CN102747081A - 一种增强基因表达的ubi1内含子序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明对来源于玉米ubiquitin第一内含子进行缺失分析，获得了可以增强外源基因表达的新型内含子序列，该内含子序列长为872bp，AT含量为61.0%，可以提高基因表达13倍，与全长的ubiquitin第一内含子相比，提高外源基因表达能力增加30%。本发明获得的内含子可以用于高效植物表达载体的构建，提高转基因植物外源基因表达水平。本发明通过构建含该改造的内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。

Description

一种增强基因表达的ubi1内含子序列及应用

技术领域：

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种增强基因表达的ubi1内含子序列。本发明还涉及该ubi1内含子的应用。

背景技术：

大多数真核基因都被一个或多个内含子所间隔，这些间隔序列可以转录成pre-mRNA，这些转录本只有在细胞核中经剪接复合体的作用去除内含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿过核孔转移到细胞质中进行翻译。真核pre-mRNA的剪接是一个在细胞核中完成的、严格保守的化学反应，该过程包括：剪接体识别外显子-内含子连接区段，通过两步转酯反应切除内含子并使相邻的外显子连接。

内含子虽然是基因中只被转录而不被翻译的序列，但越来越多的研究发现，内含子并不是基因上的一段冗余序列，相反，内含子在基因表达方面起着重要的调控作用。这种由内含子介导的使基因表达活性增强的效应叫做内含子增强效应（intron-mediatedenhancement，IME）（Callis et al.，Genes Development，1987，1:1183-1200）。真核mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。

单子叶植物的内含子增强效应高于双子叶植物，双子叶植物内含子增强效应一般在2-5倍，而单子叶植物可达10-100倍（Simpson和Filipowicz,Plant Mol.Biol.，1996，32：1-41）。双子叶植物内含子可以提高单子叶植物基因的表达，而由于单子叶植物内含子与外显子AU的平均含量为59%和44%，双子叶植物的分别为74%和55%，高AU含量可以使内含子更易形成茎环结构从而有利于剪接，因此，单子叶植物内含子通常不会提高双子叶植物基因的表达（Vain et al.，Plant cell Rep,1996,15:489-494）。Ueki等将PLD、Cat和Ubi（玉米ubiquitin第一个内含子）内含子与不同启动子连接，分别转化玉米和烟草的原生质体，验证各个载体表达特点，结果发现，含有内含子载体的报告基因表达水平在玉米原生质体中普遍高于同样载体的烟草原生质体的表达水平，内含子载体增强效应与启动子、内含子和报告基因等紧密相关（Ueki et al.，Plant Biotech，2004，21(1)：15-24）。

泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的由76个氨基酸残基组成的高度保守的蛋白质。1992年，Christensen等从玉米中克隆出了编码泛素蛋白的Ubi-1和Ubi-2基因，并准确定位了Ubi-1的启动子、转录起始位点、5’侧翼序列处的0.9kb转录调控区和完整的5’非编码区，并构建pUBI-CAT载体，在玉米和其它单子叶植物的原生质体中进行验证，发现Ubi-1启动子比CaMV35S具有更高的增强基因表达的效应(Christensen et al.,PlantMol Biol，1992，18：675-689)。

Vain等通过比较发现，ubi1内含子与侧翼外显子的41nt所构建的载体（p35SubiGUS）在玉米悬浮细胞中的增强效应高于其它载体，增强效应可提高71倍(Vain et al.,Plant cellRep，1996，15：489-494）。王悦冰比较了玉米泛素蛋白基因的第一内含子（ubi1）、水稻肌动蛋白基因的第一内含子（act1）、玉米乙醇脱氢酶基因的第一内含子(adh1)和马铃薯高赖氨酸基因SBgLR基因的第二内含子(SBgLR2)对基因表达的增强作用，结果发现ubi1增强报告基因的表达能力最强；尽管已知并不是内含子中所有序列为提高基因表达所必需，但尚未见到有关通过缺失分析对ubi1内含子改造研究的报道。

