NL8501186A - Fenylalanine-ammonia-lyase producerende microben cellen. - Google Patents

Description

« VO 7168

Titel: Fenylalanine-ammonia-lyase producerende microben cellen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe fenylalanine-ammonia- lyase producerende microorganismen en werkwijzen voor hun selectie, produktie en toepassing. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op micro-organismen die betrekkelijk hoge niveaus 5 van het enzym, fenylalanine-ammonia-lyase (hierna soms PAL genoemd), welk enzym op zijn beurt nuttig is voor de bereiding van L-fenylalanine.

L-fenylalanine is een essentieel aminozuur bij de mens en is derhalve een belangrijk bestanddeel van enterale en parenterale voe-dingssamenstellingen. Bovendien is dit aminozuur nuttig als uitgangs-10 materiaal voor de bereiding van andere produkten, zoals de kunstmatige zoetstof aspartaam. Er zijn diverse microbiologische werkwijzen voor de produktie van fenylalanine bekend. In het Amerikaanse octrooi-schrift 3.660.235 is bijvoorbeeld de produktie van fenylalanine beschreven door middel van fenylalanine-analoge resistente stammen van 15 Brevibacterium,Corynebacterium, Arthrobacter, Bacillus en Candida.

De bereiding van dit aminozuur door middel van mutanten van bepaalde stammen van Brevlbacterium, Corynebacterium, Arthrobacter en Escherichia, die tyrosine vereisen, is ook bekend. Zie de Amerikaanse octrooischriften 3.654.079 en 3.909.353.

20 PAL katalyseert de afbraak van L-fenylalanine tot trans-kaneel- zuur en ammonia. Deze enzymatische reactie is reversibel en in het Britse octrooischrift 1.489.468 is een werkwijze beschreven voor de bereiding van L-fenylalanine waarin de PAL gekatalyseerde reactie van trans-kaneelzuur met ammoniumionen, teneinde L-fenylalanine te vormen, 25 een rol speelt. Gebleken is, dat deze reactie een geschikte werkwijze is voor het bereiden van L-fenylalanine, zodat er een voortdurende behoefte bestaat aan micro-organismen, die een hoog niveau van PAL-activiteit vertonen. Dergelijke micro-organismen kunnen rechtstreeks gebruikt worden voor de omzetting van kaneelzuur en ammoniumionen in L-fenylalanine, 30 of men kan het enzym isoleren uit de cellen en toepassen teneinde L-fenylalanine te bereiden in diverse soorten bioreactoren.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe micro-organismen die een overproduktie aan PAL leveren.Deze micro-organismen worden verkregen door conventionele imitatietechnieken. Aangezien PAL-35 bevattende cellen energie kunnen ontlenen aan de enzymatische omzetting Λ > .·; . i · - 'i

\S· "*· J

* A» -2- van fenylalanine in trans-kaneelzuur en ammonia, en aan de daarop volgende afbraak van trans-kaneelzuur, vormt het groeien van dergelijke cellen op minimale voedingsmedia, die L-fenylalanine als in hoofdzaak de enige koolstofbron bevatten een middel voor het selecteren van mu-5 tanten die een overproduktie leveren aan PAL. Hoewel deze selectietechniek toegepast kan worden voor het identificeren van PAL-produce-rende mutanten, is het gebleken, dat de degradatie van L-fenylalanine aanzienlijk sneller plaatsvindt dan de daarop volgende afbraakreacties, zodat deze techniek niet bijzonder praktisch is voor het onderscheiden 10 van die mutanten, die hoge niveaus aan PAL-activiteit leveren, van stammen die slechts nominale produkties zijn.

