CN116987689B - 一种结晶阿洛酮糖的制备方法 - Google Patents

一种结晶阿洛酮糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种结晶阿洛酮糖的制备方法，本发明通过制备含D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶酶制剂的固定化酶、含固定化酶和凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂的色谱分离系统进行阿洛酮糖料的制备，再将所得阿洛酮糖料液依次进行脱色、离子交换脱盐、真空浓缩、蒸发补料结晶和降温结晶，得到结晶阿洛酮糖。本发明通过以上制备方法，实现了阿洛酮糖的连续高效转化，阿洛酮糖出料纯度达到98~99%、单位树脂单位时间处理量达到0.038~0.045t/m3·h，远高于一般的糖化过程所得纯度，可生产连续，减少中转、暂存等过程，提高生产效率。

Description

一种结晶阿洛酮糖的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种结晶阿洛酮糖的制备方法。
背景技术
D-阿洛酮糖简称阿洛酮糖，是一种低卡路里的天然甜味剂，其甜度为蔗糖的70％，但卡路里仅为蔗糖的10％。阿洛酮糖于2012年被食品和药品管理局(FDA)批准为食品添加剂，并被认为是公认安全(GRAS)的。然而，阿洛酮糖的高成本限制了其作为甜味剂的用途。
阿洛酮糖由于含量极少，不易从自然界中提取，并且化学合成的方法不易纯化。酶法转化可避免发酵法过程中微生物全合成途径错综复杂的反馈调节作用，达到相当高的产物浓度，而且产物提取过程相对简单，无疑是相当具有开发潜力的。但是纯的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶不具备较好的稳定性，很容易受到pH值、温度以及有机物的影响，在工业的应用上很容易失去其酶活性，并且无法进行反复使用。近现代科学发展催生而来的借助化学或者物理的方式，把酶固定在载体中实现固定化酶加工的技术，不但让酶维持了过去的催化特性，而且也削弱了游离酶自身所具有的缺陷，促进自动化和连续反应的进行，可以最大限度的削弱成本，因此开发D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化技术，对阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。
随着阿洛酮糖作为甜味剂备受瞩目，在食品产业领域，开发可有效生产阿洛酮糖的方法的必要性逐渐增加；2006年韩国希杰第一制糖株式会社以果糖为底物通过酶的差向异构化来制备D-阿洛酮糖。将来源于根瘤农杆菌的阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化后，通过加有二氯化锰的果糖溶液，使果糖转化为D-阿洛酮糖。然而果糖具有与阿洛酮糖类似的物性，从而即使生产阿洛酮糖，也存在难以从果糖中分离其的问题。因此，亟需一种能够以高效率生产阿洛酮糖且容易分离其的阿洛酮糖的生产方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种结晶阿洛酮糖的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种结晶阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：
1）以Co2+型树脂为固定化载体对阿洛酮糖差向异构酶进行吸附，吸附完成后加入壳聚糖溶液进行交联，得到固定化酶；
2）将所得固定化酶和凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂分别装填至色谱分离系统的色谱柱中，得到固定化酶色谱柱和凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱；
3）将果糖溶液通过固定化酶的色谱柱进行酶转化，得到酶转化液；
4）将所得酶转化液通过凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱进行色谱分离，得到果糖溶液和剩余酶转化液；将所得果糖溶液与所述步骤3）中的果糖溶液合并；
5）将所得剩余酶转化液继续通过凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱，得到阿洛酮糖料液；
6）将所得阿洛酮糖料液依次进行脱色、离子交换脱盐和真空浓缩，得到阿洛酮糖溶液；
7）将所得阿洛酮糖溶液依次经过蒸发补料结晶和降温结晶，得到结晶阿洛酮糖。
优选的，所述步骤1）中Co2+型树脂的制备方法为：
将树脂依次进行蒸馏水浸泡、氢氧化钠溶液浸泡、盐酸浸泡和CoCl2溶液浸泡处理后，得到最终的Co2+型树脂。
优选的，所述蒸馏水浸泡、氢氧化钠溶液浸泡、盐酸溶液浸泡时间均为4~5h，所述CoCl2溶液浸泡时间为8~12h。
优选的，所述步骤1）中阿洛酮糖差向异构酶的用量为100~120U/g树脂，所述壳聚糖溶液的质量浓度为1~1.5%，所述壳聚糖溶液与Co2+型树脂的体积比为0.2~0.4:1。
优选的，所述步骤2）的色谱分离系统的具体组成为：
所述色谱分离系统包括依次编号的8个色谱柱，其中1号色谱柱、2号色谱柱、3号色谱柱、5号色谱柱、6号色谱柱、7号色谱柱和8号色谱柱依次连接，4号色谱柱备用；所述1号色谱柱、2号色谱柱、3号色谱柱和4号色谱柱中装有固定化酶，所述5号色谱柱、6号色谱柱、7号色谱柱和8号色谱柱中装有凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂。
优选的，所述步骤2）的色谱分离系统的运行过程具体为：
将质量浓度为55~60%的果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入5号柱，由6号柱进入纯净水，6号柱出口未经酶转化的果糖溶液，顺管道向1号柱返回，同时提高进料口果糖溶液的质量浓度至70~75%，与6号柱返回的果糖溶液进行混合得到质量浓度为55~60%的果糖溶液，由8号柱出口经酶转化的阿洛酮糖料液；当切换至下一运行周期时，将上述得到的质量浓度为55~60%的果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入6号柱，由7号柱进入纯净水，7号柱出口果糖溶液，顺管道向1号柱返回，同时提高进料口果糖溶液的质量浓度至70~75%，与7号柱返回的果糖液进行混合，由5号柱出口经酶转化的阿洛酮糖料液，此后运行周期依此类推，形成连续生产。