发明内容：

本发明的目的是对来源于玉米泛素蛋白基因ubi1内含子进行缺失分析，提供一种可以增强基因表达的内含子，通过构建该改造的泛素蛋白内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。

本发明通过如下工作达到了上述发明目的：

1、内含子缺失载体的构建策略

本发明以ubiquitin基因第一内含子序列（SEQ ID NO:1）为目标序列。在此序列中，有下划线部分表示缺失备选位点。

SEQ ID NO:1

1  GTACGCCGCT CGTCCTCCCC CCCCCCCCCT CTCTACCTTC TCTAGATCGG CGTTCCGGTC

61 CATGGTTAGG GCCCGGTAGT TCTACTTCTG TTCATGTTTG TGTTAGATCC GTGTTTGTGT

121TAGATCCGTG CTGCTAGCGT TCGTACACGG ATGCGACCTG TACGTCAGAC ACGTTCTGAT

181TGCTAACTTG CCAGTGTTTC TCTTTGGGGA ATCCTGGGAT GGCTCTAGCC GTTCCGCAGA

241CGGGATCGAT TTCATGATTT TTTTTGTTTC GTTGCATAGG GTTTGGTTTG CCCTTTTCCT

301TTATTTCAAT ATATGCCGTG CACTTGTTTG TCGGGTCATC TTTTCATGCT TTTTTTTGTC

361TTGGTTGTGA TGATGTGGTC TGGTTGGGCG GTCGTTCTAG ATCGGAGTAG AATTAATTCT

421GTTTCAAACT ACCTGGTGGA TTTATTAATT TTGGATCTGT ATGTGTGTGC CATACATATT

481CATAGTTACG AATTGAAGAT GATGGATGGA AATATCGATC TAGGATAGGT ATACATGTTG

541ATGCGGGTTT TACTGATGCA TATACAGAGA TGCTTTTTGT TCGCTTGGTT GTGATGATGT

601 GGTGTGGTTG GGCGGTCGTT CATTCGTTCT AGATCGGAGT AGAATACTGT TTCAAACTAC

661 CTGGTGTATT TATTAATTTT GGAACTGTAT GTGTGTGTCA TACATCTTCA TAGTTACGAG

721 TTTAAGATGG ATGGAAATAT CGATCTAGGA TAGGTATACA TGTTGATGTG GGTTTTACTG

781 ATGCATATAC ATGATGGCAT ATGCAGCATC TATTCATATG CTCTAACCTT GAGTACCTAT

841 CTATTATAAT AAACAAGTAT GTTTTATAAT TATTTTGATC TTGATATACT TGGATGATGG

901 CATATGCAGC AGCTATATGT GGATTTTTTT AGCCCTGCCT TCATACGCTA TTTATTTGCT

961 TGGTACTGTT TCTTTTGTCG ATGCTCACCC TGTTGTTTGG TGTTACTTCT GCAG

采用以下方法对上述序列进行改造：

首先，采用来自“http://korflab.ucdavis.edu/cgi-bin/web-imeter.pl”的应用检索软件对玉米ubi1序列（1014bp）进行IME(intron-mediated enhancement)基序检索，并得到内含子的得分值。由于该软件所得的内含子分析数据来源于拟南芥和水稻基因组的序列信息，只针对拟南芥和水稻。考虑到玉米和水稻同属于单子叶植物，所以本发明选用水稻物种的信息，通过生物信息学分析获得内含子增强基因表达的初级信息。

其次，根据内含子左右边界序列特点（5’GT……AG3’），保证边界序列不被破坏从而可以正确剪接，依据GT、AG位置筛选缺失序列。在选择位置时，固定一端位置不变，从另一端选择待缺失位点，以此获得单一末端缺失序列。5’端GT序列待选位置：52，96，110，143，231，281（SEQ ID NO:1划线处），3’端AG序列备选位置：639，713，748，806，857（SEQ ID NO:1划线处），同时分析缺失片段的AT含量及获得的内含子序列分值。

