CN103305512A

CN103305512A - 用于抑制二化螟生长的利用acy1-CoA desaturase SexiVPAE基因的双链RNA的合成方法

Info

Publication number: CN103305512A
Application number: CN2013100443630A
Authority: CN
Inventors: 陈建军; 邵琴; 王林; 胡攀
Original assignee: WUHAN SHANGCHENG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN SHANGCHENG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-09-18

Abstract

一种二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因片段的dsRNA的合成方法，包括：根据二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆序列设计相应PCR引物；通过PCR的方法扩增acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA片段，并在体外转录合成dsRNA；将dsRNA添加到二化螟人工饲料中，用含有dsRNA的人工饲料喂饲二化螟。人工喂饲研究表明，较高浓度的dsRNA可以显著增加二化螟幼虫的死亡率并抑制其生长，该结果为进一步利用该dsRNA序列在生产上有效控制二化奠定了重要基础。

Description

用于抑制二化螟生长的利用acy1-CoA desaturase SexiVPAE基因的双链RNA的合成方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于RNA干扰技术的二化螟致死基因片段acyl-CoA desaturase SexiVPAE及其dsRNA。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体内通过RNA介导的一种特异性的基因沉默机制，其存在于从微生物到植物、动物等大多数真核生物内。RNAi对于生物体调控基因表达、抵御病毒入侵以及维持自身基因组稳定等具有重要意义。RNAi的机制于1998年由Fire等的研究发现。他们的研究表明，外源的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)可以导致秀丽新小杆线虫体内的同源基因特异性的沉默，这种现象被他们命名为RNA interference(RNAi)。其实在1998年之前人们就多次发现过RNAi的现象，如果Napoli等(1990)在牵牛花中发现的共抑制(co-suppresion)现象，Cogoni等(1994)在粗糙红色链孢霉菌中发现的压制作用(quelling)都属于RNAi。

利用RNAi机制，人们已经发展出了各种基因沉默的技术，这些技术在功能基因组研究、品种改良以及基因治疗等方面都显示出了巨大的应用前景。研究表明通过人工喂饲外源dsRNA可以特异性的沉默昆虫体内目标基因的表达((Araujo et al. 2006；Turner et al. 2006；Banm et al. 2007；Mao et al. 2007；Walshe et al. 2009)。基于这个原理近年来人们开始尝试利用RNAi机理培育转基因抗虫植物。2007年两个独立的研究小组分别报道了利用稳定表达外源dsRNA的植物喂饲昆虫可以特异性的抑制昆虫体内特异基因的表达，为培育转基因抗虫植物提供了新的思路。Mao等(2007)发现棉铃虫的一个细胞色素P450加单氧酶(cytochrome P450monooxygenases)CYP6AE14对于棉铃虫解除棉花棉酚的毒性起关键作用。他们用表达CYP6AE14基因的dsRNA的转基因拟南芥和烟草喂饲棉铃虫，发现棉铃虫中肠中CYP6AE14的表达量显著降低。棉铃虫中肠上CYP6AE14被抑制可以导致棉铃虫对棉酚的敏感性上升，因此该研究结果可用于发展转基因抗虫棉花。Mao等还用同样的策略特异性的抑制棉铃虫的另一个中肠基因glutathione-S-transferase(GST1)的表达，证明了该策略具有普遍性。Baum等(2007)尝试利用RNAi的策略特异性沉默西部玉米根虫(western corn rootworm，WCR)具有重要功能的关键基因来控制该害虫。通过喂食人工合成的dsRNA12h到1d后，害虫的目标基因的表达显著下降。然而相对于Bt杀虫基因通过RNAi策略来控制害虫的效果相对较慢。一般情况下，利用人工合成的dsRNA喂饲WCR幼虫3天后，其体重开始显著下降。但是，即使是抗虫效果最好的dsRNA片段，喂饲7d也难以观察到明显的致死效果，通常需要喂饲12d以上才能观察到比较明显的杀虫效果。Baum等利用WCR的V-ATPase基因设计的dsRNA片段转入玉米中高效表达。通过人工接种WCR卵块检测的结果表明，和非转基因的对照相比，转基因玉米显示出对WCR显著增强的抗性。用转基因玉米的根部组织喂饲WCR的幼虫发现其生长被明显抑制。

