CN111560339A - 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 - Google Patents
桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111560339A CN111560339A CN202010221514.5A CN202010221514A CN111560339A CN 111560339 A CN111560339 A CN 111560339A CN 202010221514 A CN202010221514 A CN 202010221514A CN 111560339 A CN111560339 A CN 111560339A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flightin
- egfp
- bactrocera dorsalis
- dsrna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001124181 Bactrocera dorsalis Species 0.000 title claims abstract description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241001131798 Escherichia coli HT115 Species 0.000 claims abstract description 6
- 101710103613 Flightin Proteins 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 230000032669 eclosion Effects 0.000 claims description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 11
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 108091005975 Myofilaments Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000024703 flight behavior Effects 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法，选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1，通过引物设计、flightin基因及对照egfp基因片段的克隆、构建桔小实蝇RNAi干扰表达载体、重组质粒转化大肠杆菌HT115以及dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达，获得桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液。本发明采用重组质粒可以在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA的方法，降低了实验成本，持续饲喂菌液后对桔小实蝇的飞行能力有抑制作用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法。
背景技术
桔小实蝇是全球具危害性的检疫性果蔬害虫,目前对该害虫的防治手段主要有人工防治、化学防治、性诱剂引诱、生物防治等，这些手段具有一定的防治效果，但总体存在效率低、成本高、对生态环境不友好等问题。
桔小实蝇具有极强的飞行能力，是造成其分布和发生区不断扩张，以及根除后又再次发生的重要原因，超强的飞行能力使得对桔小实蝇的防治变得困难。桔小实蝇具有的飞行蛋白flightin基因是一种大小在20kDa的多磷酸化肌原纤维蛋白，Flightin基因对昆虫肌肉伸展活化具有重要作用，在间接飞行肌的粗肌丝上与肌球蛋白高度融合，调控和指导粗肌丝的准确组装和收缩等。选择飞行蛋白flightin基因作为RNA 干扰靶标，破坏昆虫飞行肌表达通路，阻止昆虫肌肉伸展活化及肌丝的组装和收缩等生理过程，可达到害虫防治的目的。目前，并未有文献记载关于桔小实蝇flightin基因的干扰相关研究。
发明内容
针对目前未见利用RNA干扰技术抑制桔小实蝇飞行行为的研究，本发明提出一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法。
本发明的桔小实蝇flightin基因的dsRNA细菌表达菌液，其特征在于通过以下步骤获得：
1）引物设计
选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1，结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因序列和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物。上、下游引物的5’端分别加入SacI和XhoI酶切位点，具体为：
flightin-F：5’-CGAGCTCACTCGTATAATGGCTGATG-3’；其中：下划线为SacI酶切位点；
flightin-R：5’-CCTCGAGATAGCGACAAGCTCCCAC-3’；其中：下划线为XhoI酶切位点；
egfp-F：5’-CGAGCTCACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；其中：下划线为SacI酶切位点；
egfp-R：5’-CCTCGAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’；其中：下划线为XhoI酶切位点；
2）flightin基因及对照egfp基因片段的克隆
以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板，通过PCR扩增，PCR扩增体系为TSINGKEMaster Mix DNA Polymerase 12.5μl，上下游引物和模板各1μl，加灭菌ddH2O至总体积25μl，扩增条件为95℃预变性3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min，产物回收，得到含SacI和XhoI酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段；
3）构建桔小实蝇dsRNA细菌表达载体
将含SacI和XhoI酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段和L4440载体经SacI和XhoI双酶切后进行酶切产物回收，用 T4 连接酶将回收的L4440载体分别与flightin、egfp基因片段以1:3比例室温连接10 min，连接产物命名为L4440-flightin、L4440-egfp，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化的感受态细胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固体LB平板培养基上，37℃过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中培养，获得重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp作为桔小实蝇RNAi的dsRNA细菌表达载体；
4）重组质粒转化大肠杆菌HT115
用热激法将L4440-flightin和L4440-egfp表达载体转入CaCl2法制备的 HT115 感受态细胞中，涂布于含50μg/ml Amp 和12.5 μg/ml Tet的LB固体培养基上，过夜培养后挑取单菌落接种到Amp和Tet抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得菌液；
