性启动子的控制下并位于至少一个兴趣编码序列上游时，保留增强基因在植物细胞中表达的能力。
34、权利要求33的DNA分子的片段、基因变体或缺失，其中所述分子包括：与序列SEQ ID No 2-3-4的1和741位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 6-7-8的1和640位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 10-11-12的1和1123位核苷酸之间的序列的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
35、一种用于增强兴趣基因的至少一个编码序列表达水平的表达盒，其中所述表达盒包括至少一个与编码序列和基因表达非相关性调节元件相连的权利要求32的外显子1-内含子-外显子2序列。
36、一种包括权利要求35的表达盒的植物表达载体。
37、权利要求36的植物表达载体，其中所述表达盒在整个植株中产生作用。
38、一种用权利要求35的表达盒转化的细胞，和其任何子代。
39、权利要求38的细胞，其中所述细胞是细菌。
40、权利要求38的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
41、权利要求40的植物细胞，在权利要求35的表达盒包括的非相关性启动子控制下表达编码序列。
42、权利要求38的细胞，其包括稳定地整合在所述细胞的基因组中的权利要求35的表达盒。
43、权利要求38的细胞，其包括稳定地整合至所述细胞的基因组中的权利要求36的载体。
44、一种转基因植物及其任何种子和子代，其中所述植物由权利要求40的植物细胞再生。
45、权利要求44的转基因植物，在权利要求35的表达盒控制下，在其至少一个细胞中表达编码序列。
46、权利要求45的植物，其中所述植物是单子叶植物。
47、权利要求45的植物，其中所述植物是双子叶植物。
48、一种分离的DNA分子，其包含至少一个下列序列：
-COX5c-1启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 1-2-4；
-COX5c-2启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 5-6-8；和
-COX5c-3启动子-外显子1-外显子2，SEQ No 9-10-12；
或其部分。
49、权利要求48的分子，其中：
所述COX5c-1启动子-外显子1-外显子2序列，SEQ No 1-2-4，是与COX5c-1起始密码子下游的699～1211位碱基序列相连的COX5c-1起始密码子上游的1～21位碱基；
所述COX5c-2启动子-外显子1-外显子2序列，SEQ No 5-6-8，是与COX5c-2起始密码子的592-1153位碱基序列相连的COX5c-2起始密码子上游的1～11位碱基；
所述COX5c-3启动子-外显子1-外显子2序列，SEQ No 9-10-12，是与COX5c-3起始密码子上游的1059-2205位碱基序列相连的COX5c-3起始密码子上游的1～24位碱基；
且其中所述部分包含至少一个所述序列的片段、基因变体或缺失，当这些序列中的某些序列置于兴趣基因的至少一个异源编码序列的上游时，保留在植物细胞中增强组织特异性基因表达的能力。
50、权利要求49的DNA分子的片段、基因变体或缺失，其中所述分子包括：与序列SEQ ID No 1-24的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 5-6-8的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基；与序列SEQ ID No 9-10-12的100个连续碱基具有80％同源性的至少100个连续碱基。
51、一种用于增强兴趣基因的至少一个编码序列表达水平的表达盒，其中所述表达盒包括至少一个与编码序列相连的权利要求48的启动子-外显子1-外显子2序列。
52、一种包含权利要求51的表达盒的植物表达载体。
53、权利要求52的植物表达载体，其中所述表达盒所产生的作用是组织特异性的。
54、权利要求53的载体，其中所述特异性组织是花粉。
55、一种用权利要求51的表达盒转化的组胞，和其任何子代。
56、权利要求55的细胞，其中所述细胞是细菌。
57、权利要求55的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
58、权利要求57的植物细胞，在权利要求51的表达盒所包含的至少一个权利要求48的启动子-外显子1-外显子2序列控制之下，表达编码序列。
59、权利要求55的细胞，其包括稳定地整合至所述细胞的基因组中的权利要求51的表达盒。
60、权利要求55的细胞，其包括稳定地整合在所述细胞的基因组中权利要求52的载体。
61、一种转基因植物以及其任何种子和子代，其中所述植物由权利要求57的植物细胞再生。
62、权利要求61的转基因植物，，在至少一个权利要求48的启动子-外显子1-外显子2序列控制下在其至少一个细胞中表达编码序列且包括权利要求51的表达盒。
63、权利要求62的植物，其中所述植物是单子叶植物。
64、权利要求62的植物，其中所述植物是双子叶植物。
65、权利要求1的分离的DNA分子，其来源于拟南芥。
66、权利要求17的分离的DNA分子，其来源于拟南芥。
67、权利要求33的分离的DNA分子，其来源于拟南芥。
68、权利要求49的分离的DNA分子，其来源于拟南芥。
69、一种在严谨条件下能够与权利要求2中至少一个序列杂交的DNA分子。
70、一种在严谨条件下能够与权利要求18中至少一个序列杂交的DNA分子。
71、一种在严谨条件下能够与权利要求33中至少一个序列杂交的DNA分子。
72、一种在严谨条件下能够与权利要求49中至少一个序列杂交的DNA分子。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070620 |