结果如表1和表2。表中“得分”为所得的内含子分值，分值越高，意味着增强基因表达的能力越强；“AT含量”表示在SEQ ID NO1中A碱基和T碱基的个数占总碱基个数的百分比。

表1ubi1内含子3’末端缺失序列分析

GT-AG位置	序列大小	AT含量	得分	备注
					1.(GT1-AG1014)	1014	58.6	188.627	完整序列
2.GT1-AG639	639	54.5	198.413	P1
					3.GT1-AG713	713	56.0	195.981	P2
4.GT1-AG748	748	56.4	196.894
					5.GT1-AG806	806	56.8	199.393	P3
6.GT1-AG857	857	57.7	187.283

从表1看出，3’末端缺失序列中四个得分均高于完整序列（1.(GT1-AG1014)），有一个与其接近，并且缺失后AT含量均低于原序列，本发明选取639bp，713bp和806bp进行3’末端缺失（依次称为P1、P2和P3）。

表2ubi1内含子5’末端缺失序列分析

GT-AG位置	序列大小	AT含量	得分	备注
					1.(GT1-AG1014)	1014	58.6	188.627	完整序列
2.GT52-AG1014	963	60.1	140.119	P4
					3.GT96-AG1014	919	60.6	120.250
4.GT111-AG1014	904	60.6	125.319
					5.GT143-AG1014	872	61.0	102.870	P5
6.GT231-AG1014	784	62.5	83.460
					7.GT281-AG1014	734	62.8	53.806	P6

从表2看出，5’末端的缺失对得分影响较大，所有缺失序列得分均低于原序列，AT含量则均有所提高，本发明选取52bp、143bp和281bp进行5’末端的缺失（依次简称为P4、P5和P6）。

缺失的内含子序列总结如表3。

表3六个内含子缺失片段名称及位置

内含子缺失片段名称	缺失片段在ubi1中的位置
		P1	1-639bp
P2	1-713bp
		P3	1-806bp
P4	52-1014bp
		P5	143-1014bp
P6	281-1014bp

对ubi1缺失1-142bp后获得的P5内含子的序列，为SEQ ID NO:2。

2、缺失载体pSG（13i-Pn）N的构建

首先，通过PCR扩增获得六个内含子缺失片段，PCR扩增图见附图1，扩增引物见

表4：

表4ubi1内含子缺失片段扩增所需引物

同时用Bam HI和Sac I双酶切pSG（+13i）N载体，回收GUS+ubi1片段，然后插入以同样双酶切得到的pGEM7Z载体的多克隆位点上，构建得到中间载体p7ZGUS(+13i)（表5）；

将测序正确的六个内含子缺失片段以Pst I酶切的形式替换完整的ubi1内含子，得到中间载体p7ZGUS(13i-X)（表5）；

再以Bam HI和Sac I双酶切形式引入到表达载体pSG（+13i）N中，完成六个内含子缺失载体--pSG（13i-P1）N、pSG（13i-P2）N、pSG（13i-P3）N、pSG（13i-P4）N、pSG（13i-P5）N和pSG（13i-P6）N的构建（表5）。

载体PstI酶切鉴定图见附图2，载体示意图和构建策略如附图3和图4所示。

3、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS检测

选取玉米胚性愈伤组织进行基因枪转化。轰击时用pUC19、pSGN和pSG（+13i）N作为对照载体，以此验证转化效率。

依次完成pUC19、pSGN、pSG（+13i）N、pSG（13i-P1）N、pSG（13i-P2）N、pSG（13i-P3）N、pSG（13i-P4）N、pSG（13i-P5）N和pSG（13i-P6）N载体的基因枪转化。经轰击后的玉米愈伤组织在高渗培养基上过夜培养，之后转移到常规的诱导愈伤培养基上。36h后进行GUS的组织化学分析。

内含子缺失载体轰击玉米愈伤组织的GUS组织化学染色结果如附图5所示：空白对照载体pUC19轰击的愈伤表面没有任何蓝点，pSGN载体的愈伤染出少量的蓝点，pSG(13i)N载体染出的蓝点较pSGN的多。六个缺失载体中，P1和P2载体染出少数蓝点，与pSGN接近，P3载体出现较多蓝点，P4、P5和P6载体的蓝色呈片状分布，各载体染色结果明显。

