CN101126089A

CN101126089A - 利用SrMV－P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法

Info

Publication number: CN101126089A
Application number: CNA2007100092268A
Authority: CN
Inventors: 张木清; 陈如凯; 郭莺; 阮妙鸿
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2008-02-20
Anticipated expiration: 2027-07-19
Also published as: CN100572539C

Abstract

一种利用SrMV－P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV－P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P₁基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。已获得的转SrMV－P₁基因甘蔗无性系，其抗病性优于甘蔗受体品种及其组培后代。

Description

利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法

技术领域本发明涉及一种运用基因工程技术培育甘蔗抗花叶病种质材料的方法，包括高粱花叶病毒P₁蛋白(SrMV-P₁)的氨基酸和核酸序列，利用该序列构建的载体及培育的转基因植株，属于植物基因工程技术领域。

背景技术近年来，随着全球气温的升高，带毒种苗的大量种植，我国的闽、台、粤、桂、滇、浙等省蔗区花叶病非常严重。目前除通过培育抗性品种外，主要是茎尖和愈伤组织培养脱除感染的病毒，恢复品种特性，提高产量和糖分。但是脱毒苗易退化而重新感病导致花叶病的爆发流行。因此，选育与利用抗病品种是控制甘蔗花叶病发生的根本措施。

从1986年，美国Powel-Abel最先报道了将TMV-CP基因转入烟草获得了对TMV具有抗性的转CP基因烟草植株以来，利用病毒的CP基因获得抗病植株的可行性已在多种病毒、多种植物中得到证实。但由于转CP基因的专化性很强，只对同一株系的病毒有很强的抗性。当接种不同属的病毒或是同一属不同株系的病毒，其抗病性就会下降，甚至消失。故许多育种工作者正利用病毒的其它蛋白进行抗病育种。

P₁位于SrMV基因组的5’端，是丝氨酸型的蛋白酶，可自身进行剪切从多聚蛋白前体中分离出来，其蛋白分子量为30～60kDa不等。在Potyvirus属中，P₁除了C端Potyvirus属中P₁保守区及蛋白酶的结构域外，其保守性很低，这表明它可能与特异的病毒和寄主互作有关。对Potato virus Y(PVY)and Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV)的P₁分离物进行聚类分析发现，其多态性很高，且根据分离物的病症及地理位置聚类。Yam mosaicvirus(YMV)分离物的核酸序列同源性分析表明，P₁的同源性仅为65％，而HC-Pro同源性达80％。P₁蛋白的C端147个氨基酸残基为水解功能，His²¹⁴、Asp²²³、Asp²⁸⁸是水解酶最大活性所必需的氨基酸残基，这在Potyvirus中非常保守，只有在少数病毒中发现Asp被替换成Glu。但是，在丝氨酸水解残基(即Phe或Tyr后)与切点之间这段氨基酸序列的同源性却很低。近年来通过突变或部分碱基的缺失方法对P₁的功能进行了大量的研究。1994年，Klein分别构建两个突变体，一个是在P₁的C-端水解酶活性区Asp和Ser中插入一个片断，另一个是突变N端区域，结果发现，C端突变会使病毒致死，而突变N端对病毒生活力没有太大影响。但在将C端突变体中的P₁/HC-Pro的切点替换成NIa的切点后病毒又可生存，表明P₁蛋白酶活性不仅决定其自身，同时NIa也会延时或恢复其活性。1998年Jelena et.al发现去除P₁的病毒突变体对病毒的传播长距离运输影响不大，但会明显抑制基因放大，证明了P₁与病毒复制有关。P₁参与RNA结合也得到了证实。P₁与CI同时参与病毒在细胞间的运动，同时P₁与HC-Pro协作具有抑制寄主抗性及转入后基因沉默的作用(posttranscriptional genesilencing，PTGS)。

本发明就是针对以上背景技术，通过分离克隆SrMV的P₁蛋白基因，并利用其构建无筛选标记基因的高效植物表达载体，通过共转化的方法，以及快速、高效的转基因检测和抗病评价技术，大幅度提高甘蔗抗花叶病育种效率，为甘蔗抗花叶病品种的培育奠定良好的技术基础。

