JPH02100693A - ガラクトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ビフィドバクテリウム菌増殖促進作用を有す
るガラクトオリゴ糖すなわち一般式Ｇａ　１−（Ｇｓ　
ｌ）＋＋Ｇｌｃ　（但し式中Ｇｌ＋はガラクトース残基
、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を、それ
ぞれ表す）で示されるガラクトオリゴ糖を、乳糖より収
率よく製造する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

乳糖からガラクトオリゴ糖を製造する方法としては、乳
Ｗにアスペルギルスのβ−ガラクトシダーゼを作用させ
る方法（特公昭５８−２０２６６）、クリプトコツカス
属酵母を利用する方法（特開昭６ｌ−２３６７９０）な
どがあるが、これらβ−ガラクトシダーゼによるβガラ
クトシル転移反応を利用する方法では、反応によるガラ
クトオリゴ糖の生成量が少なく、ガラクトオリゴ糖の対
乳糖収率は３０％程度にとどまる。その原因の一つとし
ては、副生ずる単糖類による阻害作用が考えられる。す
なわち、β−ガラクトシル転移反応に並行して起こる加
水分解反応によって単糖類が副生ずるが、この単糖類の
主成分であるグルコースは、β−ガラクトシル転移反応
のアクセプターとなって転移二糖類を生成するので、オ
リゴ糖を生成する転移反応と競合してしまう。また、単
糖類はβ−ガラクトシダーゼの活性を阻害し、転移反応
の速度を低下させることが知られている。ガラクトオリ
ゴ糖の生成量は反応の基質である乳糖が仕込み濃度の約
１／２以下になるまで反応した時点で最大になるが、反
応の進行と共に反応液中の単糖類濃度は高くなるから、
阻害作用はより強くなり、反応時間の遅延を招き、他の
副反応なども起きてくると考えられる。

さらｔこ、反応生成物中には、未反応の乳糖や加水分解
反応で副生じた単糖類、さらには副生じた単糖類から生
成した転移二糖類などが多量に含まれており、目的とす
るガラクトオリゴ糖の含有率が低い。

そこで、ガラクトオリゴ糖の対乳糖収率を向上させあわ
せて反応生成物のオリゴ糖含有率を向上させる方法が研
究され、その結果、クリプトコツカス属酵母を乳糖に作
用させるにあたり反応ｌこよって生成するグルコースと
ガラクトースを他の酵母で消費させながらガラクトオリ
ゴ糖生成反応を進行させることによりガラクトオリゴ糖
含有率の高い反応生成物を得る方法が提案されている（
特開昭６２−１３０６９５）。しかしながら、反応中副
生ずる単糖類を酵母に消費させることにより消去しなが
ら反応を進める方法は、大量のグルコースとガラクトー
スを微生物に消費させるだけでこれを有効に利用するこ
とができないし、ガラクトオリゴ糖の対乳糖収率の向上
も満足できるものではない。

また、反応に大量の酵母が必要であり、反応終了後に酵
母を除く操作、酵母の代謝産物を反応精製物から除く精
製操作、廃酵母の処理なども必要で、経費がかさむとい
う問題がある。

更に、上述のような単糖類による転移反応阻害は、単糖
類濃度が高いほど強く現れるから、反応液の原料乳糖濃
度を高くして反応効率を上げようとする試みの妨げとな
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、β−ガラクトシダーゼ（または該酵素
を含有する微生物）の作用を利用して乳糖からガラクト
オリゴ糖を製造する方法における上述のような問題点を
解決することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明が提供するガラクトオリゴ糖の製造法は、βガラ
クトシダーゼを含有する微生物またはβ−ガラクトシダ
ーゼを乳糖に作用させてガラクトオリゴ糖を生成させる
に当たり、反応液中にグルコースイソメラーゼを共存さ
せることを特徴とするものである。

この製造法で反応液中に共存させたグルコースイソメラ
ーゼは、乳糖の加水分解により生成したグルコースを逐
次異性化してフラクトースに変換し、反応液中にグルコ
ースが蓄積して転移反応を阻害するのを防止する。した
がって、グルコースイソメラーゼはβ−ガラクトシダー
ゼと共存させて同時に作用させることが必要であり、逐
次作用させたのでは、ガラクトオリゴ糖の収率向上は望
めない。

使用するグルコースイソメラーゼは、いかなる起源のも
のでもよく、たとえば、ＧＯＤＯ−ＡＧＩ　（合同酒精
株式会社）、スイートザイム（ノボ）　、ＴＯＹＯＧＩ
（東洋醸造株式会社）などを用いることができる。

