CN110241129B - 一种发光报告系统及其在抗生素发现筛选中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发光报告系统，由分子伴侣基因clpX、groE、dnaJ、dnaK的启动子片段和与分子伴侣基因启动子相连的luxABCDE基因片段构建而成。本发明还公开了所述发光报告系统在抗生素发现筛选中的应用。同已有的抗生素筛选技术相比，本发明能够快速、高通量地鉴定溶液中抗生素的存在，提高新抗生素的发现速度，实现了对抗生素的快速发现筛选，应用前景广阔。

Description

一种发光报告系统及其在抗生素发现筛选中的应用

技术领域

本发明涉及一种发光报告系统及其在抗生素发现筛选中的应用。属于生物技术领域。

背景技术

由于抗生素的大规模使用所带来的细菌抗生素耐药性是人类健康的重大威胁。据统计，当前全球因为细菌的抗生素耐药死亡70万人。而如果当前抗生素耐药泛滥的现象得不到抑制，到2050年，全球将因为抗生素耐药死亡1000万人，超过肿瘤成为人类的第一大死因。对抗生素耐药现象的抑制，一方面需要人们对耐药的机制进行进一步研究以抑制或限制耐药性的发生、传播、水平，在另一方面也需要不断开发新的抗生素。而这就需要在药物中或者可能生产抗生素的生物体中快速、高效地筛选和发现抗生素。

在传统上，新抗生素可以通过在化合物库或者可天然生产抗生素的微生物发酵液中筛选获得。对新抗生素的发现也可以通过对可生产抗生素的微生物进行遗传改造，以期待产生新的抗生素来实现。上述方法依赖于高效筛选新抗生素方法的发明。

细菌可以使用lux基因所编码的荧光素酶实现生物发光。这些酶可以通过催化反应发出 490nm的光。luxABCDE五个基因组成了一个荧光素酶操纵子，其中luxA和luxB编码了荧光素酶的α和β催化亚基，而luxC、luxD和luxE负责底物的合成。细菌的荧光素酶在很多的体系内都得到了应用，其中包括了通过和SOS响应机制偶联实现抗生素的探测。

抗生素可以通过多种方法来实现杀菌的功能，如破坏蛋白质的翻译系统、破坏细胞壁合成、破坏DNA复制等。上述功能都会对细胞的生理活动产生显著影响，从而使得细菌产生应激性响应，其中包括了SOS机制的启动、分子伴侣的响应、UPR途径的响应等。对这些响应信号的探测，标志着对细菌应急状态的探测，从而可以预示着抗生素的存在。这种探测方式，并不依赖于抗生素的具体杀菌机制，因此，具有较好的可发现未知抗生素的潜力。

已有的抗生素发现筛选的方法基于细菌的杀菌活性，因此易于筛选到已知的抗生素，而发现新抗生素的几率较低，且筛选通量较低。经检索，尚未有使用由分子伴侣基因clpX、groE、 dnaJ、dnaK的启动子片段和与分子伴侣基因启动子相连的luxABCDE基因片段构建而成的发光报告系统进行抗生素的发现和筛选的报道出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种发光报告系统及其在抗生素发现筛选中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种发光报告系统，由分子伴侣基因clpX、groE、dnaJ、 dnaK的启动子片段和与分子伴侣基因启动子相连的luxABCDE基因片段构建而成；其特征在于：所述发光报告系统由pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、 pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒组成；其中所述 pAmilux-clpX-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述 pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述 pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述pAmilux-groE-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

本发明还提供了上述的发光报告系统在抗生素发现筛选中的应用。

其中，具体的应用方法是：将发光报告系统中的四种质粒pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、 pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中，制成四株金黄色葡萄球菌lux报告株，分别命名为：报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4，并制备含有各报告菌株的琼脂糖双层平板，将灭菌的滤纸片在琼脂糖双层平板中央或培养基表面有序排布并与培养基紧密相贴；然后将含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上，继续培养并观察有无细菌发光产生，若有至少一株报告菌株发光即确定被检测物含有抗生素。

上述的应用中：所述滤纸片优选是用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的圆形小纸片。

上述的应用中：所述含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加量优选是1～1.5μl。

上述的应用中：所述将含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上以后，优选将平板倒置于培养箱中，37℃培养20～25h。

上述的应用中：所述发光报告系统至少能发现筛选达托霉素(DAP)，多粘菌素B(PMB)，亚胺培南(IPM)，青霉素G(PEN)，万古霉素(VAN)，红霉素(ERY)，卡那霉素(KAN)，壮观霉素(SPE)，链霉素(STR)，四环素(TET)，丝裂霉素C(MMC)，环丙沙星(CIP)，加替沙星(GAT)，甲氧苄啶(TMP)，利福平(RIF)，腐草霉素(PHL)十六种抗生素。

本发明的发光报告系统可以用来发现筛选新的抗生素，具有用于细菌感染的治疗的临床应用价值。

本发明是基于金黄色葡萄球菌中分子伴侣基因启动子的表达水平而设计的发光报告系统，通过一系列的DNA序列设计与验证，在含有本报告系统的金黄色葡萄球菌遇到外界抗生素压力时，会启动本报告系统中的分子伴侣基因启动子，从而使得lux基因得到表达，从而进一步使得细菌发光。通过一系列抗生素的添加实验可以表明：外界抗生素压力可以使得细菌显著发光，从而证明了本发明的发光报告系统的可行性及其在抗生素发现筛选中的应用意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

不依赖于抗生素的作用机制及对菌株的作用效果，能够快速、高通量地鉴定溶液中抗生素的存在，同已有的抗生素筛选技术相比，重复发现抗生素的概率降低，发现新抗生素的概率提高，从而可以提高新抗生素的发现速度，所发现的抗生素能够在临床上用于治疗细菌感染，包括多重耐药菌感染，从而带来巨大的社会经济利益。

附图说明

图1：本发明中发光报告系统的构建。

图2：抗生素使得本发明中发光报告系统发光。

其中：clpX、dnaJ、dnaK、groE指的是本发明中的发光报告系统四种质粒。CIP，环丙沙星；DAP，达托霉素；ERY，红霉素；GAT，加替沙星；IPM，亚胺培南；KAN，卡那霉素；MMC，丝裂霉素C；PEN，青霉素G；PHL，腐草霉素；PMB，多粘菌素B；RIF，利福平；SPE，壮观霉素；STR，链霉素；TET，四环素；TMP，甲氧苄啶；VAN，万古霉素。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。涉及的试剂、载体、菌株若无特殊说明，则均为公知的销售渠道获得。

实施例1

实验菌株及质粒:

Escherichia coli DH5α：用于感受态制备，中国普通微生物菌种保藏管理中心获取 (CGMCC1.12873)。

Escherichia coli DH10B：用于感受态制备，ThermoFisherScientific公司获取(货号18297010)

Staphylococcus aureus RN4220：用于感受态制备及发光检测，BEI Resources获取。

pMD19-T:购于大连宝生物公司(TaKaRa)

pAmilux：来自加拿大英属哥伦比亚大学(文献：Mesak LR,Yim G,Davies J,Improved lux reporters for use in Staphylococcus aureus,Plasmid,2009,61(3):182-187.)

实验所需培养基及其配制:

LB培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨(10g)、氯化钠(10 g)、酵母提取物(5g)，并用磁力搅拌器搅拌至溶解。滴加5mol/L氢氧化钠调至pH7.0，用去离子水定容至1L后，分装并于121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。若需固体培养基，则需按1.5％的比例加入琼脂粉。

NYE培养基：配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入酪蛋白水解物(10g)、酵母提取物(5g)、氯化钠(5g)，用磁力搅拌器搅拌至溶解。滴加5mol/L氢氧化钠调至 pH 7.2左右，用去离子水定容至1L后，分装并于121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。若需固体培养基，则需按1.5％的比例加入琼脂粉。

实验所需抗生素及其配制:

氨苄青霉素(AMP)溶液:称取100mg氨苄青霉素，溶解于1ml无菌超纯水中并涡旋振荡混匀，使其终浓度为100mg/ml，存放于-20℃冰箱中备用。使用时，按1:1000的比例加入培养基中。

氯霉素(CHL)溶液：称取10mg氯霉素，溶解于1ml无水乙醇中并涡旋振荡混匀，使其终浓度为10mg/ml，存放于-20℃冰箱中备用。使用时，按1:1000的比例加入培养基中。

实验所需溶液及其配制:

感受态缓冲液:用电子天平称取0.333g CaCl2、0.105g 3-丙磺酸钠盐(MOPS)、0.148g MnCl2·4H2O,溶解于40ml去离子水中，用移液枪量取7.5ml甘油加入上述溶液后，用去离子水定容至50ml，并用NaOH调至pH至7左右。将缓冲液用0.22μm滤膜过滤除菌后，转移到50ml无菌离心管中于冰上预冷，备用。该缓冲液现用现配。

80％(v/v)甘油:量取80ml甘油溶于20ml超纯水中，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min 备用。

50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 18.612g于烧杯中，加入700ml超纯水和 57.1ml的冰醋酸，充分搅拌溶解。随后，加入NaOH调节pH至8.3，最后定容至1L，常温下储存备用，用时稀释50倍即可。

实验所需试剂及仪器:

实验所需试剂:Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(Sangong biotech,Shanghai,China)、 EZ-10柱式质粒小量抽提试剂盒(Sangong biotech,Shanghai,China)、EZ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Sangong biotech,Shanghai,China)、pMD^TM19-T VectorCloning Kit(Takara,Dalian, China)、FlyCut BamHI快速内切酶(TransGene Biotech,Beijing,China)、T4DNA Ligase(Takara, Dalian,China)、4S Green Plus无毒核酸染料(Sangong biotech,Shanghai,China)、NormalRunTM prestained 250bp-I DNA ladder(Generay biotech,Shanghai,China)、1×T3Super PCR Mix (Tsingke,Beijing,China)、无菌滤膜(0.22μm)。

实验所需仪器:

DNP-9082型恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、恒温振荡培养箱(江苏太仓实验仪器厂)、HH-S恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)、微波炉(格兰仕)、超净工作台(江苏净化实验设备厂)、分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、涡旋振荡器(江苏省其林贝尔仪器制造有限公司)、离心机(艾本德中国有限公司)、PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)、DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)。

实验步骤：

步骤1.菌株活化和纯化

将冻存的甘油保藏的大肠杆菌(15％甘油)按1：300的比例接入到LB培养基中，37℃条件下振荡培养过夜。

大肠杆菌使用LB培养基培养，金黄色葡萄球菌使用NYE培养基培养。吸取活化好的菌液10μl滴加到培养皿上，随后烧红接种环，待其冷却后蘸取菌液进行划线。注意划线时不要过疏或过密，否则难以分离得到单菌落。在37℃条件下先正放培养1h，待菌液完全吸收后倒置培养过夜。

