CN101831446B - 一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种昆虫几丁质合成酶1B dsRNA的应用，根据NCBI数据库中登录号为GU067731的东亚飞蝗几丁质合成酶1B的核苷酸序列，获得序列为SEQ ID NO：1的几丁质合成酶基因1B片段，由该片段合成dsRNA。将上述合成的dsRNA注入昆虫体腔后，昆虫因蜕皮困难死亡。为安全无公害的害虫防治方法的研制提供新的途径。

Description

一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害虫中的应用。

背景技术

农业害虫为害是我国农业产量的重要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广，但杀虫时间较长且效果缓慢。

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，2006年获诺贝尔奖。RNAi的发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007年，“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GST1的dsRNA转基因植物作为一种控制病虫害的新方法(Baum et al，2007；Mao et al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。

研究表明，RNA干扰技术能够有效控制特殊的植物害虫，在害虫防治领域具有重要的发展前景。而实现基于RNAi进行害虫有效控制的关键是筛选对昆虫高效致死的dsRNA。

几丁质合成和代谢是昆虫等节肢动物特有的生物学现象，由于人类和其它高等动物没有几丁质，因此昆虫几丁质合成系统已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。几丁质合成酶在昆虫几丁质合成的最后一步起着关键作用，采用RNA干扰技术，开展几丁质合成酶dsRNA在害虫防治中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。

本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段获得的方法，根据NCBI数据库中登录号为GU067731的几丁质合成酶1B基因序列，设计上游引物序列为SEQ ID NO：2，下游引物序列为SEQ ID NO：3，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1。

以昆虫几丁质合成酶1B基因片段为模板，通过试剂盒合成dsRNA。

dsRNA在致死害虫中的应用：注射dsRNA到昆虫体腔，结果表明：dsRNA可以特异性地沉默昆虫体内几丁质合成酶基因1B的mRNA表达，昆虫蜕皮困难死亡且全身严重皱缩。

附图说明

图1：2龄东亚飞蝗若虫注射dsRNA后对昆虫生长发育的影响。(1为注射dsGFP的对照组，2和3均为注射dsRNA的实验组)。注射dsRNA的实验组昆虫因蜕皮困难死亡且全身严重皱缩。

图2：2龄东亚飞蝗若虫注射dsRNA后对几丁质合成酶1B基因转录(LmCHS1B)的影响。β-actin为内参基因(1为注射dsGFP的对照组，2为注射dsRNA的实验组)。

具体实施方式

实施例1：东亚飞蝗几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA的获得

1)东亚飞蝗几丁质合成酶1B基因片段的获得

根据NCBI数据库中登录号为GU067731的东亚飞蝗几丁质合成酶1B的核苷酸序列，采用primer premier5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：2，下游引物序列为SEQ ID NO：3，所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，提取RNA的具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此为模板，PCR扩增获得几丁质合成酶基因片段，

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒将所获几丁质合成酶基因片段进行纯化。

2)东亚飞蝗几丁质合成酶1B基因片段的dsRNA的获得

以1)步骤获得的几丁质合成酶1B基因片段为模板，按照T7RiboMAX^TM Express RNAiSystem(Promega)试剂盒说明，体外转录合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，用酶标仪(Molecular Devices SpectraMax 190，Menlo Park，CA，USA)将其定量至终浓度为1μg/μL。保存至-70℃备用。

实施例2：几丁质合成酶1B基因片段合成的dsRNA致死东亚飞蝗实验

1、东亚飞蝗几丁质合成酶1B基因片段合成的dsRNA注射

选取2龄东亚飞蝗第四天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA。25μl规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射几丁质合成酶1B基因片段的dsRNA的量为3μg，并设置dsGFP(3μg)的对照组，每组15头虫子，3个生物学重复，共计45头。注射完毕后，将虫子用1L的烧杯至于人工气候箱中进行饲养(光照∶黑暗时间＝14h∶10h，温度30±2℃，湿度60％)，给以新鲜小麦幼苗和适当的光照，喷水保持湿度。

2、注射1B基因片段合成的dsRNA后东亚飞蝗表型的观察

若虫注射完毕后继续饲养，并及时地观察。注射dsRNA东亚飞蝗实验组与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。对照组飞蝗均可顺利蜕皮，从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟，注射dsRNA实验组若虫中，有部分若虫生长发育出现畸形，因蜕皮困难死亡且全身严重皱缩。表型见图1。

3、东亚飞蝗几丁质合成酶1B基因沉默效果检测

取上述畸形但未死亡的3龄若虫，每组收虫6只，雌雄各半，实验组和对照组均取3个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA，采用M-MLV反转录酶获得第一链cDNA，以此为模板进行RT-PCR，检测几丁质合成酶1B mRNA的表达量是否降低。结果表明实验组几丁质合成酶1B mRNA的表达量显著降低。见图2。

4、注射dsRNA后东亚飞蝗死亡情况的观察

注射dsRNA的东亚飞蝗实验组死亡率为51％。这与注射dsGFP的对照组(死亡率为0％)相比，致死效果明显。

SEQUENCE LISTING

<110>山西大学

<120>一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>214

<212>DNA

<213>Locusta migratoria manilensis(Meyen)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(214)

<400>1

taatacgact cactataggg gctgctgatc tgatagagct acggaataaa tccgtgttcg     60

ccttcttcat gttcaatgct ttgtttgtgc ttattgtttt cttgctgcaa ctgaataagg    120

acatgctaca tattgattgg ccacttggag tcaagacaaa catcacctat attgaagaga    180

cagcagaggt tcacccctat agtgagtcgt atta                                214

<210>2

<211>43

<212>DNA

<213>Locusta migratoria manilensis(Meyen)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(43)

<400>2

taatacgact cactataggg gctgctgatc tgatagagct acg      43

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>Locusta migratoria manilensis(Meyen)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(45)

<400>3

taatacgact cactataggg gtgaacctct gctgtctctt caata    45

Claims (3)

1.一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段合成的dsRNA。

3.如权利要求2所述的一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段合成的dsRNA在致死东亚飞蝗中的应用。

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