JP2001245658A - Ｌ−フェニルアラニンの製造法 - Google Patents
Ｌ−フェニルアラニンの製造法Info
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12P13/222—Phenylalanine
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｌ−フェニルアラニンの生産性が向上したメ
チロフィラス属細菌、及び、その細菌を用いたＬ−フェ
ニルアラニンの製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−フェニルアラニン生産能を有し、か
つフェニルアラニンアナログに対する耐性を有するメチ
ロフィラス属細菌を作製し、この細菌を培地で培養し、
該培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、
該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取することによ
り、Ｌ−フェニルアラニンを製造する。
チロフィラス属細菌、及び、その細菌を用いたＬ−フェ
ニルアラニンの製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−フェニルアラニン生産能を有し、か
つフェニルアラニンアナログに対する耐性を有するメチ
ロフィラス属細菌を作製し、この細菌を培地で培養し、
該培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、
該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取することによ
り、Ｌ−フェニルアラニンを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−フェニルアラ
ニンの製造方法に関する。より詳しくは、Ｌ−フェニル
アラニン生産性メチロフィラス属細菌及びメチロフィラ
ス属細菌を用いるＬ−フェニルアラニンの製造方法に関
する。
ニンの製造方法に関する。より詳しくは、Ｌ−フェニル
アラニン生産性メチロフィラス属細菌及びメチロフィラ
ス属細菌を用いるＬ−フェニルアラニンの製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いてＬ−フェニルアラニンを
発酵生産する製造法としては、組換え体エシェリヒア・
コリを用いるもの（特開昭56-1890号公報、特開昭57-17
0184号公報、特開昭58-103398号公報、特開昭61-92565
号公報、特開平1-104160号公報、国際公開第WO87/00202
号）が知られている。また、Ｌ−フェニルアラニンまた
はＬ−チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム
属の変異株を用いるもの（特開昭61-128897号公報）、
及び、組換え体コリネバクテリウムを用いるもの（特開
昭60-34197号公報、特開昭60-24192号公報、特開昭61-2
60892号公報、特開昭61-124375号公報）が知られてい
る。
発酵生産する製造法としては、組換え体エシェリヒア・
コリを用いるもの（特開昭56-1890号公報、特開昭57-17
0184号公報、特開昭58-103398号公報、特開昭61-92565
号公報、特開平1-104160号公報、国際公開第WO87/00202
号）が知られている。また、Ｌ−フェニルアラニンまた
はＬ−チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム
属の変異株を用いるもの（特開昭61-128897号公報）、
及び、組換え体コリネバクテリウムを用いるもの（特開
昭60-34197号公報、特開昭60-24192号公報、特開昭61-2
60892号公報、特開昭61-124375号公報）が知られてい
る。
【０００３】しかし、これまでメチロフィラス属細菌を
用いてＬ−フェニルアラニンを製造することは知られて
いない。
用いてＬ−フェニルアラニンを製造することは知られて
いない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−フェニ
ルアラニン生産性菌、及び、同菌を用いたＬ−フェニル
アラニンの製造法を提供することを課題とする。
ルアラニン生産性菌、及び、同菌を用いたＬ−フェニル
アラニンの製造法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、フェニル
アラニンアナログに耐性のメチロフィラス属菌株が高い
Ｌ−フェニルアラニン生産能を有することを見いだし、
本発明を完成するに至った。
アラニンアナログに耐性のメチロフィラス属菌株が高い
Ｌ−フェニルアラニン生産能を有することを見いだし、
本発明を完成するに至った。
【０００６】本発明は、Ｌ−フェニルアラニン生産能を
有し、かつフェニルアラニンアナログに対する耐性を有
するメチロフィラス属細菌（以下、本発明細菌ともい
う）を提供する。
有し、かつフェニルアラニンアナログに対する耐性を有
するメチロフィラス属細菌（以下、本発明細菌ともい
う）を提供する。
【０００７】本発明細菌は、フェニルアラニンアナログ
に対する耐性及びＬ−フェニルアラニンに対する耐性を
有することが好ましい。
に対する耐性及びＬ−フェニルアラニンに対する耐性を
有することが好ましい。
【０００８】本発明細菌は、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニ
ルアラニンに対する耐性を有することが好ましい。
ルアラニンに対する耐性を有することが好ましい。
【０００９】本発明細菌は、メチロフィラス属細菌か
ら、フェニルアラニンアナログに対する耐性及びＬ−フ
ェニルアラニンに対する耐性を有する株を、各々の耐性
について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階的に
選択することにより得られるものであることが好まし
い。
ら、フェニルアラニンアナログに対する耐性及びＬ−フ
ェニルアラニンに対する耐性を有する株を、各々の耐性
について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階的に
選択することにより得られるものであることが好まし
い。
【００１０】本発明細菌は、Ｌ−フェニルアラニンに対
する耐性に加えて、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニ
ンに対する耐性及びｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する耐性を有することがさらに好ましい。