Volgens de onderhavige uitvinding worden PAL-producerende mutanten geselecteerd door deze te groeien op een minimaal voedings-medium, dat als in hoofdzaak de enige koolstofbron een fenylalanine-15 analoog bevat. Dergelijke analogen worden uitgekozen op basis van hun vermogen te dienen als substraten voor PAL, waarbij de PAL-gekatalyseerde afbraak van de analoge verbinding de snelheidsbepalende stap is van de totale afbraak van het analoog tot simpele afbraakprodukten (metabolieten) onder gelijktijdige levering van biologische bruik-20 bare energie. Deze techniek kan toegepast worden teneinde stammen te selecteren, die een overproduktie aan PAL leveren, vein andere PAL-producerende micro-organismen en is bij-zolder nuttig voor het verkrijgen van gistmutanten van de soorten Rhodotorula en Rhodospori-dium. welke hoge niveaus aan PAL-activiteit leveren. Deze cellen kun-25 nen toegepast worden voor de directe omzetting van kaneelzuur en ammo-niumionen en fenylalanine, of anderszins kunnen gekweekt worden teneinde hoge niveaus aan pAL te produceren, hetgeen vervolgens toegepast wordt voor de bereiding van L-fenylalanine.

De microben stammen volgens de onderhavige uitvinding worden 30 verkregen door conventionele mutatieprocedures. Dergelijke procedures omvatten bijvoorbeeld het blootstellen van een cultuur van een basis-stam aan chemische mutatie, onder toepassing van een mutageen,zoals nitrosoguanidine, ethylmethaan-sulfonaat. 5-bromouracil, hydroxylamine, stikstof- en zwavel mosterd en dergelijke. Bestralen van de cellen met 35 ultraviolet licht of ioniserende straling kan ook toegepast worden.

85 0 1 1 8 8 -3- ' /» «· η

Dergelijke technieken zijn algemeen bekend en worden bijvoorbeeld beschreven in "Sasic Bacteriology1*, La Manna en Mallette, 2e editie, de Williams & Williams Company, Baltimore, 1959, pagina's 646-649.

Chemische of stralings-gelnduceerde mutatie levert in het 5 algemeen honderden tot duizenden mutant-stammen. Het selecteren van geschikte stammen met de gewenste karaktteristieken is een moeilijke taak, tenzij een specifieke selectiewerkwijze ontwikkeld kan worden. De onderhavige uitvinding omvat een selectieprocedure voor PAL-producerende mutanten, waarin de mutanten gekweekt worden op een 10 minimaal voedingsmedium, dat als in hoofdzaak de enige koolstofbron een substraat voor het PAL-enzym bevat. Die stammen die PAL bevatten kunnen het substraat afbreken, waarbij ze energie en voeding verkrijgen. Zoals hierboven aangegeven, is L-fenylalanine een substraat voor gAL, maar de enzymatische afbraak van L-fenylalanine tot kaneel-15 zuur en ammonia vindt erg snel plaats en de daarop volgende afbraak-reacties worden snelheidsbepalend. Hoewel fenylalanine-bevattende media selectief zijn voor mutanten die PAL bevatten, zijn ze derhalve niet bijzonder selectief voor stammen die een overproduktie leveren aan pAL, aangezien de groeisnelheid van de mutanten niet zo 20 zeer afhankelijk is van het PAL-gehalte van de cellen maar van de totale efficiëntie van de cel in het gebruik van fenylalanine-afbraakprodukten. De selectieprocedures volgens de onderhavige uitvinding omvatten het kweken van potentiële PAL-overproducerende mutanten op minimale media, die als in hoofdzaak de enige koolstofbron 25 een PAL -substraat bevatten, die langzaam afbreekt, vergeleken met de navolgende reacties in de metabole cyclus, De enzymatische afbraak wordt daarbij de snelheidsbepalende stap in de totale toepassing van het substraat door de cellen als voedings- en energiebron. Die cellen die het beste op dergelijke media groeien hebben de hoogste niveaus 30 aan PAL-activiteit. Bevestiging van het PAL-producerende vermogen van de cellen kan verkregen worden door enzymactiviteitsmetingen van de cellen, verkregen door de hierin beschreven procedure.