发明内容本发明的目的是提供一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术改良甘蔗抗花叶病的方法。具体地说，从高度感染甘蔗花叶病毒亚组中高粱花叶病毒株系SrMV的甘蔗品种“福农91-4621”中分离克隆SrMV-P₁基因，构建植物表达载体，利用基因枪转导将其插入到甘蔗品种“福农95-1702”的基因组中，培育抗花叶病转基因甘蔗品种，以提高其抗病性。所述的SrMV(Sorghum Mosaic Virus)指甘蔗花叶病毒亚组中高粱花叶病毒株系；所述的SrMV-P₁基因指编码甘蔗花叶病毒亚组中高粱花叶病毒株系的P₁蛋白基因。

本发明利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P1基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于：

1、SrMV-P₁的核苷酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的碱基序列；

2、SrMV-P₁的核苷酸序列所推演的氨基酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列；

3、构建的植物表达载体为pUbi-SrMV-P₁；所述的pUbi-SrMV-P₁指以SrMV-P₁为目的基因，Ubi为启动子，Nos为终止子，无筛选标记基因的植物表达载体；

4、利用基因枪转导获得转基因甘蔗品种，其外源SrMV-P₁基因插入基因组的拷贝数为2～4个。

根据上述培育方法获得的转SrMV-P₁基因品种，其抗病性优于甘蔗受体品种“福农95-1702”及其组培后代。已获得的转SrMV-P₁基因的甘蔗无性系分别为福农5、福农37、福农50、福农51，福农53和福农64。

本发明的序列与已报道的其它病毒P₁基因有明显不同，SrMV-P₁全长699bp。病毒采用翻译后修饰进行蛋白编译，整个病毒核酸序列只有一个大的ORF，由一个起始密码子ATG决定氨基酸编码的起始位置，P₁为于病毒的N端，所以所得基因序列的ORF始于ATG，但没有终止密码子。P₁的C端147个氨基酸残基为水解功能，His²¹⁴、Asp²²³、Asp²⁸⁸是水解酶最大活性所必需的氨基酸残基。P₁与CI同时参与病毒在细胞间的运动，同时P₁与HC-Pro协作具有抑制寄主抗性及转入后基因沉默的作用。

本发明的转基因甘蔗品种具有以下优点：甘蔗花叶病发病率为0，且不同无性世代间基本保持稳定，而受体品种发病率达82.7％，组培后代发病率也高于66.8％。本发明的转基因甘蔗品种在温室和大田生长均快于受体品种。

具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。

实施例：利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括以下步骤：

1、甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因(SrMV-P₁)的克隆

通过GENBANK已经公布的甘蔗花叶病毒亚组基因序列，并对其所编码的多聚蛋白氨基酸序列进行多重序列分析后，根据保守氨基酸序列，设计合成1组特异引物：

(1)FP1₁：5’-ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3’

(2)RP1₁：5’-GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3’

利用上述特异引物，以Trizol方法提取的感病叶片总RNA为模板，使用反转录酶合成cDNA第一条链，其反应按照如下进行：取1μl总RNA样品(约1μg)，分别加入下列成分：1μl的10×RT-RNA缓冲液，3.25μl的无RNase的水，1μl的dNTPs，加入0.5μl的Oligo(dT)15，0.25μl的RNase抑制剂以及0.5μl的AMV反转录酶。轻轻混匀，稍离心，于42℃温育30min。然后将反应混合物加热至95℃，温育5min终止反应，冰上冷却并稍离心，-20℃保存备用。然后采用上述设计的RT-PCR引物进行PCR扩增，其反应组成如下：10μl的5×PCR缓冲液，35.5μl的灭菌超纯水，0.5μl的TaKaRa Ex Taq酶以及FCP和RCP引物各1μl以及2μl的cDNA模板。PCR按如下反应条件进行：94℃变性5min，然后94℃变性30sec、52℃退火45sec、68℃延长45sec，35个循环，最后72℃延长5min，4℃保存备用。PCR扩增结束后，以新鲜的TAE Buffer为电泳缓冲液，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，采用PCR Fragment Recovery Kit的方法回收RT-PCR产物，然后连接到pMD-18-T载体上进行酶切验证和测试，以pMD-18-T载体通用引物，在ABI PRISM^TM 377XL型DNA测序仪上对pMD-18-T-CP质粒进行测序分析，结果见SEQ.ID.NO.1。采用BLAST、DNAMAN 4.0、OMIGA2.0软件进行序列分析，上述这些方法都是常规分子生物学技术。