する耐性に加えて、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニ
ンに対する耐性及びｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する耐性を有することがさらに好ましい。
【００１１】本発明細菌は、メチロフィラス属細菌か
ら、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する耐
性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性及びＬ
−フェニルアラニンに対する耐性を有する株を、各々の
耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階
的に選択することにより得られるものであることがさら
に好ましい。
ら、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する耐
性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性及びＬ
−フェニルアラニンに対する耐性を有する株を、各々の
耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階
的に選択することにより得られるものであることがさら
に好ましい。
【００１２】本発明細菌は、Ｌ−フェニルアラニンに対
する耐性に加えて、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニ
ンに対する耐性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対す
る耐性及びケイ皮酸に対する耐性を有することがさらに
好ましい。
する耐性に加えて、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニ
ンに対する耐性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対す
る耐性及びケイ皮酸に対する耐性を有することがさらに
好ましい。
【００１３】本発明細菌は、メチロフィラス属細菌か
ら、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する耐
性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性、ケイ
皮酸に対する耐性及びＬ−フェニルアラニンに対する耐
性を有する株を、各々の耐性について少なくとも１回、
かつ、任意の順序で段階的に選択することにより得られ
るものであることがさらに好ましい。
ら、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する耐
性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性、ケイ
皮酸に対する耐性及びＬ−フェニルアラニンに対する耐
性を有する株を、各々の耐性について少なくとも１回、
かつ、任意の順序で段階的に選択することにより得られ
るものであることがさらに好ましい。
【００１４】本発明細菌は、好ましくは、メチロフィラ
ス・メチロトロファスである。
ス・メチロトロファスである。
【００１５】本発明は、また、本発明細菌を培地で培養
し、該培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取すること
を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法（以下、本
発明方法ともいう）を提供する。
し、該培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取すること
を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法（以下、本
発明方法ともいう）を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。
て説明する。
【００１７】＜１＞本発明細菌 本発明細菌は、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有し、か
つフェニルアラニンアナログに対する耐性、好ましくは
フェニルアラニンアナログに対する耐性及びＬ−フェニ
ルアラニンに対する耐性を有するメチロフィラス属細菌
である。
つフェニルアラニンアナログに対する耐性、好ましくは
フェニルアラニンアナログに対する耐性及びＬ−フェニ
ルアラニンに対する耐性を有するメチロフィラス属細菌
である。
【００１８】メチロフィラス属細菌としては、メチロフ
ィラス・メチロトロファス等が挙げられる。
ィラス・メチロトロファス等が挙げられる。
【００１９】Ｌ−フェニルアラニン生産能とは、細菌を
培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−フェニ
ルアラニンを蓄積する能力を意味する。通常には、後述
の実施例に記載した培養条件において０．５ｇ／ｌ以上
のＬ−フェニルアラニンを蓄積する能力である。
培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−フェニ
ルアラニンを蓄積する能力を意味する。通常には、後述
の実施例に記載した培養条件において０．５ｇ／ｌ以上
のＬ−フェニルアラニンを蓄積する能力である。
【００２０】フェニルアラニンアナログとしては、ＤＬ
−ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニン、β−アミノ−β−フェニルプロピオン酸、
ｏ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラ
ニン、β−３−チエニルアラニン、β−２−フリルアラ
ニン、β−３−フリルアラニン、ｏ−アミノフェニルア
ラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｍ−アミノフェ
ニルアラニン、α−アミノ−β−フェニルエタンスルホ
ン酸、β−２−ピロールアラニン、１−シクロペンテン
−１−アラニン、１−シクロヘキセン−１−アラニン、
β−４−ピリジルアラニン、β−４−ピラゾリルアラニ
ン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｏ−クロロフェニルアラニン、ｍ−クロロフェニ
ルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｏ−ブロモ
