DE4231764A1

DE4231764A1 - Verfahren zur chromosomalen Integration eines Produkt-Gens

Info

Publication number: DE4231764A1
Application number: DE4231764A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dipl Biol Dr Steinborn
Original assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 1992-09-23
Filing date: 1992-09-23
Publication date: 1994-03-24

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Integration eines Produkt-Gens in das Chromosom eines Rezipienten, beispiels weise eines als Rezipienten-Stamm dienenden Bakterien-Stam mes, nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Verfahren der chromosomalen Gen-Integration und -Amplifika tion wurden bei Bacillus wiederholt zur genetischen Stabi lisierung und zur stabilen Amplifikation von klonierten Produkt-Genen erprobt (Mountain 1989), um eine Steigerung der Gen-Dosis und damit der Produktbildung zu erzielen. Vorteile dieser Verfahren gegenüber der Anwendung von ex trachromosomalen (autonom replizierenden) rekombinanten Plasmiden waren vor allem für hochexprimierte und hetero loge Produkt-Gene sowie unter industriellen Bedingungen ei ner hohen Produktbildung und der Langzeit-Kultivierung zu erwarten, unter denen ein destabilisierender Selektions druck gegen rekombinante Produktions-Stämme ausgeübt wird.

Für Bacillus wurden dabei Vorteile in besonderem Maße er wartet, da extrachromosomale rekombinante Plasmide in Ba cillus wegen struktureller und segregativer Plasmid-Insta bilität häufig nicht oder nur begrenzt nutzbar sind. Diesen Erwartungen konnten die bisher angewandten Integrations- Verfahren nur sehr begrenzt entsprechen.

Widersprüchliche Ergebnisse liegen für Verfahren mittels Amplifikationseinheiten vor, bei denen das Produkt-Gen und ein eng gekoppeltes Antibiotika-Resistenz-Gen innerhalb ei ner DNS-Repeat-Struktur unter ansteigendem Selektionsdruck eines Antibiotikums amplifiziert werden. Der so mit gerin gem Aufwand erreichbare Amplifikationsgrad ist nach Entzug des Antibiotikums zumeist nicht stabil aufrechtzuerhalten. Diese Instabilität wird auf Rekombinationsprozesse infolge direkter DNS-Repeats (Vagner/Ehrlich 1988) und DNS-Einzel strang-Bildung bei Replikation von amplifizierter Plasmid- DNS in Anwesenheit der Plasmid-Replikations-Region ori-rep (Young/Ehrlich 1989) zurückgeführt. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht in der Amplifikation von Genen für Resistenz gegen humantherapeutische Antibiotika wie Chloramphenicol und Kanamycin.

Eine hohe genetische Stabilität konnte hingegen bei Ver fahren mit mehrfacher, schrittweiser Integration von einzelnen Gen-Kopien an zufällig verteilten Stellen des bakteriellen Chromosoms erzielt werden, und nach wiederhol ter Integration von hochexprimierten Produkt-Genen wurde die Produktbildung wesentlich gesteigert (Kallio 1987, Steinborn 1988/1) und dieses Ergebnis auch während einer längeren Kultivierung (100 Generationen) ohne Selektions druck durch Antibiotika beibehalten (Steinborn 1988/1). Nachteile dieser Verfahren bestehen jedoch in der Anwendung des einfachen Crossing-over, der dadurch bedingten Integra tion von vollständigen Integrations-Plasmiden, einschließ lich Genen für Resistenz gegen humantherapeutische Antibio tika, und in der geringen Selektivität.

Diese geringe Selektivität ist darauf zurückzuführen, daß ein Produkt-Gen in der Regel nicht selektiv, eine schritt weise Erhöhung seiner Kopienzahl nur schwer nachweisbar, ein bestimmtes Selektionsmerkmal nicht unmittelbar für die nächste Integration verwendbar und die Anzahl der verfügba ren Selektionsmerkmale begrenzt ist. Congression (Kallio 1987) und mutative Inaktivierung (Steinborn 1988/1) erwie sen sich als hilfreich, erhöhen aber die Selektivität nur teilweise und erfordern einen erheblichen technischen Auf wand.

Es wurde auch bereits angeregt, ein thy-Gen für Thymidylat- Synthetase als Selektionsmerkmal für die mehrfache, schrittweise Integration anzuwenden (Steinborn 1988/2). Der besondere Vorteil liegt in seiner zweifachen Selektivität, indem ein funktionsfähiges thy-Gen auf Grund von Thymidin- Prototrophie und ein inaktiviertes thy-Gen an Hand von Tri methoprim-Resistenz selektierbar sind. Doch war auch dieser Vorschlag nur auf das einfache Crossing-over beschränkt, das für die Integration nachteilig ist. Dieses erfolgt zwi schen dem Chromosom des Rezipienten und einem Integrations- Plasmid in zirkulärer Form mit einem chromosomalen DNS- Fragment in lateraler Position zum Produkt-Gen, das an ho mologer Position des Chromosoms die generelle Rekombination initiiert (Niaudet 1985). Dabei wird das Produkt-Gen mit der gesamten Plasmid-DNS integriert, so daß bei mehrfacher Integration auch mehrere vollständige Plasmid-Kopien inte griert werden. Dieses ist nachteilig, weil die Plasmid-Ko pien als Fremd-DNS den Rezipienten belasten und eine desta bilisierende Rekombination und unkontrollierte Freisetzung von Plasmid-DNS ermöglichen.

Diese Mängel sollen deshalb nach einem weiteren Vorschlag (Kallio 1987) durch die Anwendung des doppelten Crossing- over behoben werden, bei dem im Unterschied zum einfachen Crossing-over die Integration auf das Produkt-Gen begrenzt werden kann. Untersuchungen zum doppelten Crossing-over be schränkten sich bisher auf wenige theoretische Arbeiten mit B. subtilis 168, wobei nur ein Antibiotika-Resistenz-Gen einfach integriert worden ist (Niaudet 1985). Stabile ha ploide Integrationsstämme konnten unter bestimmten Bedin gungen (Transformation von linearisierten Integrations- Plasmiden in kompetente Zellen des Rezipienten, Flankierung der zu integrierenden DNS im Integrations-Plasmid durch ho mologe, nicht unmittelbar benachbarte DNS-Fragmente mit der gleichen relativen Orientierung wie im Chromosom des Rezi pienten und Deletion des Chromosoms des Rezipienten in der Position des doppelten Crossing-over und Verlust der Le bensfähigkeit bei Deletion einer essentiellen Gen-Funktion) mit erhöhter Häufigkeit isoliert werden. Dieses Verfahren ist aber auf Rezipienten hoher Transformationsfähigkeit be schränkt, so daß auch linearisierte Integrations-Plasmide in großer Zahl transformiert werden - eine Voraussetzung für ein effektives doppeltes Crossing-over.

Alle anderen Bacillus-Arten haben eine weitaus geringere Transformationsfähigkeit, so daß zusätzliche Maßnahmen und andere Methoden der Plasmid-Transformation, Selektion oder Induktion ergriffen werden müssen. Eine industriell so be deutende Art wie B. amyloliquefaciens war bisher nur einfa chem Crossing-over zugänglich, das zudem nur mittels trans formierter, in vivo replizierter Integrations-Plasmide aus geführt werden konnte (Steinborn 1988/2, Vehmaanperä 1991).