Diverse substraten zijn toegepast in deze procedures en in het algemeen kan men ieder substraat toepassen dat een lagere activiteit 35 met betrekking tot PAL-degradatie bezit dan fenylalanine. Voorbeelden Λ. ·-» .-1 „J "Ί % 4 ; ·.* -4- van dergelijke substraten omvatten, maar zijn niet beperkt tot L-fenylalaninemethylester, L-fenylalaninemethylester, m-fluoro-D,L-fenylalanine, L-tyrosine, β-2-thienyl-D,L-' alanine en p-fluoro-D,L-fenylalanine. Een substraat waar in het 5 bijzonder de voorkeur aan wordt gegeven is L-tyrosine. Het PAL- gekatalyseerde metabolisme van L-tyrosine vordert langzaam en is de snelheidsbepalende stap bij de totale toepassing van L-tyrosine als nutrient. Gebleken is, dat cellen, die kunnen groeien op minimale essentiële media, die L-tyrosine als in hoofdzaak de enige kool-10 stofbron bevatten, een relatief hoog niveau aan PAL-activiteit bezitten .

Als het L-tyrosinemedium geënt wordt met een populatie van PAL-bevattende mutanten, vindt de groei van de cellen normaal gesproken plaats. In het algemeen wordt gedurende een aantal dagen geen 15 groei waargenomen, waarna een paar kolonies verschijnen. Analyse van deze kolonies op PAL-activiteit heeft aangetoond, dat deze hoge niveaus aan PAL-activiteit leveren.

Microben cellen, die verkregen kunnen worden door deze procedures omvatten bacteria van het genus Streptomyces en gisten van de genera 20 Rhodotorula, Rhodosporidium en Spordoolomyces. Na het produceren van mutanten van wilde of bekende PAL-producerende stammen, wordt de mutantenpopulatie geënt op een minimaal essentieel medium, dat een groei-bevorderende hoeveelheid van een PAL-substraat bevat,zoals hierboven beschreven. Het basis minimaal medium bevat essentiele vitaminen, 25 mineralen en een stikstofbron, maar bevat niet voldoende hoeveelheden van een koolstofbron voor de bevordering van microben groei.

Dit basismedium wordt aangevuld met het PAL-substraat, bij voorkeur L-tyrosine, hetgeen dus dient als de enige koolstofbron. In het algemeen past men concentraties van het PAL-substraat toe van ongeveer 30 1 tot ongeveer 10, bij voorkeur van ongeveer 3 tot ongeveer 7 g/1 medium.

Minimale essentiële media zijn bekend en bevatten in het algemeen fosfaat, sulfaat, chloride, jodide en molybdaatzouten van kalium, natrium, ijzer, mangaan en zink in concentraties van onge-35 veer 0,05-1,0 g/1. Bovendien bevatten deze media met voordeel vitaminen

-w —I ’ -I Λ ,A

Ow ,· 1 J

% J

-5- en groei-bevorderende stoffen, zoals biotyne, calciumpantothenaat, foliumzuur, linositol, pyocine, p-aminobenzoëzuur, pyridoxine-hydrochloride, hydroflavine en thiaminehydrochloride, waarvan de hoeveelheden variëren van ongeveer 0,1 tot ongeveer 1,0 g/1.

5 De samenstelling van het medium is niet kritisch en kan gebaseerd zijn op een variëteit aan synthetische, chemisch-synthetische of natuurlijke ingrediënten.

De selectiemedia zijn bij voorkeur vaste media(bijvoorbeeld agar-media ),teneinde de hantering en het overbrengen van de cellen te ver-10 eenvoudigen. Deze media zijn steriel en worden gebufferd op een fysiologisch aanvaardbare pH,bijvoorbeeld van ongeveer 5 tot ongeveer 8, bij voorkeur van ongeveer 6 tot ongeveer 7. Geënte media worden ge-incubeerd bij biologisch aanvaardbare temperaturen^ bijvoorbeeld vanong.20°C tot ong. 50°C, meer in het bijzonder ongeveer 30°C. Gebleken is, dat 15 de hierboven beschreven procedures in het bijzonder nuttig zijn voor het verkrijgen van PAL-overproducerende mutantstammen van de rode gisten, Rhodotorula rubra en Rhodosporidium toruloides. Deze mutanten leveren grote kolonies op L-tyrosine verrijkte minimale, essentiële media, en het is aangetoond, door middel van enzymactiviteitsmetingen, 20 dat ze hoge niveaus aan PAL leveren.