步骤2.细菌基因组DNA提取

本实验采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，步骤如下：

菌体收集：

金黄色葡萄球菌：取1ml过夜培养的细菌菌液到1.5ml离心管中，8000-12000rpm离心1 min,尽量将上清液去除干净。加入180μl的溶菌酶溶液(使用前将溶菌酶加入Enzymatic lysis buffer中，配制成30mg/ml的溶菌酶溶液)，用移液枪反复吹打重悬菌体，于37℃条件下水浴至少3h。随后，加入20μl Proteinase K,颠倒或振荡混匀，于56℃水浴中孵育至少1h至 EP管中的液体澄清如蛋清状。此步骤非常关键，因金黄色葡萄球菌细胞壁厚，若裂解不完全，难以提取其基因组DNA。

加入200μl Buffer BD,混匀。

加入200μl无水乙醇，混匀。

将试剂盒中的吸附柱放于收集管中，用移液枪加入BufferBD和无水乙醇后的液体全部转移至吸附柱中，静置2-3min,随后12000rpm离心3min,弃去收集管中的废液。

将吸附柱放回收集管，滴加500μl PW Solution,12000rpm离心1min,弃去收集管中的废液。

将吸附柱放回收集管，加500μl Wssh solution,12000rpm离心1min。

将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心5min,以除去残留的漂洗液。

取出吸附柱，置于新的1.5ml EP管中，加入50-100μl无菌超纯水静置2min,12000rpm 离心2min得到DNA溶液。

步骤3.启动子-T载体的构建

基因groES-EL、dnaK、dnaJ、clpX启动子片段的扩增:

以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,利用Primer Premier 5.0软件设计相应引物后(针对clpX、dnaK、dnaJ、groE启动子序列)，在上游、下游引物的5’端分别加上BamHⅠ酶切位点：GGATCC。此外，由于许多限制性内切核酸酶难以切割靠近DNA分子末端的识别序列，为了解决这一问题，应当在寡核苷酸引物的5’端设计额外的保护碱基(如CGC)，引物序列如表1所示。

表1重组质粒构建和验证所需引物

PCR反应体系以Super PCR Mix说明书为参考(表2)：

表2 PCR反应体系

PCR程序中的退火温度可根据扩增状况来调整，若杂带较多则提高退火温度，若目的条带难以扩增则降低退火温度。延伸时间与目的基因的片段大小有关，正常的扩增速度为 1Kb/min。

表3 PCR反应程序

Staphylococcus aureus RN4220琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物：

(1)配制0.8％的琼脂糖凝胶，称取0.8g琼脂糖，与100ml 1×TAE电泳缓冲液混合后于微波炉加热直至琼脂糖完全融化，直到获得清亮透明的溶液。

(2)于室温下冷却至50℃左右，按1：1000的比例加入核酸染料混匀，浇入模具内并插上合适的梳子，然后等待其凝结。梳齿底部的位置应当距离托盘面0.5-1mm，若梳齿太接近托盘面，在拔出梳子时容易破坏凝胶的点样孔，造成样品泄露。

(3)待胶凝固后，放置到装有1×TAE电泳缓冲的电泳槽中，用移液枪将PCR产物和DNA marker分别点到胶孔中。关上电泳槽盖，接好电极插头，120V电压下进行电泳。

配胶所用的电泳液与电泳槽中放置的电泳液尽量为同一批次，因为即使是很小的离子强度改变都有可能导致凝胶性能异常，影响DNA的迁移速率。

(4)将电泳完成后的琼脂糖凝胶放入成像仪内，在300nm的紫外灯下观察并拍照。

PCR产物纯化：

(1)使用凝胶成像仪观察琼脂糖凝胶，将含有目的条带的胶块用干净的刀片切下，切去边缘，使胶块体积尽可能小。随后，称量胶块重量，并将胶块转移到1.5ml EP管中。

(2)每100mg的胶块加入300μl Binding bufferⅡ,在50-60℃的水浴锅中孵育10min, 期间不断轻柔地晃动EP管，直至胶块融化。

(3)将收集管放置到2ml的EP管中，将上一步得到的混合液转移到收集管中，在室温下静置2min，12000rpm离心1min,弃去EP管中的废液。

(4)加入500μl Wash Solution到收集管中,12000rpm离心1min,弃去EP管中的废液。

(5)重复步骤(4)。

(6)将收集管放回EP管中，12000rpm离心1min以除去残留的Wash Solution。

(7)将收集管放置在新的1.5ml EP管中，向滤膜上加入30-40μl无菌超纯水，50℃水浴中孵育10min,12000rpm离心1min即可得到目的DNA溶液。

启动子与T载体的连接：

构建中间载体是为了使启动子序列酶切完全。采用pMD^TM19-T Vector CloningKit，连接体系如下(10μl)：

表4.连接体系

将以上连接体系轻弹混匀，放置于4℃冰箱中过夜。

大肠杆菌感受态细胞的制作：

(1)接种10μl甘油管菌体到新鲜的3ml LB试管中，37℃过夜培养。

(2)按1％-5％的比例将活化后的菌体接种于新鲜的100ml LB培养基中，37℃、150r 转速震荡培养至OD值为0.3-0.6,然后置于冰上至少30min，终止细菌的快速生长,此步骤是感受态制作成功的关键，不可省略。

(3)将菌液转移至50ml无菌EP管中，使用4℃低温离心机5000rpm离心10min,弃上清。

(4)加入5ml预冷的感受态缓冲液,用枪头轻柔地重悬菌体，冰浴10min。

(5)使用4℃低温离心机5000rpm离心10min,弃上清。加入1ml预冷的感受态缓冲液，用枪头轻柔地重悬菌体，随后按每管100μl的体积分装于无菌EP管中，冻存在-80℃冰箱中备用。

(6)检测：取10μl感受态菌液，接种到3ml含有AMP的新鲜LB培养基中，37℃过夜培养。若第二天培养基未见菌体生长，则说明感受态未染菌，可以正常使用。若培养基变浑浊，则这批感受态应该弃之不用，重新制作。

转化(热击法)：

(1)将含有100ml LB琼脂培养基的锥形瓶放置于微波炉中加热至完全融化，在室温下冷却至60℃左右，向培养基中加入100μl氨苄青霉素(100mg/ml)。轻轻摇动锥形瓶，注意不要有气泡，然后倾倒在灭菌培养皿中制成氨苄青霉素抗性平板。

(2)将冰盒中装满冰，放置于-80℃冰箱旁边。从冰箱中取出保存的感受态细胞，并利用手掌的温度使其快速解冻。当感受态刚刚融化时，立即插入冰中。

(3)将10μl启动子与T载体连接反应完成后的反应体系加入到100μl感受态细胞中，轻弹EP管混匀，冰浴30min。

(4)冰浴后的混合液于42℃水浴锅中热击90s，此步骤的温度和时间都非常关键，注意热击时不可晃动EP管。

(5)热击后，迅速将EP管转移至冰上，冰浴5min。

(6)向EP管中加入800μl新鲜的不含抗生素的LB培养基，37℃条件下150r恢复培养1h。随后，3000r离心，弃去部分上清液后混匀,取150μl涂布于含有相应抗生素的LB平板上。37℃条件下先正置培养1h,待菌液被培养基吸收完全后，再倒置培养过夜。

阳性克隆的鉴定：

在EP管中加入10μl无菌超纯水，挑取平板上的单克隆在水中混匀。取1μl用作PCR模板进行菌落PCR，剩余9μl用于接种(表5)。

表5 PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物经电泳后得到目的条带，则可进行测序，测序结果利用Bioedit 软件进行序列比对后，即可筛选出正确的阳性克隆，从而制备成功发光报告系统pAmilux-clpX-luxABCDE(SEQ ID NO：1)、pAmilux-dnaJ-luxABCDE(SEQ ID NO：2)、pAmilux-dnaK-luxABCDE(SEQ ID NO：3)、pAmilux-groE-luxABCDE(SEQ ID NO：4)。

表6构建的T质粒

步骤4.发光报告系统的构建

酶切：将质粒pAmilux、PM1、PM2、PM3、PM4用BamHⅠ进行酶切。反应体系如下(表 7)：

表7酶切体系

上述混合液在37℃下孵育1h,随后80℃孵育20min使内切酶失活，失活步骤不可省略，以免内切酶出现星活性。推荐使用PCR仪进行温度控制。

载体去磷酸化：质粒pAmilux经单酶切后，去除5’端的磷酸基团能够抑制质粒DNA发生自连和环化。在体外连接反应中，只有当一个核苷酸含有5’-磷酸基团且另一个带有3’-羟基末端时，才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。因此，利用碱性磷酸酶处理质粒DNA，使其脱去5’-端的磷酸基团，可以有效防止自身环化的发生。反应体系如下(表8)：

表8载体去磷酸化体系

37℃条件下反应1h,随后75℃加热5min使碱性磷酸酶失活。启动子片段无需去磷酸化，载体去磷酸化时间也不宜过长，以免降低连接效率。

DNA纯化：参考试剂盒纯化流程。

连接：将酶切、纯化后的启动子片段和质粒pAmilux用T4连接酶连接，体系如下(表9)：

表9连接体系

将连接体系混匀后，放置于4℃冰箱中过夜连接。

转化及阳性克隆的筛选：由于金黄色葡萄球菌细胞壁很厚，质粒的转化操作较为困难，所以要先将连接产物用热击法转化进E.coli DH5α中，便于阳性克隆的筛选。然后从BamHⅠ位点两侧设计引物(LuxF,LuxR)，以便进行片段插入方向的验证。

金黄色葡萄球菌电转化感受态的制备：

金黄色葡萄球菌感受态全程要在常温下制备。

(1)取过夜生长的S.aureus RN4220，按2％的比例接种到新鲜的100ml NYE液体培养基中，37℃、150r振荡培养至OD为0.2-0.3。

(2)将菌体收集至50ml无菌EP管中，5000rpm离心10min。

(3)弃去上清液，加入25ml无菌超纯水，用枪头轻轻吹打使菌体重悬，5000rpm离心十分钟。

(4)弃去上清液，加入10ml无菌超纯水，重悬菌体，5000rpm离心10min。

(5)弃去上清液，加入5ml 10％甘油，重悬菌体，5000rpm离心10min。

(6)重复步骤(5)。

(7)向菌体中加入1ml 10％的甘油，重悬，按每管70μl的体积分装到无菌EP管中，-80℃保存备用。

制作电转化感受态的过程中，必须用去离子水充分洗涤菌体，以去除培养基中所含的盐离子，防止电击时爆杯。

金黄色葡萄球菌电转化：

(1)将含有100ml NYE琼脂培养基的锥形瓶放置于微波炉中加热至完全融化，在室温下冷却至60℃左右，向培养基中加入100μl氯霉素(10mg/ml)。轻轻摇动锥形瓶，注意不要有气泡，然后倾倒在灭菌培养皿中制成氯霉素抗性平板。