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die angegebe nen Nachteile des bekannten Standes der Technik zu beseiti gen und ein eingangs näher bezeichnetes Verfahren so zu ge stalten, daß die Vorteile der mehrfachen Kopien-Zahl bei der Integration eines hochexprimierten Produkt-Gens und da mit der hohen Produktivität des Rezipienten mit dessen ho her genetischer Stabilität und darüberhinaus mit umweltbio logischer Sicherheit verbunden sind.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß gene relle Rekombination nach dem Mechanismus des doppelten Crossing-over angewendet wird, daß ein kloniertes thy-Gen in funktionsfähiger Form und - mit dieser alternierend - in inaktivierter Form zur Integration und Selektion des Pro dukt-Gens verwendet wird, daß das doppelte Crossing-over durch Antibiotika-Sensibilität und einfaches Crossing-over mittels Antibiotika-Resistenz nachgewiesen werden, und daß die durch das doppelte Crossing-over erfolgte Integration des Produkt-Gens durch den Nachweis zusätzlicher Gen-Kopien dieses Produkt-Gens und des Fehlens von Plasmid-DNS bestä tigt wird. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn ein funktionsfähiges thy-Gen in einzelnen Gen-Kopien schritt weise mittels unterschiedlicher Integrations-Plasmide, bei spielsweise mittels unterschiedlicher pIT-Integrations- Plasmide, in das Chromosom des Rezipienten integriert und seine Integration an Hand von Thymidin-Prototrophie selek tiert wird, und wenn weiterhin das Produkt-Gen in einzelnen Gen-Kopien schrittweise mittels eines Integrations-Plas mids, beispielsweise mittels eines pIG-Integrations-Plas mids, nach jeweils einer vorausgegangenen Integration einer Gen-Kopie des funktionsfähigen thy-Gens in dieses thy-Gen integriert, dadurch das thy-Gen inaktiviert und die so er zeugte Thymidin-Auxotrophie an Hand von korrelierter Trime thoprim-Resistenz selektiert wird. Es ist besonders gün stig, wenn dabei in den pIT-Integrations-Plasmiden das funktionsfähige thy-Gen durch chromosomale DNS-Fragmente des Rezipienten flankiert wird, die an homologen Positionen des Chromosoms die Integration des thy-Gens durch einfaches oder doppeltes Crossing-over bewirken, und wenn dabei in den pIG-Integrations-Plasmiden das Produkt-Gen von DNS- Fragmenten des thy-Gens flankiert wird, die die Integration des Produkt-Gens durch einfaches oder doppeltes Crossing over bewirken, und wenn ferner in den Integrations-Plasmi den das thy-Gen beziehungsweise das Produkt-Gen und ihre flankierenden DNS-Fragmente durch eng gekoppelte Antibio tika-Resistenz-Gene flankiert werden. Es ist vorteilhaft, daß die Antibiotika-Resistenz-Gene bei doppeltem Crossing over nicht integriert werden und die Antibiotika-Sensibili tät des Rezipienten zum Nachweis des doppelten Crossing over verwendet wird, und daß ferner die Antibiotika-Resi stenz-Gene bei einfachem Crossing-over integriert und die Antibiotika-Resistenz des Rezipienten zum Nachweis des ein fachen Crossing-over verwendet wird.

Weitere Merkmale enthalten die Unteransprüche 9 bis 55.

Wegen des doppelten Crossing-over wird nur DNS mit dem Pro dukt-Gen integriert, während die Antibiotika-Resistenz-Gene und andere Plasmid-DNS von der Integration ausgeschlossen sind. Es ist folglich ganz bemerkenswert und ein wesentli ches Ergebnis der Erfindung, daß das Verfahren zwar zunächst gentechnische Mittel verwendet, um einen Rezipien ten in geeigneter Weise zu verändern, dieser aber im Ergeb nis durchaus den Status konventioneller, gentechnisch nicht bearbeiteter Integrations-Stämme aufweist. Die Erfindung verbindet damit zwei wesentliche Gesichtspunkte: mit Mit teln der Gentechnik können beispielsweise hochproduktive bakterielle Produktions-Stämme geschaffen werden, die aber keine Merkmale der gentechnischen Bearbeitung mehr aufwei sen und deshalb auch strengen umweltbiologischen Anforde rungen genügen.

Die Nutzung des thy-Gens als selektives Reporter-Gen für eine mehrfache, schrittweise Integration erfolgt in der Weise, daß in einem ersten Integrationsschritt mittels ei nes ersten pIT-Integrations-Plasmids zunächst eine Kopie des funktionsfähigen thy-Gens durch doppeltes Crossing-over (DC01) integriert und diese Integration an Hand von gene tisch stabiler Thymidin-Prototrophie (Thy⁺) selektiert wird. In dieses integrierte thy-Gen wird in einem zweiten Integrationsschritt mittels eines pIG-Integrations-Plasmids das Produkt-Gen durch doppeltes Crossing-over (DC02) inte griert, wobei das thy-Gen inaktiviert und die so erzeugte Thymidin-Auxotrophie (Thy⁻) an Hand von korrelierter, stabiler Trimethoprim-Resistenz (Tmp^r) zur Selektion auf Integration des Produkt-Gens nutzbar ist. Danach wird eine zweite Kopie des funktionsfähigen thy-Gens mittels eines zweiten, vom ersten unterschiedlichen pIT-Integrations- Plasmids an anderer, zufällig verteilter Stelle des Chromo soms und in dieses mittels des gleichen pIG-Integrations- Plasmids eine zweite Kopie des Produkt-Gens integriert. In gleich alternierender Weise wird die Integration des Pro dukt-Gens bis zu einer solchen Kopien-Zahl und entsprechen der Gen-Dosis fortgesetzt, die der Leistungsfähigkeit und der physiologischen Verträglichkeit des Rezipienten ent sprechen. Neben der besonderen Eignung des thy-Gens als se lektives Reporter-Gen für die mehrfache schrittweise Inte gration durch doppeltes Crossing-over ist es auch bemer kenswert wegen seiner epidemiologischen und toxikologischen Unbedenklichkeit.

Als flankierende DNS-Fragmente dienen für die pIT-Integra tions-Plasmide Teilstücke von nicht vorselektierten chromo somalen DNS-Fragmenten, die die generelle Rekombination an zufällig verteilten homologen Stellen des Chromosoms initi ieren. Beide Teilstücke müssen dabei eine für diese Rekom bination hinreichende Länge haben, so daß beidseitiges ein faches Crossing-over zu doppeltem Crossing-over führt.

In den pIG-Integrations-Plasmiden werden dagegen Teilstücke des thy-Gens als flankierende DNS-Fragmente benutzt, welche die generelle Rekombination in einem vorher integrierten thy-Gen initiieren. Die flankierenden DNS-Fragmente haben in den pIT- und pIG-Integrations-Plasmiden die gleiche re lative Orientierung wie im Chromosom des Rezipienten, eine Vorbedingung für die Erzeugung stabiler haploider Integra tions-Stämme mittels doppeltem Crossing-over.

Auf Grund der unmittelbaren Nachbarschaft der flankierenden DNS-Teilstücke können die Integrations-Plasmide mit relativ geringem Aufwand hergestellt werden, und große Deletionen im Chromosom des Rezipienten werden vermieden, so daß die Lebensfähigkeit dieser Integrations-Stämme befördert wird. Aus dem gleichen Grund werden pIT-Integrations-Plasmide von der Integration ausgeschlossen, die DNS-Fragmente mit einem Gen für eine essentielle Gen-Funktion enthalten, die bei Integration zur Inaktivierung des homologen chromosomalen Gens führen können. Das Spektrum aller übrigen Integrati ons-Plasmide steht hingegen für die Integration von ver schiedenen Produkt-Genen zur Verfügung. Es ist zweckmäßig, diese Integrations-Plasmide zunächst bei der Integration eines homologen Produkt-Gens mit gut meß- und nachweisbarer Gen-Funktion (z. B. eines Produkt-Gens für ein extrazellulä res Enzym) zu isolieren und erst danach für die Integration anderer Produkt-Gene, insbesondere von heterologen Genen, einzusetzen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man unter schiedliche Produkt-Gene in unterschiedliche Rezipienten mittels unterschiedlicher thy-Gene als Reporter-Gene inte grieren, sofern die Produkt-Gene von dem Rezipienten expri miert werden und ihre Thymidin-Auxotrophie an Hand von Tri methoprim-Resistenz selektierbar ist. So können ein thyL- Gen von B. licheniformis als Reporter-Gen verwendet und die homologen, hochexprimierten Gene amyA und nprA für alpha- Amylase beziehungsweise neutrale Protease in Bakterien- Stämme von B. amyloliquefaciens integriert werden, die wegen ihrer hohen Potenz zur Bildung von extrazellulären Enzymen, ihrer traditionellen und verbreiteten industriellen Anwen dung und ihrer toxikologischen Unbedenklichkeit für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet sind. Aller dings - darauf war bereits hingewiesen - ist B. amyloliquefaciens nur gering transformierbar, wie die meisten Bacillus-Arten außer B. subtilis, so daß lineari sierte Integrations-Plasmide nicht hinreichend häufig transformiert werden. Es werden deshalb erfindungsgemäß vorzugsweise zirkuläre, in Plasmid-Transformanten selbst replizierte Integrations-Plasmide benutzt. Das dabei ver mehrte Auftreten von einfachem Crossing-over wird nach Se gregation des Integrationsplasmids mittels der flankieren den Resistenz-Gene selektiert; durch die Anwendung zweier Resistenz-Gene und ihre enge Kopplung an das Produkt-Gen ist die Selektion besonders sicher. Dagegen werden diese Resistenz-Gene bei doppeltem Crossing-over nicht mit inte griert, so daß nach Segregation des Integrationsplasmids ein effektives Screening auf Integrations-Stämme mit dop peltem Crossing-over über Antibiotika-Sensibilität, etwa gegen Chloramphenikol Cm^s und MLS-Antibiotika MLS^s ermög licht wird. Es lassen sich also durch das erfindungsgemäße Verfahren Integrations-Stämme mit doppeltem Crossing-over für das thy-Gen und nachfolgend für ein Produkt-Gen an Hand der Phänotypen Thy+Cm^sMLS^s beziehungsweise Tmp^rC^msMLS^s sehr effektiv selektieren und nachweisen.