优选的，所述步骤1）中固定化酶对果糖的转化率为30~33%，半衰期为25~28天。
优选的，所述步骤1）中交联的温度25~35℃，交联的时间1~2h。
优选的，所述步骤3）中果糖溶液的质量浓度为55~60%。
优选的，所述步骤3）中酶转化的温度为55~65℃。
优选的，所述步骤6）中脱色的具体步骤为：
将阿洛酮糖料液通过颗粒活性碳柱进行脱色，料液温度为55~65℃，再经阿玛过滤机过滤，料液温度为50~60℃，阿玛过滤机工作压力0.2~0.4Mpa。
优选的，所述步骤6）中离子交换脱盐的具体步骤为：
将脱色后阿洛酮糖料液依次经过阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱，料液温度为35~45℃，流速为2~4BV/h。
优选的，阳离子交换柱所用树脂为D001型；阴离子交换柱所用树脂为301P型。
优选的，所述步骤6）中真空浓缩的具体步骤为：
使用四效蒸发器对离子交换脱盐后的阿洛酮糖料液进行浓缩，浓缩温度65~75℃，压力-0.06~-0.1Mpa，获得可溶性固形物质量浓度为71~73%的阿洛酮糖溶液。
优选的，所述步骤7）中蒸发补料结晶包括以下步骤：
1）将阿洛酮糖溶液与晶种混合后进行养晶，得到养晶后的料液；
2）将所述养晶后的料液进行连续蒸发补料，得到蒸发补料结晶后的料液。
优选的，所述步骤7）中蒸发补料结晶具体包括以下步骤：
1）将阿洛酮糖溶液与晶种混合后进行养晶，得到养晶后的料液；其中阿洛酮糖溶液温度为43~45℃，晶种量为干基质量浓度的0.8~1%，晶种直径为48~58μm，养晶时间为2~4h，养晶时搅拌转速3~5rpm。
2）将所述养晶后的料液进行连续蒸发补料，得到蒸发补料结晶后的料液；其中，补料液为可溶性固形物质量浓度为71~73%阿洛酮糖溶液，通过调节补料速度和水分蒸发量，使煮糖罐中物料可溶性固形物质量浓度为79~81%，补料过程中转速5~10rpm，温度为44~46℃，当补料补至满罐时，将罐体积45~55%的料液转入卧式结晶机中，进行降温结晶，煮糖罐继续补料，补满再将罐体积45~55%的料液转入卧式结晶机中，依此类推。
优选的，所述步骤7）中降温结晶包括以下步骤：
将蒸发结晶后所得料液降温至第一温度，然后继续降温至第二温度；
所述降温的速率为0.4~0.55℃/h，所述第一温度为38~41℃；
继续降温的速率为0.8~1.1℃/h，所述第二温度为28~31℃。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明将固定化酶-色谱分离系统进料的果糖溶液质量浓度设定为55~60%，此浓度范围既可防止染菌，又可提高色谱分离效率。返回色谱分离的果糖溶液后，因返回果糖溶液的质量浓度较低，因此将果糖溶液的进料质量浓度提高至70~75%，以保证进入固定化酶-色谱分离系统的果糖溶液质量浓度维持在55~60%。通过此系统实现了阿洛酮糖的连续高效转化，阿洛酮糖出料纯度达到98~99%、单位树脂单位时间处理量达到0.038~0.045t/ m3·h，远高于一般的糖化过程所得纯度，且较一般糖化、脱色、立交、浓缩、色谱分离等工序来说，生产连续，减少中转、暂存等过程，提高生产效率。
本发明所述蒸发补料结晶过程为连续过程，降温结晶过程为分批式结晶。本发明通过设定煮糖罐进料体积为罐体积的40~50%，蒸发补料补满后，将罐体积45~55%的物料转入卧式结晶机进行降温结晶。煮糖罐继续蒸发补料，再次满罐时，再将罐体积45~55%的料液转入下一个卧式结晶机中。由此实现阿洛酮糖的半连续结晶，较阿洛酮糖分批结晶，半连续结晶所得产品品质稳定性更强，可消除不同批次间晶体品质差异，易于操作，生产效率更高。
结晶过程：向物料可溶性固形物质量浓度78~79%，温度43~45℃的阿洛酮糖溶液中，加入干基质量浓度0.8~1%的晶种，晶种直径为48~58μm，养晶2~4h，开始蒸发补料结晶。该晶种尺寸和晶种量可保证足够的晶种个数，满足连续蒸发补料结晶对晶种数量的需求，同时连续蒸发补料结晶过程中新形成的晶核，亦可作为晶种使用，补充每次转料造成的晶种损失。蒸发补料过程中温度控制为44~46℃，补料液可溶性固形物质量浓度控制为71~73%，煮糖罐物料可溶性固形物质量浓度控制为79~81%。此温度浓度下物料粘度为500~600mPa·S，适合结晶生长，且此温度下较30~40℃，蒸发效率更高，可缩短结晶周期，降低生产成本。同时蒸发补料结晶过程，控制转速5~10rpm，此转速条件下，既可促进物料传质、热量传导，又可使大晶体自然沉降，而小晶体以及蒸发补料结晶过程新形成的晶核在煮糖罐上部停留。每次煮满罐，由煮糖罐底部放料至卧式结晶机，大晶体均可进入卧式结晶机，小晶体及新形成的晶核继续留在煮糖罐中，作为晶种能够继续生长。
降温结晶过程为分批式结晶，45~40℃范围内，每小时降温0.5℃。此温度范围内，对应的饱和物料粘度较大（400~600mPa·S），设置每小时降温0.5℃，可保证充分的物料传至和热量传导，40~30℃范围内，每小时降温1℃，此温度范围内，对应的饱和物料粘度较小（300~400mPa·S），每小时降温1℃，即可保证充分传质和热量传导，又可提高生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为固定化酶—色谱分离系统初次循环运行示意图；其中1、2、3、4号为装填固定化酶的柱子，5、6、7、8号为装填凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂的柱子；
图2为固定化酶—色谱分离系统二次循环运行示意图；其中1、2、3、4号为装填固定化酶的柱子，5、6、7、8号为装填凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂的柱子；
图3为实施例1中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图4为实施例2中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图5为对比例11中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图6为对比例12中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图7为对比例13中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图8为对比例14中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态；