フェニルアラニン、ｍ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−
ブロモフェニルアラニン、β−４−チアゾールアラニン
等が挙げられる。
−ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニン、β−アミノ−β−フェニルプロピオン酸、
ｏ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラ
ニン、β−３−チエニルアラニン、β−２−フリルアラ
ニン、β−３−フリルアラニン、ｏ−アミノフェニルア
ラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｍ−アミノフェ
ニルアラニン、α−アミノ−β−フェニルエタンスルホ
ン酸、β−２−ピロールアラニン、１−シクロペンテン
−１−アラニン、１−シクロヘキセン−１−アラニン、
β−４−ピリジルアラニン、β−４−ピラゾリルアラニ
ン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｏ−クロロフェニルアラニン、ｍ−クロロフェニ
ルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｏ−ブロモ
フェニルアラニン、ｍ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−
ブロモフェニルアラニン、β−４−チアゾールアラニン
等が挙げられる。
【００２１】フェニルアラニンアナログに対して耐性と
は、野生株（例えば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度
のフェニルアラニンアナログの存在下において増殖でき
ることを意味する。この濃度は、フェニルアラニンアナ
ログの種類によって異なるが、ＤＬ−ｐ−フルオロフェ
ニルアラニンの場合には、通常には、後述の実施例に記
載した培養条件において２ｇ／ｌ、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニンの場合には、通常には、後述の実施例に記載
した培養条件において１ｇ／ｌである。
は、野生株（例えば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度
のフェニルアラニンアナログの存在下において増殖でき
ることを意味する。この濃度は、フェニルアラニンアナ
ログの種類によって異なるが、ＤＬ−ｐ−フルオロフェ
ニルアラニンの場合には、通常には、後述の実施例に記
載した培養条件において２ｇ／ｌ、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニンの場合には、通常には、後述の実施例に記載
した培養条件において１ｇ／ｌである。
【００２２】本発明細菌は、２種以上のフェニルアラニ
ンアナログに対して耐性であることが好ましい。例え
ば、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン及びｍ−フル
オロフェニルアラニンに対して耐性であることが好まし
い。
ンアナログに対して耐性であることが好ましい。例え
ば、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン及びｍ−フル
オロフェニルアラニンに対して耐性であることが好まし
い。
【００２３】Ｌ−フェニルアラニンに対して耐性とは、
野生株（例えば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度のＬ
−フェニルアラニンの存在下において増殖できることを
意味する。この濃度は、通常には、後述の実施例に記載
した培養条件において８ｇ／ｌである。
野生株（例えば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度のＬ
−フェニルアラニンの存在下において増殖できることを
意味する。この濃度は、通常には、後述の実施例に記載
した培養条件において８ｇ／ｌである。
【００２４】本発明細菌は、より高濃度（例えば、0.1
M）のＬ−フェニルアラニンに対して耐性であることが
好ましい。
M）のＬ−フェニルアラニンに対して耐性であることが
好ましい。
【００２５】本発明細菌は、メチロフィラス属細菌に、
必要な耐性を順次付与することにより得ることができ
る。フェニルアラニンアナログ耐性及びＬ−フェニルア
ラニン耐性の各々の耐性の付与の順序に特に制限はな
く、任意の順序で行えばよい。
必要な耐性を順次付与することにより得ることができ
る。フェニルアラニンアナログ耐性及びＬ−フェニルア
ラニン耐性の各々の耐性の付与の順序に特に制限はな
く、任意の順序で行えばよい。
【００２６】以下に、フェニルアラニンアナログ耐性を
有するメチロフィラス属細菌及びＬ−フェニルアラニン
耐性を有するメチロフィラス属細菌を取得する方法につ
いて説明する。
有するメチロフィラス属細菌及びＬ−フェニルアラニン
耐性を有するメチロフィラス属細菌を取得する方法につ
いて説明する。
【００２７】フェニルアラニンアナログ耐性を有するメ
チロフィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌をその生
育を阻害する濃度のフェニルアラニンアナログを含む最
小培地で培養し、生育する株を選択することによって取
得することができる。
チロフィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌をその生
育を阻害する濃度のフェニルアラニンアナログを含む最
小培地で培養し、生育する株を選択することによって取
得することができる。
【００２８】フェニルアラニンアナログ耐性株の選択
は、１種のフェニルアラニンアナログについて行っても
よく、複数のフェニルアラニンアナログについて行って
もよい。また、選択は、１種のフェニルアラニンアナロ
グについて１回でもよく、複数回行ってもよい。
は、１種のフェニルアラニンアナログについて行っても
よく、複数のフェニルアラニンアナログについて行って
もよい。また、選択は、１種のフェニルアラニンアナロ
グについて１回でもよく、複数回行ってもよい。
【００２９】培地に添加するフェニルアラニンアナログ
の量は、フェニルアラニンアナログの種類によっても異
なるが、例えばＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに
ついては、２ｇ／ｌ以上が好ましい。選択に先だって、
メチロフィラス属細菌に突然変異処理を施してもよい。
突然変異処理は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理
によって行えばよい。
の量は、フェニルアラニンアナログの種類によっても異