PAL is een induceerbaar enzym in de meeste micro-organismen, waarbij een substraat voor PAL-produktie benodigd is. Bovendien zijn deze enzymen dikwijls onderworpen aan katabolische onderdrukking.

Met voordeel worden derhalve produktiewerkwijzen ontworpen, waarbij 25 de inductie van de PAL-synthese maximaal is en de katabolische repressie minimaal is.

In het algemeen wordt PAL geproduceerd door het cultiveren van een PAL-producerende stam op een voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen bevat, evenals essentiele vitaminen, mine-30 ralen en andere groeifactoren. Geschikte koolstofbronnen kunnen diverse geraffineerde of ruwe koolwaterstoffen omvatten, zoals glucose, molassen, zetmelen, granen en dergelijke. Een bij voorkeur toegepaste koolstofbron is glucosestroop.

Stikstofbronnen omvatten anorganische ammoniumzouten, zoals 35 ammoniumfosfaten, ammoniumsulfaat, ammoniumacetaat, ammoniumcitraat, Λ '1 * /1 ^ ^ r i .

-V J J * w 'J

-6- ammoniumnitraat en dergelijke, evenals organische stikstofbevattende produkten, zoals sojabonenmeel, vleesbouillon, aminozuren, maisweekvloeistof, proteinehydrolysaat, peptonen, gistextracten, en dergelijke. Een stikstofbron, die bij voorkeur toegepast wordt 5 voor de werkwijze van de onderhavige uitvinding is gistextract.

Vitaminen, mineralen en andere groeifactoren kunnen geleverd worden door de koolstof- en stikstofbronnen of kunnen apart geleverd worden. Deze componenten kunnen variëren, afhankelijk van het micro-organisme dat in het specifieke geval toegepast wordt. In het bijzonder 10 kunnen sporen mineralen, zoals zink, mangaan, ijzer, kobalt en calcium toegevoegd worden in groei-bevorderende hoeveelheden als anorganische zouten. Deze mineralen kunnen bijvoorbeeld toegevoegd worden met het proceswater, b.v. kraanwater, zeewater en dergelijke. Een andere groeifactor die in het bijzonder toegevoegd kan worden is D,L-15 methionine. Voedingsmedia van de beschreven typen zijn welbekend en kunnen aanzienlijk in samenstelling variëren.

Vanwege de induceerbare aard van het PAL-enzym in de meeste micro-organismen, worden de cellen in het algemeen gekweekt tot een gewenste celdichtheid in een conventioneel medium, zoals hierboven beschreven. Nadat de gewenste celgroei verkregen is, kan een PAL-20 inducerende verbinding toegevoegd worden, teneinde de PAL-synthese te stimuleren. L-fenylalanine is een goede PAL-inducerende verbinding en een aantal analoge verbindingen van L-fenylalanine induceren ook de synthese van dit enzym. Bijvoorbeeld L-tyrosine, L-fenylalanine-methylester, of m-fluoro-D,L-fenylalanine kunnen voor dit doel toe-25 gepast worden.

De PAL-inducerende verbinding wordt aan de cellen toegevoegd in een PAL-inducerende hoeveelheid, die in het algemeen varieert van ongeveer 0,1 tot ongeveer 1,0 g/g aan cellen (droog gewicht).

Bij voorkeur wordt de PAL-inducerende verbinding toegepast in een con-30 centratie van ongeveer 0,2 tot ongeveer 0,5. Gedurende deze stap worden PAL-inducerende condities van temperatuur, pH en beluchting gehandhaafd. Deze parameters kunnen variëren en worden in het algemeen gehandhaafd binnen fysiologisch bruikbare grenzen.