图9为对比例15中结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明实施例仅用于描述本发明的技术方案，并非限定于本发明。
本发明实施例中所使用试剂均为市售产品。以下实施例所使用的阳离子交换柱所用树脂为D001型；阴离子交换柱所用树脂为301P型。
实施例1 一种结晶阿洛酮糖的制备方法
一、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的制备
使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase）转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的来源为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBLCY-010），供体为瘤胃球菌CAG55（Ruminococcus sp.CAG55）。其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis BLCY-010）于2023年7月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.27923，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1、一级种子培养：取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis BLCY-010）甘油管接种于液体LB培养基中，接种量0.5%，在33℃的条件下，220rpm振荡培养10h，制得一级种子液。
2、二级种子培养：将一级种子液接种于种子罐中，接种量为5%，在33℃的条件下培养6h，通风比控制为1:1（V/Vm），由此制得二级种子液。
所述二级种子培养基组分为（均为重量体积比）：酵母浸粉0.5%；蛋白胨1%；氯化钠0.8%；葡萄糖0.5%；余量水。
发酵培养：将二级种子液接种于发酵罐中，接种量为5%，在33℃的条件下培养30h获得发酵液，培养过程控制pH6.8，通过比控制1:1（V/Vm），溶氧控制20%，接种后培养至出现溶氧波谷时，开始流加补料培养基，补料速度为5mL/L/h。
所述发酵培养基组分为（均为重量体积比）：玉米浆粉1.8%，蛋白胨2.7%，磷酸氢二铵0.1%，亚硫酸钠0.2%，磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钠0.4%，硫酸镁0.1%，甘油1.5%，余量水。
补料培养基组分为（均为重量体积比）：甘油35%，硫酸镁0.8%，磷酸氢二铵6%，余量水。
发酵后提取：将发酵液经碟片式离心机离心，转速设备2000rpm，离心过程温度控制25℃。离心分离后收集细胞，加入细胞重量2倍的自来水洗涤，进行二次离心，收集细胞，即为酶制剂。
二、固定化酶的制备
D101树脂的预处理
用4倍D101树脂体积的蒸馏水浸泡树脂4h，将蒸馏水滤除后，用5%质量浓度的NaOH溶液浸泡树脂5h，将NaOH溶液滤除后，用蒸馏水洗D101树脂，洗至pH7.0，再用5%质量浓度的HCl溶液浸泡树脂5h，将HCl溶液滤除后，用蒸馏水洗树脂，洗至pH7.0，再用摩尔浓度为30mMCoCl2•6H2O浸泡树脂12h，滤除多余液体，完成树脂的预处理。
固定化酶的制备
按照120U/g树脂的加酶量向树脂中加入酶制剂，30℃条件下吸附5h后，加入树脂体积0.3倍、质量浓度为1%的壳聚糖溶液进行交联，控制交联温度35℃，交联时间2h，完成固定化酶的制备。
3、固定化酶的活性测定：
1）转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比。
以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量浓度20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为32.84%。
2）半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。
酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表1所示。第27天（648h）时，酶活力单位为48.96U/g，约下降一半，固定化酶的半衰期为27天。
表1 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 96.87 264 65.55 504 54.24
24 92.32 288 64.67 528 53.16
48 89.13 312 63.46 552 52.86
72 85.54 336 62.65 576 51.61
96 81.14 360 61.34 600 50.41
120 77.54 384 60.05 624 49.33
144 73.46 408 58.91 648 48.96
168 70.20 432 57.85 672 47.99
192 68.33 456 56.64 696 47.01
216 67.86 480 55.47 720 46.13
240 66.74 / / / /
三、固定化酶—色谱分离系统的制备与运行
1、固定化酶—色谱分离系统的制备
制备八柱固定化酶—色谱分离系统，设置1、2、3、4号柱子装填固定化酶，5、6、7、8号柱子装填凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂。
2、固定化酶—色谱分离系统的运行
如图1所示，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入5号柱，由6号柱进入纯净水，6号柱出口物料返回至1号柱，由8号柱出口出阿洛酮糖液体物料。运行至下一周期时，如图2所示，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入6号柱，由7号柱进入纯净水，7号柱出口物料返回至1号柱，由5号柱出口出阿洛酮糖液体物料。
所述固定化酶—色谱分离系统运行条件为：
初始进料果糖溶液质量浓度为55%，第二次循环开始后，进料果糖溶液质量浓度为70%，系统运行温度55℃，料水比1：2.5，当1号柱酶活力单位降至一半时，更换为2号柱、3号柱、4号柱走料，更换1号柱中的固定化酶，依此类推，形成连续生产。