Voraussetzung für die Selektion von thymidin-prototrophen Integrations-Stämmen sind stabil thymidin-auxotrophe Bakte rien-Stämme, die durch Deletion auf Grund von doppeltem Crossing-over mittels pID-Deletions-Plasmiden erzeugt wer den. Dadurch entstehen reversions-stabile Deletions-Mutan ten, bei denen die Isolierung von Integrations-Stämmen nicht durch spontane thymidin-prototrophe Revertanten be einträchtigt ist. In den Wirts-Stämmen kann außerdem die chromosomal kodierte Bildung von Nebenprodukten, insbeson dere von hochexprimierten extrazellulären Enzymen, redu ziert oder eliminiert werden, so daß Bildung, Reinheit und Stabilität des Produktes verbessert werden (Steinborn 1988, Vehmaanperä 1991). Derartige Derivate können mittels chemi scher Mutagenese erzeugt werden; zur Eliminierung einer Produktbildung werden Deletionsmutanten erzeugt.

Vorteilhaft und alternativ zur Deletion werden das thyA-Gen und andere unerwünschte chromosomale Gene des Bakterien- Stammes durch Integration des Produkt-Gens in diese Gene inaktiviert, wodurch zugleich und zusätzlich zur Integra tion mittels pIT- und pIG-Integrations-Plasmiden das Pro dukt-Gen ebenfalls mehrfach und schrittweise in einzelnen Kopien durch doppeltes Crossing-over integriert werden kann. Dazu werden erfindungsgemäß pIP-Integrations-Plasmide konstruiert und angewendet, die mit pIG-Integrations-Plas miden strukturell und funktionell vergleichbar sind. Im Un terschied zu diesen enthalten jene aber Teilstücke der zu inaktivierenden Gene als flankierende DNS-Fragmente, und die Integration erfolgt in die zu inaktivierenden chromoso malen Gene, so daß die Integration des Produkt-Gens auf Grund von doppeltem Crossing-over mittels pIP-Integrations- Plasmiden an Hand der Gen-Inaktivierung, der Antibiotika- Sensibilität und der Abwesenheit von Plasmid-DNS nachgewie sen wird.

Wegen der generellen Anwendung des doppelten Crossing-over ist schließlich keine Plasmid-DNS in den Integrations-Stäm men enthalten.

Zur Integration in andere Bakterien-Stämme von B. amyloliquefaciens, beispielsweise ATCC23844, mit wirts spezifischer Plasmid-Stabilität werden konditional replika tionsunfähige Integrations-Plasmide in vergleichbarer Weise angewendet. Dazu werden temperatursensible pIT-, pIG- und pIP-Integrations-Plasmide durch in-vitro-Mutagenese er zeugt, die nach Integration bei nicht permissiver Tempera tur eine effektive Plasmid-Segregation gestatten.

Schließlich können die so isolierten Integrations-Stämme nach der Southern-DNS-Hybridisierung-Methode charakteri siert werden, wobei die Anzahl der integrierten Gen-Kopien und die Abwesenheit von Plasmid-DNS als Kriterien für dop peltes Crossing-over gewertet werden. Die genetische Stabi lität wird an gleichbleibender Produktbildung und Anzahl der integrierten Gen-Kopien gemessen.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnung an zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 die Herstellung und Anwendung von pIT- und pIG- Integrationsplasmiden,

Fig. 2 die Restriktionskarte eines Plasmides pSB319 mit einem klonierten thyL-Gen,

Fig. 3 die Restriktionskarte eines Plasmides pSB411 mit einem klonierten thyA-Gen,

Fig. 4 die Restriktionskarte eines Plasmides pSB351,

Fig. 5 die Restriktionskarte eines Integrations-Plasmi des pIT1,

Fig. 6 die Restriktionskarte eines Integrations-Plasmi des pIG1,

Fig. 7 die Restriktionskarte eines Integrations-Plasmi des pIG2,

Fig. 8 die Restriktionskarte eines Deletions-Plasmides pID1 und

Fig. 9 die Restriktionskarte eines Integrations-Plasmi des pIP1.

Dabei werden in der Zeichnung die nachfolgenden Abkürzungen und Symbole verwendet:

A, B, C: nicht vorselektierte chromosomale DNS-Fragmente eines Rezipienten-Stammes;
C/1, C/2: Teilstücke eines chromosomalen DNS-Fragments C,
thy: kloniertes thy-Gen für Thymidylat-Synthetase;
thy/1, thy/2: Teilstücke des thy-Gens;
Cm^r: Antibiotika-Resistenz-Gen für Resistenz gegen Chloramphenikol;
MLS^r: Antibiotika-Resistenz-Gen für Resistenz gegen Ma krolid-Linkosamid- und Streptogramin-B-Antibio tika;
BI: BclI-Schnittstelle;
EI: EcoRI-Schnittstelle;
P: Produkt-Gen;
DCO: Doppeltes Crossing-over;
a, b, c, d; aufeinanderfolgende Positionen in C in natürli cher und gleich relativer Orientierung a′, b′, c′, d′ wie in der homologen Region im Chromosom des Rezipienten-Stammes;
e, f, g, h: aufeinanderfolgende Positionen in thy in natürli cher und gleich relativer Orientierung a′, b′, c′, d′ wie in dem integrierten thy-Gen;
repR: repR-Gen für ein essentielles Replikations-Pro tein RepR;
thyL: thyL-Gen für Thymidylat-Synthetase von B. licheniformis,
thyA: thyA-Gen für Thymidylat-Synthetase von B. amyloliquefaciens.

Durchgehende Doppellinien ohne Pfeil markieren chromosomale Gene mit noch unbekannter DNS-Sequenz; bei Teilstücken die ser Gene soll ein Pfeil ihre gleiche relative Orientierung im Vergleich zum vollständigen DNS-Fragment zeigen. Im üb rigen entsprechen die Darstellungen der üblichen Symbolik bei der Darstellung von Restriktionskarten und ganz allge mein der schematischen Darstellung in der Gentechnik.

Auf eine explizite Beschreibung allseits üblicher gentech nischer oder sonstiger Verfahrensschritte wird im nachfol genden verzichtet. Kenntnisse zur Isolierung von Plasmid- DNS, DNS-Fragmenten oder chromosomaler DNS, Spaltung von DNS durch Restriktasen, "fill in"-Reaktion, Gel-Elektro phorese, Plasmid-Transformation, Southern-Hybridisierung, Kultivierung, chemischer Mutagenese oder Selektion werden vorausgesetzt und können entsprechenden Veröffentlichungen (Sambrook 1989) entnommen werden.