4、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析

将基因枪轰击的玉米愈伤组织进行GUS荧光定量分析，结果见附图6。不同位置的缺失影响内含子增强效应：P5内含子载体表达水平最高，较pSGN载体提高了7倍；P1和P2载体表达水平与pSGN接近，说明增强效应已经消失；P3、P4和P6载体表达效果与pSG(13i)N接近。其中3’末端缺失显著地降低了增强效应，且缺失序列越多，增强效应降低的越明显，P1内含子片段几乎没有增强效应，但组织化学染色的结果表明仍然完成了内含子的剪接；5’末端的缺失在一定程度上提高了基因表达，但这与缺失片段的长度不相关；两个缺失载体进一步表明3’末端的序列在增强效应中所起的作用从一定程度上高于5’末端的序列。

实验表明，ubi1内含子增强效应并不完全依赖全长的内含子，存在一些关键序列在其中起着重要作用，获得增强效应明显提高的缺失内含子P5，证实内含子改造的可行性，可用于植物表达载体的构建和转基因植物研究。

本发明通过缺失分析对ubi1内含子改造，获得了增强基因表达能力更强的内含子序列。利用玉米愈伤组织瞬时表达系统，本研究获得了可以提高外源基因表达的新型内含子P5，其提高基因的表达水平已超过常用的ubiquitin1内含子，可以用于植物表达载体的构建，在植物组织中提高外源基因表达水平。

附图说明：

图1是P1、P2、P3、P4、P5和P6内含子片段PCR扩增图；

图2是内含子缺失载体pSG（13i-Pn）N的Pst I酶切鉴定图；

图3是构建的ubi1内含子缺失载体pSG（13i-Pn）N示意图；

图4是内含子缺失载体pSG（13i-Pn）N的构建策略；

图5是内含子缺失载体轰击玉米愈伤组织的GUS组织化学分析；

图6是内含子缺失载体轰击玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析。

具体实施方式:

说明：以下所用到的部分生物材料的特征和来源如表5。

表5

实施例

1、缺失载体pSG（13i-Pn）N的构建

通过PCR扩增法获得内含子缺失片段，扩增引物见表4，PCR扩增图见图1。扩增片段两端添加Pst I酶切位点，由于CaMV35S启动子的23-28bp处含有一个Pst I酶切位点，因此不能直接在pSG（+13i）N载体上替换内含子序列。构建时首先用Bam HI和Sac I双酶切pSG（+13i）N载体（中国农业科学院生物技术研究所作物基因组与遗传改良研究室保存），回收GUS+ubi1片段，然后插入以同样双酶切得到的pGEM7Z载体（商业化载体，可在生物公司购买）的多克隆位点上，构建得到中间载体p7ZGUS(+13i)，之后将测序正确的六个内含子缺失片段以Pst I酶切的形式替换完整的ubi1内含子，得到中间载体p7ZGUS(13i-X)，再以Bam HI和Sac I双酶切形式引入到表达载体pSG（+13i）N中，共完成了三个3’末端缺失载体、三个5’末端缺失载体的构建，分别命名为pSG（13i-P1）N、pSG（13i-P2）N、pSG（13i-P3）N、pSG（13i-P4）N、pSG（13i-P5）N和pSG（13i-P6）N(以下简称为P1、P2、P3、P4、P5和P6)，载体的Pst I酶切鉴定图如图2。载体示意图和构建策略如图3和图4所示。

2、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS检测

取授粉后10-12d的Hi II玉米穗进行消毒处理，剥取1-2mm大小的幼胚转入N6培养基进行胚性愈伤组织的诱导，每15d将诱导的愈伤组织转入新鲜的N6培养基，对胚性愈伤组织进行扩繁，扩繁3-4次后，提前一周选取颜色鲜黄、质地松脆的II型愈伤组织转入新鲜的N6培养基以备基因枪转化使用，基因枪转化前4h将愈伤组织转入高渗培养基（N6培养基+0.4M甘露糖）中，用金粉颗粒包被质粒，每枪质粒用量为1μg，基因枪转化条件为1100psi，真空度为25-28inches Hg，射击距离9cm。