所述固定化酶—色谱分离系统具体的色谱循环过程为：
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.31%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.23%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为96.17%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.31%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为97.08%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.56%。
所述固定化酶—色谱分离系统中果糖转化率定义为：
一段时间内，出系统阿洛酮糖干基/进入系统果糖干基×100%，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为96.72%。单位树脂单位时间处理量为0.041t/m3·h。
四、结晶阿洛酮糖的制备
1、将固定化酶—色谱分离系统出料的阿洛酮糖料液，经脱色、离交、四效蒸发浓缩，获得可溶性固形物质量浓度73%的阿洛酮糖溶液。
脱色过程为将阿洛酮糖物料通过颗粒活性碳柱进行脱色，物料温度65℃，再经阿玛过滤机过滤，物料温度60℃，阿玛过滤机工作压力0.4Mpa。
离子交换过程为将脱色后物料依次经过阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱，物料温度45℃，流速4BV/h。
真空浓缩过程为使用四效蒸发器对离交后物料进行浓缩，浓缩温度75℃，压力-0.06Mpa，获得可溶性固形物质量浓度73%的阿洛酮糖溶液；
本发明所述可溶性固形物质量浓度×阿洛酮糖纯度=阿洛酮糖质量浓度。
2、连续蒸发结晶
将可溶性固形物质量浓度为73%的阿洛酮糖溶液打入煮糖罐，打入体积为罐体积的50%。在煮糖罐中真空蒸发水分，将物料可溶性固形物质量浓度提高至78.25%，物料温度调整为43.5℃，加入干基质量浓度1%的晶种，晶种直径为48μm。养晶3h，养晶时搅拌转速3rpm。养晶结束后，开始蒸发补料结晶，温度控制为45℃，补料液为可溶性固形物质量浓度为73%的阿洛酮糖溶液，调节补料速度控制煮糖罐内物料可溶性固形物的质量浓度为80.5%。蒸发补料过程搅拌转速为5rpm。当补料补至满罐时，将罐体积50%的料液转入卧式结晶机中，继续蒸发补料，再次满罐时，再将罐体积50%的料液转入下一个卧式结晶机中，依此类推。
分批式降温结晶
转入卧式结晶机中后，45℃稳定3小时，搅拌转速3rpm。45~40℃范围内，每小时降温0.5℃，40~30℃范围内，每小时降温1℃，降至30℃时，稳定2h。结束降温结晶过程。
4、离心、干燥结晶阿洛酮糖
通过离心、干燥结晶阿洛酮糖；离心时，600rpm维持600s，转速升至900rpm维持1200s，其中900rpm进行至300s时水洗10s、900rpm进行至第900s时水洗10s。干燥时，热风温度控制60℃，干燥时长 60min。
所述结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态（×100）及目数分布如图3及表2所示。
表2 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 4.53%
40～60目 87.18%
60～80目 6.33%
80目以下 1.96%
实施例2 一种结晶阿洛酮糖的制备方法
一、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的制备
使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase）转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的来源为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBLCY-010），供体为瘤胃球菌CAG55（Ruminococcus sp.CAG55）。其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis BLCY-010）于2023年7月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.27923，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1、一级种子培养：取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis BLCY-010）甘油管接种于液体LB培养基中，接种量1%，在37℃的条件下，220rpm振荡培养15h，制得一级种子液。
2、二级种子培养：将一级种子液接种于种子罐中，接种量为10%，在37℃的条件下培养9h，通风比控制为1:1.5（V/Vm），由此制得二级种子液。
所述二级种子培养基组分为（均为重量体积比）：酵母浸粉0.5%；蛋白胨1%；氯化钠0.8%；葡萄糖0.5%；余量水。
发酵培养：将二级种子液接种于发酵罐中，接种量为10%，在37℃的条件下培养36h获得发酵液，培养过程控制pH7.2，通过比控制1:1.5（V/Vm），溶氧控制40%，接种后培养至出现溶氧波谷时，开始流加补料培养基，补料速度为10mL/L/h。
所述发酵培养基组分为（均为重量体积比）：玉米浆粉1.8%，蛋白胨2.7%，磷酸氢二铵0.1%，亚硫酸钠0.2%，磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钠0.4%，硫酸镁0.1%，甘油1.5%，余量水。
补料培养基组分为（均为重量体积比）：甘油35%，硫酸镁0.8%，磷酸氢二铵6%，余量水。
发酵后提取：将发酵液经碟片式离心机离心，转速设备2000rpm，离心过程温度控制35℃。离心分离后收集细胞，加入细胞重量3倍的自来水洗涤，进行二次离心，收集细胞，即为酶制剂。
二、固定化酶的制备
1、D101树脂的预处理
用3倍D101树脂体积的蒸馏水浸泡树脂5h，将蒸馏水滤除后，用4%质量浓度的NaOH溶液浸泡树脂4h，将NaOH溶液滤除后，用蒸馏水洗树脂，洗至pH6.5，再用4%质量浓度的HCl溶液浸泡树脂4h，将HCl溶液滤除后，用蒸馏水洗树脂，洗至pH6.5，再用摩尔浓度为25mMCoCl2•6H2O浸泡树脂8h，滤除多余液体，完成树脂的预处理。