Es wurden die nachfolgenden Ausgangsmaterialien, Hilfs stoffe oder Methoden häufig verwendet:

Vektorplasmid pGB354 von 6,2 kb mit Cm^r (Behnke 1982) für Klonierungen und als Ausgangs-Plasmid für alle Integrations-Plasmide;
Bakterien-Stamm B. subtilis GSB26 - als Rezipienten- Stamm für Plasmid-Konstruktionen, abgeleitet als spontane streptomycin-resistente Mutante von dem amylase-defekten Bakterien-Stamm QB1133 sacA321 aroI906 metB5 amyE (Steinmetz 1976) aus der Stammlinie von B. subtilis 168;
Bakterien-Stamm (thymidin-auxotroph) B. subtilis 168 TT thyA thyB trpC2 (Steinmetz 1976) als Rezipien ten-Stamm für die Klonierung und gentechnische Bearbeitung von thy-Genen für Thymidylat-Synthe tase von Bacillus;
Bakterien-Stamm B. amyloliquefaciens BE71 mit stammspe zifisch hoher segregativer Plasmid-Instabilität (Steinborn 1988) als Ausgangs-Stamm für Rezipien ten-Stämme für die Integration;
Bakterien-Stamm B. amyloliquefaciens ATCC23844 (In gle/Boyer 1976) als Ausgangs-Stamm für Rezipien ten-Stämme für konditional replikationsunfähige (ts) Integrations-Plasmide und als Gen-Donor- Stamm für die Klonierung eines thyA-Gens;
PEG-Protoplasten-Methode (Chang/Cohen 1979) zur Plas mid-Transformation in Bacillus mit Modifikationen der Medien (Steinborn 1988) zur Plasmid-Transfor mation in B. amyloliquefaciens;
Kultivierung bei 37°C in flüssigem TBY-Vollmedium mit 1% bactotryptone, Difco - 0,5% yeast extract, Difco - 0,5% NaCl und mit pH = 7,0 oder auf TBY - Agar (1,8% Agar-Agar);
Selektion auf plasmid-kodierte Antibiotika-Resi stenz erfolgt durch Zusatz von 10 Mikrogramm/ml Chloramphenikol Cm oder 5 Mikrogramm/ml Erythro mycin Em, Seletion auf Trimethoprim-Resistenz (Gryczan/Dubnau 1982) bei 10 Mikrogramm/ml Trime thoprim Tmp in Anwesenheit von 50 Mikrogramm/ml Thymidin in MSM-Minimal-Medium (Demain 1958); bei Auxotrophie der Bakterien-Stämme werden essenti elle Aminosäuren zu 50 Mikrogramm/ml und Thymidin zu 100 Mikrogramm/ml supplementiert;
Southern-Hybridisierung zum Nachweis von DNS-Homolo gie, insbesondere von integrierten Gen-Kopien des Produkt-Gens, nach der nichtradioaktiven Digoxi genin-Methode (Fa. Boehringer) bei Anwendung ei nes Vakuum-Blotters (Fa. Bio-Rad);
Nachweis und halbquantitative Bestimmung der Bildung von extrazellulärer alpha-Amylase und neutraler Protease an Hand von Abbau-Höfen auf Agar-Platten mit Zusatz von 1% unlöslicher Mais-Stärke bzw. 0,5% Magermilch-Pulver; die quantitative Bestim mung der Enzym-Aktivitäten in Kultur-Überständen erfolgt nach ausführlich beschriebenen Methoden (Steinborn/Hofemeister 1984, Steinborn 1988);
DNS-Isolierungen aus Bakterien-Stämmen von Bacillus für chromosomale DNS und Plasmid-DNS in großem Maßstab nach den Methoden von Saito/Miura 1963 bzw. Gryczan 1978.

1. Primärklonierung und Restriktions-Kartierung von thy- Genen für Thymidylat-Synthetase von B. licheniformis und B. amyloliquefaciens

Die Primärklonierung von thy-Genen für Thymidylat-Synthe tase von B. licheniformis und B. amyloliquefaciens - nachfol gend als thyL- bzw. thyA-Gen bezeichnet - wird durch "shot gun" unter Anwendung eines Donor-Stammes B. licheniformis ATCC9789 (Ingle/Boyer 1976) bzw. B. amyloliquefaciens ATCC23844, eines thymidin-auxotrophen Rezipienten-Stammes B. subtilis TT, eines Plasmidvektors pGB354 bzw. pSB3 (Steinborn 1983) und der Restriktasen BclI bzw. PstI ausge führt.

Nach Transformation der Ligations-Gemische erfolgt die Se lektion auf DM3-Agar ohne Thymidin-Zusatz, auf dem der Re zipienten-Stamm in kleinen, dünnen Kolonien wächst. Als Transformanten mit potentiell rekombinanten Plasmiden für thy-Gene werden stark wachsende, prototrophe Kolonien iso liert und auf vergrößerte Plasmide mit zusätzlichem BclI- bzw. PstI-DNS-Fragment gel-elektrophoretisch charakteri siert. Sie werden danach in den plasmidfreien Rezipienten- Stamm retransformiert und bei plasmid-kodierter Thymidin- Prototrophie als rekombinante Plasmide mit klonierten thy- Genen identifiziert.

In einem Versuch wurden 16 bzw. 4 rekombinante Plasmide mit jeweils identischem zusätzlichem DNS-Fragment isoliert, von denen je ein repräsentatives Plasmid als Plasmid pSB319 bzw. pSB411 bezeichnet und durch Restriktionsanalyse (ein fache bis dreifache Restriktions-Spaltung) charakterisiert werden (Fig. 2 und 3). Entsprechend den Restriktionskarten werden die Lage und Größe der funktionsfähigen thy-Gene in nerhalb der klonierten DNS-Fragmente mittels Deletions- oder Insertionsanalyse lokalisiert.

Die Identität der klonierten DNS-Fragmente als chromosomale DNS-Fragmente der verwendeten Gen-Donor-Stämme wird mittels Southern-Hybridisierung auf Grund von DNS-Homologie bestä tigt, wobei die klonierten BclI- und PstI-DNS-Fragmente aus den Plasmiden pSB319 bzw. pSB411 gegen BclI- und PstI-ge spaltene chromosomale DNS von den Gen-Donor-Stämmen ATCC9789 bzw. ATCC23844 sowie von B. subtilis GSB26 (Kon trolle) hybridisiert werden.

Die Klonierung von thy-Genen in den Plasmiden pSB319 und pSB411 wird zunächst funktionell dadurch nachgewiesen, daß diese rekombinanten Plasmide den in B. subtilis TT nachge wiesenen Defekt in der Bildung vom Thymidylat-Synthetase (Gryczan/Dubnau 1982) komplementieren und in thymidin-auxo trophen Bakterien-Stämmen von B. subtilis 168 und B. amyloliquefaciens Thymidin-Prototrophie und korrelierte Sensibilität gegen Trimethoprim bewirken. Diese Funktionen sind für die erfindungsgemäße Anwendung von thy-Genen we sentlich.

2. Erzeugung der Plasmide pSB351, pSB352 und pSB355 als Ausgangs-Plasmide für Integrations- und Deletions-Plasmide

Ausgehend von dem Plasmidvektor pGB354 (Cm^r) werden Plas mide konstruiert, die zwischen zwei eng benachbarten Anti biotika-Resistenz-Genen (Cm^r, MSL^r) unterschiedlich viele unikale Restriktase-Schnittstellen enthalten. Zunächst wird der Plasmidvektor pGB354 in seiner unikalen BclI-Schnitt stelle gespalten und mittels "fill in"-Kit nach Vorschrift (Fa. Stratagene) ein HindIII-DNS-Fragment mit dem MLS^r-Gen aus einem Plasmid pDB101 (Behnke 1979) rekloniert. Dadurch entsteht ein Plasmid pSB351 (Fig. 4), das zwischen dem residenten Cm^r-Gen und dem eng benachbarten MSL^r-Gen eine unikale BclI-Schnittstelle enthält. Das MSL^r-Gen kodiert unter anderem Antibiotika-Resistenz gegen Erythromycin (Em^r), die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Selektion ge nutzt wird.