β−ガラクトシダーゼとしても、どのような起源のもの
を用いてもよく、たとえばアスペルギルス・オリゼ、ア
スペルギルス・ニガーなどのカビ由来のもの、ブレラ・
シンギュラリス、キャンシダ属、クリペロマイセス属な
どの酵母由来のもの、バチルス・サーキュランス、ラク
トバチルス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・サー
モフィルスなどの細菌由来のものなどがあり、また、ク
リプトコツカス・ロウレンティの酵素（特開昭６２−１
１１６８５）を使用することもできる。市販品としては
、マキシラクト（ギストプロケード社）、ラクターゼＹ
４００　（ヤクルト本社）、ラクトザイム（ノボ社）　
、ＧＯＤＯ−ＹＮＬ　（合同酒精社）、ビオラフタ（大
和化我社）などがある。

両酵素は、酵素溶液として用いるほか、固定化酵素の形
で用いてもよい。各酵素を含有する微生物を反応に用い
ることもでき、その場合、微生物を固定化微生物の状態
にして用いてもよい。

併用するグルコースイソメラーゼの量は、β−ガラクト
シダーゼの作用によって生成するグルコースを直ちにフ
ラクトースに変換するのに必要な量とすることが望まし
いが、それよりも過剰に用いても差し支えない。

ＰＨ，温度等の反応条件は、二つの酵素が共によく働く
ように、それらの特性にあわせて選定することが望まし
い。通常、β−ガラクトシダーゼによる糖転移反応は、
弱酸性から中性付近で可能であり、グルコースイソメラ
ーゼは中性から弱アルカリ性で作用するので、好適ｐ）
（は５〜８である。また、反応温度は、通常３０〜９０
°Ｃ１望ましくは４０〜７０°Ｃが適当であるが、高濃
度の糖液中では酵素が安定化するので、高い反応温度を
採用することができる。

反応開始時の原料乳糖の濃度は、約４．５〜９０％の範
囲であればよいが、β−ガラクトシダーゼは、乳糖濃度
が高いほど高率でガラクトオリゴ糖を生成させる。した
がって、特に好ましい乳糖濃度は、過飽和状態を含む約
２０〜８０％である。また、グルコースイソメラーゼに
よる異性化も、グルコース濃度が高いほど早く進行する
。したがって、乳糖は可能な限り高濃度で仕込むことが
望ましい。

なお、反応に用いるβ−ガラクトシダーゼとグルコース
イソメラーゼに金属要求性がある場合は、他の酵素の活
性を阻害しない範囲で必要な金属を添加する。

一般に、グルコースイソメラーゼはマグネシウム塩が活
性発現に必要であるが、β−ガラクトシダーゼは、マグ
ネシウム塩で安定化されるか、あるいは活性発現には全
く影響を受けないので、多くの場合、マグネシウム塩の
添加が最も適当である。

上述のような好適反応条件で反応させた場合の反応時間
は次のようにする。まず回分式反応のときは、反応時間
が経過するにともない増加し続けたガラクトオリゴ糖が
、ある時期からはその加水分解反応が優位になることに
より減少し始めるので、最高のガラクトオリゴ糖収率を
与える時点の前後で反応を停止させる。

また、固定化酵素反応の場合は、ガラクトオリゴ糖生成
量が最高になるように基質供給速度を設定する。この場
合、グルコースイソメラーゼによる異性化反応は、グル
コース−フラクトース間の平衡反応であるため、β−ガ
ラクトシダーゼが乳糖に作用する反応がガラクトオリゴ
糖生成率に影響を与える主Ｉ；る因子である。

したがって、過剰のグルコースイソメラーゼ存在下では
、β−ガラクトシダーゼの反応時間を制御すればよい。

必要とする酵素を含有する微生物を反応に用いた場合も
同様で、特殊な注意は不要である。

反応生成物は、必要に応して（微生物を用いた場合にお
ける）微生物分離、脱色精製、単糖類分離、濃縮、乾燥
などの処理を施して、ビフィドバクテリウム菌増殖促進
因子としての用に供する。

〔発明の効果〕

本発明のガラクトオリゴ糖製造法は、β−ガラクトシダ
ーゼを乳糖に作用させてガラクトオリゴ糖を製造するに
あたり副生ずるグルコースをグルコースイソメラーゼに
より逐次フラクトースに変換し、反応液中にグルコース
を蓄積させないから、第一に転移反応における競合反応
を無くすことによってガラクトオリゴ糖収率を上げ、第
二にβ−ガラクトシダーゼの活性阻害作用を減じてガラ
クトオリゴ糖収率を向上させることができる。そして、
ガラクトオリゴ糖との分離が困難な転移二糖類と未反応
乳糖の量を減らすことができるため、反応後の精製が容
易になるほか、精製によって分離される糖混合物も、甘
味度の高いフラクトースやガラクトースを主成分とし、
甘味料としての利用価値が高いものになるという利点が
ある。