5）dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达
1：25比例将菌液转入新的 LB 培养基中，37℃，200 rpm培养至菌液 OD600 =0.4左右，加入IPTG终浓度至1.0 mmol/L进行诱导表达，诱导培养 4 h 后收集菌液，采用 TRIzol 法提取细菌总RNA，DNase I和RNase A溶液消化纯化总RNA，获得表达flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的细菌菌液。
桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的使用方法，其特征在于采用饲喂法，从桔小实蝇羽化开始将桔小实蝇dsRNA细菌表达浓缩菌液拌进饲料连续饲喂。
为实现沉默靶标基因的目标，需控制最佳菌液浓缩程度及最佳饲喂时间，所述菌液最佳浓缩程度为20-50倍，最佳饲喂时间为桔小实蝇在1日龄时饲喂，最低连续饲喂25天。若菌液浓缩程度不够或错过最佳干扰时间，则上述菌液对桔小实蝇飞行能力削弱影响不显著。
RNAi是近年来新发现的一种通过 dsRNA 介导的特异性高效抑制基因表达的途径，其在基因功能研究及农业病虫害防治等领域中具有广阔应用前景。L4440质粒具有氨苄抗性，含有两个反向对应的T7强启动子，本发明采用重组质粒可以在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA的方法，与现有技术采用的试剂盒体外转录和化学合成方法相比，能够大大降低实验成本。持续饲喂IPTG诱导表达靶标dsRNA的大肠杆菌HT115菌液后，对桔小实蝇的飞行能力有抑制作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为flightin和egfp基因干扰片段的克隆及干扰载体的构建示意图。
具体实施方式
实施例1：本研究所用的虫源均为云南省林业和草原科学院森保所室内饲养的桔小实蝇种群。饲养条件为：温度25℃~30℃，湿度为60％~70％，光周期为L16:D8。
引物设计：根据桔小实蝇flightin基因转录组序列（GeenBank登录号：XM_011210668），用siDirect (http://design.RNAi.jp/) 在线预测了可能存在的 siRNA 位点，选择其中 678 bp 序列作为 RNA 干扰片段，即SEQ ID NO.1；用Primer5.0和Oligo6，结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因序列和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物。上、下游引物的5’端分别加入SacI和XhoI酶切位点。
flightin-F：5’-CGAGCTCACTCGTATAATGGCTGATG-3’(下划线为SacI酶切位点)；
flightin-R：5’-CCTCGAGATAGCGACAAGCTCCCAC-3’(下划线为XhoI酶切位点)；
egfp-F：5’-CGAGCTCACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’(下划线为SacI酶切位点)；
egfp-R：5’-CCTCGAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’(下划线为XhoI酶切位点)。
桔小实蝇flightin基因及对照egfp基因片段的克隆：分别以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板，按照TSINGKE Master Mix DNA Polymerase说明书进行PCR扩增，克隆桔小实蝇flightin及egfp基因干扰片段。PCR扩增体系：TSINGKE Master Mix DNAPolymerase 12.5μl，上下游引物和模板各1μl，加灭菌ddH2O至总体积25μl；扩增条件：95℃预变性3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min；反应结束后，l％琼脂糖凝胶电泳检测并用DNA回收试剂盒纯化回收目的片段送测序。
桔小实蝇flightin及egfp基因的RNA干扰表达载体构建：将L4440质粒与胶回收的桔小实蝇flightin和egfp基因片段分别同时用SacI和XhoI进行双酶切，37℃，1 h，分别回收酶切产物；用 T4 连接酶将回收的L4440载体分别与flightin、egfp基因片段以1:3比例室温连接10 min；连接产物命名为L4440-flightin、L4440-egfp，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化的感受态细胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固体LB平板培养基上，37℃过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中培养，菌液PCR检测阳性后，提取重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp，用SacI和XhoI双酶切鉴定，筛选阳性克隆，取阳性克隆菌液送测序。
重组质粒转化大肠杆菌HT115：用热激法将L4440-flightin和L4440-egfp表达载体转入CaCl2法制备的 HT115 感受态细胞中，涂布于含50μg/ml Amp 和12.5 μg/ml Tet的LB固体培养基上，过夜培养后挑取单菌落接种到Amp和Tet抗性的LB液体培养基中，提取质粒并通过 PCR 及双酶切鉴定阳性克隆，重组质粒进一步通过测序进行验证。
dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达：将带有L4440-flightin和L4440-egfp的HT115菌液接种于 Amp和Tet抗性LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，1：25比例将菌液转入新的LB 培养基中，37℃，200 rpm培养至菌液 OD600 =0.4左右，加入IPTG终浓度至1.0 mmol/L进行诱导表达，诱导培养 4 h 后收集菌液。采用TRIzol法提取细菌总RNA，DNaseI和RNase A溶液消化纯化总RNA，获得flightin-dsRNA和egfp-dsRNA。
饲喂细菌表达dsRNA的菌液：采用饲喂法，从桔小实蝇羽化开始将表达桔小实蝇dsRNA的50倍浓缩菌液拌进饲料连续饲喂，桔小实蝇在1日龄时饲喂，最低连续饲喂25天
作为验证，本发明提供flightin和egfp基因干扰片段的克隆及干扰载体的构建的电泳检测结果。
桔小实蝇flightin及对照egfp基因干扰片段的克隆：PCR扩增得到含SacI和XhoI酶切位点的桔小实蝇flightin和egfp基因片段，结果为，桔小实蝇flightin基因片段介于500-750bp之间，对照egfp基因片段介于100-250bp之间分别与预期添加了酶切位点和保护碱基后的大小692bp和201bp相符（图1 A 3、4泳道）。测序结果与Genebank中报道的序列进行比对，无碱基差异，同源性达100%，桔小实蝇flightin基因及egfp基因干扰片段克隆成功；把载体质粒L4440和胶回收得到的目的片段分别经限制性内切酶SacI和XhoI双酶切后，2790 bp的L4440质粒线性化单一条带约为2755 bp，桔小实蝇flightin及对照egfp基因大小正确（图1 A 2、5、6泳道）。