Als de toegepaste cellen gevoelig zijn voor katabolische onder-35 drukking van de PAL-synthese, dienen vóór de inductie, maatregelen genomen te worden, teneinde de katabolieten en de precursors daarvan in C S 0 1 1 .*

*“ V

-7- het medium te verminderen of er uit te elimineren. Dit kan men doen door het afscheiden van de cellen van het medium, ze te wassen en ze in een katabolietvrij medium te suspenderen. Het is ook mogelijk de cellen te laten groeien tot de voedingsstoffen in hoofdzaak verbruikt 5 zijn, voordat de PAL-induetieprocedure geïnitieerd wordt.

De cellen worden met voordeel gekweekt onder PAL-inducerende condities totdat de PAL-activiteit ongeveer 0,5-2,0 eenheden/ml heeft bereikt, bij voorkeur 1,5 eenheden/ml. Men heeft in het algemeen waargenomen dat onder deze condities de PAL-activiteit toeneemt tot een 10 bepaald punt en dan begint te verminderen. PAL dat door middel van deze werkwijze geproduceerd is kan toegepast worden voor het bereiden van L-fenylalanine uit trans-kaneelzuur en ammonia. Deze reactanten kunnen direct aan de PAL-bevattende cellen in een waterig medium toegevoegd worden. De cellen of het enzym dat daaruit geïsoleerd is, kan ook door 15 middel van bekende werkwijzen geïmmobiliseerd worden op een vaste drager, die net zo lang opnieuw gebruikt kan worden als de enzym-activiteit gehandhaafd blijft.

Fenyalalanine wordt bereid door middel van deze werkwijze onder toepassing van fenylalanine-producerende condities. Deze condities 20 zullen variëren, afhankelijk van de in het bijzonder toegepaste microbe-stammen, danwel of deze als complete cellen, celvrije enzymepreparaten of geïmmobiliseerde systemen worden toegepast. In het algemeen wordt trans-kaneelzuur en waterige ammonia (of oplosbare ammoniumzouten) toegevoegd in dusdanige hoeveelheden, dat de waterige ammonia of de 25 ammoniumzouten in overmaat aanwezig zijn. Waterige ammonia en anmonium-zouten worden toegepast in hoeveelheden van ongeveer 3 tot ongeveer 8 mol/1. Het doel van de hoge ammoniaconcentratie is een hoge omzet-tingssnelheid van trans-kaneelzuur in fenylalanine te verkrijgen.

Het trans-kaneelzuur wordt toegepast in hoeveelheden van on-30 geveer 5 tot ongeveer 30 g/1. De concentratie van trans-kaneelzuur in de reactor wordt binnen deze grenzen gehandhaafd door periodieke toevoegingen van trans-kaneelzuur. De pH wordt gehandhaafd tussen 9,5 en 11, bij voorkeur tussen 10,4 en 10,8. De temperatuur wordt in het algemeen tussen 15 en 35° gehouden.

35 L-fenylalanine dat doror middel van deze werkwijzen geproduceerd is, kan op iedere geschikte wijze gewonnen worden. De oplosbaarheid j| J , ¼ Λ Μ .Λ ; : 1 : .*t V -sr ; * W u/ • m -8- ' van dit aminozuur is betrekkelijk laag/ zodat het produkt vaak zal precipiteren vanuit het reactiemengsel als de pH ingesteld wordt op het isoëlektrische punt (5,5). Het aminozuur kan dan gewonnen worden door filtreren of centrifugeren. Het produkt kan vervolgens 5 verder gezuiverd worden, indien gewenst, door rekristallisatie of kolom-chromatografie. Een bij voorkeur toegepaste winningsprocedure is beschreven in de niet-voorgepubliceerde Europese octrooiaanvrage 84307522.7, ingediend op 30 oktober 1984, waarvan de inhoud bij wijze van referentie in de onderhavige aanvrage opgenomen is.

10 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de vol gende voorbeelden, welke niet beperkend bedoeld zijn.

Voorbeeld I

Dit voorbeeld beschrijft de mutatie·en selectie van gistcellen, teneinde PAL-overproducerende cellen te verkrijgen.