Danach wird in die BclI-Schnittstelle des Plasmids pSB351 ein Linker mit interner EcoRI-Schnittstelle und distalen Schnittstellen für die Restriktasen BglII und BamHI aus ei nem Plasmid pIC20H (Marsh 1984) unter Bildung eines Plasmi des pSB352 subkloniert. Schließlich wird in die EcoRI- Schnittstelle des Plasmids pSB352 ein Polylinker mit dista len EcoRI-Schnittstellen aus einem Plasmid pIC20R (Marsh 1984) rekloniert, so daß ein Plasmid pSB355 mit zahlreichen unikalen Restriktase-Schnittstellen zwischen den flankie renden Antibiotika-Resistenz-Genen entsteht.

3. Erzeugung von pIT-Integrations-Plasmiden

Die pIT-Integrations-Plasmide werden durch Reklonierung von je einem nicht vorselektierten chromosomalen DNS-Fragment von B. amyloliquefaciens in die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pSB352 und nachfolgende Reklonierung des thyL-Gens aus dem Plasmid pSB319 in eine mittelständige Restriktase- Schnittstelle des chromosomalen DNS-Fragments hergestellt. Dabei bleiben die Gesamtgröße und die relative Orientierung der Teilstücke des klonierten chromosomalen DNS-Fragments im Vergleich zum Chromosom des Donor-Stammes unverändert.

Durch die Reklonierung von unterschiedlichen chromosomalen DNS-Fragment aus den Plasmiden pSB370 bis pSB379 entsteht eine Plasmid-Serie mit den Bezeichnungen pIT1 bis pIT10. Die chromosomalen DNS-Fragmente in den Plasmiden pSB370 bis pSB379 wurden dazu vorher durch "shot gun" bei Anwendung eines Donor-Stammes B. amyloliquefaciens ATCC23844, eines amylase-defekten Rezipienten-Stammes B. subtilis GSB26, der Restriktase EcoRI und eines Plasmidvektors pSB3 (Steinborn 1983) kloniert und auf geeignete mittelständige Restrik tase-Schnittstellen charakterisiert. Dabei wurden die chro mosomalen DNS-Fragmente in eine interne EcoRI-Schnittstelle des klonierten Gens für eine extrazelluläre Amylase in den Plasmidvektor pSB3 inseriert, so daß die Klonierung der chromosomalen DNS-Fragmente an Hand von Insertions-Inak tivierung des Amylase-Gens nachgewiesen wird.

Die Identität der klonierten chromosomalen DNS-Fragmente als Fragmente aus B. amyloliquefaciens wird durch Southern- Hybridisierung auf Grund von DNS-Homologie bestätigt, wobei die klonierten chromosomalen DNS-Fragmente gegen EcoRI-ge schnittene chromosomale DNS des Donor-Stammes ATCC23844 und von B. subtilis GSB26 (Kontrolle) hybridisiert werden.

In Fig. 5 enthält das Integrations-Plasmid pIT1 ein chromo somales 3,5 kb langes DNS-Fragment mit einer mit telständigen BclI-Schnittstelle, in die das thyL-Gen aus dem Plasmid pSB319 innerhalb des in dieses Plasmid klonier ten BclI-DNS-Fragments rekloniert wurde. In dem Integrati ons-Plasmid pIT1 werden das thyL-Gen von Teilstücken des chromosomalen DNS-Fragments und diese Teilstücke, wegen dem Ausgangs-Plasmid pSB352, von den Antibiotika-Resistenz-Ge nen Cm^r und MSL^r flankiert.

4. Erzeugung von pIG-Integrations-Plasmiden

Es wird zunächst das thyL-Gen mittels der Restriktase BclI aus dem Plasmid pSB319 unter Verwendung des Rezipienten- Stammes B. subtilis in die BclI-Schnittstelle des Plasmids pSB351 rekloniert, wodurch ein Plasmid pSB360 entsteht. An schließend wird das Produkt-Gen in eine interne Schnitt stelle des funktionsfähigen thyL-Gens in Plasmid pSB360 re kloniert, so daß das thyL-Gen durch Insertion inaktiviert und das Produkt-Gen von Teilstücken des thyL-Gens flankiert wird, die beidseitig eine für die generelle Rekombination hinreichende Länge aufweisen. Geeignet ist dafür die in terne PvuII-Schnittstelle des thyL-Gens, die wegen der glatten Enden zur Reklonierung mittels verschiedener Re striktasen geeignet ist.

Analog zu den pIT-Integrations-Plasmiden werden auch bei der Reklonierung des Produkt-Gens die Gesamtgröße und die relative Orientierung der Teilstücke des thyL-Gens im Ver gleich zu dem funktionsfähigen thyL-Gen nicht verändert, und das Produkt-Gen und die flankierenden Teilstücke des thyL-Gens werden von den Antibiotika-Resistenz-Genen Cm^r und MLS^r flankiert.

Als Produkt-Gene werden die hochexprimierten amyA- und nprA-Gene für die extrazellulären Enzyme alpha-Amylase bzw. neutrale Protease von B. amyloliquefaciens rekloniert. Dabei werden die rekombinanten Plasmide pSB6 (Stein born/Hofemeister 1984) als Gen-Donoren und B. subtilis TT als Rezipient verwendet und die Reklonierung an Hand von Thymidin-Auxotrophie oder korrelierter Trimethoprim-Resi stenz und hoher Bildung der plasmid-kodierten, extrazellu lären Enzyme nachgewiesen.

Das amyA- und das nprA-Gen werden innerhalb eines PvuII- bzw. BclI-DNS-Fragments rekloniert, bei dem BclI-DNS-Frag ment findet die "fill in"-Reaktion mittels eines Kits (Fa. Stratagene) Anwendung. Die Fig. 6 und 7 zeigen die so hergestellten Integrations-Plasmide pIG1 und pIG2.

5. Erzeugung von Deletions-Plasmiden

Ausgangspunkt für die Herstellung von Deletions-Plasmiden zur Inaktivierung des chromosomalen thyA-Gens aus B. amyloliquefaciens ist das klonierte thyA-Gen in dem Plas mid pSB411 (vgl. 1.) entsprechend Fig. 3. Innerhalb dieses funktionsfähigen thyA-Gens wird ein kleines, mittelständi ges DNS-Fragment in der Weise entfernt, daß das thyA-Gen inaktiviert und auf beiden Seiten der Deletionsstelle je ein für die generelle Rekombination hinreichend langes Teilstück des in das Plasmid pSB411 klonierten chromosoma len DNS-Fragments aus B. amyloliquefaciens verbleibt. An schließend wird das im Plasmid verbliebene deletierte DNS- Fragment mittels der Restriktase PstI in eine PstI-Schnitt stelle im Polylinker des Plasmids pSB355 rekloniert, so daß es von den Antibiotika-Resistenz-Genen Cm^r und MSL^r flan kiert ist.

Wegen je zwei dicht benachbarter PvuII- und SacI-Schnitt stellen in dem thyA-Gen lassen sich für dieses die be schriebenen Deletions-Plasmide leicht herstellen, so daß Deletions-Plasmide pID1 (Fig. 8) und pID2 gewonnen werden. Bei der Verwendung von B. subtilis TT als Rezipient kann die Selektion an Hand der Trimethoprim-Resistenz und plasmid kodierter Antibiotika-Resistenz erfolgen. In gleicher Weise werden Deletions-Plasmide zur Inaktivierung anderer chromo somaler Gene hergestellt.

6. Erzeugung von pIP-Integrations-Plasmiden

Die pIP-Integrations-Plasmide entstehen durch Reklonierung des Produkt-Gens in ein kloniertes Gen des Rezipienten, das in seinem Chromosom inaktiviert und wobei zugleich das Pro dukt-Gen durch doppeltes Crossing-over integriert werden soll. Es wird hier auf die Inaktivierung der chromosomalen thyA- und nprA-Gene bei der Integration des amyA-Gens abge hoben.