(2)从-80℃冰箱中取出适当数量的冷冻感受态细胞置于常温，待其刚刚解冻时，向其中加入10μl pAmilux-clpX-luxABCDE质粒，或pAmilux-groE-luxABCDE质粒，或pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒，或pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒，轻弹EP管壁混匀，在常温下孵育30min。有文献报道孵育时间以30min为佳，超过或不足30min将会降低转化效率。

(3)将混合液转移到2mm电转杯中，最好是将移液器吸头沿着电转杯壁插入，将细胞加到槽的一端，并在平整的桌面上轻叩电转杯，以震出液体里含有的气泡。随后将电转杯盖上盖子装入电转仪中，选择预设程序：StA，按下Pulse键，听到蜂鸣声后迅速将电转杯拿出，在30s之内向电转杯中加入800μl新鲜的NYE培养基。

感受态细胞与DNA的混合液中含有的离子会增加溶液的电导率，导致电弧的产生，这时电转杯会发生爆裂，极大降低电转化的效率。若出现这种情况，要考虑感受态细胞制作时是否洗涤不完全，或是溶解质粒DNA的溶液中是否含有某些离子，应逐一排查并解决。

(4)将液体转移到无菌EP管中，37℃条件下100r恢复培养1.5h。电击后细菌菌体非常脆弱，不可剧烈振摇。

(5)将复苏后的菌液3000rpm离心5min，弃去部分上清，剩余的450μl上清液与菌体重悬后用来涂板，每板涂布150μl。37℃正置培养1h，待菌液吸收后倒置培养24-48h，方能出现肉眼可见的菌落。不建议将离心浓缩后的细菌悬液全部涂到一个平板上，因为电转化会产生大量死细胞，这些细胞附着在培养基表面可能会抑制本就稀少的转化子生长。

实施例1的实验过程如图1所示。

上述四种质粒pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中得到的四株金黄色葡萄球菌lux报告株分别命名为：报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4。含有pAmilux空质粒的菌株命名为：菌株S0。

实施例2发光报告系统对抗生素的响应

实验菌株：实验所用菌株为的四株金黄色葡萄球菌lux报告株：S1、S2、S3、S4，以及含有pAmilux空质粒的菌株S0。

实验所需培养基及其配制

1.NYE琼脂培养基

2.0.7％琼脂：用天平称取0.7g琼脂加入到锥形瓶中，再加入100ml去离子水，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min备用。

实验所需抗生素及其配制

1.达托霉素(DAP)溶液：取30mg达托霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

2.多粘菌素B(PMB)溶液：取100mg多粘菌素B溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

3.亚胺培南(IPM)溶液：取10mg亚胺培南溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

4.青霉素G(PEN)溶液：取10mg青霉素G溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

5.万古霉素(VAN)溶液：取30mg万古霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

6.红霉素(ERY)溶液：取15mg红霉素溶解于1ml无水乙醇中，使其终浓度为30mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

7.卡那霉素(KAN)溶液：取30mg卡那霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

8.壮观霉素(SPE)溶液：取100mg壮观霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

9.链霉素(STR)溶液：取10mg链霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

10.四环素(TET)溶液：取30mg四环素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为30mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

11.丝裂霉素C(MMC)溶液：取5mg丝裂霉素C溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

12.环丙沙星(CIP)溶液：取5mg环丙沙星溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

13.加替沙星(GAT)溶液：取5mg加替沙星溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌；

14.甲氧苄啶(TMP)溶液：取5mg甲氧苄啶于500ml超纯水中，缓慢滴加稀盐酸，直至全部溶解，用超纯水定容至1ml，使其终浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

15.利福平(RIF)溶液：取10mg利福平溶解于1ml DMSO中，使其终浓度为10mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；

16.腐草霉素(PHL)溶液：取5mg腐草霉素溶解于1ml超纯水中，使其终浓度为5mg/ml， 0.22μm滤膜过滤除菌。

实验所需仪器：超净工作台(江苏净化实验设备厂)、电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、Lumazone PyLoN 2048B植物活体成像系统(博益伟业仪器有限公司)。

实验步骤

步骤1、平板制备

1.将菌株S0、报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4在NYE平板上划线，37℃过夜培养，然后用封口膜包好，放入4℃冰箱备用。

2.取新华1号定性滤纸，用打孔器打成直径6mm的圆形小纸片，放置在玻璃培养皿中，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min，在烘箱中烘干备用。

3.将NYE琼脂培养基用微波炉加热至琼脂完全融化后，放置于室温冷却至60℃左右，倾倒平板，每块板的厚度尽量均匀一致。

4.挑取菌株S0、或报告菌株S1、或报告菌株S2、或报告菌株S3、或报告菌株S4单菌落溶解于200μl无菌超纯水中，然后按1：1000的比例将菌悬液加入0.7％的琼脂中，混匀后倾倒在NYE平板的上层，相应制成含有菌株S0、报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4的双层平板各16个。

5.待双层平板凝固后，将镊子在火焰上灼烧一下，冷却后夹取滤纸片轻轻贴在培养基表面。为了使纸片与培养基紧密相贴，可用镊子轻轻按压纸片。为了能够准确的观察结果，纸片在培养基表面的位置应当有序分布。

6.培养基在冷却的过程中，表面可能出现冷凝水滴。为防止冷凝水将药物冲散影响抑菌圈的形状，纸片加药前可先将培养基的盖子打开，利用超净台内的无菌空气蒸发掉多余水分。

7.在所制备的含有菌株S0的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是CIP，DAP，ERY，GAT，IPM，KAN，MMC，PEN，PHL，PMB，RIF，SPE，STR，TET， TMP，或VAN，按每一个平板1μl分别滴加。

8.在所制备的含有菌株S1的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是CIP，DAP，ERY，GAT，IPM，KAN，MMC，PEN，PHL，PMB，RIF，SPE，STR，TET， TMP，或VAN，按每一个平板1μl分别滴加。

9.在所制备的含有菌株S2的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是CIP，DAP，ERY，GAT，IPM，KAN，MMC，PEN，PHL，PMB，RIF，SPE，STR，TET， TMP，或VAN，按每一个平板1μl分别滴加。

10.在所制备的含有菌株S3的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是CIP，DAP，ERY，GAT，IPM，KAN，MMC，PEN，PHL，PMB，RIF，SPE，STR，TET， TMP，或VAN，按每一个平板1μl分别滴加。

11.在所制备的含有菌株S4的双层平板(共16个)中，用移液枪取1μl抗生素溶液滴加到各个平板中预置的滤纸片上，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20h。其中，所述抗生素是CIP，DAP，ERY，GAT，IPM，KAN，MMC，PEN，PHL，PMB，RIF，SPE，STR，TET， TMP，或VAN，按每一个平板1μl分别滴加。

步骤2.平板成像

Lumazone成像系统由三部分组成，分别是CCD相机、暗箱和光源。具体操作步骤如下：

1.打开CCD相机电源开关、暗箱开关、电源开关，打开电脑和软件。

2.打开液氮开关，此时开始向CCD相机中加注液氮，大约2h后温度即可降至-110℃。

3.将需要成像的培养皿放置于暗箱中，打开软件的“Acquire”选项，选择“明场”，曝光时间为100ms,采样频率为1MHz,然后单击“Acquire”获取明场图像，保存为TIF格式。

4.获取生物发光图像时，打开软件的“Acquire”选项，选择“Luc”，曝光时间为10min,采样频率为50KHz,然后单击“Acquire”获取图像，保存为TIF格式。

5.使用完毕后，首先关闭分析软件，然后关闭暗箱电源和光源电源。注意：CCD相机的电源不可马上关闭，要等24h后CCD相机的温度升到室温后再关闭。

发光报告系统对抗生素的发光响应如图2所示。

步骤3.抗生素筛选发现

使用四种报告菌株S1、S2、S3、S4检测同一种溶液。如果有一种或者多种菌株产生生物发光，则确定被检测物含有抗生素。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种发光报告系统及其在抗生素发现筛选中的应用