なるが、例えばＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに
ついては、２ｇ／ｌ以上が好ましい。選択に先だって、
メチロフィラス属細菌に突然変異処理を施してもよい。
突然変異処理は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理
によって行えばよい。
【００３０】Ｌ−フェニルアラニン耐性を有するメチロ
フィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌をその生育が
阻害される濃度のＬ−フェニルアラニンを含む最小培地
で培養し、生育する株を選択することによって取得する
ことができる。ここで、生育阻害とは生育の遅れや生育
阻止をいう。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよ
い。培地のＬ−フェニルアラニンの濃度は、特に制限さ
れないが、０．０５Ｍ以上、好ましくは０．１Ｍが挙げ
られる。選択に先だって、メチロフィラス属細菌に前記
と同様にして突然変異処理を施してもよい。
フィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌をその生育が
阻害される濃度のＬ−フェニルアラニンを含む最小培地
で培養し、生育する株を選択することによって取得する
ことができる。ここで、生育阻害とは生育の遅れや生育
阻止をいう。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよ
い。培地のＬ−フェニルアラニンの濃度は、特に制限さ
れないが、０．０５Ｍ以上、好ましくは０．１Ｍが挙げ
られる。選択に先だって、メチロフィラス属細菌に前記
と同様にして突然変異処理を施してもよい。
【００３１】上記のようにして得られるＬ−フェニルア
ラニン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、親株が生育
できない濃度のＬ−フェニルアラニン存在下でも、生育
することができる。
ラニン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、親株が生育
できない濃度のＬ−フェニルアラニン存在下でも、生育
することができる。
【００３２】本発明細菌は、ケイ皮酸に対して耐性であ
ることが好ましい。
ることが好ましい。
【００３３】ケイ皮酸に対して耐性とは、野生株（例え
ば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度のケイ皮酸の存在
下において増殖できることを意味する。この濃度は、通
常には、後述の実施例に記載した培養条件において５０
ｍｇ／ｌである。
ば、ＡＳ−１株）が増殖できない濃度のケイ皮酸の存在
下において増殖できることを意味する。この濃度は、通
常には、後述の実施例に記載した培養条件において５０
ｍｇ／ｌである。
【００３４】ケイ皮酸に耐性のメチロフィラス属細菌
は、フェニルアラニンアナログ耐性細菌と同様の方法に
よって得ることができる。ケイ皮酸耐性、フェニルアラ
ニンアナログ耐性及びＬ−フェニルアラニン耐性の付与
の順序に特に制限はなく、任意の順序で行えばよい。
は、フェニルアラニンアナログ耐性細菌と同様の方法に
よって得ることができる。ケイ皮酸耐性、フェニルアラ
ニンアナログ耐性及びＬ−フェニルアラニン耐性の付与
の順序に特に制限はなく、任意の順序で行えばよい。
【００３５】Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルア
ラニン生合成の種々の段階の調節に関与しており、Ｌ−
フェニルアラニン耐性を付与する単独の変異のみでもＬ
−フェニルアラニン生産性向上に効果を示すが、複数の
変異によってより多くの調節が解除されることが好まし
い。また、単独の変異を有するメチロフィラス属細菌
は、Ｌ−フェニルアラニン生産性が低いものであって
も、Ｌ−フェニルアラニン生産菌育種の出発材料として
用いることができる。
ラニン生合成の種々の段階の調節に関与しており、Ｌ−
フェニルアラニン耐性を付与する単独の変異のみでもＬ
−フェニルアラニン生産性向上に効果を示すが、複数の
変異によってより多くの調節が解除されることが好まし
い。また、単独の変異を有するメチロフィラス属細菌
は、Ｌ−フェニルアラニン生産性が低いものであって
も、Ｌ−フェニルアラニン生産菌育種の出発材料として
用いることができる。
【００３６】本発明細菌は、さらに、通常の突然変異処
理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−フェニルアラニン
生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。
理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−フェニルアラニン
生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。
【００３７】例えば、メチロフィラス属細菌のホスホエ
ノールピルビン酸の生産能を上昇させることによって、
Ｌ−フェニルアラニンの生合成が強化され得る（国際公
開第ＷＯ９７／０８３３３号参照）。
ノールピルビン酸の生産能を上昇させることによって、
Ｌ−フェニルアラニンの生合成が強化され得る（国際公
開第ＷＯ９７／０８３３３号参照）。
【００３８】また、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プ
レフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（特開平５−２３６９
４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱感
作型３−デオキシ−Ｄ−arabino−ヘプツロソン酸７−
リン酸シンターゼ遺伝子（特開平５−２３６９４７号、
特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増強すること
によって、Ｌ−フェニルアラニンの生産性が向上する。
レフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（特開平５−２３６９
４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱感
作型３−デオキシ−Ｄ−arabino−ヘプツロソン酸７−
リン酸シンターゼ遺伝子（特開平５−２３６９４７号、
特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増強すること