Ein Integrations-Plasmid pIP1 (Fig. 9) entsteht, wenn das amyA-Gen innerhalb eines PvuII-DNS-Fragments aus dem Plas mid pSB6 in die interne EcoRV-Schnittstelle des thyA-Gens in dem Plasmid pSB411 rekloniert und so das thyA-Gen durch Insertion inaktiviert wird. Das inaktivierte thyA-Gen wird dann mittels der Restriktase PstI in die PstI-Schnittstelle in dem Polylinker des Plasmids pSB355 rekloniert, so daß auch dieses Integrations-Plasmid pIP1 die flankierenden An tibiotika-Resistenz-Gene Cm^r und MLS^r enthält.

In gleicher Weise wird das Integrations-Plasmid pIP2 erhal ten, wenn das amyA-Gen in eine interne EcoRV-Schnittstelle des nprA-Gens in dem Plasmid pSB92 inseriert wird.

7. Erzeugung von konditional replikationsunfähigen Inte grations-Plasmiden

Es werden temperatursensible (ts-) Integrations-Plasmide isoliert, die bei permissiver Temperatur (30°C) in den Re zipienten replizieren und bei erhöhter Temperatur (42°) nicht replikationsfähig sind. Sie werden von den Integrati ons-Plasmiden oder Ausgangs-Plasmiden pSB351, pSB352 und pSB355 durch chemische Mutagenese abgeleitet, indem sie durch Ethylmethansulfonat EMS mutagenisiert und an schließend in den Bakterien-Stamm B. subtilis GSB26 transfor miert werden. Behandlungszeit und Konzentration des Muta gens werden dabei so gewählt, daß die mutagenisierten Plas mide noch eine Transformations-Häufigkeit von etwa 10% im Vergleich zu unbehandelten Plasmiden erreichen. Das Scree ning auf temperatursensible Plasmide erfolgt nach der Replikationstechnik: auf Masterplatten wachsen die Plasmid- Transformanten zunächst bei 30°C, nach Replikation wird bei 42°C inkubiert. Die bei dieser Temperatur nicht wachsenden Transformanten werden auf temperatursensible Plasmide un tersucht.

8. Mehrfache, schrittweise Integration durch doppeltes Crossing-over mittels pIT- und pIG-Integrations-Plasmiden

Zunächst wird ein Integrations-Plasmid pIT1 aus 3. (Fig. 5) in einen stabil thymidin-auxotrophen Bakterien-Stamm von B. amyloliquefaciens BE71 transformiert, und es werden Plas mid-Transformanten über Thymidin-Prototrophie selektiert und danach ohne Selektionsdruck durch Antibiotika in thymi din-freiem Minimalmedium MSM über 10 bis 30 Generationen passagiert, wobei das Integrations-Plasmid segregiert und Integrations-Stämme mit integriertem thyL-Gen selektiv angereichert werden. Die Integration geschieht dabei vor oder während des Passagierens, und die Integration des thyL-Gens durch doppeltes Crossing-over wird phänotypisch über stabile Thymidin-Prototrophie und Antibiotika-Sensibi lität gegen Chloramphenikol und Erythromycin ermittelt. Dazu wird nach dem Passagieren auf thymidinfreiem Minimal medium MSM plattiert und Antibiotika-Sensibilität mittels Replikationstechnik nachgewiesen. Biochemisch wird für diese wie auch alle nachfolgenden Integrationen doppeltes Crossing-over mittels Southern-Hybridisierung bestätigt, indem im Chromosom des Integrations-Stammes eine zusätzli che Kopie des integrierten Gens und hingegen keine Plasmid- DNS des Integrations-Plasmids nachgewiesen wird. Dazu wer den das integrierte Gen und das Ausgangs-Plasmid des Inte grations-Plasmids (beispielsweise pSB351 für pIT1) gegen die chromosomale DNS des Integrations-Stammes hybridisiert.

Nach der Integration einer Kopie des thyL-Gens durch dop peltes Crossing-over wird das Integrations-Plasmid pIG1 nach 4. (Fig. 6) in einen solchen Integrations-Stamm trans formiert und Plasmidtransformation an Hand plasmid-kodier ter Antibiotika-Resistenz Cm^r, Em^r selektiert. Anschließend werden Plasmid-Transformanten ohne Selektionsdruck durch Antibiotika in thymidinhaltigem Minimalmedium MSM über 10 bis 30 Generationen passagiert, wobei das amyA-Gen inte griert wird. Bei Integration durch doppeltes Crossing-over wird das vorher integrierte thyL-Gen inaktiviert und Plas mid-DNS bleibt von der Integration ausgeschlossen, so daß Integrations-Stämme mit doppeltem Crossing-over phänoty pisch auf Grund von Trimethoprim-Resistenz und Antibiotika- Sensibilität gegen Chloramphenikol und Erythromyin selek tiert werden. Diese Selektion wird wieder mittels Replika tionstechnik vorgenommen, wobei die MSM-Masterplatten Zu sätze von Thymidin und Trimethoprim enthalten und den Re plikationsplatten zusätzlich Chloramphenikol und Erythromy cin supplementiert werden.

Schließlich werden die genetische Stabilität des integrier ten amyA-Gens und sein Gen-Dosis-Effekt auf die Amylase- Bildung untersucht, und es werden solche Integrations- Stämme als Rezipienten für die weitere schrittweise Inte gration des amyA-Gens ausgewählt,die nach Passagieren ohne Selektionsdruck über 100 Generationen keinen Verlust des integrierten amyA-Gens und eine gleichbleibende erhöhte Amylase-Bildung zeigen.

Nunmehr wird eine zweite Kopie des thyL-Gens mittels eines zweiten, unterschiedlichen pIT-Integrations-Plasmids an an derer, ebenfalls zufällig verteilter Stelle des Chromosoms und in dieses mittels des gleichen pIG-Integrations-Plas mids pIG1 eine zweite Kopie des amyA-Gens integriert. In gleicher, alternierender Weise wird die Integration des amyA-Gens bis zu einer solchen Kopienzahl und Gen-Dosis fortgesetzt, die der Leistungsfähigkeit und physiologischen Verträglichkeit des Rezipienten entsprechen.

Die mehrfache, schrittweise Integration des nprA-Gens durch doppeltes Crossing-over wird in gleicher Weise wie für das amyA-Gen ausgeführt. Es werden die gleichen pIT-Integrati onsplasmide und Rezipienten-Stämme verwendet; der wesentli che Unterschied besteht in der Nutzung eines Integrations plasmids pIG2 (Fig. 7) mit nprA-Gen.

Konditional replikationsfähige (ts) Integrations-Plasmide aus 7. werden zur Integration in Rezipienten-Stämme von B. amyloliquefaciens, beispielsweise ATCC23844, verwendet, bei denen im Unterschied zu dem Rezipienten-Stamm BE71 nach der Integration keine stammspezifisch hohe segregative Plasmid-Instabilität zur Plasmid-Segregation genutzt werden kann. Die Segregation dieser ts-Integrations-Plasmide wird effizient durch Inhibitition der Plasmid-Replikation bei 42°C erreicht. Ansonsten bestehen keine Unterschiede zur Anwendung von normal replizierenden Integrations-Plasmiden.

9. Isolierung von stabil thymidin-auxotrophen Rezipien ten-Stämmen

Stabil thymidin-auxotrophe Bakterien-Stämme von B. amyloliquefaciens können (vgl. 10.) mittels doppeltem Crossing-over mit Hilfe von Deletions-Plasmiden (vgl. 5.) pID1 (Fig. 8) oder pID2 erzeugt werden. Nach Plasmid-Trans formation und -Segregation wird die Deletion im chromosoma len thyA-Gen auf Grund von doppeltem Crossing-over über Trimethoprim-Resistenz und Antibiotika-Sensibilität gegen Chloramphenikol und Erythromycin selektiert bzw. nachgewie sen, wie auch bei Integration mittels pIG-Integrations- Plasmiden verfahren wird (vgl. 8.).