因此，利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，会引起害虫的致死或体重下降，从而达到控制害虫的目的。二化螟是水稻的主要害虫之一，由于其危害水稻时会钻入水稻茎杆类，造成喷施农药也对其难以控制。本专利发明就是利用实验室的dsRNA人工喂饲法，从二化螟基因组中筛选出经干扰后能够影响其生长发育的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。

发明内容

根据二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆序列设计相应PCR引物。通过PCR的方法扩增acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA片段，并在体外转录合成dsRNA。将dsRNA添加到二化螟人工饲料中，用含有dsRNA的人工饲料喂饲二化螟。人工喂饲研究表明，较高浓度的dsRNA可以显著增加二化螟幼虫的死亡率并抑制其生长，该结果为进一步利用该dsRNA序列在生产上有效控制二化奠定了重要基础。

本发明的具体步骤是：

根据二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆的序列，设计其PCR扩增的上游引物P1(SEQ ID NO.3)和下游引物P2(SEQ ID NO.4)。在P1和P2上分别添加T7启动子序列“TAATACGACTCACTATAGG”构成引物P3(SEQ ID NO.5)和P4(SEQ ID NO.6)。以二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆为模板，用P1+P4和P2+P3引物对，分别进行两个PCR反应，获得T7启动子在其上游或下游的两种不同PCR产物。两种PCR产物采用

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒(Promega)进行回收纯化。以回收的两种PCR产物为模板，利用T7RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒(Promega)分别进行体外RNA的转录。将分别转录的RNA等体积进行混合，70℃变性10min，然后缓慢冷却至室温以形成dsRNA，然后加入DNase和RNase降解DNA和单链RNA，最后对dsRNA进行纯化。配制二化螟的人工饲料，添加dsRNA至5种不同的浓度梯度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml和500ng/ml)。用含有不同浓度dsRNA的人工饲料喂饲一龄二化螟幼虫，连续喂饲8天后，检测二化螟幼虫的死亡率及存活幼虫的平均体重。

本发明还包括DNA分子在控制水稻二化螟危害中的应用。

本发明的有益效果在于：

利用RNAi技术沉默acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因，对二化螟幼虫的生长具有明显的抑制效果，说明该基因可作为利用RNAi技术控制二化螟的靶基因；

本发明采用喂饲法进行RNAi实验，相对注射法减少了对虫体的机械损伤，便于实验操作；

最终通过喂饲试验验证了对acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因进行RNAi，二化螟具有显著抑制效果，为建立利用RNA干扰技术控制二化螟的新策略提供潜在的新方法。

附图说明

图1是dsRNA合成电泳图，泳道1：DNA Marker，泳道2：纯化后的acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的dsRNA。

图2是dsRNA喂饲8天后二化螟幼虫的死亡率。ACD-50、ACD-100、ACD-200、ACD-300和ACD-500分别表示人工饲料中acyl-CoA desaturase SexiVPAE的dsRNA的浓度为：50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml和500ng/ml。“*”和“**”分别表示t测验的P值小于0.05和0.01。

图3是dsRNA喂饲8天后存活的二化螟幼虫的平均体重。ACD-50、ACD-100、ACD-200、ACD-300和ACD-500分别表示人工饲料中acyl-CoA desaturase SexiVPAE的dsRNA的浓度为：50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml和500ng/ml。“*”和“**”分别表示t测验的P值小于0.05和0.01。

其中：

序列表SEQ ID NO：1是acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因cDNA克隆的序列，长度为457bp。