によって、Ｌ−フェニルアラニンの生産性が向上する。
【００３９】＜２＞本発明方法 本発明方法は、本発明細菌を培地で培養し、該培養物中
にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、該培養物か
らＬ−フェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ
−フェニルアラニンの製造法である。
にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、該培養物か
らＬ−フェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ
−フェニルアラニンの製造法である。
【００４０】本発明細菌は、メタノール資化性微生物の
培養に通常に用いられる方法で培養することができる。
本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機栄養
素及び必要に応じてその他の有機微量栄養素を含む培地
であれば、天然培地及び合成培地のいずれでも用いられ
る。
培養に通常に用いられる方法で培養することができる。
本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機栄養
素及び必要に応じてその他の有機微量栄養素を含む培地
であれば、天然培地及び合成培地のいずれでも用いられ
る。
【００４１】メタノールを主たる炭素源として用いる
と、Ｌ−フェニルアラニンを安価に製造することができ
る。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、
培地中に通常には0.001〜30重量％添加する。窒素源と
しては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。
これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなど
の無機栄養素が少量添加される。
と、Ｌ−フェニルアラニンを安価に製造することができ
る。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、
培地中に通常には0.001〜30重量％添加する。窒素源と
しては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。
これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなど
の無機栄養素が少量添加される。
【００４２】培養は、通常には、振とう培養又は通気撹
拌培養などの好気条件下、pH5〜9、温度20〜40℃に保持
して行われ、通常24〜120時間で終了する。
拌培養などの好気条件下、pH5〜9、温度20〜40℃に保持
して行われ、通常24〜120時間で終了する。
【００４３】培養物は、菌体及び培養培地を包含し、好
ましくは培養培地である。
ましくは培養培地である。
【００４４】培養物からのＬ−フェニルアラニンの採取
は、通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方
法を組み合わせることにより実施できる。
は、通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方
法を組み合わせることにより実施できる。
【００４５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。先ず、下記の実施例で用いた、メチロフィラ
ス・メチロトロファス株の培養法およびＬ−フェニルア
ラニンの分析法を説明する。
説明する。先ず、下記の実施例で用いた、メチロフィラ
ス・メチロトロファス株の培養法およびＬ−フェニルア
ラニンの分析法を説明する。
【００４６】＜１＞試験管培養 １．種培養 株は、１％メタノールを含む121(Fe2)寒天培地のプレー
ト又はスラント上で、３０℃において４８〜７２時間培
養した。次いで、株を、４０ｍｌ容の試験管内の、２％
メタノールを含む121(Fe2)培地５ｍｌに種培養として接
種した。種培養をロータリーシェイカー上で３７℃にお
いて１８時間培養した。
ト又はスラント上で、３０℃において４８〜７２時間培
養した。次いで、株を、４０ｍｌ容の試験管内の、２％
メタノールを含む121(Fe2)培地５ｍｌに種培養として接
種した。種培養をロータリーシェイカー上で３７℃にお
いて１８時間培養した。
【００４７】２．試験管およびフラスコでの発酵 Ｌ−フェニルアラニン生産菌の培養は、４０ｍｌ容の試
験管内の、２％メタノールおよび３％炭酸カルシウムを
含む121(Fe2)培地５ｍｌを用いて３７℃で行った。培養
開始から２４時間後に、メタノールを２％さらに加え、
培養をさらに４８時間、３７℃においてロータリーシェ
イカー上で継続した。
験管内の、２％メタノールおよび３％炭酸カルシウムを
含む121(Fe2)培地５ｍｌを用いて３７℃で行った。培養
開始から２４時間後に、メタノールを２％さらに加え、
培養をさらに４８時間、３７℃においてロータリーシェ
イカー上で継続した。
【００４８】２％メタノールおよび３％炭酸カルシウム
を含む121(Fe2)培地の組成は以下の通りであった（培地
１Ｌ当たり）。
を含む121(Fe2)培地の組成は以下の通りであった（培地
１Ｌ当たり）。
【００４９】
【００５０】発酵試験管中の培地の初期容量：５ｍｌ 接種量：１０％ 温度：３７℃ 撹拌：シェイカーにより２５０ｒｐｍ
【００５１】＜２＞発酵液中のＬ−フェニルアラニンの
分析 １．試料調製 発酵液の試料は、細胞および破片を除去するため、5415
C型小型遠心機（Eppendorf）で１５分間遠心した。上清
を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に
用いた。
分析 １．試料調製 発酵液の試料は、細胞および破片を除去するため、5415
C型小型遠心機（Eppendorf）で１５分間遠心した。上清
を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に
用いた。
【００５２】２．Ｌ−フェニルアラニンのクロマトグラ
フィーによる測定 クロマトグラムシステムは、HPLCポンプ307型（Gilso
n）および245 nmに設定した2151型可変波長モニター（L
KB）を備えるものであった。試料は、１μｌループを備
えた7410型インジェクター（Rheodyne）を用いて注入し
た。カラムは、実験室で作製したウォータージャケット
型のサーモスタットにより４５℃に温度を調節した。
フィーによる測定 クロマトグラムシステムは、HPLCポンプ307型（Gilso
n）および245 nmに設定した2151型可変波長モニター（L
