CN109251929A - 一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA - Google Patents

一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA，通过RNA干扰技术，使注射特定siRNA干扰二化螟的几丁质酶基因CsCht10后，再结合喷洒白僵菌对二化螟幼虫进行毒杀，白僵菌防治效果得到显著提升。

Description

一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体的涉及一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的 siRNA及其应用。
背景技术
二化螟Chilo suppressalis(Walker)属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一。在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致二化螟对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。因此，在农业生产实践中，以白僵菌、绿僵菌、苏云金杆菌等真菌作为生物农药被广泛运用于害虫防治。白僵菌(Beauveria)是一种真菌性杀虫剂，对人、畜无毒，对作物安全，无残留、无污染，但对家蚕有毒害，在自然界中广泛分布。已知白僵菌可侵染200 多种昆虫，是很好的防治害虫的生物制剂，而球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是目前研究和应用最多的病原真菌之一，能够引起二化螟、蓟马、烟粉虱、松毛虫等昆虫白僵病的发生，现已广泛应用于工农业生产上。
几丁质是昆虫的表皮和围食膜等结构的重要组分，在昆虫生长发育的各个时期都需要一定量的几丁质酶来调节几丁质含量，以适应周期性的蜕皮和变态。几丁质酶可以用于降解昆虫表皮和围食膜等结构中的几丁质，破坏昆虫的保护屏障，从而为其它昆虫病原微生物侵入其体内提供便利，有助于提高昆虫的感病率以及死亡率。几丁质酶与昆虫幼虫的蜕皮、化蛹以及成虫的羽化密切相关。农业生产上，几丁质酶及其抑制剂可以用作生物杀虫剂或杀菌剂，有助于提高作物的抗虫、抗病等能力。
作为现代分子生物学领域重大的技术突破之一，RNA干扰(RNAi)是目前研究基因功能比较成熟有效的分子生物学技术。实验证明，利用RNAi技术来沉默某些昆虫基因的表达，可以达到影响昆虫发育甚至致死的目的。随着昆虫基因的功能分析显著增加，特别是那些沉默导致死亡或干扰病原体传播的基因，鉴定这些候选基因对于增加RNAi在病虫害防治中的作用意义重大，而RNAi技术则可作为控制病虫害(包括作为植物病原体重要载体的病虫害) 的有效策略。
昆虫几丁质酶基因对昆虫生命活动的维持有重要的作用，因此，从理论上而言，如果利用RNAi技术干扰农业害虫中重要几丁质酶基因的表达并结合真菌的侵染，则会使害虫的致畸率或致死率增强，达到联合毒杀的效果。本专利发明就是提供了一种通过注射特定siRNA 来干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10，并结合生物农药白僵菌联合侵染致死二化螟幼虫，白僵菌对二化螟的防治效果得到提升。
发明内容
本发明的目的提供了用于二化螟防治中增强白僵菌防治效果的RNAi技术的靶标基因及其应用，可通过如下技术方案实现：
一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列如SEQ ID No.1所示：
本发明的siRNA在制备二化螟灭虫药剂中的应用；
一种二化螟灭虫方法，其特征在于：将权利要求1所述的siRNA用溶剂溶解配置成溶液 A，使用溶液A注射二化螟幼虫：
优选地，
(1)所述溶剂为经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌水，所述溶液A的浓度为100pmol/μl；
(2)在二化螟幼虫的上背部或侧面，对二化螟幼虫注射溶液A 2μL/头；
(3)用针头挑起虫体，待溶液A已混入幼虫血腔，轻轻拔出针头；
(4)注射24小时后，用白僵菌孢子悬浮液喷洒注射过溶液A的二化螟幼虫。
有益效果：
本发明利用RNA干扰技术，通过注射特定siRNA来干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10，再用白僵菌侵染二化螟，提高了白僵菌对二化螟的致死效果。
附图说明
图1注射了siCsCht10的二化螟幼虫感染Bb84后的表型图。
具体实施方式
实施例1
CsCht10的全长克隆和生物信息学分析：
(1)在已知二化螟基因组(http://www.insect-genome.com/)的情况下，从Insectbase数据库(http://www.insect-genome.com/)中搜索到多条二化螟几丁质酶基因片段序列，通过筛选片段并利用RACE技术将CsCht10的片段序列成功克隆得到了全长，并获取了其3′UTR区、 5′UTR和完整的CDS区；
(2)引物设计：使用primer5.0软件完成，其中两轮引物的长度为均27nt；GC含量为65.4％；序列不与UPM 3’端互补。其中，GSP是指第一轮PCR反应中使用的基因特异引物；NGSP是指第二轮PCR反应中使用的巢氏基因特异引物。两轮PCR的RACE引物如表1所示：
表1 RACE引物