dsRNA表达载体的构建：HT115 菌株中提取的重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp（图1 B）经SacI和XhoI双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳20 min检测均分别得到两条带，2755bp的线性化L4440质粒载体，及678 bp和187 bp左右的flightin和egfp目的片段（图1C），表明桔小实蝇flightin基因和对照egfp基因片段成功转入 L4440 质粒中，与预期设计一致。双向测序结果与目的基因序列完全一致，阅读框正确，说明已经成功构建了L4440-flightin和L4440-egfp干扰表达载体。
<110> 云南省林业和草原科学院
<120> 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 桔小实蝇(Bactrocera dorsalis flightin)
<400> 2
actcgtataa tggctgatga ggaggatcca tggggtttcg atgagggtga tagtgagcca 60
gccgctgccc ctgctcctgc cgctgccgct gccgcagatg caggtgctgc ccctgccgcg 120
ggtggtggtg agagcgcccc aacaggaggc gaaactgaag cagctgccgc cgaagaagaa 180
tcggcaccac caccaccgcc gccagaagac gatgggtacc gaaagcccgt gcaactatat 240
cgtcactggg tgagaccaca attcttgcag tataaataca tgtacaacta cagaacaaac 300
tactatgatg acgtaattga ttacttggat aagaagcaag ttggcgtttc aagggaaata 360
ccgcgcgcac aaacttgggc tgaacgcgtg ctcagaacaa gcaacgccag tggacgtgac 420
cttgactcat acacatgttc aagcaaaagg gataagcatc ttgttcaaac tctggctgcc 480
tcgattcgta ctcataatta tcacaccaaa gcttatatta accaaaaata tgcaaatgtt 540
ctataaataa atacaaaacc tatctataaa tatgaatacc aactaaaaag ttagttaaaa 600
ttgtagtaca atttaattat aaggagatga ttacctaatt acgttctaat aaacaataaa 660
gtgggagctt gtcgctat 678
Claims (3)
1.桔小实蝇flightin基因的dsRNA细菌表达菌液，其特征在于通过以下步骤获得：
1）引物设计：
选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1，结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因序列和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物；
上、下游引物的5’端分别加入SacI和XhoI酶切位点，具体为：
flightin-F：5’-CGAGCTCACTCGTATAATGGCTGATG-3’；其中：下划线为Sac
酶切位点；
flightin-R：5’-CCTCGAGATAGCGACAAGCTCCCAC-3’；其中：下划线为Xho
酶切位点；
egfp-F：5’-CGAGCTCACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；其中：下划线为Sac
酶切位点；
egfp-R：5’-CCTCGAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’；其中：下划线为Xho
酶切位点；
2）flightin基因及对照egfp基因片段的克隆：
以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板，通过PCR扩增，PCR扩增体系为TSINGKEMaster Mix DNA Polymerase 12.5μl，上下游引物和模板各1μl，加灭菌ddH2O至总体积25μl，扩增条件为95℃预变性3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min，产物回收，得到含Sac
和Xho
酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段；
3）构建桔小实蝇RNAi干扰表达载体：
将含Sac
和Xho
酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段和L4440载体经Sac
和Xho
双酶切后进行酶切产物回收，用 T4 连接酶将回收的L4440载体分别与flightin、egfp基因片段以1:3比例室温连接10 min，连接产物命名为L4440-flightin、L4440-egfp，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化的感受态细胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固体LB平板培养基上，37℃过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中培养，获得重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp作为桔小实蝇dsRNA细菌表达载体；
4）重组质粒转化大肠杆菌HT115：
用热激法将L4440-flightin和L4440-egfp表达载体转入CaCl2法制备的 HT115 感受态细胞中，涂布于含50μg/ml Amp 和12.5 μg/ml Tet的LB固体培养基上，过夜培养后挑取单菌落接种到Amp和Tet抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得菌液；
5）dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达：
1：25比例将菌液转入新的 LB 培养基中，37℃，200 rpm培养至菌液 OD600 =0.4左右，加入IPTG终浓度至1.0 mmol/L进行诱导表达，诱导培养 4 h 后收集菌液，采用 TRIzol 法提取细菌总RNA，DNase I和RNase A溶液消化纯化总RNA，获得表达flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的细菌菌液。
2.桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的使用方法，其特征在于采用饲喂法，从桔小实蝇羽化开始将桔小实蝇dsRNA细菌表达浓缩菌液拌进饲料连续饲喂。
3.如权利要求2所述的2.桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的使用方法，其特征在于菌液最佳浓缩程度为20-50倍，最佳饲喂时间为桔小实蝇在1日龄时饲喂，最低连续饲喂25天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010221514.5A CN111560339B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010221514.5A CN111560339B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111560339A true CN111560339A (zh) | 2020-08-21 |