KB）を備えるものであった。試料は、１μｌループを備
えた7410型インジェクター（Rheodyne）を用いて注入し
た。カラムは、実験室で作製したウォータージャケット
型のサーモスタットにより４５℃に温度を調節した。
【００５３】５μｍセパロン(Separon)C18ソルベント
（Tessek）を充填した150 mm×3.9 mmI.D.ガラスカート
リッジを備えたガラスカートリッジを、全ての分離に用
いた。溶出液は、水／アセトニトリル（80/20(v/v)）中
の0.001 M CuSO4を用いた。
（Tessek）を充填した150 mm×3.9 mmI.D.ガラスカート
リッジを備えたガラスカートリッジを、全ての分離に用
いた。溶出液は、水／アセトニトリル（80/20(v/v)）中
の0.001 M CuSO4を用いた。
【００５４】発酵液の試料は、13000×gで５分間遠心
し、さらに分離をすることなく注入した。
し、さらに分離をすることなく注入した。
【００５５】データは、960型インターフェースおよび
ネルソン(Nelson)ＰＣインテグレーターソフトウェア
（PE Nelson）を備えたIBM PC/AT互換データステーショ
ンを用いて処理した。ピークは、外部標準法を用いて算
出した。
ネルソン(Nelson)ＰＣインテグレーターソフトウェア
（PE Nelson）を備えたIBM PC/AT互換データステーショ
ンを用いて処理した。ピークは、外部標準法を用いて算
出した。
【００５６】
【実施例１】 Ｌ−フェニルアラニン生産能を有するメ
チロフィラス・メチロトロファス変異株の構築 ＜１＞ 突然変異誘発および芳香族アミノ酸アナログで
あるＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対して耐性
の変異株の選択 メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１（NCIB 105
15; ATCC 53528）株を、芳香族アミノ酸アナログである
ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する感受性に
関して試験した。この感受性は、種々の濃度でＤＬ−ｐ
−フルオロフェニルアラニンを含む121(Fe2)培地で試験
した。１０8c.f.u./mlのＭ．メチロトロファス菌をプレ
ートし、３０℃において３日間培養した。１mg/mlのＤ
Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンは、細菌叢の増殖を
完全に阻害した。アナログ耐性変異体を選択するため
に、Ｍ．メチロトロファス株の１０8個の細菌を、２mg/
mlのＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンを含むプレー
トに接種した。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＧと略記する）変異原の結晶を
数個プレートの中央に置いた。３０℃において４〜５日
間後、プレートを分析した。細菌は、ＮＧ変異原の近傍
では増殖しなかったが、それから３〜４cm離れた場所で
はアナログ耐性変異体コロニーが増殖した。大きいコロ
ニーを釣り上げ、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン
を含む同培地上で純化した。上記の様にして、Ｍ．メチ
ロトロファスＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性
（以下、ｐＦｐRと略記する）変異体を培養し、発酵培
地中のＬ−フェニルアラニンを分析した。最も良好な
Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR変異体Ｎｏ．２２７は、
３０mg/lのＬ−フェニルアラニン、およそ１g/lのＬ−
バリン、並びに、0.2 g/lのＬ−ロイシン、Ｌ−イソロ
イシンおよびＬ−アラニンを産生した。ＨＰＬＣの結果
は薄層クロマトグラフィーにより確認された。
チロフィラス・メチロトロファス変異株の構築 ＜１＞ 突然変異誘発および芳香族アミノ酸アナログで
あるＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対して耐性
の変異株の選択 メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１（NCIB 105
15; ATCC 53528）株を、芳香族アミノ酸アナログである
ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに対する感受性に
関して試験した。この感受性は、種々の濃度でＤＬ−ｐ
−フルオロフェニルアラニンを含む121(Fe2)培地で試験
した。１０8c.f.u./mlのＭ．メチロトロファス菌をプレ
ートし、３０℃において３日間培養した。１mg/mlのＤ
Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンは、細菌叢の増殖を
完全に阻害した。アナログ耐性変異体を選択するため
に、Ｍ．メチロトロファス株の１０8個の細菌を、２mg/
mlのＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンを含むプレー
トに接種した。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＧと略記する）変異原の結晶を
数個プレートの中央に置いた。３０℃において４〜５日
間後、プレートを分析した。細菌は、ＮＧ変異原の近傍
では増殖しなかったが、それから３〜４cm離れた場所で
はアナログ耐性変異体コロニーが増殖した。大きいコロ
ニーを釣り上げ、ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン
を含む同培地上で純化した。上記の様にして、Ｍ．メチ
ロトロファスＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性
（以下、ｐＦｐRと略記する）変異体を培養し、発酵培
地中のＬ−フェニルアラニンを分析した。最も良好な
Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR変異体Ｎｏ．２２７は、
３０mg/lのＬ−フェニルアラニン、およそ１g/lのＬ−
バリン、並びに、0.2 g/lのＬ−ロイシン、Ｌ−イソロ
イシンおよびＬ−アラニンを産生した。ＨＰＬＣの結果
は薄層クロマトグラフィーにより確認された。
【００５７】＜２＞ 突然変異誘発および増殖培地にお
けるＬ−フェニルアラニンの高濃度に対して耐性の変異