15 STAMMEN

Rhodotorula rubra (ATCC 4056) en Rhodosporidium toruloides (ATCC 10788 ; "mating-type alpha") werden verkregen van American Type Culture Collection, Rockville, Maryland ü.S.A. De stammen werden gehouden op YE-agar (zie hierna). Het kweken in een vloeibare cultuur werd 20 gevolgd aan de hand van de optische dichtheid bij 560 mm. Een optische dichtheid van 1,0 komt overeen met ongeveer 0,37 g/1 droog celgewicht. De culturen werden geënt bij 30°C.

MEDIA

YE-medium bevatte 15 g gistextract/liter. Minimale media bevat-25 ten allemaal, per liter, 1 g monobasisch kaliumfosfaat, 0,5 g magnesiumsulfaat, 0,1 g natriumchloride, 0,1 g calciumchloride en 0,4 mg elk van biotine, calciumpantothenaat, foliumzuur, inositol, niacine, para-aminobenzoëzuur, pyridoxinehydrochloride, riboflavine, thiamine-hydrochloride, boorzuur, kaliumjodide, ferrichloride, mangaansulfaat, 30 natriummolybdaat en zinksulfaat. In aanvulling daarop bevatte het GP-medium 10 g glucose en 5 g L-fenylalanine/liter; het PA-medium bevatte 5 g elk van L-fenylalanine en ammoniumsulfaat per liter; en het TA-medium bevatte 5 g/1 elk aan L-tyrosine en ammoniumsulfaat. Vaste media bevatten 20 g agar/1, in aanvulling op de bovengenoemde componen-35 ten.

35 ;1 1 $-3 * · -9-

MUTAGENESE

De culturen werden gekweekt in YE-medium tot een optische dichtheid vam. 1,5 of meer bereikt was. De culturen werden vervolgens gecentrifugeerd en gesuspendeerd in PA-medium met een optische dichtheid 5 van 2. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) werd toegevoegd bij een eindconcentratie van 20-100^,ug/ml en de culturen werd 9e_ incubeerd onder schudden gedurende 30 minuten bij 30°C. De cellen werden gewassen voordat men ze verdunde en op platen aanbracht.

Voor de ethylmethaansulfonaat (EMS)-mutagenese, werden de cellen 10 behandeld op dezelfde wijze, zoals hierboven, maar NTG werd vervangen door EMS, hetgeen toegevoegd werd tot een eindconcentrayie van 5 mg/ml.

De blootstelling aan EMS duurde 60 minuten.

TEST

De PAL-activiteit werd gemeten door een monster van de cellen 15 (10-100 ^ul) toe te voegen aan 900 ^,ul van een oplossing van 50 mM Tris- buffer (pH 8,8), 25 mM L-fenylalanine en 0,001% (gew./vol.) cetylpyri-diniumchloride. Dit mengsel werd geïncubeerd in een schrijvende spectro-fotometer en de verschijning van kaneelzuur werd gevolgd bij 280 nm (molaire absorptie is 16200). Als L-tyrosine toegepast werd als 20 substraat, werd de optische dichtheid gevolgd bij 315 nm. Een molaire extinctie-coëfficient van 10.000 werd toegepast voor coumarinezuur.

De snelheid van toename in optische dichtheid werd gemeten gedurende een periode van lineaire toename, normaal gesprken tussen 1 en 5 minuten na toevoeging van de cellen. Een eenheid PAL is de hoeveelheid 25 enzym, die de vorming van 0,83 ^.u mol kaneelzuur/min bij 22°C of 1 mol per minuut bij 30°C, katalyseert. Specifieke activiteiten worden uitgedrukt als eenheden PAL per g aan droog celgewicht (ü/g).