<141> 2019-6-11

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12432

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pAmilux-clpX-luxABCDE质粒序列

<400> 1

aattcgacgc tgcaggatat caactatcaa acgcttcggt taagcttaaa gcacaccctt 60

tctgcgtcct cgtattgacg cgacgtaaaa tttcaacgag cacgccggga tacttaccat 120

attctctgct aattatcccg acatcatcgg taacaataaa tgctggataa ctggttgctg 180

acgcatccat ataactcatc aaccccggcg ttccatcagg tacaggtttc aacgtttcag 240

gatcaagcgc tcgcgcatat acccacggcg gaacatgttt acgctgcatt tcatcctcaa 300

agaaacaagt gttgagttca acttgattaa atatatctcg gatctgacta atatcactga 360

gattgaaagt atcaaataaa agatgattga aatcatcacg tttcagagat tctttttcgt 420

aacttttcca gccgcctccg gttatgatat aaaggctttt atctccagaa aatgagattt 480

ttttatcttt catataatgg cagagtaaat aaataaagta tggcgaacca ataagacaaa 540

gatctttccc ttgatttttt attcgttcaa gactattcaa tgttttaaca aaatctattc 600

gttcttctgt tacggtaaat gtcgtaggat ataacaattc caccaaactc ataacatatt 660

taaaccaaat attatgagca ttaaatctat ctggtcccaa attgactaat tctatttgat 720

gatcaaacca actaccaaca tatttcatgc cataactcac agagcctaag agtctctcaa 780

tacttaatct gtcacgcgcc acctgacttt ttaaaccatt cgtgccgcta ctggtaaacc 840

aactttcaat ctcgttttcc tgagaagtta ataagcgagt aaacttaaaa accgatgttg 900

ggaatacagg tatgtcatca atttccgtaa tattgtcatc tactttgtgt gcctgacagt 960

agtgacgata ttctcgacaa tgtttataat gattacgaaa tgcatcaagc acaagtttct 1020

ttctgatttt ttcctgctcg tcgtaagacc acactaatgg atcgctcgaa aaaatcaaat 1080

catcaatttc tgagcttgct gtaatttctt gtttatcaac atatgaagtc atacctgttt 1140

tcctcctcaa gatcctttaa gacagagaaa ttgcttgatt ttcaatctca attctcattc 1200

ggcgttcatt gactgtcgca atagttaaat gttcaaatga cggttcagta atatcaacat 1260

caatatccag atgatcatta tccatcgcga tagcggcttt cgtaaccgat tgataaaaat 1320

tgcgcaggac cactaaattt tcactcaagt catgcgaact tcctaacaaa gaatatatct 1380

tgcatcgatt actacgaata tttgataaca atgtgataac ttcatcttgc ttgacccaat 1440

tatcgttatt tgcagtaaaa gcaataaacg gtatatcaag atacatcatg ttattaattg 1500

tagaagctaa atcttcccaa ccaaaatcaa gacaatctct cgcaaagact tcagcaccca 1560

atttatggcc ttcaaaatct agattatccg gcaattcatt aatgggtaga ctgagataat 1620

caaaccctaa agctctttca agagaatatc ttaagttaac aacaccgact gcggtgatta 1680

aaaacgaagc attgatttca gataggcttg cataagctat ccgcgcagat aagcttgaag 1740

ccaacatacc gaagttattt atttttcgtg tagttaacca atcaaccact gctaacaagc 1800

tctgctttcc tatagacatt gtaaattcat caattgtccc tgaactcaat ccaacgtggt 1860

gaagcgaatc atagcggatc acatgaaatc cattccgcga taaatattcc gccagaccag 1920

caaaatgatc catcctgcgg gcaaaaccag acgcaataat aatggcattc tttctctttg 1980

ggctgttttc ttctggcagc gtttcccaaa catgaatttt tttatttcct tcaacacaaa 2040

taacgtggtc gatggtttta tattttgatt cattttccat acttttacct attatgggac 2100

aaatacaagg aacttatctt cttccaggaa tcgagtctgt tctatttcaa ccgcaacatc 2160

cttagccgta tagttagatg gcctttcatg agaaatatat gtcactaatc gttgcaacgg 2220

tctcattccg tcatgagatc caccaactcg aaatatgtta ttcattcctg cttctacaat 2280

cctttccgca ccttttaatg ctaacgcatc tcgatattta aatgatgact cccaaggaaa 2340

aatagatatg gtttgcgtct tatttttttg aacataaggc aatatttgct caatattatc 2400

gacgtgatga aggtacacac atctgccaag tggttgatta aattccacac ctgcatttga 2460

ctcaataatc atccaacgtt gatgaatatc cacctctact tttaatccag caaacaagct 2520

ttctttttga actaaagaat aggccgcctt ttcatcaaaa tcttttttgg cattcggtaa 2580

tatatgcgca tatagattaa gtttttctat caacgctaac ttaaattcct cataatgatt 2640

tcccatgtaa tatatgtttt gggcagaaaa acaagctcgc tgatcgtaaa aacaaacatc 2700

atgagccgca cctgtcgctg cggacgtcaa atcaacagga ttatcgataa tgcaaagact 2760

ctttttagaa ccaaatttaa tcacatcagc ataagatggc gcatgctcta ccgcccaatt 2820

aatcgcatct ggccctcccc aagcgacaat aacatccgca tgtcgcataa tttcttttgc 2880

gagtgatgta tcaccttggt ggggccaata tataacagat aaagagcgcg ttatcggatg 2940

attagggtct acatcaataa aacttaacgc taatgcatta gcggtaaaag gatcggttga 3000

cgatgttttt ataatacact gattcttagt taaaattgcg cgtaatatag acatgatccc 3060

agataatgga acattacctg ccaacagatg tacagattta cctttcggaa aagcccgaac 3120

ataactttca tcctgaggta gccattcatc catgatatgg cgagaaccaa gttcattttc 3180

tacaacatca taaaggccgc ctttagaaca taaaatcata gatatccaat tggcctctag 3240

cttagccatt tcttctgaat atcccatata tttttttaag tcacgaatgt atgtcctgcg 3300

tcttgagtat tcttcatttt tccatctttg ccctaccgta tagagaaaat tgacaatgtt 3360

atgcaaccgt aattcgttat ttccattaca atcaataatg ttttttacat gagagtcatt 3420

caatattggc aggtaaacac tattatcacc aaaattaatg gattgcacta aatcatcact 3480

ttcgggaaag atttcaacct ggccgttaat aatgaatgaa atttttttag tcatatttgc 3540

cttcctcctg gtaccccatt atatcacatt atccattaaa aagcaaacaa attttcggta 3600

cctattaggt atattccatg tggtacttct taatattatc atcaacaata ttgattacat 3660

ttttttggct catcaaatca ttcattggtt caaaggacag caatacactt ttcgcaccac 3720

acttttcaat tgccaactta gccgcagtta tacactccgt ataatttccg acagcgtttt 3780

ctgcaattat ttcttcaagt ttattttcga aattttcatt agggtgcatt tcaagaacat 3840

aatcactaat aaatgcacgc gtctcttgtt tagctttatt actatcttcg ttatagttaa 3900

ctaatatcat taactgatgg tctatctctg ataggtcaac gtcatattta tccgcaacgg 3960

ctttatatct ttcagcatat tcatatctaa catcattaga atcatcccac ttaaagatga 4020

gaggaatacc ttttttggcc gcccactcaa caatatgatg actggttgct gttacatatt 4080

tccgaggtcc gcctggcgta taagcatggg gatttacaga tattttaggg aagctataaa 4140

aatcgttatc tggattacaa tagcctgttg ttaaagcatc gttaatgatt tcataacact 4200

cttcaaatag ttgctgttga tattcaaccg ggcgattaaa aaaatgcatt tcatcttttt 4260

tttcgcaatc actaaaccct aaaataaatc tcccttcact taactgatcc aataagcaag 4320

cttcctccgc tatggcgaca ggatgatgag ttgtaatgat gtgatttaat gaaccaattt 4380

taattttctc tgttaaaccg agcagaaaac cagaaacagt cagaggagcg ccgacaacac 4440

cattatctga aaaatgattt tcatacacta aaatctgttc aaaattcaac ttatcaacat 4500

actccgttat ttcctgcatg cgaactatac tttgttcttg aacagttgtt gaattgatga 4560

agttaaggaa gaacaatcca aatttcattt ctttctcctt agctaatata atagcgaacg 4620

ttgtttttct ttaagaaatg gcatgacatc agactggaag agcttcatgg aagcaataat 4680

ttcgtctact gttccattag cttcaaatcc acaacaaata tttgatattc ctgtagcatc 4740

aatgtctttt tgaattatgt caatacattc ctgcggcgtt cccacgggat tgatttcgta 4800

actgtaatca atacggcgat tagtatcttt atgtcctttt aatacaaagt cacgccactg 4860

ccctttattg aaatcataac ctcttgtttg gtctgaatca tcaaaaatag tcgtagcatt 4920

cacataagaa tcataccaat gccccagaaa tttccggcaa atctctttcg ctttaattga 4980

gtcatgatct acagatgtta tatatgataa gcaatggtcg atattatgaa tatcgtgccc 5040

atattcttga gccacttcat tataaagctc aagttgtgct ttcttttcgt tagtatttat 5100

aatccaactt aatatcatcg gtaggccaaa ttgagcagcc cactcagtcg tcgaagctga 5160

ttcagccacc acataaaccg gtgcgccacc tctgctatac gccgcggggt ttacttttac 5220

cttatggaac ttgatatgtt cattatcagc ttccatatat ccctctgtca tgccattctt 5280

tatcagcccg taccagcatt ccgctaaggc gcgactgtta ttcatatctg tgccgaatac 5340

gcgaaagtcc ttgttgtaaa gccctcggca aataccaaac cgaaatcgtc cttttgacat 5400

ttgatccaat aaattcacat cttcaagttg gcgtactgga tgggctgtgg gaagaacaat 5460

agcggcagtt cctacattca attttttagt cgcgccaagt aaatatgcag cagcgacata 5520

agggttacca agcaaaccaa actccgtgaa atgatgctcc agtaaccata cggtatcaaa 5580

accacactcc tcagagatgc gacctaattt aaccaaacgt ttcattacct ctgtttgaga 5640

aaattgggga ggttggtatg taagcaaaaa gtttccaaat ttcatagaga gtcctcctgt 5700

cgacggatcc acaacaaggt ttagatttac aaacgtactt ccaaatctca ggtcaagatg 5760

aaactcaatt aagagagcaa atgaaagacg atgcagaaca acgtgttaaa actaacttaa 5820

ctttaactgc gatcgctgaa gctgaaaaaa tcgaagctac tgatgaagat atcgataaag 5880

aattagaaaa aatgagtaaa caatttaata tctcagttga agatatcaaa aatactttag 5940

gtaatactga tatcattaaa aatgatgttc gtatccaaaa agttatcgat ttattaagag 6000

ataacgcaaa gttcgttgaa ggaactaaag aagattaatc ttcattaaat attaaattac 6060

aaaaatgagt agcagatgca tagcttatgt atctgctact attctttaag caaaaagttt 6120

gtatgttaat atgttgcatt gtaacatcca atctagtata gtctttaacg aataggggtg 6180

taaaaagaat gtttaaattc aatgaagatg aagaaaattt gaaatgctct ttctgcggaa 6240

aagaccaaga tcaagtaaaa aaacttgtag caggaagtgg tgtatatatt tgtaatgagt 6300

gtattgaatt atgctcagaa atcgtcgaag aagaattagc tcaaaacact tctgaagcga 6360

tgacagaatt acctactcct aaagaaatta tggatcattt aaacgaatat gttattggtc 6420

aagaaaaagc taaaaaatct ttagctgtag ctgtttataa ccactataag cgtattcaac 6480

aattaggacc aaaagaagat gatgttgaat tacaaaaaag taacattgca ttaattgggc 6540

caacaggtag tggtaaaaca tggatccccg ggaattcctg gcagtttatg gcgggcgtcc 6600

tgcccgccac cctccgggcc gttgcttcgc aacgttcaaa tccgctcccg gcggatttgt 6660

cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga 6720

ctgagccttt cgttttattt gatgcctggg gaattcttga agacgaaagg gcctcgtgat 6780

acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt cttcaactaa 6840

agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg gatattttta aaatatatat 6900

ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa 6960

gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg catatcaaat gaactttaat 7020

aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta atcattattt gaaccaacaa 7080

acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa 7140

gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat 7200

acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag 7260

ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta 7320

aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt 7380

tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt 7440

ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta 7500

cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct 7560

ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt 7620

caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta 7680

ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta 7740

tattacagct ccagatccat atccttcaga tccctagata attcttctga taatttagtt 7800

tttgttagag tttaacataa ctgatgatta tcagaagttt ctttaatata aataaaagca 7860

ctataagcga cttaacttat agtgcttatt taatatattt tttcaaacaa tcattagcca 7920

ccaaacaaac gactccagaa gcctttttta gtttgggttt cttctatagc aatatcttta 7980

tcattttgat taaatgaatc atcttgttgt tgtgattttt catcttgttg actctcagat 8040

atatctttag gttgaacctc tggtttcttt tcttctttct gatattgatc agtatttaca 8100

gaatccgaag tatatgatgc ttcttgtaca tcaaagtttt ctcgatcatt agtagattta 8160

tcaaaggaat aacttaattg tctctcttcc tctaattgat gttccaattt ttgaattttt 8220

ttattgcttt ctaaagctaa aatttgttga ttctctaata atttatttaa tgtattaaca 8280

ttgctatttt gttggtctag ttgtttagtt aaattctcaa tatacttttc atcattttta 8340

gctctagttt caaagatttc tacctgcttt tctaattcgt ttacttttgt ttttaatgtc 8400

tcaaagccat ctgaattatt atatctattc ttttcagtgt tttcataagt tatttctgat 8460

tttttatttt ctttattttg agttgttctt tctttcttag tgattttttc tactattttc 8520

aaataatcat tatcatcaat ataattcact ccattttctt tttcaaaaga tatattcaaa 8580

tttttagcat tattaacaac agtttgttta gttacattca attcatcagc aaccattttt 8640

atagttttca tatcatccac ccttaggcac ctaatttact acctaatttt accacctaac 8700

aatttttctt tcatcttttt taccgcctaa atatatcatt tttactacct aagtacctaa 8760

tttactacct aattagccac taaaataata aattttgttg ttttaaggtc ataacatgat 8820

tctgatctgt acttaaaacg ctttatatac acctttaaaa atgttaatat tatcttatga 8880

attttaaaaa gccaatgcta ttggcgtagc atcggctctg gtaattaaaa cgatttgcgt 8940

tcgtttattt atatattttt ttgatacttg tattatatat atctactcgt ctaagtgcaa 9000

gcacaaaaca tataacttac gtaaaaattg ttttattacc tcaactctaa gtaaaaggaa 9060

atgaggtttt ttattatgtc taaatttaaa aaaatatctg caagtgaatt cgaaacatta 9120

cgtttttatc aattacccaa atttttattt gaagatgaat acttttctaa aatgcccaca 9180

gatgcaaaag ttatgtatgc tttattaaaa gatcgctttg aactatcaag attaaataac 9240

tgggtagatt cagaaaataa tatttatctt ttatatacca ataaacagtt atgctcaatt 9300

ttaaattatg cagaaccaaa aatcattaaa ttaaaaaaag aattagaaaa atacaatttg 9360

attataaacg aaagacaagg tttaaataaa cctaacaaaa tttatttact cgaacccaca 9420

tatgacaagg aactaataaa ttctaagttc cagaacaaag aatttattag ttccagaact 9480

aataaatcat cagttcaaga actaataaat tctaagtcaa gtgatactga ttttaataat 9540

actgaatata tagagactaa gaataatgat acgaattata cgaatgatac atctaacatg 9600

atttctaaga attctcattc gaatcataca aatcatcaac aaaccgaatt taataatgat 9660

gccttaaaat tccaggcgct tgaagaatta ccttcgcaaa tcaaatctta tgtaagtaat 9720

tttgaaatta aagacatccg tattattaaa agtatcttac tcaaggggaa aaagtcattt 9780

aataatacac atgatacata ttaccgttta gaagacgtcg aatttgaact tgtaagtgtt 9840

ttaaaacgtt ttaaagccat gttgctacaa aaaaatgaaa ccgttgaaac tatgcaaggc 9900

tatttaatgc aatcaattaa agctgaactt gaagaaatac atgcattaaa tatgcgtcgt 9960

caaaacatac ctcaatacaa tatctttaat caataactca aataatctta caacaatcaa 10020

aacaacatca aaatttggaa ttaagtcaac agaaaaggat ctccccaggt ggcacttttc 10080

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 10140

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 10200

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 10260

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 10320

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 10380

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg 10440

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 10500

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 10560

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 10620

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 10680

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 10740

cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 10800

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 10860

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 10920

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 10980

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 11040

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 11100

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 11160

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 11220

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 11280

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 11340

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 11400

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 11460

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 11520

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 11580

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc 11640

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 11700

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 11760

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 11820

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 11880

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 11940

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 12000

gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 12060

ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct 12120

acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 12180

ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 12240

gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg caggggttaa aattccttca 12300

ttacactctt ggcggtttca cttatcaact tatcatttgg cttatcactt ttattgtctt 12360

tattcgtaaa aatgactaaa acaataggtt cagattggcc cttaggataa acaaaagcaa 12420

catcatttct ag 12432

<210> 2

<211> 12421

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒序列

<400> 2

aattcgacgc tgcaggatat caactatcaa acgcttcggt taagcttaaa gcacaccctt 60

tctgcgtcct cgtattgacg cgacgtaaaa tttcaacgag cacgccggga tacttaccat 120

attctctgct aattatcccg acatcatcgg taacaataaa tgctggataa ctggttgctg 180

acgcatccat ataactcatc aaccccggcg ttccatcagg tacaggtttc aacgtttcag 240

gatcaagcgc tcgcgcatat acccacggcg gaacatgttt acgctgcatt tcatcctcaa 300

agaaacaagt gttgagttca acttgattaa atatatctcg gatctgacta atatcactga 360

gattgaaagt atcaaataaa agatgattga aatcatcacg tttcagagat tctttttcgt 420

aacttttcca gccgcctccg gttatgatat aaaggctttt atctccagaa aatgagattt 480

ttttatcttt catataatgg cagagtaaat aaataaagta tggcgaacca ataagacaaa 540

gatctttccc ttgatttttt attcgttcaa gactattcaa tgttttaaca aaatctattc 600

gttcttctgt tacggtaaat gtcgtaggat ataacaattc caccaaactc ataacatatt 660

taaaccaaat attatgagca ttaaatctat ctggtcccaa attgactaat tctatttgat 720

gatcaaacca actaccaaca tatttcatgc cataactcac agagcctaag agtctctcaa 780

tacttaatct gtcacgcgcc acctgacttt ttaaaccatt cgtgccgcta ctggtaaacc 840

aactttcaat ctcgttttcc tgagaagtta ataagcgagt aaacttaaaa accgatgttg 900

ggaatacagg tatgtcatca atttccgtaa tattgtcatc tactttgtgt gcctgacagt 960

agtgacgata ttctcgacaa tgtttataat gattacgaaa tgcatcaagc acaagtttct 1020

ttctgatttt ttcctgctcg tcgtaagacc acactaatgg atcgctcgaa aaaatcaaat 1080

catcaatttc tgagcttgct gtaatttctt gtttatcaac atatgaagtc atacctgttt 1140

tcctcctcaa gatcctttaa gacagagaaa ttgcttgatt ttcaatctca attctcattc 1200

ggcgttcatt gactgtcgca atagttaaat gttcaaatga cggttcagta atatcaacat 1260

caatatccag atgatcatta tccatcgcga tagcggcttt cgtaaccgat tgataaaaat 1320

tgcgcaggac cactaaattt tcactcaagt catgcgaact tcctaacaaa gaatatatct 1380

tgcatcgatt actacgaata tttgataaca atgtgataac ttcatcttgc ttgacccaat 1440

tatcgttatt tgcagtaaaa gcaataaacg gtatatcaag atacatcatg ttattaattg 1500

tagaagctaa atcttcccaa ccaaaatcaa gacaatctct cgcaaagact tcagcaccca 1560

atttatggcc ttcaaaatct agattatccg gcaattcatt aatgggtaga ctgagataat 1620

caaaccctaa agctctttca agagaatatc ttaagttaac aacaccgact gcggtgatta 1680

aaaacgaagc attgatttca gataggcttg cataagctat ccgcgcagat aagcttgaag 1740

ccaacatacc gaagttattt atttttcgtg tagttaacca atcaaccact gctaacaagc 1800

tctgctttcc tatagacatt gtaaattcat caattgtccc tgaactcaat ccaacgtggt 1860

gaagcgaatc atagcggatc acatgaaatc cattccgcga taaatattcc gccagaccag 1920

caaaatgatc catcctgcgg gcaaaaccag acgcaataat aatggcattc tttctctttg 1980

ggctgttttc ttctggcagc gtttcccaaa catgaatttt tttatttcct tcaacacaaa 2040

taacgtggtc gatggtttta tattttgatt cattttccat acttttacct attatgggac 2100

aaatacaagg aacttatctt cttccaggaa tcgagtctgt tctatttcaa ccgcaacatc 2160

cttagccgta tagttagatg gcctttcatg agaaatatat gtcactaatc gttgcaacgg 2220

tctcattccg tcatgagatc caccaactcg aaatatgtta ttcattcctg cttctacaat 2280

cctttccgca ccttttaatg ctaacgcatc tcgatattta aatgatgact cccaaggaaa 2340

aatagatatg gtttgcgtct tatttttttg aacataaggc aatatttgct caatattatc 2400

gacgtgatga aggtacacac atctgccaag tggttgatta aattccacac ctgcatttga 2460

ctcaataatc atccaacgtt gatgaatatc cacctctact tttaatccag caaacaagct 2520

ttctttttga actaaagaat aggccgcctt ttcatcaaaa tcttttttgg cattcggtaa 2580

tatatgcgca tatagattaa gtttttctat caacgctaac ttaaattcct cataatgatt 2640

tcccatgtaa tatatgtttt gggcagaaaa acaagctcgc tgatcgtaaa aacaaacatc 2700

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gagtgatgta tcaccttggt ggggccaata tataacagat aaagagcgcg ttatcggatg 2940