2、固定化酶的制备
按照100U/g树脂的加酶量向树脂中加入酶制剂，35℃条件下吸附5h后，加入树脂体积0.4倍、质量浓度为1.5%的壳聚糖溶液进行交联，控制交联温度35℃，交联时间2h，完成固定化酶的制备。
3、固定化酶的活性测定：
1）转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比。
以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量浓度20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为31.68%。
2）半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。
酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表3所示。第26天（624h）时，酶活力单位为44.87U/g，约下降一半，固定化酶的半衰期为26天。
表3 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 89.31 240 63.93 480 50.76
24 87.62 264 62.84 504 49.45
48 85.31 288 61.36 528 48.36
72 82.94 312 60.24 552 47.09
96 79.13 336 59.22 576 46.19
120 76.26 360 58.71 600 45.31
144 73.46 384 56.93 624 44.87
168 70.20 408 55.42 648 44.10
192 67.98 432 53.33 672 43.24
216 65.43 456 51.79 696 42.86
/ / / / 720 41.94
三、固定化酶—色谱分离系统的制备与运行
1、固定化酶—色谱分离系统的制备
制备八柱固定化酶—色谱分离系统，设置1、2、3、4号柱子装填固定化酶，5、6、7、8号柱子装填凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂。
2、固定化酶—色谱分离系统的运行
如图1所示，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入5号柱，由6号柱进入纯净水，6号柱出口物料返回至1号柱，由8号柱出口出阿洛酮糖液体物料。运行至下一周期时，如图2所示，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱、3号柱的酶转化反应后，进入6号柱，由7号柱进入纯净水，7号柱出口物料返回至1号柱，由5号柱出口出阿洛酮糖液体物料。
所述固定化酶—色谱分离系统运行条件为：
初始进料果糖溶液质量浓度为60%，第二次循环开始后，进料果糖溶液质量浓度为75%，系统运行温度55℃，料水比1：2.0，当1号柱酶活力单位降至一半时，更换为2号柱、3号柱、4号柱走料，更换1号柱中的固定化酶，依此类推，形成连续生产。
所述固定化酶—色谱分离系统具体的色谱循环过程为：
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.16%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.19%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.86%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.46%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为96.63%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.52%。
第四个色谱循环，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为96.41%，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.60%。
所述固定化酶—色谱分离系统中果糖转化率定义为：
一段时间内，出系统阿洛酮糖干基/进入系统果糖干基×100%，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为97.08%。单位树脂单位时间处理量为0.043t/m3·h。
四、阿洛酮糖的制备
1、将固定化酶—色谱分离系统出料的阿洛酮糖料液，经脱色、离交、四效蒸发浓缩，获得可溶性固形物质量浓度71%的阿洛酮糖溶液。
脱色过程为将阿洛酮糖物料通过颗粒活性碳柱进行脱色，物料温度55℃，再经阿玛过滤机过滤，物料温度50℃，阿玛过滤机工作压力0.2Mpa。
离子交换过程为将脱色后物料依次经过阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱，物料温度35℃，流速2BV/h。
真空浓缩过程为使用四效蒸发器对离交后物料进行浓缩，浓缩温度65℃，压力-0.1Mpa，获得可溶性固形物质量浓度71%的阿洛酮糖溶液；
本发明所述可溶性固形物质量浓度×阿洛酮糖纯度=阿洛酮糖质量浓度。
2、连续蒸发结晶
将可溶性固形物质量浓度为71%的阿洛酮糖溶液打入煮糖罐，打入体积为罐体积的40%。在煮糖罐中真空蒸发水分，将物料可溶性固形物质量浓度提高至为79%，物料温度调整为45℃，加入干基质量浓度0.8%的晶种，晶种直径为58μm。养晶3h，养晶时搅拌转速3rpm。养晶结束后，开始蒸发补料结晶，温度控制为44℃，补料液为可溶性固形物质量浓度为71%的阿洛酮糖溶液，调节补料速度控制煮糖罐内物料可溶性固形物的质量浓度为79%。蒸发补料过程搅拌转速为10rpm。当补料补至满罐时，将罐体积45%的料液转入卧式结晶机中，继续蒸发补料，再次满罐时，再将罐体积45%的料液转入下一个卧式结晶机中，依此类推。
3、分批式降温结晶
转入卧式结晶机中后，45℃稳定5小时，搅拌转速5rpm。45~40℃范围内，每小时降温0.5℃，40~30℃范围内，每小时降温1℃，降至30℃时，稳定2h。结束降温结晶过程。
4、离心、干燥结晶阿洛酮糖