PAL—INDUCTIE

Voor de PAL-inductie werden stammen geënt van agarplaten in YE-30 medium en geïncubeerd bij 30°C onder schudden. Als de optische dichtheid bij 560 nm 1,5 of hoger werd, werden de culturen gecentrifugeerd op 6.000 G, gedurende 10 minuten. De celkorrels werden gehersuspen-deerd in PA-medium bij een optische dichtheid van 1,0. De culturen werden vervolgens geïncubeerd bij 30°C onder schudden, waarbij de tijds-35 duur nader in de tekst aangegeven is. Vervolgens werden de PAL-activiteit en de optische dichtheid gemeten.

^ ij 1 π J & v v 1 * J

-10-

, SUBSTRAAT TESTEN

Een aantal fenylalanine-analogen werden getest als substraten voor PAL. De activiteit van iedere verbinding als substraat voor PAL werd vastgesteld door het meten van de snelheid van toename van 5 absorptie bij 280 nm of 315 nm, als PAL-bevattende cellen van R.rubra ATCC 4056, geïncubeerd werden met oplossingen, die 50mM Tris-buffer (pH 8,8), 0,001% (gew./vol) cetylpyridiniumchloride en 2 mM van de te testen component bevatten. De resultaten van deze tests, weergegeven in Tabel A, gevan aan, dat een aantal fenylalanine-analogen 10 minder efficiënt werken dan L-fenylalanine als PAL-substraten, zodat deze toegepast kunnen worden voor het uitzoeken van PAL-overproducerende stammen volgens de onderhavige uitvinding. Dergelijke verbindingen omvatten onder meer L-fenylalaninemethylester, L-fenylalanine-ethyles-ter, m-fluoro-D,L-alanine en p-fluoro-D,L-fenylalanine.

15 KWEEK VAM MUTANTEN OP TYROSINEMEDIA

Mutanten van R. rubra en R. toruloides, die verkregen waren, zoals hierboven beschreven, werden aangebracht op plaatjes van L-tyrosine-bevattende media (TA-plaatjes). Na 5 dagen incubatie op deze media verschenen enkele kolonies. De grootte van de kolonies 20 was vergelijkbaar met hetgeen waargenomen werd na 2 of 3 dagen incubatie met L-fenylalanine als koolstofbron. Diverse kolonies R. rubra en R. toruloides, werden opgenomen van de TA-plaatjes en uitgestreken op TA-agar. Nadat deze gegroeid waren, werden afzonderlijke kolonies geïnduceerd voor PAL, zoals hierboven beschreven. PAL-testresultaten 25 tonen aan, dat veel van deze geïsoleerde produkten leverden hoge niveaus aan PAL. Van vier van derg. stammen is aangetoond,dat ze bijzonder hoge niveaus aan PAL-activiteit vertonen.Deze stammen zijn gedeponeerd bij het United States Department of Agriculture, Agricultural Research Culture

Collection, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, U.S.A.

Deze stammen hebben de aanduidingen en toelatingsnummers, zoals 30 hierna opgesomd, verkregen: R. rubra GX3243 NRRL Y-15597 R. rubra GX3242 NRRL Y-15596 R. toruloides GX 3249 NRRL Y-15599 R. toruloides GX3248 NRRL Y-15598 a λ -M g δ 3?

Substraat activiteit . , ,. ten opzichte van L-fenylalanine yeraindrng_ _2___

-11-TABEL A

PAL· substraat activiteit van fenylalanine analogen 5 L-fenylalanine 100 L-fenylalanine methylester 60 L-fenylalanine ethylester 47 m-fluosyD, L-fenylalanine 43 L-tyrosine 31 10 S-2-chienyl-D,L-alanine 27 p-fluoro-D,L-fenylalanine 20 L-2-amino-3-fenyl-l-propanol 15 3-fenyl-D,L-serine 10 m-D,L-tyrosine 8 15 β-methyl-D,L-fenylalanine 5 D-tyrosine 4 4 N-CBZ-L-fenylalanine < 4 N-t-BOC-L-fenylalanine ^ 4 .

p-amino-D,L-fenylalanine ^ 3 20 o-D,L-tyrosine ^ 3 x CBZ : carbobenzyloxy xx BOC : N-tert-butoxycarbonyl £"11186 V 1 i V v

Claims (21)

1. Feny lalanine-ammoniar lyase-producerend micro-organisme, dat het vermogen heeft te groeien op een minimaal essentieel medium, dat als in hoofdzaak de enige koolstofbron L-tyrosine bevat.

2. Micro-organisme volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 5 een bacterie van het genus Streptomyces is.

3. Micro-organisme volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het een gist is van het genus Rhodotorula, Rhodosporidium of Sporobolomyces.

4. Micro-organisme volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat 10 het de gist Rhodotorula rubra of Rhodosporidium toruloides is.

5. Micro-organisme volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het R. rubra is, met de identificerende karakteristieken van stam GX 3243, NRRL Y-15597.

6. Micro-organisme volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het

7. Micro-organisme volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het R. toruloides is met de'identificerende kard<fceristieken van stam GX 3249, NRRL-Y-15599.

8. Micro-organisme volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het R. toruioides is met de identificerende karakteristieken van stam GX 3248, NRRL-Y-15598.

9. Werkwijze voor het bereiden van fenylalanine-ammonia-lyase, omvattende het cultiveren onder PAL-producerende condities van een

25 PAL-producerende microbenstam in een voedingsmedium dat assimileerbare koolstof- en stikstof-bronnen bevat evenals essentiele mineralen en groeifactoren, waarbij de PAL-producerende microbenstam een micro-organisme is, dat het vermogen heeft te groeien op een minimaal essentieel medium, dat als in hoofdzaak de enige koolstofbron 30 L-tyrosine bevat.

10 Rhodosporidium of Sporobolomyces is.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat na het kweken van de cellen van de microbenstam, een PAL-inducerende verbinding aan de cellen toegevoegd wordt. - * *J -13-

11- Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men voor het toevoegen van de PAL-indueerende verbinding de katabolieten of precursors daarvan in het voedingsmedium verwijdert of in concentratie vermindert.

12. Werkwijze volgens conclusie 9,10 of 11, met het kenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam een bacterie van het genus Streptomyees is.

13. Werkwijze volgens conclusies 9-11, met het kenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam een gist van het genus Rhodotorula,

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam Rhodotorula rubra of Rhodosporidium toruloides is.

15 PAL-producerende microbenstam R.rubra is met de identificerende karakteristieken van stam GX 3243, NRRL Y-15597.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de

15 R.rubra is met de identificerende karakteristieken van stam GX 3242/ NRRL Y-15596.

16. Werkwijze volgens conclusie 14, met het tenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam R. rubra is, met de identificerende karakteristieken van stam GX 3242, NRRL Y-15596.

17. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam R. toruloides is met de identificerende karakteristieken van stam GX 3249, NRRL Y-15599.

18. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de PAL-producerende microbenstam R. toruloides is, met de identificerende 25 karakteristieken van stam GX 3248, NRRL Y-15598.

19. Werkwijze voor het bereiden van L-fenylalanine, omvattende (a) het bereiden van fenylalanine-ammonia-lyase door kweken van een PAL-producerende microbenstam onder PAL-producerende condities in een voedingsmedium dat assimileerbare koolstof- en stik-30 stofbronnen bevat, evenals essentiele mineralen en groeifactoren, waarbij de PAL-producerende microbenstam een micro-organisme is dat het vermogen bezit in een minimaal essentieel medium te groeien dat als in hoofdzaak de enige koolstofbron L-tyrosine bevat, (b) het in contact brengen van de fenylalanine-ammonia-lyase 35 met trans-kaneelzuur en ammonia onder L-fenylalanine-producerende * A s . .. « ! V J -14- condities, teneinde L-fenylalanine te vormen en (c) het winnen van L-fenylalanine.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat men na het kweken van de cellen van de microbenstam een PAL-indueerende verbin- 5 ding toevoegt aan de cellen.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat men,voordat men de PAL-inducerende verbinding toevoegt, de katabolieten of hun precursors in het voedingsmedium verwijdert of de concentratie ervan vermindert. 35 0 1 1 8 ê