株の選択 ＜１＞で得られたＭ．メチロトロファスＤＬ−ｐ−フル
オロフェニルアラニン耐性変異体はＬ−フェニルアラニ
ンを産生したが、培地中に高濃度のＬ−フェニルアラニ
ンが存在するとＬ−フェニルアラニンに感受性であっ
た。０．１ＭのＬ−フェニルアラニンは、121寒天培地
に添加されると、Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR変異体
Ｎｏ．２２７の増殖を完全に阻害した。
けるＬ−フェニルアラニンの高濃度に対して耐性の変異
株の選択 ＜１＞で得られたＭ．メチロトロファスＤＬ−ｐ−フル
オロフェニルアラニン耐性変異体はＬ−フェニルアラニ
ンを産生したが、培地中に高濃度のＬ−フェニルアラニ
ンが存在するとＬ−フェニルアラニンに感受性であっ
た。０．１ＭのＬ−フェニルアラニンは、121寒天培地
に添加されると、Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR変異体
Ｎｏ．２２７の増殖を完全に阻害した。
【００５８】この感受性を排除し、株の生産性を向上さ
せるため、増殖培地に存在する高濃度のＬ−フェニルア
ラニンに対して耐性の変異株を選択した。Ｌ−フェニル
アラニン耐性（以下、ｐｈｅRと略記する）変異体の選
択のための親株として、少量（30 mg/l）のＬ−フェニ
ルアラニンを産生するＭ．メチロトロファスＮｏ．２２
７（ｐＦｐR変異株）を用いた。選択培地は、１％のメ
タノールおよび0.05 MのＬ−フェニルアラニンを含む12
1(Fe2)寒天培地であった。ＮＧによる突然変異誘発を上
記と同様に行った。Ｌ−フェニルアラニン耐性変異体コ
ロニーを同培地で数回純化し、次いで、0.05 MのＬ−フ
ェニルアラニンを含まない培地で純化した。変異体のｐ
ｈｅRマーカーは安定に遺伝し、選択圧なしでも失われ
なかった。上記の様にして、選択されたＭ．メチロトロ
ファスｐＦｐR ｐｈｅR変異体を培養し、発酵培地中の
Ｌ−フェニルアラニンを分析した。最も良好な、高濃度
のＬ−フェニルアラニンに対する耐性の変異を有する
Ｍ．メチロトロファスｐＦｐ R ｐｈｅR変異体Ｎｏ．２
２７−１６は、0.4 g/lのＬ−フェニルアラニンを産生
した。このように、Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR ｐｈ
ｅR変異体Ｎｏ．２２７−１６における第２の変異であ
るｐｈｅR変異は、Ｌ−フェニルアラニンの産生を１０
倍を超えて上昇させた。すなわち、ｐＦｐR変異体（Ｎ
ｏ．２２７）は30mg/lのＬ−フェニルアラニンを産生
し、ｐＦｐR ｐｈｅR二重変異体（Ｎｏ．２２７−１
６）は400 mg/lのＬ−フェニルアラニンを産生した。
せるため、増殖培地に存在する高濃度のＬ−フェニルア
ラニンに対して耐性の変異株を選択した。Ｌ−フェニル
アラニン耐性（以下、ｐｈｅRと略記する）変異体の選
択のための親株として、少量（30 mg/l）のＬ−フェニ
ルアラニンを産生するＭ．メチロトロファスＮｏ．２２
７（ｐＦｐR変異株）を用いた。選択培地は、１％のメ
タノールおよび0.05 MのＬ−フェニルアラニンを含む12
1(Fe2)寒天培地であった。ＮＧによる突然変異誘発を上
記と同様に行った。Ｌ−フェニルアラニン耐性変異体コ
ロニーを同培地で数回純化し、次いで、0.05 MのＬ−フ
ェニルアラニンを含まない培地で純化した。変異体のｐ
ｈｅRマーカーは安定に遺伝し、選択圧なしでも失われ
なかった。上記の様にして、選択されたＭ．メチロトロ
ファスｐＦｐR ｐｈｅR変異体を培養し、発酵培地中の
Ｌ−フェニルアラニンを分析した。最も良好な、高濃度
のＬ−フェニルアラニンに対する耐性の変異を有する
Ｍ．メチロトロファスｐＦｐ R ｐｈｅR変異体Ｎｏ．２
２７−１６は、0.4 g/lのＬ−フェニルアラニンを産生
した。このように、Ｍ．メチロトロファスｐＦｐR ｐｈ
ｅR変異体Ｎｏ．２２７−１６における第２の変異であ
るｐｈｅR変異は、Ｌ−フェニルアラニンの産生を１０
倍を超えて上昇させた。すなわち、ｐＦｐR変異体（Ｎ
ｏ．２２７）は30mg/lのＬ−フェニルアラニンを産生
し、ｐＦｐR ｐｈｅR二重変異体（Ｎｏ．２２７−１
６）は400 mg/lのＬ−フェニルアラニンを産生した。
【００５９】メチロフィラス・メチロトロファスｐＦｐ
R ｐｈｅR変異株Ｎｏ．２２７−１６は、２g/lのＤＬ−
ｐ−フルオロフェニルアラニンおよび0.05 MのＬ−フェ
ニルアラニンに加えて、0.5 g/lのｍ−フルオロフェニ
ルアラニンに対しても耐性であることが判明した。しか
し、株Ｎｏ．２２７−１６は、１g/lのｍ−フルオロフ
ェニルアラニン上ではわずかにしか増殖を示さなかっ
た。１g/lのｍ−フルオロフェニルアラニンに対して耐
性（以下、ｍＦｐRと略記する）の新規変異体が、上記
のようなＮＧ突然変異誘発により、株Ｎｏ．２２７−１
６から単離された。得られた新規なＭ．メチロトロファ
スｐＦｐR ｐｈｅR ｍＦｐR変異体Ｎｏ．２２７−１６
−１０は、その先駆体と同じ量(0.4 g/l)のＬ−フェニ
ルアラニンを産生した。
R ｐｈｅR変異株Ｎｏ．２２７−１６は、２g/lのＤＬ−
ｐ−フルオロフェニルアラニンおよび0.05 MのＬ−フェ
ニルアラニンに加えて、0.5 g/lのｍ−フルオロフェニ
ルアラニンに対しても耐性であることが判明した。しか
し、株Ｎｏ．２２７−１６は、１g/lのｍ−フルオロフ
ェニルアラニン上ではわずかにしか増殖を示さなかっ
た。１g/lのｍ−フルオロフェニルアラニンに対して耐
性（以下、ｍＦｐRと略記する）の新規変異体が、上記
のようなＮＧ突然変異誘発により、株Ｎｏ．２２７−１
６から単離された。得られた新規なＭ．メチロトロファ
スｐＦｐR ｐｈｅR ｍＦｐR変異体Ｎｏ．２２７−１６
−１０は、その先駆体と同じ量(0.4 g/l)のＬ−フェニ
ルアラニンを産生した。
【００６０】より高濃度（0.1 M）のＬ−フェニルアラ
ニンに耐性（以下、ｐｈｅRRと略記する）の新規なＭ．
メチロトロファスｐＦｐR ｐｈｅR ｍＦｐR ｐｈｅRR変
異体Ｎｏ．２２７−１６−１０−１１が、上記のような
ＮＧ突然変異誘発により、株Ｎｏ．２２７−１６−１０
から選択された。このｐｈｅRR変異株は、試験管で、0.
5〜0.7 g/lのＬ−フェニルアラニン、0.3 g/lのＬ−バ
リン、0.2 g/lのＬ−ロイシン、並びに、0.1 g/l未満の
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミン
酸を産生した。
ニンに耐性（以下、ｐｈｅRRと略記する）の新規なＭ．
メチロトロファスｐＦｐR ｐｈｅR ｍＦｐR ｐｈｅRR変
異体Ｎｏ．２２７−１６−１０−１１が、上記のような
ＮＧ突然変異誘発により、株Ｎｏ．２２７−１６−１０
から選択された。このｐｈｅRR変異株は、試験管で、0.