通过离心、干燥结晶阿洛酮糖；离心时，600rpm维持600s，转速升至900rpm维持1200s，其中900rpm进行至300s时水洗10s、900rpm进行至第900s时水洗10s。干燥时，热风温度控制55℃，干燥时长 60min。
所述结晶阿洛酮糖的显微镜观察形态（×100）及目数分布如图4及表4所示。
表4 阿洛酮糖结晶的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 4.87%
40-60目 85.86%
60-80目 5.96%
80目以下 3.31%
对比例1
将实施例1中CoCl2•6H2O的摩尔浓度替换为5mM，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为27.31%。
2 半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表5。第20天（480h）时，酶活力单位为38.62U/g，约下降一半，固定化酶的半衰期为20天。
表5 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 76.52 192 55.67 384 42.63
24 73.13 216 53.24 408 41.50
48 70.18 240 51.32 432 40.45
72 68.32 264 49.69 456 39.53
96 65.89 288 48.36 480 38.62
120 63.21 312 47.08 504 37.96
144 60.04 336 45.90 528 36.86
168 57.93 360 43.77 / /
对比例2
将实施例1中的壳聚糖溶液的质量浓度替换为0.5%，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
1、转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为31.82%。
2、半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表6。第15天（360h）时，酶活力单位为45.81U/g，约下降一半固定化酶的半衰期为15天。
表6 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 92.92 144 63.39 288 48.64
24 85.89 168 59.66 312 47.42
48 80.05 192 56.75 336 46.84
72 76.30 216 53.34 360 45.81
96 72.77 240 51.53 384 44.34
120 68.22 264 49.86 408 43.62
对比例3
将实施例1中壳聚糖溶液的质量浓度替换为2%，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
1、转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为24.58%。
2、半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表7。第23天（504h）时，酶活力单位为41.13U/g，约下降一半固定化酶的半衰期为23天。
表7 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 83.14 216 62.54 432 45.63
24 81.27 240 60.39 456 44.59
48 78.04 264 58.83 480 42.71
72 75.69 288 56.61 504 41.13
96 73.34 312 54.66 528 39.29
120 71.61 336 52.49 552 37.31
144 69.56 360 50.68 576 35.50
168 67.73 384 48.24 600 35.48
192 64.33 408 47.39 / /
对比例4
将实施例1中壳聚糖溶液用量改为树脂体积0.1倍，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
1、转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为30.26%。
2、半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表8。第10天（240h）时，酶活力单位为45.58U/g，约下降一半固定化酶的半衰期为10天。
表8 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 91.38 120 62.38 240 45.58
24 84.66 144 56.44 264 44.37
48 77.95 168 52.72 288 43.51
72 72.88 192 48.67 312 42.30
96 67.51 216 46.83 / /
对比例5
将实施例1中壳聚糖溶液用量改为树脂体积0.5倍，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
1、转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为21.92%。
2、半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表9。第24天（576h）时，酶活力单位为40.36U/g，约下降一半固定化酶的半衰期为24天。
表9 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 81.46 216 63.46 432 47.63
24 78.87 240 61.80 456 46.88
48 76.71 264 59.02 480 45.74
72 75.95 288 57.22 504 43.98
96 73.82 312 55.38 528 42.51
120 71.66 336 53.55 552 41.28
144 69.37 360 51.60 576 40.36
168 67.59 384 49.91 600 39.77
192 65.80 408 48.45 624 37.61
对比例6
将实施例1中加酶量替换为80U/g，其余步骤相同。
固定化酶的活性测定如下：