〔実施例） 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例１ 乳糖３５０ｇを０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に加えて加熱溶解し、全量を５００ｍ１とし
た。これにアスペルギルス・オリゼ由来のβ−ガラクト
シダーゼ・ラクターゼＹ−４００（株式会社ヤクルト本
社）を１５００単位および固定化グルコースイソメラー
ゼ・ＧＯＤＯ−ＡＧＩ　（合同酒精株式会社。

３１０１ＧＩＵ／ｇ）　５０　ｇを加え、さらに硫酸マ
グネシウムを５ｍＭになるように加えて、６０°Ｃで一
夜振とうしながら反応させた。固定化グルコースイソメ
ラーゼを濾別したのち、反応液を加熱してβ−ガラクト
シダーゼを失活させた。酵素反応を停・止させた反応液
に次いで活性炭５ｇを加えて脱色処理し、無色透明の糖
液を得た。

実施例２ 乳糖３０ｇを０．０５Ｍリンリン酸カリウム緩衝液Ｈ６
，０）に加えて加熱溶解し、全量を４５１とした。

これにブレラ・シンギュラリス由来のβ−ガラクトシダ
ーゼを２７単位、固定化グルコースイソメラーゼ・ＧＯ
ＤＯ−ＡＧＩを５ｇ、ＩＭの硫酸マグネシウムを０．２
５ｍ１加え、さらに水を加えて全量を５０ｍ１にし、５
５°Ｃで一夜振とうしながら反応させた。固定化グルコ
ースイソメラーゼを濾別したのち、反応液を加熱してβ
−ガラクトシダーゼを失活させた。酵素反応を停止させ
た反応液に次いで活性炭１ｇを加えて脱色処理し、無色
透明の糖液を得た。

実施例３ 乳糖２５ｇを０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）に加えて加熱溶解し、全量を４５ｍ１とした。

これにバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ・ビオラフタ（大和化成社）２００単位、固定化
グルコースイソメラーゼ・ＧＯＤＯ−ＡＧＩを５ｇ、Ｌ
Ｍの硫酸マグネシウムを０．２５ｍ１加え、さらに水を
加えて全量を５０ｍ１にし、５５°Ｃで一夜振とうしな
がら反応させた。固定化グルコースイソメラーゼを濾別
したのち、反応液を加熱してβ−ガラクトシダーゼを失
活させた。酵素反応を停止させた反応液に次いで活性炭
１ｇを加えて脱色処理し、無色透明の糖液を得た。

実施例４ 乳糖２５ｇを０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）に加えて加熱溶解し、全量を４５１とした。

これに、常法により調整したラクトバチルス・ブルガリ
カスＡＴＣＣ１１８４２のβ−ガラクトシダーゼを３０
０単位、固定化グルコースイソメラーゼＧＯＤＯ−ＡＧ
Ｉを５ｇ、１Ｍ硫酸マグネシウムを０．２５ｍ１加え、
さらに水を加えて全量を５０ｍ１にし、５０°Ｃで一夜
振とうしながら反応させた。固定化グルコースイソメラ
ーゼを濾別したのち、反応液を加熱してβ−ガラクトシ
ダーゼを失活させた。酵素反応を停止させた反応液に、
次いで活性炭１ｇを加えて脱色処理し、無色透明の糖液
を得た。

実施例５ 乳糖２５ｇを０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）に加えて加熱溶解し、全量を４５ｍ１とした。

これに、培養により得たストレプトコッカス・サーモフ
ィルスＹＩＴ２０４６の菌体懸濁液（β−ガラクトシダ
ーゼ活性として３００単位）、固定化グルコースイソメ
ラーゼＧＯＤＯ−ＡＧ　Ｉを５ｇ、１Ｍの硫酸マグネシ
ウムを０．２５ｍ１加え、さらに水を加えて全量を５０
ｍ１にし、５０′Ｃで一夜振とうしながら反応させた。

固定化グルコースイソメラーゼとストレプトコッカス・
サーモフィルスの菌体を濾別した反応液に活性炭１ｇを
加えて脱色処理し、透明な糖液を得た。

以上の各側による反応生成物の組成を法衣にまとめて示
した。なお、固定化グルコースイソメラーゼを併用しな
いほかは同様にして行なった比較例の結果もあわせて示
した。

反応生成物糖組成（単位二重量％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 β−ガラクトシダーゼを含有する微生物またはβ−ガラ
   クトシダーゼを乳糖に作用させて一般式Ｇａｌ−（Ｇａ
   ｌ）＿ｎ−Ｇｌｃ （但し式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコ
   ース残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ表す）で示さ
   れるガラクトオリゴ糖を生成させるに当たり、反応液中
   にグルコースイソメラーゼを共存させることを特徴とす
   るガラクトオリゴ糖の製造法。