attagggtct acatcaataa aacttaacgc taatgcatta gcggtaaaag gatcggttga 3000

cgatgttttt ataatacact gattcttagt taaaattgcg cgtaatatag acatgatccc 3060

agataatgga acattacctg ccaacagatg tacagattta cctttcggaa aagcccgaac 3120

ataactttca tcctgaggta gccattcatc catgatatgg cgagaaccaa gttcattttc 3180

tacaacatca taaaggccgc ctttagaaca taaaatcata gatatccaat tggcctctag 3240

cttagccatt tcttctgaat atcccatata tttttttaag tcacgaatgt atgtcctgcg 3300

tcttgagtat tcttcatttt tccatctttg ccctaccgta tagagaaaat tgacaatgtt 3360

atgcaaccgt aattcgttat ttccattaca atcaataatg ttttttacat gagagtcatt 3420

caatattggc aggtaaacac tattatcacc aaaattaatg gattgcacta aatcatcact 3480

ttcgggaaag atttcaacct ggccgttaat aatgaatgaa atttttttag tcatatttgc 3540

cttcctcctg gtaccccatt atatcacatt atccattaaa aagcaaacaa attttcggta 3600

cctattaggt atattccatg tggtacttct taatattatc atcaacaata ttgattacat 3660

ttttttggct catcaaatca ttcattggtt caaaggacag caatacactt ttcgcaccac 3720

acttttcaat tgccaactta gccgcagtta tacactccgt ataatttccg acagcgtttt 3780

ctgcaattat ttcttcaagt ttattttcga aattttcatt agggtgcatt tcaagaacat 3840

aatcactaat aaatgcacgc gtctcttgtt tagctttatt actatcttcg ttatagttaa 3900

ctaatatcat taactgatgg tctatctctg ataggtcaac gtcatattta tccgcaacgg 3960

ctttatatct ttcagcatat tcatatctaa catcattaga atcatcccac ttaaagatga 4020

gaggaatacc ttttttggcc gcccactcaa caatatgatg actggttgct gttacatatt 4080

tccgaggtcc gcctggcgta taagcatggg gatttacaga tattttaggg aagctataaa 4140

aatcgttatc tggattacaa tagcctgttg ttaaagcatc gttaatgatt tcataacact 4200

cttcaaatag ttgctgttga tattcaaccg ggcgattaaa aaaatgcatt tcatcttttt 4260

tttcgcaatc actaaaccct aaaataaatc tcccttcact taactgatcc aataagcaag 4320

cttcctccgc tatggcgaca ggatgatgag ttgtaatgat gtgatttaat gaaccaattt 4380

taattttctc tgttaaaccg agcagaaaac cagaaacagt cagaggagcg ccgacaacac 4440

cattatctga aaaatgattt tcatacacta aaatctgttc aaaattcaac ttatcaacat 4500

actccgttat ttcctgcatg cgaactatac tttgttcttg aacagttgtt gaattgatga 4560

agttaaggaa gaacaatcca aatttcattt ctttctcctt agctaatata atagcgaacg 4620

ttgtttttct ttaagaaatg gcatgacatc agactggaag agcttcatgg aagcaataat 4680

ttcgtctact gttccattag cttcaaatcc acaacaaata tttgatattc ctgtagcatc 4740

aatgtctttt tgaattatgt caatacattc ctgcggcgtt cccacgggat tgatttcgta 4800

actgtaatca atacggcgat tagtatcttt atgtcctttt aatacaaagt cacgccactg 4860

ccctttattg aaatcataac ctcttgtttg gtctgaatca tcaaaaatag tcgtagcatt 4920

cacataagaa tcataccaat gccccagaaa tttccggcaa atctctttcg ctttaattga 4980

gtcatgatct acagatgtta tatatgataa gcaatggtcg atattatgaa tatcgtgccc 5040

atattcttga gccacttcat tataaagctc aagttgtgct ttcttttcgt tagtatttat 5100

aatccaactt aatatcatcg gtaggccaaa ttgagcagcc cactcagtcg tcgaagctga 5160

ttcagccacc acataaaccg gtgcgccacc tctgctatac gccgcggggt ttacttttac 5220

cttatggaac ttgatatgtt cattatcagc ttccatatat ccctctgtca tgccattctt 5280

tatcagcccg taccagcatt ccgctaaggc gcgactgtta ttcatatctg tgccgaatac 5340

gcgaaagtcc ttgttgtaaa gccctcggca aataccaaac cgaaatcgtc cttttgacat 5400

ttgatccaat aaattcacat cttcaagttg gcgtactgga tgggctgtgg gaagaacaat 5460

agcggcagtt cctacattca attttttagt cgcgccaagt aaatatgcag cagcgacata 5520

agggttacca agcaaaccaa actccgtgaa atgatgctcc agtaaccata cggtatcaaa 5580

accacactcc tcagagatgc gacctaattt aaccaaacgt ttcattacct ctgtttgaga 5640

aaattgggga ggttggtatg taagcaaaaa gtttccaaat ttcatagaga gtcctcctgt 5700

cgacggatcc tctttacgga ttgaaatttc ttttgttgta ccaaataccg cttcttcaaa 5760

tgttaatgtc attgtatact gaagatcatc acctttttgc ggtgcatttg gatctctttg 5820

tctgccgcca ccgaagaaag agctaaagat atcttcaaaa ccgccgccac cgaagccact 5880

aaaaccgcca aagtcagagc cattgaatcc ttgtccacca aaaccttgtg gaccatcatg 5940

tccaaattga tcatagcttg cgcgtttatt atcatcactt aaaacttcat aggcttcaga 6000

aatttcttta aacttttcat ctgcaccttc ttctttgtta atatctggat gatatttttt 6060

cgaaagcttt cgatacgctt ttttgatttc atcttttgaa gcatccttac taatgcctaa 6120

aacttcataa taatctcttt tggccacagc tatctctcct tttcttaatt aactcatata 6180

gtttaacgta atatgtcata ctatccaaat aaaaagccaa agccaatgtt ctattgactt 6240

tgacttttca gatcatgaca acattctaat tgtattgttt aattattttt tgtcgtcgtc 6300

ttttacttct ttaaattcag catcttctac agtactatca ttgttttgac cagcattagc 6360

accttgtgct tgttgttgct gttgagccgc ttgctcatat acttttgctg ataattcttg 6420

aatcactttt tcaagttctt cttttttaga tttaatatct tctatatctt gaccttctaa 6480

agcagtttta agagcgtctt ttttctcttc agcagatttt ttatcttctt caccgatatt 6540

ttcgcctaaa ggatccccgg gaattcctgg cagtttatgg cgggcgtcct gcccgccacc 6600

ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg cggatttgtc ctactcagga 6660

gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc 6720

gttttatttg atgcctgggg aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 6780

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc ttcaactaaa gcacccatta 6840

gttcaacaaa cgaaaattgg ataaagtggg atatttttaa aatatatatt tatgttacag 6900

taatattgac ttttaaaaaa ggattgattc taatgaagaa agcagacaag taagcctcct 6960

aaattcactt tagataaaaa tttaggaggc atatcaaatg aactttaata aaattgattt 7020

agacaattgg aagagaaaag agatatttaa tcattatttg aaccaacaaa cgacttttag 7080

tataaccaca gaaattgata ttagtgtttt ataccgaaac ataaaacaag aaggatataa 7140

attttaccct gcatttattt tcttagtgac aagggtgata aactcaaata cagcttttag 7200

aactggttac aatagcgacg gagagttagg ttattgggat aagttagagc cactttatac 7260

aatttttgat ggtgtatcta aaacattctc tggtatttgg actcctgtaa agaatgactt 7320

caaagagttt tatgatttat acctttctga tgtagagaaa tataatggtt cggggaaatt 7380

gtttcccaaa acacctatac ctgaaaatgc tttttctctt tctattattc catggacttc 7440

atttactggg tttaacttaa atatcaataa taatagtaat taccttctac ccattattac 7500

agcaggaaaa ttcattaata aaggtaattc aatatattta ccgctatctt tacaggtaca 7560

tcattctgtt tgtgatggtt atcatgcagg attgtttatg aactctattc aggaattgtc 7620

agataggcct aatgactggc ttttataata tgagataatg ccgactgtac tttttacagt 7680

cggttttcta atgtcactaa cctgccccgt tagttgaaga aggtttttat attacagctc 7740

cagatccata tccttcagat ccctagataa ttcttctgat aatttagttt ttgttagagt 7800

ttaacataac tgatgattat cagaagtttc tttaatataa ataaaagcac tataagcgac 7860

ttaacttata gtgcttattt aatatatttt ttcaaacaat cattagccac caaacaaacg 7920

actccagaag ccttttttag tttgggtttc ttctatagca atatctttat cattttgatt 7980

aaatgaatca tcttgttgtt gtgatttttc atcttgttga ctctcagata tatctttagg 8040

ttgaacctct ggtttctttt cttctttctg atattgatca gtatttacag aatccgaagt 8100

atatgatgct tcttgtacat caaagttttc tcgatcatta gtagatttat caaaggaata 8160

acttaattgt ctctcttcct ctaattgatg ttccaatttt tgaatttttt tattgctttc 8220

taaagctaaa atttgttgat tctctaataa tttatttaat gtattaacat tgctattttg 8280

ttggtctagt tgtttagtta aattctcaat atacttttca tcatttttag ctctagtttc 8340

aaagatttct acctgctttt ctaattcgtt tacttttgtt tttaatgtct caaagccatc 8400

tgaattatta tatctattct tttcagtgtt ttcataagtt atttctgatt ttttattttc 8460

tttattttga gttgttcttt ctttcttagt gattttttct actattttca aataatcatt 8520

atcatcaata taattcactc cattttcttt ttcaaaagat atattcaaat ttttagcatt 8580

attaacaaca gtttgtttag ttacattcaa ttcatcagca accattttta tagttttcat 8640

atcatccacc cttaggcacc taatttacta cctaatttta ccacctaaca atttttcttt 8700

catctttttt accgcctaaa tatatcattt ttactaccta agtacctaat ttactaccta 8760

attagccact aaaataataa attttgttgt tttaaggtca taacatgatt ctgatctgta 8820

cttaaaacgc tttatataca cctttaaaaa tgttaatatt atcttatgaa ttttaaaaag 8880

ccaatgctat tggcgtagca tcggctctgg taattaaaac gatttgcgtt cgtttattta 8940

tatatttttt tgatacttgt attatatata tctactcgtc taagtgcaag cacaaaacat 9000

ataacttacg taaaaattgt tttattacct caactctaag taaaaggaaa tgaggttttt 9060

tattatgtct aaatttaaaa aaatatctgc aagtgaattc gaaacattac gtttttatca 9120

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tatgtatgct ttattaaaag atcgctttga actatcaaga ttaaataact gggtagattc 9240

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agaaccaaaa atcattaaat taaaaaaaga attagaaaaa tacaatttga ttataaacga 9360

aagacaaggt ttaaataaac ctaacaaaat ttatttactc gaacccacat atgacaagga 9420

actaataaat tctaagttcc agaacaaaga atttattagt tccagaacta ataaatcatc 9480

agttcaagaa ctaataaatt ctaagtcaag tgatactgat tttaataata ctgaatatat 9540

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ttctcattcg aatcatacaa atcatcaaca aaccgaattt aataatgatg ccttaaaatt 9660

ccaggcgctt gaagaattac cttcgcaaat caaatcttat gtaagtaatt ttgaaattaa 9720

agacatccgt attattaaaa gtatcttact caaggggaaa aagtcattta ataatacaca 9780

tgatacatat taccgtttag aagacgtcga atttgaactt gtaagtgttt taaaacgttt 9840

taaagccatg ttgctacaaa aaaatgaaac cgttgaaact atgcaaggct atttaatgca 9900

atcaattaaa gctgaacttg aagaaataca tgcattaaat atgcgtcgtc aaaacatacc 9960

tcaatacaat atctttaatc aataactcaa ataatcttac aacaatcaaa acaacatcaa 10020

aatttggaat taagtcaaca gaaaaggatc tccccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 10080

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caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 10200

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gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 10320

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 10380

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg 10440

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gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca 10740

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 10800

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 10860

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 10920

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 10980

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 11040

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 11100

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 11160

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 11220

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 11280

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 11340

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 11400

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gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 11880

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agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 12000

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 12060

atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg 12120

tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 12180

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 12240

tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc aggggttaaa attccttcat tacactcttg 12300

gcggtttcac ttatcaactt atcatttggc ttatcacttt tattgtcttt attcgtaaaa 12360

atgactaaaa caataggttc agattggccc ttaggataaa caaaagcaac atcatttcta 12420

g 12421

<210> 3

<211> 12240

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒序列

<400> 3

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attctctgct aattatcccg acatcatcgg taacaataaa tgctggataa ctggttgctg 180

acgcatccat ataactcatc aaccccggcg ttccatcagg tacaggtttc aacgtttcag 240

gatcaagcgc tcgcgcatat acccacggcg gaacatgttt acgctgcatt tcatcctcaa 300

agaaacaagt gttgagttca acttgattaa atatatctcg gatctgacta atatcactga 360

gattgaaagt atcaaataaa agatgattga aatcatcacg tttcagagat tctttttcgt 420

aacttttcca gccgcctccg gttatgatat aaaggctttt atctccagaa aatgagattt 480

ttttatcttt catataatgg cagagtaaat aaataaagta tggcgaacca ataagacaaa 540

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gttcttctgt tacggtaaat gtcgtaggat ataacaattc caccaaactc ataacatatt 660

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tacttaatct gtcacgcgcc acctgacttt ttaaaccatt cgtgccgcta ctggtaaacc 840

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caatatccag atgatcatta tccatcgcga tagcggcttt cgtaaccgat tgataaaaat 1320

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tgcatcgatt actacgaata tttgataaca atgtgataac ttcatcttgc ttgacccaat 1440

tatcgttatt tgcagtaaaa gcaataaacg gtatatcaag atacatcatg ttattaattg 1500

tagaagctaa atcttcccaa ccaaaatcaa gacaatctct cgcaaagact tcagcaccca 1560

atttatggcc ttcaaaatct agattatccg gcaattcatt aatgggtaga ctgagataat 1620

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aaaacgaagc attgatttca gataggcttg cataagctat ccgcgcagat aagcttgaag 1740

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tctgctttcc tatagacatt gtaaattcat caattgtccc tgaactcaat ccaacgtggt 1860

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caaaatgatc catcctgcgg gcaaaaccag acgcaataat aatggcattc tttctctttg 1980

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tcttgagtat tcttcatttt tccatctttg ccctaccgta tagagaaaat tgacaatgtt 3360

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caatattggc aggtaaacac tattatcacc aaaattaatg gattgcacta aatcatcact 3480

ttcgggaaag atttcaacct ggccgttaat aatgaatgaa atttttttag tcatatttgc 3540

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ctaatatcat taactgatgg tctatctctg ataggtcaac gtcatattta tccgcaacgg 3960

ctttatatct ttcagcatat tcatatctaa catcattaga atcatcccac ttaaagatga 4020

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cttcaaatag ttgctgttga tattcaaccg ggcgattaaa aaaatgcatt tcatcttttt 4260

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agcggcagtt cctacattca attttttagt cgcgccaagt aaatatgcag cagcgacata 5520

agggttacca agcaaaccaa actccgtgaa atgatgctcc agtaaccata cggtatcaaa 5580

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tcgaaatttc aatttttttt aatcatttat taggaaagct tcaaaaacct cattacctat 6000

gactttccct ctatttgtaa gtgcaatcac atcgttcttt tctacaatta attccttctc 6060

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tgcacctgct ccaaatccat aatattcctc attaaaccag taaaccttat tatgttctga 6360

ttcatggccg gatccccggg aattcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc 6420

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gacaattgga agagaaaaga gatatttaat cattatttga accaacaaac gacttttagt 6900

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tttcccaaaa cacctatacc tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc atggacttca 7260

tttactgggt ttaacttaaa tatcaataat aatagtaatt accttctacc cattattaca 7320

gcaggaaaat tcattaataa aggtaattca atatatttac cgctatcttt acaggtacat 7380

cattctgttt gtgatggtta tcatgcagga ttgtttatga actctattca ggaattgtca 7440

gataggccta atgactggct tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc 7500

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taacttatag tgcttattta atatattttt tcaaacaatc attagccacc aaacaaacga 7740

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tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt 11940

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<400> 4

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agaaacaagt gttgagttca acttgattaa atatatctcg gatctgacta atatcactga 360

gattgaaagt atcaaataaa agatgattga aatcatcacg tttcagagat tctttttcgt 420

aacttttcca gccgcctccg gttatgatat aaaggctttt atctccagaa aatgagattt 480

ttttatcttt catataatgg cagagtaaat aaataaagta tggcgaacca ataagacaaa 540

gatctttccc ttgatttttt attcgttcaa gactattcaa tgttttaaca aaatctattc 600

gttcttctgt tacggtaaat gtcgtaggat ataacaattc caccaaactc ataacatatt 660

taaaccaaat attatgagca ttaaatctat ctggtcccaa attgactaat tctatttgat 720

gatcaaacca actaccaaca tatttcatgc cataactcac agagcctaag agtctctcaa 780

tacttaatct gtcacgcgcc acctgacttt ttaaaccatt cgtgccgcta ctggtaaacc 840

aactttcaat ctcgttttcc tgagaagtta ataagcgagt aaacttaaaa accgatgttg 900

ggaatacagg tatgtcatca atttccgtaa tattgtcatc tactttgtgt gcctgacagt 960

agtgacgata ttctcgacaa tgtttataat gattacgaaa tgcatcaagc acaagtttct 1020

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catcaatttc tgagcttgct gtaatttctt gtttatcaac atatgaagtc atacctgttt 1140

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caaaatgatc catcctgcgg gcaaaaccag acgcaataat aatggcattc tttctctttg 1980