序列表SEQ ID NO：2是用于体外合成dsRNA的PCR扩增序列，长度为237bp。

序列表SEQ ID NO：3是上游引物P1的序列，长度为21nt，其扩增产物用于体外合成dsRNA。

序列表SEQ ID NO：4是下游引物P2的序列，长度为20nt，其扩增产物用于体外合成dsRNA。

序列表SEQ ID NO：5是加T7启动子的上游引物P3的序列，长度为40nt，其扩增产物用于体外合成dsRNA。

序列表SEQ ID NO：6是加T7启动子的下游引物P4的序列，长度为39nt，其扩增产物用于体外合成dsRNA。

具体实施方式

实施例1acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因片段的获得

acyl-CoAdesaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆由华中农业大学植物科学技术学院华红霞教授提供。该cDNA克隆的序列见SEQ ID NO.1。利用该cDNA克隆的序列片段在http://www.ncbi.nlm nih gov/上进行同源性比对，将其注释为acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因。

(1)根据acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因片段序列，采用Primer Premier3.0软件设计基因特异的上游和下游引物，然后在上下游引物5’端加入T7启动子的序列TAATACGACTCACTATAGG；

上游引物(P1)：GGCACTACGCTTATCCTGTGA(SEQ ID NO.3)

下游引物(P2)：CCGCGTTAGTGTCGCTAAAT(SEQ ID NO.4)

上游引物加T7启动子(P3)：5′TAATACGACTCACTATAGGGGCACTACGCTTATCCTGTGA3′(SEQ ID NO.5)

下游引物加T7启动子(P4)：5′TAATACGACTCACTATAGGCCGCGTTAGTGTCGCTAAAT3′(SEQ ID NO.6)

利用acyl-CoAdesaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆为模板，以引物对P1+P4和P2+P3分别进行PCR反应以生成T7启动子在不同方向的PCR产物，PCR产物序列如SEQ ID NO.2，PCR反应的条件如下：

PCR条件：94℃变性10min，94℃30sec，60.5℃30sec，72℃30sec，32个循环，72℃延伸10min。

(2)PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，其序列见SEQ ID NO.2。采用

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒(Promega)进行回收：

①对分离得到的目标片段切胶，并放入称量过重量(a)的1.5ml微量离心管中，再次称量(b)，b-a算得所切胶重；

②根据胶重，每10mg凝胶加入10μL Membrane Binding Solution。凝胶重量不超过 350mg；

③将凝胶放入50-65℃水浴锅中水浴10min或者直到凝胶完全融化；

④将试剂盒中的滤管放置在配套的收集管中，转移融化的凝胶液体至滤管中，室温放置1min；

⑤14,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；

⑥加入700ul Membrane Wash Solution(已加入95％酒精)，14,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；

⑦加入500ul Membrane Wash Solution(已加入95％酒精)，14,000rpm离心5min，弃去收集管中的液体；

⑧不加液体14,000rpm转1nin；

⑨转移滤管到1.5ml微量离心管中，加入50μl Nuclease-Free Water，室温放置1min，14,000rpm离心1min；

⑩收集到的DNA产物保存在4℃或-20℃。

实施例2.RNA的体外转录及dsRNA的合成、纯化

(1)以回收的两种PCR产物为模板，利用T7RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒(Promega)进行体外RNA的转录，转录条件如下：

42℃水浴1h。然后将两管转录产物等体积混合，70℃干浴10min，缓慢冷却至室温(20min)。加入1μL1∶200稀释的RNase Solution和0.5μL的RQ1RNase-Free DNase(T7RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒自带)，37℃放置30min。加入0.1倍体积的3M NaAC和1倍体积的异丙醇，混合后冰上放置5min，13000rpm离心10min。弃去上清，加入75％的乙醇0.5mL，13,000rpm离心5min。去掉上清，室温空气干燥15min，加200μL nuclease-free水溶解。