2、抗甘蔗花叶病转SrMV-P₁基因植物表达载体的构建

用BglII和SacI双酶切T-P₁质粒和pZMLR14表达载体，将切下的目的基因P₁片段和载体片段通过琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收，连接目的基因和载体片段，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到Ubi启动子驱动的P₁基因植物表达载体pUbi-SrMV-P₁。将载体pUbi-SrMV-P₁和pZMLR14以1∶1的比例混合，采用基因枪的方法共转化甘蔗。操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定为分子生物学的常规方法。

3、抗甘蔗花叶病转SrMV-P₁基因材料的培育

(1)受体材料预处理：在基因枪轰击前先将受体材料转入JDA培养基中预培养2d，然后转入含渗透剂0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇的JDA培养基中预处理4～6h。

(2)基因枪轰击：将预先准备好的装有愈伤组织的小培养皿放入基因枪室的托盘上，关闭基因枪门，利用气压1100psi和射击距离6cm直接轰击甘蔗胚性愈伤组织。

(3)过渡培养：轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(MS+2，4-D 2mg/L+Sorbitol 0.2mol/L+Mannitol 0.2mol/L)上继续处理18h，其后接入MS+2，4-D 2mg/L的培养基上25℃暗恢复培养5～8d。

(4)筛选继代培养：恢复后的愈伤组织转移至总糖为10.0g/L，内含5.5g/L甘露糖的JDA培养基上筛选继代培养，15d继代一次；

(5)筛选分化培养：选择继代三次后仍存活的愈伤组织，转接入正常培养基进行筛选分化。

(6)筛选促根培养：抗性苗长到2～4cm后，转入SG培养基上筛选和生根培养。

(7)炼苗和移栽：当幼苗的根长至2.5cm长时，移到室外炼苗2d，然后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，移栽到小花盆中(草木灰∶砂子∶耕作土＝1∶1∶1，混合后高压灭菌)定时喷浇稀释10倍的MS无机盐液。

(8)转基因植株的分子检测：根据所转导的甘蔗花叶病病毒蛋白基因序列设计特异引物，分别进行PCR、Southern和RT-PCR，对转基因植株进行目的基因分子检测，经Southern杂交证实，转基因抗花叶病品种的外源P₁基因的拷贝数：福农5为2个拷贝，福农37为4个拷贝，福农50、福农51和福农53和福农64为3个拷贝。Southern杂交采用Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitI的试剂盒，操作过程严格按照试剂盒提供的指南方法。RT-PCR按TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0，产品编号为DRR0194。经氯酚红检测上述几个转P₁基因无性系均没有pmi标记基因。

4、抗病转基因甘蔗无性系的筛选鉴定

根据国家转基因安全管理条例，将获得的转基因植株及相应的对照(空载体轰击获得的植株以及受体原种福农95-1702)分别在人工气候箱、大棚温室以及大田进行抗病性的筛选鉴定，评价转基因无性系。

抗病性鉴定：

·接种鉴定：

病毒液粗提：参照周仲驹等(1987)方法，取严重感染相同花叶病的病叶加3倍量的(v/w)0.1mol/L pH7.2含NaSO₃的磷酸缓冲液，经高速组织捣碎机捣碎5min，双层纱布过滤榨汁或12,000g离心10min，取上清。汁液用于田间或温室病毒接种。

接种方法：用上述病毒汁液磨擦接种生长至7-8片叶的转基因甘蔗植株。接种时，接种叶片大小一致，先用镊子轻轻划伤嫩叶，然后沾取少量病毒液涂抹伤口处。重复接种3次，每次间隔6d。

发病率调查：首次接种7d后开始调查发病率，以后每周调查一次，直至发病率稳定。

·自然诱发接种鉴定：

以空载体转化植株、受体原种作为对照，每隔两个转基因甘蔗无性系，种植一行原种作为诱发行。田间自然发病在甘蔗齐苗后开始调查发病率，每周调查一次，直到发病率稳定。

·结果：在人工接种条件下，受体品种(原种)的发病达82.7％，组培无性系发病率达66.8％，福农95-1702通过组培后其发病率虽然也大幅度降低，但是还极易感病，而转基因甘蔗均无发病，说明转入外源SrMV-P₁基因后提高了甘蔗抗花叶病的能力。