1、转化率的测定
转化率指以果糖为底物，固定化酶转化果糖的反应达到平衡时，所产生的阿洛酮糖占溶液中干物质的百分比；以质量浓度为55%的果糖溶液为底物，pH 调至6.0，向果糖溶液中加入干基质量20%的固定化酶颗粒，60℃反应4h后，经HPLC检测转化率为22.29%。
2、半衰期的检测
每隔24h检测固定化酶的酶活力单位，酶活力单位下降至一半所用的时间即为半衰期。酶活力单位定义，将200mg固定化酶颗粒加入到300μL质量浓度为55%的果糖溶液中，60℃反应10min，经HPLC检测分析阿洛酮糖含量，定义每分钟产生1μmol的阿洛酮糖为一个酶活单位。经检测固定化酶酶活力单位变化如下表10。第16天（384h）时，酶活力单位为30.46U/g，约下降一半固定化酶的半衰期为16天。
表10 固定化酶酶活力单位变化
时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g） 时间（h） 酶活力单位（U/g）
0 60.13 168 40.11 336 32.52
24 55.77 192 38.55 360 31.76
48 52.36 216 37.59 384 30.46
72 48.70 240 36.68 408 29.66
96 45.29 264 35.43 432 28.53
120 43.66 288 34.79 456 27.28
144 42.39 312 33.80 / /
对比例7
将实施例1 中的初始进料果糖溶液质量浓度替换为40%，循环运行后，进料果糖溶液质量浓度替换为60%，其余步骤相同。
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.23%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.31%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为96.08%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为98.42%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为96.89%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为99.61%。
经检测，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为96.75%。单位树脂单位时间处理量为0.027t/m3·h。
对比例8
将实施例1中所述固定化酶—色谱分离系统运行条件中的系统运行温度替换为40℃，其余步骤相同。
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为90.16%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为92.87%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为90.74%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为93.10%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为91.12%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为93.25%。
经检测，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为91.86%。单位树脂单位时间处理量为0.039t/m3·h。
对比例9
将实施例1中所述固定化酶—色谱分离系统运行条件中的料水比替换为1：1.5，其余步骤相同。
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为84.13%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为87.62%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为84.56%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为87.85%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为84.87%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为87.92%。
经检测，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为85.63%。单位树脂单位时间处理量为0.05t/m3·h。
对比例10
将实施例1中的固定化酶-色谱分离系统运行方式更改为，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱酶转化反应后，进入5号柱，由6号柱进入纯净水，6号柱出口物料返回至1号柱，由8号柱出口出阿洛酮糖液体物料。运行至下一周期时，果糖溶液由1号柱进入，经1号柱、2号柱的酶转化反应后，进入6号柱，由7号柱进入纯净水，7号柱出口物料返回至1号柱，由5号柱出口出阿洛酮糖液体物料。当1号柱、2号柱酶活力单位降至一半时，更换为3号柱、4号柱走料，更换1号柱、2号柱中的固定化酶。其余步骤不变。
第一个色谱循环，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.12%，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为86.24%。
第二个色谱循环，由7号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.65%，由5号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为87.23%。
第三个色谱循环，由8号柱出料口取料，经HPLC检测分析果糖纯度为95.59%，由6号柱出料口取料，经HPLC检测分析阿洛酮糖纯度为87.27%。
经检测，该系统运行至60天时，统计此段运行时间内果糖的转化率为85.13%。单位树脂单位时间处理量为0.038t/m3·h。
对比例11
将实施例1步骤四中阿洛酮糖的制备方法进行替换，其余步骤相同；