5〜0.7 g/lのＬ−フェニルアラニン、0.3 g/lのＬ−バ
リン、0.2 g/lのＬ−ロイシン、並びに、0.1 g/l未満の
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミン
酸を産生した。
【００６１】Ｌ−フェニルアラニンの化学構造類似体で
あるケイ皮酸（50 mg/l）に耐性（以下、ｃｉｎRと略記
する）の新規なＭ．メチロトロファスｐＦｐR ｐｈｅR
ｍＦｐR ｐｈｅRR ｃｉｎR変異体Ｎｏ．２２７−１６−
１０−１１−ｃｉｎ８が、上記のようなＮＧ突然変異誘
発により、株Ｎｏ．２２７−１６−１０−１１から選択
された。このｃｉｎR変異株は、試験管で、0.8〜0.9 g/
lのＬ−フェニルアラニン及び0.6 g/lのＬ−バリンを産
生した。
あるケイ皮酸（50 mg/l）に耐性（以下、ｃｉｎRと略記
する）の新規なＭ．メチロトロファスｐＦｐR ｐｈｅR
ｍＦｐR ｐｈｅRR ｃｉｎR変異体Ｎｏ．２２７−１６−
１０−１１−ｃｉｎ８が、上記のようなＮＧ突然変異誘
発により、株Ｎｏ．２２７−１６−１０−１１から選択
された。このｃｉｎR変異株は、試験管で、0.8〜0.9 g/
lのＬ−フェニルアラニン及び0.6 g/lのＬ−バリンを産
生した。
【００６２】Ｎｏ．２２７、Ｎｏ．２２７−１６、Ｎ
ｏ．２２７−１６−１０、Ｎｏ．２２７−１６−１０−
１１及びＮｏ．２２７−１６−１０−１１−ｃｉｎ８
株、は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・
インダストリアル・マイクロオルガニズムス（Russian
National Collection of Industrial Microorganisms；
ＶＫＰＭ）に、2000年2月10日に寄託され（2000年7月18
日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管）、それぞ
れ、VKPM B-7909、VKPM B-7910、VKPM B-7911、VKPM B-
7912及びVKPM B-7913の受託番号が付与されている。
ｏ．２２７−１６−１０、Ｎｏ．２２７−１６−１０−
１１及びＮｏ．２２７−１６−１０−１１−ｃｉｎ８
株、は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・
インダストリアル・マイクロオルガニズムス（Russian
National Collection of Industrial Microorganisms；
ＶＫＰＭ）に、2000年2月10日に寄託され（2000年7月18
日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管）、それぞ
れ、VKPM B-7909、VKPM B-7910、VKPM B-7911、VKPM B-
7912及びVKPM B-7913の受託番号が付与されている。
【００６３】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−フェニルアラニンの
生産性が向上したメチロフィラス属細菌、及び、その細
菌を用いたＬ−フェニルアラニンの製造方法が提供され
る。
生産性が向上したメチロフィラス属細菌、及び、その細
菌を用いたＬ−フェニルアラニンの製造方法が提供され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 エレーナ ゲオルギエヴナ アバラキナ ロシア連邦、113545、モスクワ、１、ドロ ズニィ プロエズド、１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティチュー ト内 Ｆターム(参考） 4B064 AE29 CA02 CD02 CD06 4B065 AA01X BB02 BB06 CA17
Claims (10)
- 【請求項１】 Ｌ−フェニルアラニン生産能を有し、か
つフェニルアラニンアナログに対する耐性を有するメチ
ロフィラス属細菌。 - 【請求項２】 フェニルアラニンアナログに対する耐性
及びＬ−フェニルアラニンに対する耐性を有する請求項
１記載の細菌。 - 【請求項３】 ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに
対する耐性を有する請求項１記載の細菌。 - 【請求項４】 メチロフィラス属細菌から、フェニルア
ラニンアナログに対する耐性及びＬ−フェニルアラニン
に対する耐性を有する株を、各々の耐性について少なく
とも１回、かつ、任意の順序で段階的に選択することに
より得られる請求項２記載の細菌。 - 【請求項５】 ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに
対する耐性及びｍ−フルオロフェニルアラニンに対する
耐性を有する請求項２記載の細菌。 - 【請求項６】 メチロフィラス属細菌から、ＤＬ−ｐ−
フルオロフェニルアラニンに対する耐性、ｍ−フルオロ
フェニルアラニンに対する耐性及びＬ−フェニルアラニ
ンに対する耐性を有する株を、各々の耐性について少な
くとも１回、かつ、任意の順序で段階的に選択すること
により得られる請求項５記載の細菌。 - 【請求項７】 ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニンに
対する耐性、ｍ−フルオロフェニルアラニンに対する耐
性及びケイ皮酸に対する耐性を有する請求項２記載の細
菌。 - 【請求項８】 メチロフィラス属細菌から、ＤＬ−ｐ−
フルオロフェニルアラニンに対する耐性、ｍ−フルオロ
フェニルアラニンに対する耐性、ケイ皮酸に対する耐性
及びＬ−フェニルアラニンに対する耐性を有する株を、
各々の耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序
で段階的に選択することにより得られる請求項７記載の
細菌。 - 【請求項９】 メチロフィラス・メチロトロファスであ
る請求項１〜８のいずれか１項に記載の細菌。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の
細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−フェニルアラニ
ンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−フェニルアラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの
製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000105201/13A RU2202607C2 (ru) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | Штамм бактерий methylophilus methylotrophus - продуцент l-фенилаланина (варианты), способ получения l-фенилаланина |
| RU2000105201 | 2000-03-03 |
Publications (1)
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