10. Inaktivierung des chromosomalen thyA-Gens und anderer chromosomaler Gene mittels pIP-Integrations-Plasmiden

Mittels pIP-Integrations-Plasmiden (vgl. 6.) wird das Pro dukt-Gen in unerwünschte oder nicht essentielle chromoso male Gene eines Rezipienten-Stammes B. amyloliquefaciens durch doppeltes Crossing-over integriert und dadurch das betreffende chromosomale Gen inaktiviert. Damit wird, an ders als beim Einsatz von pID-Deletions-Plasmiden, zugleich die Kopienzahl des integrierten Produkt-Gens erhöht, so daß zusätzlich zur Integration mittels pIT- und pIG-Integrati ons-Plasmiden seine Gen-Dosis gesteigert wird. Unter Ver wendung der Integrations-Plasmide pIP1 (Fig. 9) und pIP2 werden beispielsweise die thyA- und nprA-Gene inaktiviert und damit zwei Kopien des amyA-Gens integriert.

Integration durch doppeltes Crossing-over wird auch hier an Hand von Inaktivierung der chromosomalen Gene, von Anti biotika-Sensibilität gegen Chloramphenikol und Erythromy cin sowie der integrierten Kopien des amyA-Gens nachgewie sen.

11. Mutagen-induzierte Plasmid-Chromosomen-Rekombination

Zur Erhöhung der Häufigkeit doppelten Crossing-overs wer den gegebenenfalls Versuche zur UV-Induktion ausgeführt. Im Gegensatz zu der üblichen Methode (Mudgett 1991) werden transformierte Zellen und nicht Plasmid-DNS in vitro behan delt. Die UV-Dosis wird so gewählt, daß 30 bis 50% der be strahlten Bakterienzellen überleben.

Anhang: Literatur 92.223PN

Behnke, D. et al., Plasmid 2, 605-616 (1979) (Behnke 1979)
Behnke, D. et al. in: Microbiology-1982, pp. 239-243 (1982) (Behnke 1982)
Chang, S./Cohen, S.N. Molec. gen Genet. 168, 111-115 (1979) (Chang/Cohen 1979)
Demain, A.L., Bacteriol. 75, 517-522 (1958) (Demain 1958)
Gryczan, T.J. et al., J. Bacteriol. 134, 318-329 (1978) (Gryczan 1978)
Gryczan, T.J./Dubnau, D., Gene 20, 459-469 (1982) (Gry czan/Dubnau 1982)
Ingle, M.B./Boyer, E.W., in D. Schlessinger (Ed.), Micro biology-1976. American Society for Microbiology, Washington D.C., pp. 420-426 (1976) (Ingle/Boyer 1976)
Kallio, P. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 27, 64-71 (1987) (Kallio 1987)
Marsh, J.L. et al., Gene 32, 481-485 (1984) (Marsh 1984)
Mountain, A., in C.R. Harwood (Ed.), Biotechnology Hand books, vol. 2; Plenum Press, New York, 73-114 (1989) (Moun tain 1983)
Mudgett, J.S. et al., Gene 97, 131-136 (1991) (Mudgett 1991)
Niaudet, B., et al., J. Bacteriol. 163, 111-120 (1985) (Niaudet 1985)
Saito, H./Miura, K.-I. Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963) (Saito/miura 1963)
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Press, 1989 (Sambrook 1989)
DD-Patentschrift 2 81 414 (1983) (Steinborn 1983)
DD-Patentschrift 2 33 852 (1984) (Steinborn/Hofemeister 1984)
DD-Patentschrift 2 77 467 (1988) (Steinborn 1988/1)
DD-Patentschrift 2 77 468 (1988) (Steinborn 1988/2)
Steinmetz, M. et al., Molec. gen. Genet. 148, 281-285 (1976) (Steinmetz 1976)
Vagner, V./Ehrlich, S.D., J. Bacteriol. 170, 3978-3982 (1988) (Vagner(Ehrlich 1988)
Vehmaanperä, J. et al., J. Biotechnol. 19, 221-240 (1991) (Vehmaanperä 1991)
Young., M./Ehrlich, D., J. Bacteriol. 171, 2653-2656 (1989) (Young/Ehrlich 1989)

Claims

1. Verfahren zur Integration eines Produkt-Gens in das Chromosom eines Rezipienten, beispielsweise eines als Rezi pienten-Stamm dienenden Bakterien-Stammes, die durch ein thy-Gen für Thymidylat-Synthetase bewirkt und selektiert wird und mehrfach und schrittweise in einzelnen Gen-Kopien des Produkt-Gens erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß

- generelle Rekombination nach dem Mechanismus des doppel ten Crossing-over angewendet wird,
- ein kloniertes thy-Gen in funktionsfähiger Form und - mit dieser alternierend - in inaktivierter Form zur Integration und Selektion des Produkt-Gens verwendet wird,
- das doppelte Crossing-over durch Antibiotika-Sensibilität und einfaches Crossing-over mittels Antibiotika-Resistenz nachgewiesen werden und
- die durch das doppelte Crossing-over erfolgte Integration des Produkt-Gens durch den Nachweis zusätzlicher Gen-Kopien dieses Produkt-Gens und des Fehlens von Plasmid-DNS bestä tigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein funktionsfähiges thy-Gen in einzelnen Gen-Kopien schrittweise mittels unterschiedlicher Integrations-Plas mide, beispielsweise mittels unterschiedlicher pIT-Integra tions-Plasmide, in das Chromosom des Rezipienten integriert und seine Integration an Hand von Thymidin-Prototrophie se lektiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich net, daß das Produkt-Gen in einzelnen Gen-Kopien schritt weise mittels eines Integrations-Plasmids, beispielsweise mittels eines pIG-Integrations-Plasmids, nach jeweils einer vorausgegangenen Integration einer Gen-Kopie des funktions fähigen thy-Gens in dieses thy-Gen integriert, dadurch das thy-Gen inaktiviert und die so erzeugte Thymidin-Auxotro phie an Hand von korrelierter Trimethoprim-Resistenz selek tiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den pIT-Integrations-Plasmiden das funktionsfähige thy- Gen durch chromosomale DNS-Fragmente des Rezipienten flan kiert wird, die an homologen Positionen des Chromosoms die Integration des -Gens durch einfaches oder doppeltes Crossing-over bewirken.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den pIG-Integrations-Plasmiden das Produkt-Gen von DNS- Fragmenten des thy-Gens flankiert wird, die die Integration des Produkt-Gens durch einfaches oder doppeltes Crossing- over bewirken.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß in den Integrations-Plasmiden das thy- Gen beziehungsweise das Produkt-Gen und ihre flankierenden DNS-Fragmente durch eng gekoppelte Antiobiotika-Resistenz- Gene flankiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotika-Resistenz-Gene bei doppeltem Crossing-over nicht integriert werden und die Antibiotika-Sensibilität des Rezipienten zum Nachweis des doppelten Crossing-over verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotika-Resistenz-Gene bei einfachem Crossing-over integriert werden und die Antibiotika-Resistenz des Rezipi enten zum Nachweis des einfachen Crossing-over verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch ge kennzeichnet, daß als Rezipient ein zur generellen Rekombi nation fähiger, insbesondere für die Erzeugung extrazellu lärer Enzyme geeigneter Bakterien-Stamm von Bacillus amylo liquefaciens verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein konditional replikationsunfähiges Integrations-Plasmid verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Derivat von Bacillus amyloliquefaciens ATCC23844 als Rezipient verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rezipient mit stammspezifisch hoher segregativer Plasmid-Instabilität verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Derivat von Bacillus amyloliquefaciens BE71 verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezipient ein stabil thymidin-auxo trophes Derivat eines Bakterien-Stammes verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezipient ein Derivat eines Bakte rien-Stammes verwendet wird, bei dem die nicht durch das Produkt-Gen chromosomal kodierte Erzeugung von insbesondere hochexprimierten extrazellulären Enzymen stark reduziert oder eliminiert ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt-Gen ein hochexprimiertes homologes oder heterologes Produkt-Gen ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt-Gen ein amyA-Gen für alpha-Amylase von Ba cillus amyloliquefaciens ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt-Gen ein nprA-Gen für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciens ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmidvektor verwendet wird, der zu strukturell stabilen Integrations-Plasmiden führt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmid pGB354 als Plasmidvektor verwendet wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein kloniertes thy-Gen von Bacillus verwendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein thyL-Gen von Bacillus licheniformis ATCC9789 ver wendet wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das thyL-Gen durch "shot gun" mittels der Restriktase BclI in den Plasmidvektor pGB354 kloniert und ein Plasmid pSB319 gewonnen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein MLS^r-Gen für die Resistenz gegen MLS-Antibiotika aus einem Plasmid pDB101 in den Plasmidvektor pGB354 reklo niert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das durch die Reklonierung gewonnene Plasmid pSB351, in dem eine unikale BclI-Schnittstelle von dem MLS^r-Gen und einem residenten Cm^r-Gen für die Resistenz gegen Cloramphe nikol flankiert wird, als Ausgangs-Plasmid für die Erzeu gung von Integrations-Plasmiden für doppeltes Crossing-over verwendet wird.