ggctgttttc ttctggcagc gtttcccaaa catgaatttt tttatttcct tcaacacaaa 2040

taacgtggtc gatggtttta tattttgatt cattttccat acttttacct attatgggac 2100

aaatacaagg aacttatctt cttccaggaa tcgagtctgt tctatttcaa ccgcaacatc 2160

cttagccgta tagttagatg gcctttcatg agaaatatat gtcactaatc gttgcaacgg 2220

tctcattccg tcatgagatc caccaactcg aaatatgtta ttcattcctg cttctacaat 2280

cctttccgca ccttttaatg ctaacgcatc tcgatattta aatgatgact cccaaggaaa 2340

aatagatatg gtttgcgtct tatttttttg aacataaggc aatatttgct caatattatc 2400

gacgtgatga aggtacacac atctgccaag tggttgatta aattccacac ctgcatttga 2460

ctcaataatc atccaacgtt gatgaatatc cacctctact tttaatccag caaacaagct 2520

ttctttttga actaaagaat aggccgcctt ttcatcaaaa tcttttttgg cattcggtaa 2580

tatatgcgca tatagattaa gtttttctat caacgctaac ttaaattcct cataatgatt 2640

tcccatgtaa tatatgtttt gggcagaaaa acaagctcgc tgatcgtaaa aacaaacatc 2700

atgagccgca cctgtcgctg cggacgtcaa atcaacagga ttatcgataa tgcaaagact 2760

ctttttagaa ccaaatttaa tcacatcagc ataagatggc gcatgctcta ccgcccaatt 2820

aatcgcatct ggccctcccc aagcgacaat aacatccgca tgtcgcataa tttcttttgc 2880

gagtgatgta tcaccttggt ggggccaata tataacagat aaagagcgcg ttatcggatg 2940

attagggtct acatcaataa aacttaacgc taatgcatta gcggtaaaag gatcggttga 3000

cgatgttttt ataatacact gattcttagt taaaattgcg cgtaatatag acatgatccc 3060

agataatgga acattacctg ccaacagatg tacagattta cctttcggaa aagcccgaac 3120

ataactttca tcctgaggta gccattcatc catgatatgg cgagaaccaa gttcattttc 3180

tacaacatca taaaggccgc ctttagaaca taaaatcata gatatccaat tggcctctag 3240

cttagccatt tcttctgaat atcccatata tttttttaag tcacgaatgt atgtcctgcg 3300

tcttgagtat tcttcatttt tccatctttg ccctaccgta tagagaaaat tgacaatgtt 3360

atgcaaccgt aattcgttat ttccattaca atcaataatg ttttttacat gagagtcatt 3420

caatattggc aggtaaacac tattatcacc aaaattaatg gattgcacta aatcatcact 3480

ttcgggaaag atttcaacct ggccgttaat aatgaatgaa atttttttag tcatatttgc 3540

cttcctcctg gtaccccatt atatcacatt atccattaaa aagcaaacaa attttcggta 3600

cctattaggt atattccatg tggtacttct taatattatc atcaacaata ttgattacat 3660

ttttttggct catcaaatca ttcattggtt caaaggacag caatacactt ttcgcaccac 3720

acttttcaat tgccaactta gccgcagtta tacactccgt ataatttccg acagcgtttt 3780

ctgcaattat ttcttcaagt ttattttcga aattttcatt agggtgcatt tcaagaacat 3840

aatcactaat aaatgcacgc gtctcttgtt tagctttatt actatcttcg ttatagttaa 3900

ctaatatcat taactgatgg tctatctctg ataggtcaac gtcatattta tccgcaacgg 3960

ctttatatct ttcagcatat tcatatctaa catcattaga atcatcccac ttaaagatga 4020

gaggaatacc ttttttggcc gcccactcaa caatatgatg actggttgct gttacatatt 4080

tccgaggtcc gcctggcgta taagcatggg gatttacaga tattttaggg aagctataaa 4140

aatcgttatc tggattacaa tagcctgttg ttaaagcatc gttaatgatt tcataacact 4200

cttcaaatag ttgctgttga tattcaaccg ggcgattaaa aaaatgcatt tcatcttttt 4260

tttcgcaatc actaaaccct aaaataaatc tcccttcact taactgatcc aataagcaag 4320

cttcctccgc tatggcgaca ggatgatgag ttgtaatgat gtgatttaat gaaccaattt 4380

taattttctc tgttaaaccg agcagaaaac cagaaacagt cagaggagcg ccgacaacac 4440

cattatctga aaaatgattt tcatacacta aaatctgttc aaaattcaac ttatcaacat 4500

actccgttat ttcctgcatg cgaactatac tttgttcttg aacagttgtt gaattgatga 4560

agttaaggaa gaacaatcca aatttcattt ctttctcctt agctaatata atagcgaacg 4620

ttgtttttct ttaagaaatg gcatgacatc agactggaag agcttcatgg aagcaataat 4680

ttcgtctact gttccattag cttcaaatcc acaacaaata tttgatattc ctgtagcatc 4740

aatgtctttt tgaattatgt caatacattc ctgcggcgtt cccacgggat tgatttcgta 4800

actgtaatca atacggcgat tagtatcttt atgtcctttt aatacaaagt cacgccactg 4860

ccctttattg aaatcataac ctcttgtttg gtctgaatca tcaaaaatag tcgtagcatt 4920

cacataagaa tcataccaat gccccagaaa tttccggcaa atctctttcg ctttaattga 4980

gtcatgatct acagatgtta tatatgataa gcaatggtcg atattatgaa tatcgtgccc 5040

atattcttga gccacttcat tataaagctc aagttgtgct ttcttttcgt tagtatttat 5100

aatccaactt aatatcatcg gtaggccaaa ttgagcagcc cactcagtcg tcgaagctga 5160

ttcagccacc acataaaccg gtgcgccacc tctgctatac gccgcggggt ttacttttac 5220

cttatggaac ttgatatgtt cattatcagc ttccatatat ccctctgtca tgccattctt 5280

tatcagcccg taccagcatt ccgctaaggc gcgactgtta ttcatatctg tgccgaatac 5340

gcgaaagtcc ttgttgtaaa gccctcggca aataccaaac cgaaatcgtc cttttgacat 5400

ttgatccaat aaattcacat cttcaagttg gcgtactgga tgggctgtgg gaagaacaat 5460

agcggcagtt cctacattca attttttagt cgcgccaagt aaatatgcag cagcgacata 5520

agggttacca agcaaaccaa actccgtgaa atgatgctcc agtaaccata cggtatcaaa 5580

accacactcc tcagagatgc gacctaattt aaccaaacgt ttcattacct ctgtttgaga 5640

aaattgggga ggttggtatg taagcaaaaa gtttccaaat ttcatagaga gtcctcctgt 5700

cgacggatcc tatttaattt atttatgaat taagttctgt attattcaat aactgctaaa 5760

atatcttctt catttaatac cagatatgtt tcattatctc gtttaacttc tgtaccagca 5820

tattgttgga acacgacacg gtccccttct ttcacttcag gagtcactct tgtaccatca 5880

tttaataggc gtccagttcc tactgcaacg ataacgcctt cgtttgattt ttctttagca 5940

ctatcagtta aaacaatacc acttttagtt gtttgttctt gttctttttt ctcaataatc 6000

acacgatttc caattggttt tagcatgatt gttcctcctt aaaaaaccta aagtttagca 6060

cttaacatta aagagtgcta acatacattt ataataatca aatttggtca aaatttcaag 6120

tcataacctt ttaattaagt tttgtaactt caagttattt acgataaaat aaattataaa 6180

caaatatttg gaggaaaatt atgacaagat tatgggcatc attgctaact gttattattt 6240

atatattgtc tcaattttta ccgcttctca ttgtaaaaaa attaccattt gtacaatata 6300

gtggcataga actgactaaa gcagtcattt acatacaact tgttctattt ttaatcgccg 6360

ccacgacgat tattttaatt aatttaaaaa ttaaaaatcc aacaaaatta gaattagaag 6420

ttaaagaacc taaaaaatat atcattccat gggcattgct tggatttgca ttggtaatga 6480

tttatcaaat ggtagtgagc attgtattaa cgcaaattta tggtggacaa caagtaagtc 6540

ctaatacaga aaagctaatt attattgctc gaaaaatacc tatatttatc ttctttgtat 6600

ctattattgg tcctttatta gaagaatatg tattcagaaa agtaatcttt ggagaattat 6660

ttaatgcgat taaaggtaat cgtatcgtgg catttattat tgctacaaca gtaagttcat 6720

taatatttgc ggatccccgg gaattcctgg cagtttatgg cgggcgtcct gcccgccacc 6780

ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg cggatttgtc ctactcagga 6840

gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc 6900

gttttatttg atgcctgggg aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 6960

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc ttcaactaaa gcacccatta 7020

gttcaacaaa cgaaaattgg ataaagtggg atatttttaa aatatatatt tatgttacag 7080

taatattgac ttttaaaaaa ggattgattc taatgaagaa agcagacaag taagcctcct 7140

aaattcactt tagataaaaa tttaggaggc atatcaaatg aactttaata aaattgattt 7200

agacaattgg aagagaaaag agatatttaa tcattatttg aaccaacaaa cgacttttag 7260

tataaccaca gaaattgata ttagtgtttt ataccgaaac ataaaacaag aaggatataa 7320

attttaccct gcatttattt tcttagtgac aagggtgata aactcaaata cagcttttag 7380

aactggttac aatagcgacg gagagttagg ttattgggat aagttagagc cactttatac 7440

aatttttgat ggtgtatcta aaacattctc tggtatttgg actcctgtaa agaatgactt 7500

caaagagttt tatgatttat acctttctga tgtagagaaa tataatggtt cggggaaatt 7560

gtttcccaaa acacctatac ctgaaaatgc tttttctctt tctattattc catggacttc 7620

atttactggg tttaacttaa atatcaataa taatagtaat taccttctac ccattattac 7680

agcaggaaaa ttcattaata aaggtaattc aatatattta ccgctatctt tacaggtaca 7740

tcattctgtt tgtgatggtt atcatgcagg attgtttatg aactctattc aggaattgtc 7800

agataggcct aatgactggc ttttataata tgagataatg ccgactgtac tttttacagt 7860

cggttttcta atgtcactaa cctgccccgt tagttgaaga aggtttttat attacagctc 7920

cagatccata tccttcagat ccctagataa ttcttctgat aatttagttt ttgttagagt 7980

ttaacataac tgatgattat cagaagtttc tttaatataa ataaaagcac tataagcgac 8040

ttaacttata gtgcttattt aatatatttt ttcaaacaat cattagccac caaacaaacg 8100

actccagaag ccttttttag tttgggtttc ttctatagca atatctttat cattttgatt 8160

aaatgaatca tcttgttgtt gtgatttttc atcttgttga ctctcagata tatctttagg 8220

ttgaacctct ggtttctttt cttctttctg atattgatca gtatttacag aatccgaagt 8280

atatgatgct tcttgtacat caaagttttc tcgatcatta gtagatttat caaaggaata 8340

acttaattgt ctctcttcct ctaattgatg ttccaatttt tgaatttttt tattgctttc 8400

taaagctaaa atttgttgat tctctaataa tttatttaat gtattaacat tgctattttg 8460

ttggtctagt tgtttagtta aattctcaat atacttttca tcatttttag ctctagtttc 8520

aaagatttct acctgctttt ctaattcgtt tacttttgtt tttaatgtct caaagccatc 8580

tgaattatta tatctattct tttcagtgtt ttcataagtt atttctgatt ttttattttc 8640

tttattttga gttgttcttt ctttcttagt gattttttct actattttca aataatcatt 8700

atcatcaata taattcactc cattttcttt ttcaaaagat atattcaaat ttttagcatt 8760

attaacaaca gtttgtttag ttacattcaa ttcatcagca accattttta tagttttcat 8820

atcatccacc cttaggcacc taatttacta cctaatttta ccacctaaca atttttcttt 8880

catctttttt accgcctaaa tatatcattt ttactaccta agtacctaat ttactaccta 8940

attagccact aaaataataa attttgttgt tttaaggtca taacatgatt ctgatctgta 9000

cttaaaacgc tttatataca cctttaaaaa tgttaatatt atcttatgaa ttttaaaaag 9060

ccaatgctat tggcgtagca tcggctctgg taattaaaac gatttgcgtt cgtttattta 9120

tatatttttt tgatacttgt attatatata tctactcgtc taagtgcaag cacaaaacat 9180

ataacttacg taaaaattgt tttattacct caactctaag taaaaggaaa tgaggttttt 9240

tattatgtct aaatttaaaa aaatatctgc aagtgaattc gaaacattac gtttttatca 9300

attacccaaa tttttatttg aagatgaata cttttctaaa atgcccacag atgcaaaagt 9360

tatgtatgct ttattaaaag atcgctttga actatcaaga ttaaataact gggtagattc 9420

agaaaataat atttatcttt tatataccaa taaacagtta tgctcaattt taaattatgc 9480

agaaccaaaa atcattaaat taaaaaaaga attagaaaaa tacaatttga ttataaacga 9540

aagacaaggt ttaaataaac ctaacaaaat ttatttactc gaacccacat atgacaagga 9600

actaataaat tctaagttcc agaacaaaga atttattagt tccagaacta ataaatcatc 9660

agttcaagaa ctaataaatt ctaagtcaag tgatactgat tttaataata ctgaatatat 9720

agagactaag aataatgata cgaattatac gaatgataca tctaacatga tttctaagaa 9780

ttctcattcg aatcatacaa atcatcaaca aaccgaattt aataatgatg ccttaaaatt 9840

ccaggcgctt gaagaattac cttcgcaaat caaatcttat gtaagtaatt ttgaaattaa 9900

agacatccgt attattaaaa gtatcttact caaggggaaa aagtcattta ataatacaca 9960

tgatacatat taccgtttag aagacgtcga atttgaactt gtaagtgttt taaaacgttt 10020

taaagccatg ttgctacaaa aaaatgaaac cgttgaaact atgcaaggct atttaatgca 10080

atcaattaaa gctgaacttg aagaaataca tgcattaaat atgcgtcgtc aaaacatacc 10140

tcaatacaat atctttaatc aataactcaa ataatcttac aacaatcaaa acaacatcaa 10200

aatttggaat taagtcaaca gaaaaggatc tccccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 10260

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 10320

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 10380

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 10440

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 10500

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 10560

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg 10620

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 10680

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 10740

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 10800

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 10860

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca 10920

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 10980

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 11040

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 11100

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 11160

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 11220

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 11280

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 11340

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 11400

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 11460

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 11520

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 11580

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 11640

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 11700

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 11760

accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 11820

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 11880

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 11940

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 12000

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 12060

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 12120

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 12180

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 12240

atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg 12300

tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 12360

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 12420

tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc aggggttaaa attccttcat tacactcttg 12480

gcggtttcac ttatcaactt atcatttggc ttatcacttt tattgtcttt attcgtaaaa 12540

atgactaaaa caataggttc agattggccc ttaggataaa caaaagcaac atcatttcta 12600

g 12601

Claims (1)

1.一种利用发光报告系统发现筛选抗生素的方法；其中所述发光报告系统由分子伴侣基因clpX、groE、dnaJ、dnaK的启动子片段和与分子伴侣基因启动子相连的luxABCDE基因片段构建而成；发现筛选抗生素的方法是：将发光报告系统中的四种质粒pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中，制成四株金黄色葡萄球菌lux报告株，分别命名为：报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4，并制备含有各报告菌株的琼脂糖双层平板，将灭菌的滤纸片在琼脂糖双层平板中央或培养基表面有序排布并与培养基紧密相贴；然后将含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上，继续培养并观察有无细菌发光产生，若有至少一株报告菌株发光即确定被检测物含有抗生素；其中，所述滤纸片是用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的圆形小纸片；所述含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加量是1～1.5μl；所述将含有待筛选药物或怀疑含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上以后，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20～25h；

其特征在于：

所述pAmilux-clpX-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述pAmilux-groE-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；

所述发现筛选抗生素的种类是：达托霉素(DAP)，多粘菌素B(PMB)，亚胺培南(IPM)，青霉素G(PEN)，万古霉素(VAN)，红霉素(ERY)，卡那霉素(KAN)，壮观霉素(SPE)，链霉素(STR)，四环素(TET)，丝裂霉素C(MMC)，环丙沙星(CIP)，加替沙星(GAT)，甲氧苄啶(TMP)，利福平(RIF)，腐草霉素(PHL)十六种抗生素。

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