(2)对dsRNA进行纯化，纯化的过程如下：

①加入等体积(200μL)的酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，混匀；

②12,000rpm离心5min；

③取上清转入新离心管中，加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；

④12,000rpm离心5min；

⑤取上清转移到新的1.5mL离心管中，加入0.1体积的3M的NaAC，两倍体积的95％乙醇；

⑥-20℃放置1h；

⑦13,000rpm离心20min

⑧弃去上清，加入0.5mL的75％乙醇；

⑨12,000rpm离心5min；

⑩弃去上清，空气中干燥15min，加入适量的nuclease-free水溶解。

实施例3.dsRNA喂饲实验

二化螟人工饲料配置参考了刘慧敏和张国安(2008)发表的配方，其成分为：稻茎粉18.75g、大豆粉15.00g、麦芽粉15.00g、稻糠粉6.25g、茭白茎粉7.50g、干酪素10.00g、酵母粉18.75g、纤维素7.50g、蔗糖15.00g、葡萄糖7.50g、维生素C7.50g、复合维生素B3.00g、胆固醇0.375g、氯化胆碱0.25g、Beck氏盐2.50g、山梨酸1.35g、琼脂13.49g和自来水809.25g。

分别称取配制好的各种饲料成分，放入容器中混匀。同时按配方总干物质重(用G表示)的10％称取琼脂，放入盛有6倍G的DEPC H2O的另一容器中，加热融解后加入1％G的山梨酸，搅拌均匀并使温度下降到60℃时，再分别加入Beck氏盐溶液，氯化胆碱和胆固醇，最后加入适量的纯化的dsRNA溶液，使其终浓度达到50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml和500ng/ml。作为对照的人工饲料不加入任何的dsRNA。然后迅速倒入前面的容器中，快速搅拌均匀后放入4℃冰箱中保存。

将配制好的饲料切成合适大小的条状，分别放入各自编号的饲养管中，饲养管为1.8cm×12cm平底玻璃试管。将刚孵化的二化螟幼虫接入饲养管中，每管接20头。然后将饲料管置于人工气候箱中，设置条件为29℃，湿度85％，光照16h/d。连续喂饲8天后统计二化螟幼虫死亡率和平均虫重。其结果见图2和3，结果表明dsRNA的作用表现出明显的剂量效应。当人工饲料中dsRNA浓度较低时(如50ng/ml)，其对二化螟幼虫的死亡率和体重的影响均不明显；当人工饲料中dsRNA浓度较高时(如达到300ng/ml以上)，二化螟幼虫的死亡率显著增加，其存活幼虫的平均体重下降50％以上。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因片段的dsRNA的合成方法，包括：

(1)根据二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆的序列，设计其PCR扩增的上游引物P1和下游引物P2；

(2)在P1和P2上分别添加T7启动子序列“TAATACGACTCACTATAGG”构成引物P3和P4；

(3)以二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆为模板，用P1+P4和P2+P3引物对，分别进行两个PCR反应，获得T7启动子在其上游或下游的两种不同PCR产物；

(4)两种PCR产物采用

SV Gel和PCR Clean-Up System试剂盒进行回收纯化；

(5)以回收的两种PCR产物为模板，利用T7RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒分别进行体外RNA的转录；

(6)将分别转录的RNA等体积进行混合，70℃变性10min，然后缓慢冷却至室温以形成dsRNA，然后加入DNase和RNase降解DNA和单链RNA，最后对dsRNA进行纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤(7)配制二化螟的人工饲料，添加dsRNA至5种不同的浓度梯度。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤(8)用含有不同浓度dsRNA的人工饲料喂饲一龄二化螟幼虫，连续喂饲8天后，检测二化螟幼虫的死亡率及存活幼虫的平均体重。

4.根据权利要求2所述的方法，步骤(7)中的浓度梯度为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml和500ng/ml。

5.权利要求1所述的DNA分子在控制水稻二化螟危害中的应用。