26. Verfahren nach Anspruch 23 bis 25, dadurch gekenn zeichnet, daß das thyL-Gen aus dem Plasmid pSB319 in die unikale BclI-Schnittstelle des Plasmids pSB351 unter Gewin nung eines Plasmids pSB360 rekloniert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 23 bis 26, dadurch gekenn zeichnet, daß das Produkt-Gen in eine interne Schnittstelle des thyL-Gens in dem Plasmid pSB360 unter Bildung eines pIG-Integrations-Plasmids inseriert und dabei das thyL-Gen inaktiviert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt-Gen in die PvuII-Schnittstelle des thyL- Gens inseriert wird.

29. Verfahren nach Anspruch 23 bis 28, dadurch gekenn zeichnet, daß das amyA-Gen für alpha-Amylase aus einem Plasmid pSB6 in die PvuII-Schnittstelle unter Bildung eines pIG-Integrations-Plasmids pIG1 inseriert wird.

30. Verfahren nach Anspruch 23 bis 28, dadurch gekenn zeichnet, daß das nprA-Gen für neutrale Protease aus einem Plasmid pSB92 in die PvuII-Schnittstelle unter Bildung ei nes pIG-Integrations-Plasmids pIG2 inseriert wird.

31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß ein BamHI-BglII-DNS-Fragment aus dem synthetischen Po lylinker eines Plasmids pIC20H in die unikale BclI-Schnitt stelle subkloniert wird, so daß ein Plasmid pSB352 mit ei ner unikalen EcoRI-Schnittstelle entsteht.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß je ein nicht vorselektiertes DNS-Fragment von B. amyloliquefaciens in die EcoRI-Schnittstelle rekloniert wird und dabei Plasmide pSB370 bis pSB379 mit je einem un terschiedlichen DNS-Fragment von B. amyloliquefaciens gewon nen werden.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das thyL-Gen aus dem Plasmid pSB319 in eine mittelständige Schnittstelle des chromosomalen DNS- Fragments in den Plasmiden pSB370 bis pSB379 inseriert wird und dabei pIT-Integrations-Plasmide pIT1 bis pIT10 gewonnen werden.

34. Verfahren nach Anspruch 32 und 33, dadurch gekenn zeichnet, daß die pIT-Integrations-Plasmide chromosomale DNS-Fragmente aufweisen, deren Rekombination mit dem Chro mosom nicht die Lebensfähigkeit des Rezipienten beeinträch tigt.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die chromosomalen DNS-Fragmente durch "shot gun" aus B. amyloliquefaciens ATCC23844 in eine in terne EcoRI-Schnittstelle des amyA-Gens in dem Plasmid pSB6 kloniert werden und die Klonierung mittels Insertions-Inak tivierung nachgewiesen wird.

36. Verfahren nach Anspruch 1 bis 35, dadurch gekennzeich net, daß als Rezipienten dienende, stabil thymidin-auxotro phe Bakterien-Stämme von B. amyloliquefaciens mittels Dele tion in ihrem chromosomalen thyA-Gen für Thymidylat-Synthe tase durch doppeltes Crossing-over mit Hilfe geeigneter De letions-Plasmide erzeugt werden und dabei das thyA-Gen in aktiviert wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletions-Plasmide durch Deletion eines internen DNS-Fragments des klonierten thyA-Gens in einem Plasmid pSB411 und Reklonierung des deletierten thyA-Gens in ein Plasmid pSB355 erzeugt werden.

38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pSB411 durch "shot gun"-Klonierung des thyA-Gens aus B. amyloliquefaciens ATCC23844 mittels der Re striktase PstI in ein Plasmid pSB3 gewonnen wird.

39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pSB355 durch Reklonierung des synthetischen Polylinkers aus einem Plasmid pIC20R in das Plasmid pSB352 mittels der Restriktase EcoRI gewonnen wird.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß das deletierte thyA-Gen in den Deleti ons-Plasmiden zum Nachweis von doppeltem Crossing-over von je einem MLS^r und Cm^r-Gen flankiert ist.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß ein Deletions-Plasmid pID1 durch Dele tion des internen PvuII-DNS-Fragments in dem klonierten thyA-Gen erzeugt wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß ein Deletions-Plasmid pID2 durch Dele tion des internen SacI-DNS-Fragments in dem klonierten thyA-Gen erzeugt wird.

43. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß unerwünschte Produktbildung chromosomaler Gene durch chemische Mutagenese reduziert wird.

44. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß unerwünschte Produktbildung eliminiert wird, indem die diese kodierenden chromosomalen Gene bei doppeltem Cros sing-over durch Deletion mittels Deletions-Plasmiden inak tiviert werden.

45. Verfahren nach Anspruch 1 bis 35, dadurch gekennzeich net, daß das thyA-Gen und/oder weitere unerwünschte chromo somale Gene des Rezipienten bei doppeltem Crossing-over mit Hilfe von pIP-Integrations-Plasmiden inaktiviert werden, die zugleich neben den pIT-und pIG-Integrations-Plasmiden zur mehrfachen schrittweisen Integration des Produkt-Gens benutzt werden.

46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die pIP-Integrations-Plasmide durch Insertion des Pro dukt-Gens in das klonierte thyA-Gen und/oder in weitere un erwünschte klonierte Gene und folgende Reklonierung der da durch inaktivierten Gene in das Plasmid pSB355 hergestellt werden.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, daß das durch die Insertion inaktivierte Gen in den pIP-Integrations-Plasmiden zum Nachweis von dop peltem Crossing-over von je einem MLS^r- und Cm^r-Gen flan kiert ist.

48. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß ein pIP-Integratkions-Plasmid pIP1 durch Insertion des amyA-Gens in die interne EcoRV-Schnittstelle des thyA-Gens in dem Plasmid pSB411 erzeugt wird.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß ein pIP-Integrations-Plasmid pIP2 durch Insertion des amyA-Gens in die interne EcoRV-Schnittstelle des nprA-Gens in dem Plasmid pSB92 erzeugt wird.

50. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß durch in-vitro-Mutagenese von Integra tions-Plasmiden konditional replikationsunfähige, tempera tursensible Integrations-Plasmide erzeugt werden.

51. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß die Integrations- und Deletions-Plas mide in geeigneter Weise, beispielsweise nach der PEG-Pro toplasten-Methode oder mittels Elektroporation, in Rezipi enten-Stämme von B. amyloliquefaciens transformiert und Plasmid-Transformanten über Antibiotika-Resistenz selek tiert werden.

52. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß Plasmid-Transformanten mit konditional replikationsunfähigen, temperatursensiblen Integrations- Plasmiden zur Integration und Plasmid-Segregation bei nicht permissiver Temperatur und ohne Selektionsdruck durch Anti biotika kultiviert werden.

53. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß Plasmid-Transformanten mit stammspezi fisch hoher segregativer Plasmid-Instabilität zur Integra tion und Plasmid-Segregation ohne Selektionsdruck durch An tibiotika passagiert werden.

54. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 53, dadurch gekennzeichnet, daß das Crossing-over durch mutagen-indu zierte Plasmid-Chromosomen-Integration befördert wird.

55. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Integration, die Anzahl der inte grierten Gen-Kopien und die Abwesenheit von Plasmid-DNS im Chromosom des Rezipienten durch Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden.