CN101831447B - 一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种昆虫几丁质合成酶1A dsRNA的应用,根据NCBI数据库中登录号为GU067730的东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因序列获得序列为SEQ ID NO:1的几丁质合成酶基因1A片段,由该片段合成dsRNA。将上述合成的dsRNA注入昆虫体腔后,昆虫因蜕皮困难死亡。为安全无公害的害虫防治方法的研制提供新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。
背景技术
农业害虫为害是我国农业产量的重要制约因素,长期施用化学杀虫剂导致一系列问题:1)昆虫出现抗药性,用药剂量加大,防治成本提高;2)农药残留导致环境污染严重;3)对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广,但杀虫时间较长且效果缓慢。
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象,2006年获诺贝尔奖。RNAi的发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破,同时也为人类疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007年,“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因V-ATPaseA,CYP6AE14 and GST1的dsRNA转基因植物作为一种控制病虫害的新方法(Baum et al,2007;Mao et al,2007)。2008年,Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势:1)选择对害虫专一的基因进行干扰,对高等动物和人类是安全的;2)抗虫具有专一性,对非靶标生物无杀伤作用;3)对环境无毒无害。
研究表明,RNA干扰技术能够有效控制特殊的植物害虫,在害虫防治领域具有重要的发展前景。而实现基于RNAi进行害虫有效控制的关键是筛选对昆虫高效致死的dsRNA。
几丁质合成和代谢是昆虫等节肢动物特有的生物学现象,由于人类和其它高等动物没有几丁质,因此昆虫几丁质合成系统已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。几丁质合成酶在昆虫几丁质合成的最后一步起着关键作用,采用RNA干扰技术,开展几丁质合成酶dsRNA在害虫防治中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。
本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段,其核苷酸序列是SEQ ID NO:1。
本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段获得的方法,根据NCBI数据库中登录号为GU067730的几丁质合成酶序列,设计上游引物序列为SEQ ID NO:2,下游引物序列为SEQ ID NO:3,通过PCR扩增获得SEQ ID NO:1。
以昆虫几丁质合成酶1A基因片段为模板,通过试剂盒合成dsRNA。
dsRNA在致死害虫中的应用:注射dsRNA到昆虫体腔,结果表明:dsRNA可以特异性地沉默昆虫体内几丁质合成酶基因1A的mRNA表达,昆虫蜕皮困难死亡。
附图说明
图1:2龄东亚飞蝗若虫注射dsRNA后对昆虫生长发育的影响。(左侧为注射dsGFP的对照组,右侧为注射dsRNA的实验组)。注射dsRNA实验组昆虫因蜕皮困难死亡。
图2:2龄东亚飞蝗若虫注射dsRNA后对几丁质合成酶基因1A(LmCHS1A)转录的影响。β-actin为内参基因(1为注射dsGFP的对照组,2为注射dsRNA的实验组)。
具体实施方式
实施例1:东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA的获得
1)东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段的获得
根据NCBI数据库中登录号为GU067730的东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因序列,采用primer premier5.0软件设计特异性引物,上游引物序列为SEQ ID NO:2,下游引物序列为SEQ ID NO:3,所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫,四头一组,冷冻于液氮中,待提取RNA,提取RNA的具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA,以此为模板,PCR扩增获得几丁质合成酶1A基因片段,SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒将所获几丁质合成酶1A基因片段进行纯化。
2)东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段的dsRNA的获得
以1)步骤获得的几丁质合成酶1A基因片段为模板,按照T7RiboMAXTM Express RNAiSystem(Promega)试剂盒说明,体外转录合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性,用酶标仪(Molecular Devices SpectraMax 190,Menlo Park,CA,USA)将其定量至终浓度为1μg/μL。保存至-70℃备用。
实施例2:几丁质合成酶1A基因片段合成的dsRNA致死东亚飞蝗
1、东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段合成的dsRNA注射
选取2龄东亚飞蝗第四天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA。25μl规格微量注射器用于注射,注射时不可用力过大,顺着血液流动的方向,侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点,要避开气门。注射几丁质合成酶1A基因片段合成的dsRNA的量为3μg,并设置dsGFP(3μg)的对照组,每组15头虫子,3个生物学重复,共计45头。注射完毕后,将虫子用1L的烧杯于人工气候箱中进行饲养(光照∶黑暗时间=14h∶10h,温度30±2℃,湿度60%),给以新鲜小麦幼苗和适当的光照,喷水保持湿度。
2、注射dsRNA后东亚飞蝗表型的观察
若虫注射完毕后继续饲养,并及时地观察。注射dsRNA的实验组与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。对照组飞蝗均可顺利蜕皮,从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟,注射dsRNA的实验组若虫中,有部分若虫生长发育出现畸形,因蜕皮困难死亡。表型见图1。
3、东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因沉默效果检测
取上述畸形但未死亡的3龄若虫,每组收虫6只,雌雄各半,实验组和对照组均取3个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA,采用M-MLV反转录酶获得第一链cDNA,以此为模板进行RT-PCR,检测几丁质合成酶1A mRNA的表达量是否降低。结果表明注射dsRNA实验组几丁质合成酶1A mRNA的表达量显著降低。见图2。
4、注射dsRNA后东亚飞蝗死亡情况的观察
注射dsRNA的东亚飞蝗实验组死亡率为88%。这与注射dsGFP的对照组(死亡率为0%)相比,致死效果明显。
SEQUENCE LISTING
<110>山西大学
<120>一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和应用
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
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<212>DNA
<213>Locusta migratoria manilensis(Meyen)
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<221>gene
<222>(1)..(214)
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taatacgact cactataggg gcaaaggacc tgaaagaatt gcgagattcg tctgtgtttt 60
ttttctttat gatgaatgca ctgttcgttc tcatcgtatt cttgctgcaa ctgagtaagg 120
ataagctaca tattaaatgg ccttttggag tcaaaacaaa cattacgttt aatgaagaaa 180
gtcagaaggt tcacccctat agtgagtcgt atta 214
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<213>Locusta migratoria manilensis(Meyen)
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<221>gene
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taatacgact cactataggg gcaaaggacc tgaaagaatt g 41
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<211>45
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<221>gene
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<400>3
taatacgact cactataggg gtgaaccttc tgactttctt catta 45
Claims (3)
1.一种东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段,其核苷酸序列是SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的一种东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段合成的dsRNA。
3.如权利要求2所述的一种东亚飞蝗几丁质合成酶1A基因片段合成的dsRNA在通过RNAi致死东亚飞蝗中的应用。
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