依次完成pUC19、pSGN、pSG（+13i）N、pSG（13i-P1）N、pSG（13i-P2）N、pSG（13i-P3）N、pSG（13i-P4）N、pSG（13i-P5）N和pSG（13i-P6）N载体的基因枪转化，每个载体轰击三枪，整个实验流程重复三次。轰击后的玉米愈伤组织在高渗培养基上过夜培养，第二天转移到常规的N6诱导愈伤培养基上；12h后随机选取轰击的愈伤组织，用GUS染色液进行GUS的组织化学分析。以不含有gus基因的质粒pUC19轰击的玉米愈伤作为阴性对照，含有gus基因和完整内含子的pSG（+13i）N载体为阳性对照。

GUS组织化学染色结果如附图5所示，染色效果明显表明：空白对照载体pUC19轰击的愈伤表面没有任何蓝点，pSGN载体的愈伤染出少量的蓝点，pSG(13i)N载体染出的蓝点较pSGN的多。六个缺失载体中，P1和P2载体染出少数蓝点，与pSGN接近，P3载体出现较多蓝点，P4、P5和P6载体的蓝色呈片状分布，各载体染色结果明显。

3、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析

选取轰击36h后的玉米愈伤组织用GUS蛋白提取缓冲液在液氮条件下进行研磨，4℃离心收集蛋白上清。取40μl蛋白上清，加入到37℃预热的400μl GUS蛋白反应缓冲液（GUS提取缓冲液+1mM MUG）中，立即取100μl加入到900μl反应终止液中，以此作为0时的空白对照；37℃避光温浴，分别在15min、30min和60min各取100μl，加入到900μl反应终止液，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm条件下的HITACHIF-4500荧光分光光度计中测定各样品的荧光值，以4-MU标准样品绘制的曲线为标准，再用考马斯亮蓝法测定蛋白上清的总蛋白含量，最终以nmol MU/min*mg Pr表示GUS蛋白表达量。

基因枪轰击的玉米愈伤组织进行GUS荧光定量分析结果见附图6。P5内含子载体表达水平最高，较pSGN载体提高了13倍；P1和P2载体表达水平与pSGN接近，说明增强效应已经消失；P3、P4和P6载体表达效果与pSG(13i)N接近。其中3’末端缺失显著地降低了增强效应，且缺失序列越多，增强效应降低的越明显，P1内含子片段几乎没有增强效应，但组织化学染色的结果表明仍然完成了内含子的剪接；5’末端的缺失在一定程度上提高了基因表达，但这与缺失片段的长度不相关；两个缺失载体进一步表明3’末端的序列在增强效应中所起的作用从一定程度上高于5’末端的序列。获得增强效应明显提高的改造内含子，实验表明，ubi1内含子增强效应并不完全依赖全长的内含子，存在一些关键序列在其中起着重要作用，证实内含子改造的可行性，并且获得了表达水平更高的缺失内含子P5，可用于植物表达载体的构建和转基因植物研究。

利用玉米愈伤组织瞬时表达系统，本研究获得了可以提高外源基因表达的新型内含子P5，P5内含子提高基因的表达水平已超过常用的ubiquitin1内含子，本发明获得的内含子可以用于植物表达载体的构建，在植物组织中提高外源基因表达水平。

Claims (6)

1.一种可以提高基因表达的内含子序列，其特征是具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的内含子序列在培育转基因植物中的应用。

3.一种提高ubi1内含子增强基因表达水平的方法，其特征是对ubi1内含子进行特定位置的缺失。

4.权利要求3所述的方法，所述内含子是泛素蛋白内含子，所述缺失是将SEQ ID NO：1中1-142bp进行缺失。

5.一种植物表达载体，其特征是含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的载体在培育转基因植物中的应用。

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