(2)提取总RNA：将液氮置于匀浆器中预冷，加入样品后再次加入液氮研磨至粉末，加 1mlTrizol研磨，后转入EP管中，设置4℃、12000g条件并离心15min后获取上清液；接着加0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，震荡15s，室温温浴5min；然后设置4℃,12000g条件离心15min，取上层水相置于新EP管中，加0.5ml异丙醇，室温温浴10min；再次设置4℃,12000g条件离心15min，弃上清，加1ml 75％乙醇进行洗涤两次，涡旋混合，7500g(2～8℃)离心 5分钟，弃上清；随后让沉淀的RNA在室温在自然干燥后用Rnase-free water溶解RNA沉淀；最后通过凝胶成像检测并检测浓度，获得所需总RNA；
(3)反转录及测序：为了准确定量基因的表达量，首先利用TaKaRa的PrimeScriptTMregent Kit with Gdna Eraser试剂盒去除基因组DNA，然后进行cDNA的合成，整个过程在冰上操作。具体步骤是先在500μl Ep管中配置反应液(冰浴)，然后在PCR中进行反应，合成的cDNA于-20℃保存备用。其中5'-RACE cDNA和3'-RACE cDNA分开合成，在结束PCR 反应后依次完成分子克隆和连接反应。最后将菌液PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带情况选取相应的菌液送至金斯瑞公司(中国南京)测序，送测新鲜菌液量不少于100μl。最终获得完整序列信息：cDNA长度为1500bp，编码区范围是64bp-1500bp，基因翻译的蛋白分子量为52.43KD。
(4)为了确定克隆得到的几丁质酶基因序列可靠性，通过信号肽检测、GeneDoc比对和 BLASTX检测等一系列生物信息学手段进行了分析验证，证实序列可靠。
实施例2
siRNA注射实验及白僵菌侵染：
(1)siRNA的化学合成。siCsCht10是指对CsCht10基因特异的小干扰RNA；NCsiRNA是与目的基因序列无同源性的通用阴性对照。siRNA序列如表2所示，由上海吉玛制药技术有限公司(中国上海)进行化学合成，并通过使用高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。将 1ODsiRNA干粉溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌水中稀释至终浓度为100pmol/μl 的siRNA溶液。
表2 siRNA序列
(2)使用具有1.0mm外径和0.50mm内径的玻璃毛细管使用微量移液管拉拔器(型号P87，Sutter Instruments Co.，Novato，CA，USA)拉动针，针在注射点保持30秒以避免小干扰RNA泄漏。接着使用Eppendorf InjectMan NI 2显微注射系统(Eppendorf，Hamburg，Germany)进行siRNA注射(2μl/次)。
(3)选取100只6龄的6日龄的二化螟幼虫，在上背部或侧面，通过EppendorfInjectMan NI 2显微注射仪向每头试虫注射2μl siRNA溶液，用针头挑起虫体，等待30秒左右，待siRNA 已混入幼虫血腔后，轻轻拔出针头，实验重复三次；
(4)siRNA注射完成后，于24h、48h和72h分别取样，提取总RNA，反转录后进行定量PCR并检测RNAi干扰的效果：注射完基因特异性的siRNA 24h后即可检测到mRNA水平有明显的降低；注射48h后可检测到部分基因的表达量略有上升；注射72h后检测mRNA表达水平，处理组与对照组没有明显差异，表明siRNA有效可用。
(5)取球孢白僵菌菌株(Bb84)，接种于PDA平板上，于在28±1℃，RH95％,光周期12L ﹕12D条件下培养一周。向平板内加入适量0.15mol/L NaCl溶液，充分吹打，洗下孢子。将孢子和菌丝的混合悬浮液转移至50ml 0.05％吐温-80溶液的离心管中，漩涡震荡10min，使球孢白僵菌孢子分散，用滤纸过滤，得到球孢白僵菌的单孢子悬液。用血球计数板计数，得出单孢子悬液，用适量的0.15mol/L NaCl溶液，将单孢子悬液稀释至终浓度为1×108个/mL。
一天后，将活化并稀释过的球孢白僵菌单孢子悬浮液通过手持式Micro Ultra喷雾器喷洒在玻璃瓶中RNAi过后的二化螟幼虫及水稻幼苗上，将处理过后的二化螟置于28±1℃， RH95％，光周期18L﹕6D条件下培养，每隔12小时观察记录对照组和处理组的试虫表型、死亡时间及死亡率。
表3白僵菌侵染效果对比
结果显示处理组相较于对照组而言，死亡时间有明显的提前12小时，干扰后5天，死亡率明显增加(处理组92.3％，对照组51.9％)；同时二化螟被白僵菌侵染后会发红变僵硬、死亡，接着二化螟体表长出白色绒毛状或棉絮状菌丝，后期成粉状。
序列表
<110> 杭州贝英福生物科技有限公司
<120> 一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcggaaacu ggaaggaaa 19

Claims (4)

1.一种干扰二化螟几丁质酶基因CsCht10的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列如SEQID No.1所示。
2.权利要求1所述的siRNA在制备二化螟灭虫药剂中的应用。
3.一种二化螟灭虫方法，其特征在于：将权利要求1所述的siRNA用溶剂溶解配置成溶液A，使用溶液A注射二化螟幼虫。
4.根据权利要求3所述的二化螟灭虫方法，其特征在于：
(1)所述溶剂为经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌水，所述溶液A的浓度为100pmol/μl；
(2)在二化螟幼虫的上背部或侧面，对二化螟幼虫注射溶液A 2μL/头；
(3)用针头挑起虫体，待溶液A已混入幼虫血腔，轻轻拔出针头；
(4)注射24小时后，用白僵菌孢子悬浮液喷洒注射过溶液A的二化螟幼虫。
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