SEQUENCE LISTING

<110>福建农林大学

<120>利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>699

<212>DNA

<213>Sorghum Mosaic Virus(SrMV)

<400>1

atggcaggag catggaacac tgtgacttac aagtggagac cgaatttgga caatgcaagg 60

gatgttcgaa aagtgatgga acactttgca gcaaagcacc aagtttacga cgcaaagcga 120

gcagcggagc ataacagtag aatccttcga aggacttttg tgcaagaaat cataaaaaca 180

cctgaagaga agattcagcg caaatctcag gtgtgggtcg aaaaacaaga caacaatcca 240

acaattcatc tgcactatgt taggttcaaa aacaaggaga agaaggcatc acctgaaatt 300

acttcaggat cagttgcaaa gttgacgcga caggtacttg aactcagcaa aatcacaaag 360

cttgaagtag aactcattgg caagaagagg tgcaaatcaa ctaaactagc aatcaaaaag 420

cgtagcaata aagagtatct acattgtgaa accagacacg agacaaataa attcaagcgc 480

attgatatca acttagaacg gcactggttt ccacttgtga agaagattac aaagtgttat 540

ggtcacatac caccaagaat gttttggaaa atgagcaaag gtgatagtgg gttaacgttc 600

attcaaaatg gtgagttgtt cataattcga ggaaaacgag atggcgtcct acttaatagt 660

atcactagtg aaactcgaat taatgaaata acttatttt 699

<210>2

<211>233

<212>PRT

<213>Sorghum Mosaic Virus(SrMV)

<400>2

Met Ala Gly Ala Trp Asn Thr Val Thr Tyr Lys Trp Arg Pro Asn Leu

1 5 10 15

Asp Asn Ala Arg Asp Val Arg Lys Val Met Glu His Phe Ala Ala Lys

20 25 30

His Gln Val Tyr Asp Ala Lys Arg Ala Ala Glu His Asn Ser Arg Ile

35 40 45

Leu Arg Arg Thr Phe Val Gln Glu Ile Met Lys Thr Pro Glu Glu Lys

50 55 60

Ile Gln Arg Lys Ser Gln Val Trp Val Glu Lys Gln Asp Asn Asn Pro

65 70 75 80

Thr Ile His Leu His Tyr Val Arg Phe Lys Asn Lys Glu Lys Lys Ala

85 90 95

Ser Pro Glu Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Lys Leu Thr Arg Gln Val

100 105 110

Leu Glu Leu Ser Lys Ile Thr Lys Leu Glu Val Glu Leu Ile Gly Lys

115 120 125

Lys Arg Cys Lys Ser Thr Lys Leu Ala Ile Lys Lys Arg Ser Asn Lys

130 135 140

Glu Tyr Leu His Cys Glu Thr Arg His Glu Thr Asn Lys Phe Lys Arg

145 150 155 160

Ile Asp Ile Asn Leu Glu Trp His Trp Phe Pro Leu Val Lys Lys Ile

165 170 175

Thr Lys Cys Tyr Gly His Met Pro Pro Arg Met Phe Trp Lys Met Ser

180 185 190

Lys Gly Asp Ser Gly Leu Thr Phe Ile Gln Asn Gly Glu Leu Phe Met

195 200 205

Ile Arg Gly Lys Arg Asp Gly Val Leu Leu Asn Ser Ile Thr Ser Glu

210 215 220

Thr Arg lle Asn Glu Met Thr Tyr Phe

225 230

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>Sorghum Mosaic Virus(SrMV)

<400>3

attggatcca tggcaggagc atggaac 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>Sorghum Mosaic Virus(SrMV)

<400>4

gggagatcta aaataagtta tttcatt 27

Claims

1.一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P₁基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于：

(1)SrMV-P₁的核苷酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的碱基序列；

(2)SrMV-P₁的核苷酸序列所推演的氨基酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列；

(3)构建的植物表达载体为pUbi-SrMV-P₁；

(4)利用基因枪转导获得转基因甘蔗品种，其外源SrMV-P₁基因插入基因组的拷贝数为2～4个。

2.根据权利要求1所述的一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，其特征在于设计合成的特异引物为：

(1)FP1₁：5’-ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3’

(2)RP1₁：5’-GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3’

3.根据权利要求1或2的方法培育的转SrMV-P₁基因甘蔗无性系，其抗病性优于甘蔗受体品种。