具体步骤如下：
连续蒸发结晶：
将实施例1中阿洛酮糖溶液的打入体积更改为70%，满罐时，转入卧式结晶机的料液体积更改为罐体积的30%，其余步骤相同。
2、分批式降温结晶：步骤相同。
3、离心、干燥结晶阿洛酮糖：步骤相同。
经检测，结晶阿洛酮糖显微镜观察形态（×100）及目数分布如下图5及表11所示。
表11 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 1.61%
40～60目 23.65%
60～80目 25.19%
80目～100目 36.65%
100目以下 12.90%
对比例12
将实施例1步骤四中阿洛酮糖的制备方法进行替换，其余步骤相同；
具体步骤如下：
1、连续蒸发结晶：
将实施例1中，加入晶种量改为干基质量浓度0.5%的晶种，其余步骤相同。
2、分批式降温结晶：步骤相同。
3、离心、干燥结晶阿洛酮糖：步骤相同。
经检测，结晶阿洛酮糖显微镜观察形态（×100）及目数分布如下图6和表12所示。
表12 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 3.42%
40～60目 20.61%
60～80目 24.33%
80～100目 20.13%
100～120目 17.65%
120目以下 13.86%
对比例13
将实施例2步骤四中阿洛酮糖的制备方法进行替换，其余步骤相同；
具体步骤如下：
1、连续蒸发结晶：
将实施例1中，加入的晶种直径改为75μm，其余步骤相同。
2、分批式降温结晶：步骤相同。
3、离心、干燥结晶阿洛酮糖：步骤相同。
经检测，结晶阿洛酮糖显微镜观察形态（×100）及目数分布如下图7和表13所示。
表13 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 1.67%
40～60目 19.88%
60～80目 23.19%
80～100目 24.22%
100～120目 16.53%
120目以下 14.51%
对比例14
将实施例1步骤四中阿洛酮糖的制备方法进行替换，其余步骤相同；
具体步骤如下：
1、连续蒸发结晶：
将实施例1中，加入晶种量改为干基质量浓度2%的晶种，其余步骤相同。
2、分批式降温结晶：步骤相同。
3、离心、干燥结晶阿洛酮糖：步骤相同。
经检测，结晶阿洛酮糖显微镜观察形态（×100）及目数分布如下图8和表14所示。
表14 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 2.64%
40～60目 41.62%
60～80目 45.33%
80目以下 10.41%
对比例15
将实施例1步骤四中阿洛酮糖的制备方法进行替换，其余步骤相同；
具体步骤如下：
连续蒸发结晶：
将实施例1中，养晶时搅拌转速改为10rpm，蒸发补料过程搅拌转速调整为30rpm，其余步骤相同。
分批式降温结晶：步骤相同。
离心、干燥结晶阿洛酮糖：步骤相同。
经检测，结晶阿洛酮糖显微镜观察形态（×100）及目数分布如下图9和表15所示。
表15 结晶阿洛酮糖的目数分布情况
目数 所占比率
40目以上 2.67%
40～60目 19.85%
60～80目 23.14%
80～100目 26.41%
100～120目 18.17%
120目以下 9.76%
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种结晶阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以Co2+型树脂为固定化载体对阿洛酮糖差向异构酶进行吸附，吸附完成后加入壳聚糖溶液进行交联，得到固定化酶；
2)将所得固定化酶和凝胶型聚苯乙烯钙型色谱树脂分别装填至色谱分离系统的色谱柱中，得到固定化酶色谱柱和凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱；
3)将果糖溶液通过固定化酶的色谱柱进行酶转化，得到酶转化液；
4)将所得酶转化液通过凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱进行色谱分离，得到果糖溶液和剩余酶转化液；将所得果糖溶液与所述步骤3)中的果糖溶液合并；
5)将所得剩余酶转化液继续通过凝胶型聚苯乙烯钙型色谱柱，得到阿洛酮糖料液；
6)将所得阿洛酮糖料液依次进行脱色、离子交换脱盐和真空浓缩，得到阿洛酮糖溶液；
7)将所得阿洛酮糖溶液依次经过蒸发补料结晶和降温结晶，得到结晶阿洛酮糖；
所述步骤1)中阿洛酮糖差向异构酶的用量为100~120U/g树脂，所述壳聚糖溶液的质量浓度为1~1.5%，所述壳聚糖溶液与Co2+型树脂的体积比为0.2~0.4:1；
所述步骤1)中固定化酶对果糖的转化率为30~33%，半衰期为25~28天；
所述步骤3)中果糖溶液的质量浓度为55~60%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中Co2+型树脂的制备方法：
将树脂依次进行蒸馏水浸泡、氢氧化钠溶液浸泡、盐酸浸泡和CoCl2溶液浸泡处理后，得到最终的Co2+型树脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法 ，其特征在于，所述蒸馏水浸泡、氢氧化钠溶液浸泡、盐酸溶液浸泡时间均为4~5h，所述CoCl2溶液浸泡时间为8~12h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中交联的温度25~35℃，交联的时间1~2h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中酶转化的温度为55~65℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中蒸发补料结晶包括以下步骤：
1)将阿洛酮糖溶液与晶种混合后进行养晶，得到养晶后的料液；
2)将所述养晶后的料液进行连续蒸发补料，得到蒸发补料结晶后的料液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中降温结晶包括以下步骤：
将蒸发结晶后所得料液降温至第一温度，然后继续降温至第二温度；
所述降温的速率为0.4~0.55℃/h，所述第一温度为38~41℃;
继续降温的速率为0.8~1.1℃/h，所 述第二温度为28~31℃。
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