CN104046641A - 昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种昆虫Ⅱ型几丁质酶基因(Cht10)特异性dsRNA的应用，它可沉默Ⅱ型几丁质酶基因使飞蝗死亡，而对其他昆虫并无影响。对飞蝗的Ⅱ型几丁质酶基因进行克隆、测序后，分析其功能域；然后选择独有几丁质结合域，设计序列为SEQ ID NO：1的该基因片段，用于特异性双链RNA(dsRNA)的合成。该基因dsRNA注入飞蝗的体腔后，此种昆虫蜕皮时无法顺利蜕出进入下一龄期，导致死亡，死亡率达到100％。而其它昆虫注射该dsRNA并不导致死亡。本发明为基于RNA干扰的专一害虫防治提供靶标，可用于特定害虫飞蝗的防治。

Description

昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用。
背景技术
对于农业虫害，我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂加以控制，这引起一系列问题：害虫出现抗药性,需加大农药剂量,生产成本上升；农药残留导致环境污染严重，危害人类身体健康等。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。本发明提供一种基于RNA干扰的害虫防治应用。
RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，是21世纪以来十大热门科技之一，并于2006年获得诺贝尔奖。这一发现促进了生物学上许多新方法、新技术的出现，并应用于人们的生活当中，例如：人类的疾病治疗、基因功能研究和作物害虫防治等。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实验结果后，提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：对害虫独有基因进行干扰，抗虫具有专一性，对高等动物和和人类是安全的；对环境无毒无害。
昆虫的几丁质酶基因家族包含多个基因，不同的基因负责不同的生物学功能。Ⅱ型几丁质酶基因即为昆虫几丁质酶基因10(cht10)，它主要负责蜕皮时外骨骼几丁质的降解，昆虫缺失此基因后表现为蜕皮困难而致死。由于高等动物中并没有同类型的基因，故对该基因进行RNA干扰是安全的。该基因在不同昆虫中分化较大，可以设计特异性的dsRNA进行专一的害虫防治，而不影响其他昆虫。
发明内容
本发明的目的提供一种昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA在致死害虫中的应用。
本发明提供的昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用，其核苷酸序列是SEQ IDNO：1。该序列是通过对飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因(LmCht10)氨基酸序列分析后，选择飞蝗所特有的几丁质结合域(chitin-binding domain，CBD)，设计上游引物SEQ ID NO：2和下游引物SEQ ID NO：3，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1，其含有T7启动子，核苷酸序列长度为332bp。进一步利用试剂盒合成dsRNA(dsCBD)。
SEQ ID NO：1合成的dsRNA(dsCBD)在致死害虫中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：1合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。储粮害虫赤拟谷盗注射该dsRNA后，此昆虫的Ⅱ型几丁质酶基因(TcCht10)并没有受到干扰，幼虫也没有出现蜕皮困难的情况，并可以发育至成虫。由此可见，该dsRNA只针对性的干扰飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因，而对其他昆虫同源基因并没有影响。
附图说明
图1：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因功能域分布示意图。黄色部分为几丁质酶催化域，绿色部分为几丁质结合域。第一个几丁质结合域为飞蝗所特有，为红圈标识。
图2：飞蝗注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA，24h后飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，β-actin做为内参基因。**P<0.01。
图3：五龄飞蝗注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA。
图4：赤拟谷盗幼虫注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA，24h后赤拟谷盗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，β-actin做为内参基因。
图5：赤拟谷盗幼虫注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA后发育正常。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA。
具体实施方式
实施例1：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的获得
1、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因氨基酸序列分析
基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，获得飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因(LmCht10)序列，该序列编码2964个氨基酸。在SMART网站上对其进行功能域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，得到其独有的几丁质结合域1(图1)。
2、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA合成
1)飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA引物的设计
基于飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因独有的几丁质结合域1的序列，采用primer premier5.0软件设计。设计dsRNA引物，其序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。
2)飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的合成
上述dsRNA引物合成序列为SEQ ID NO：1的PCR产物，经SV Gel and PCRClean-Up System(Promega)试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA(dsCBD)。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax190测定，并浓缩至终浓度为3μg/μl。
实施例2：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA致死五龄飞蝗
1、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA注射
将2μl(6μg)SEQ ID NO：1的dsRNA(dsCBD)用25μl规格微量注射器注射到五龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，共注射30只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后飞蝗置于30℃恒温生化培养箱中饲养。
2、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因沉默检测
对于五龄dsRNA注射后24h检测其沉默效率，整虫虫体作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链cDNA，Real-time PCR检测目的基因(LmCht10)和管家基因(β-actin)的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率(图2)。
3、注入dsRNA后五龄飞蝗表型的观察
五龄若虫注射dsRNA后，对照组虫体6天后开始蜕皮并在注射后第7天全部成功发育至成虫，蜕皮时间约为15min，蜕皮发育为成虫后虫体状态良好。注射飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA(dsCBD)的处理组若虫共30头，与对照组相比未出现蜕皮延迟的现象，但蜕皮一直持续直至死亡。30头若虫均未能够蜕至成虫，死亡率达到100％。30头死亡若虫出现表型(图3)为：蝗蝻蜕皮时翅芽张开、背部弓起，旧表皮未开裂，腹部底端出现红肿腐烂，昆虫死亡。
实施例3：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA对赤拟谷盗幼虫发育无影响。
1、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA注射赤拟谷盗
将400ng SEQ ID NO：1的dsRNA(dsCBD)用显微注射仪注射到赤拟谷盗幼虫体内，共注射28头，雌雄各半。注射相同质量的dsGFP至对照组体内。将注射后赤拟谷盗幼虫置于30℃恒温生化培养箱中饲养。
2、赤拟谷盗Ⅱ型几丁质酶基因沉默检测
对于赤拟谷盗幼虫dsRNA注射后24h检测其沉默效率，整虫虫体作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链cDNA，半定量PCR检测目的基因(TcCht10)和管家基因(β-actin)的表达水平，以观察其是否沉默(图4)。
3、注入dsRNA后赤拟谷盗幼虫的观察
注射不同dsRNA后，两组赤拟谷盗幼虫在体长、重量及活跃度都无明显差异，也均可顺利化蛹和羽化为成虫，没有出现蜕皮困难导致死亡的现象。

Claims (4)

1.一种昆虫Ⅱ型几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的昆虫Ⅱ型几丁质酶基因的dsRNA的合成方法，用上游引物SEQ IDNO：2，下游引物SEQ ID NO：3，合成PCR产物，经SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成的dsRNA。
3.如权利要求2所述方法合成的昆虫Ⅱ型几丁质酶基因的dsRNA。
4.如权利要求3所述的dsRNA在致死飞蝗中的应用。
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