| CN111560339B CN111560339B (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=72068959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010221514.5A Active CN111560339B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111560339B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343637A (zh) * | 2007-07-10 | 2009-01-14 | 中山大学 | 饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法 |
| CN104059931A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 西南大学柑桔研究所 | 桔小实蝇细胞色素p450基因的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
| CN104059938A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 西南大学柑桔研究所 | 桔小实蝇钠离子通道基因的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
-
2020
- 2020-03-26 CN CN202010221514.5A patent/CN111560339B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343637A (zh) * | 2007-07-10 | 2009-01-14 | 中山大学 | 饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法 |
| CN104059931A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 西南大学柑桔研究所 | 桔小实蝇细胞色素p450基因的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
| CN104059938A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 西南大学柑桔研究所 | 桔小实蝇钠离子通道基因的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NCBI: "PREDICTED: Bactrocera dorsalis flightin (LOC105230083), transcript variant X1, mRNA", NCBI, pages 011210668 * |
| REEDY等: "Flightin Is Essential for Thick Filament Assembly and Sarcomere Stability in Drosophila Flight Muscles", THE JOURNAL OF BIOPHYSICAL AND BIOCHEMICAL CYTOLOGY, vol. 151, no. 7 * |
| 袁瑞玲等: "细菌表达dsRNA介导桔小实蝇flightin基因的RNA干扰", vol. 47, no. 2, pages 119 - 120 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111560339B (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | Enhancing recombinant protein production with an Escherichia coli host strain lacking insertion sequences | |
| RU2013135484A (ru) | Молекулы нуклеиновых кислот, которые придают устойчивость к насекомым-вредителям отряда жестокрылых | |
| CN112029795B (zh) | MpICE1转录因子在提高植物抗病性中的应用 | |
| CN114752610B (zh) | 柑橘木虱泛素结合酶e2j2基因在防控柑橘黄龙病中的应用 | |
| CN110229222A (zh) | 番茄抗南方根结线虫相关基因及其应用 | |
| CN114921467A (zh) | 基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA及其在防治桃蚜中的应用 | |
| CN110551730B (zh) | 茄二十八星瓢虫rps18基因及其在防虫害中的应用 | |
| US20240218389A1 (en) | METHODS FOR CONSTRUCTING TRANSGENIC PLANTS COMPRISING TaPDIL4-1B GENE | |
| CN114989268A (zh) | 一种植物病毒移动蛋白及其应用 | |
| CN111560339A (zh) | 桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法 | |
| CN109679950B (zh) | 一种新型埃博霉素生物合成基因p3启动子及其制备方法和应用 | |
| CN113430201B (zh) | 美国白蛾Iap基因dsRNA及其细菌表达菌液和应用 | |
| CN115976103A (zh) | 一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法 | |
| CN113430200B (zh) | 美国白蛾vATPase A基因dsRNA及其细菌表达液及应用 | |
| CN109112117B (zh) | 一种分离的二化螟cyp15c1基因及其编码蛋白 | |
| WO2020232448A1 (en) | Rhizobial trna-derived small rnas and uses thereof for regulating plant nodulation | |
| Kanjo et al. | Truncated, strong inducible promoter P mcl1 from Metarhizium anisopliae | |
| CN117070483B (zh) | NfADH1抗逆基因及其编码氨基酸序列在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 | |
| CN115029357B (zh) | 昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用 | |
| CN110563828B (zh) | 二化螟雄性特异性致死相关蛋白MSL3及其编码基因、dsRNA干扰序列和应用 | |
| CN109112132A (zh) | 一种分离的二化螟HSPs基因及其编码的蛋白 | |
| CN112501171B (zh) | 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用 | |
| CN118222638B (zh) | 一种干扰蚯蚓目的基因表达的方法 | |
| CN111057717B (zh) | 快速制备可直接使用的gRNA表达载体的方法及其应用 | |
| CN117106815A (zh) | 一种中肠细菌介导的小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |