CA2164864A1 - Promoteur de levure et son utilisation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des séquences d'ADN possédant une activité de promoteur transcriptionnel et les vecteurs d'expression contenant ces séquences. Elle concerne également l'utilisation de ces séquences pour l'expression de gènes recombinés.

Description

' ~ 94/29463 216 ~ 8 6 i PCT/FR94/00698 PROMOTEUR DE T.FVURE ET SON UTILISATION
La p~sellle invention con~prne le domaine de la biologie moléculaire.
Plus particulièrement, elle con~çrn~ une nouvelle séquence d'ADN pr~sPnt~nt une activité de promoteur transcriptionnPl, des vecteurs d'expression contPn~nt cette 5 séquence, et son lltili~ation pour la production de protéines recombinantes, et par exemple de protéines hétérologues. L'invention con~Prne aussi les cellules recombinées conlçn~l cette séquence d'ADN.
Les progrès ~ccompli~ dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier des microorg~ni~mçs pour leur faire produire des protéines l0 hétérologues. _n particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur la bactérie E.coli. Toutefois, l'application industrielle de ces nouveaux modes de production est encore limitée, en particulier par les problèmes d'efficacité
d'expression des gènes dans ces microorg~niemç~ recombinés. Aussi, dans le but d'~llgmçnter les pe,Çc....,~n~P~ de ces systèmes de production, des recherches ont été
effectuées afin d'isoler des plvn~ ælll~ forts, pprmett~nt d'obtenir des niveaux élevés d'eA~lession de protéines hétérologues. Chez E.coli, on peut citer en particulier les promoteurs des opérons llyplophane et lactose.
Plus récçmmPnt chez la levure S.cerevisiae, des études ont porté sur des promoteurs dérivés de gènes impliqués dans la glycolyse. On peut citer not~mment20 les travaux sur le promoteur du gène de la 3-phosphoglycé,ale kinase ~ (Dobson et al., Nucleic Acid Res. ~.Q, 1982, 2625; ~it7Pm~n et al., Nucleic Acid Research 1982, 7791), sur celui du gène de la glyceraldéhyde-3-phosph~te deshydrogénase GAPDH (Holland et al., J.Biol.Chem. ~, 1979, 9839; Musti et al., Gene 25, 1983, 133), sur celui du gène de l'alcool deslly~ogénase 1 ADH1 (BPnn~-nt7~n et al., 25 J.Biol.Chem. ~Z, 1982, 3018; Denis et al., J.Biol.Chem. 25, 1983, 1165), sur celui du gène de l'enolase 1 ENO1 (Uemura et al., Gene 45, 1986, 65), sur celui du gène GAL1/GAL10 ~John~ton et Davis, Mol. Cell. Biol. 4 (1984) 1440) ou sur celui du gène CYC1 (Guarente et Ptashne, PNAS 78 (1981) 2199).
Réc~mmPnt des outils génétiques ont été développés afin de se servir de la 30 levure Kluyveromyces comme cellule hôte pour la production de protéines recombin~ntes. La mise en évidence d'un pl~mide de type 2-micron originaire de Kdrosophilarum (pl~mide pKD1 - EP 241 435) a permis d'établir un système hôte/vecteur très efflc~ce pour la production de protéines recombinantes (EP
361 991). Cependant, les promoteurs utilisés dans ce système n'ont pas été optimisés WO 94/29463 ~ PCT/FR94/00698 jusqu'à présent. En particulier, il s'agit ç~cPntiellement de promoteurs hétérologues, c'est-à-dire pruve,lant d'autres microorg~ni~mPs, tel que notamment S.cerevisiae.
Cette situation peut engendrer di~é,el-~ incollv~ nt.c, et not~mm~nt limiter l'activité du promoteur à cause de l'~hs~nce de certains éléments de la m~hin~rie 5 transcriptionnelle (par exemple de trans-a-;livaleu~), présenter une certaine toxicité
pour la cellule hôte due à une ~hson~e de régulation, ou affecter la stahilité du vecteur.
Dans ces conditions, le manque de promoteurs homologues forts chez Kluyveromyces con~titue un facteur li..li~l dans l'exploitation industrielle de ce lo système d'expression.
La Dçm~n~eresse a m~int-on~nt identifié, cloné et séquencé une région du génome de Kluyveromyces lactis pr~s~nt~nt une activité de promoteur transcriptionnel (voir SEQ ID n 1). Plus préci~ém~nt cette région correspond aupromoteur du gène d'une protéine impliquée dans le transport de sucres. Cette région, 15 ou des dérivés ou fr~gments de celle-ci, peut être utilisée de manière très perform~nte pour la production de protéines recombinantes chez les levures du genre Kluyveromyces. Il est ent~n~u que cette séquence peut également être utilisée dans d'autres org~ni~mes hôtes.
De plus, un avantage de l'activité promotrice obtenue réside dans son 20 caractère régulable. De ce fait, selon les cQn-lition~ d'utilisation (milieu, souche), il est possible de contrôler l'activité du promoteur, et donc de déclencher ou de réprimer l'eAl)re~ion d'un gène recombiné.
Un objet de la présente invention réside donc dans une séquence d'ADN
co...prenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n 1 ou de son brin 2s complémentaire, ou d'un dérivé de celles-ci, et po~nt une activité de promoteur transcriptionnel .
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute séquence obtenue à partir de la séquence SEQ ID n 1 par mc~ification(s) de nature génétique et/ou chimique, conservant une activité de promoteur. Par m~lification de nature30 génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, délétion, substitution, addition, et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent être effectuées dans différents buts, et not~mm~nt celui de préparer des promoteurs portables, ou celui de p,epa er des promoteurs adaptés à l'expression dans un type particulier de vecteur ou d'hôte, celui de réduire la taille, d'augmenter l'activité de 35 promoteur de la transciption, de générer des promoteurs in~llctihles~ d'améliorer le --') 94/2g46;3 216 4 8 6 ll PCT/FR94/00698 niveau de régulation, ou encore de changer la nature de la régulation. De tellesmo~iific~tions peuve~l être effectuées par PY~mple par ml~t~n~se in vitro, par introduction d'élçmPnt.~ additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des ~létion~ ou des s~lbstit~1tions des élémçnt.~ originels de contrôle.
Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité de promoteur l-anscri~lionnel peut être mise en évidence de plusieurs façons, et enparticulier en plaçant sous le contrôle de la séquence étudiée, un gène reporteur dont l'expression est ~etect~hle. Toute autre technique connue de l'homme de l'art peut bien évidçmmen~ être utilisée à cet effet.
lo La séquence SEQ ID n 1 a été obtenue à partir d'une banque de fusion entre des fr~gm~nt~ du génome de Klactis 2359/152 et le gène lacZ de E.c~li selon le protocole décrit dans les exemples. Il est entçn~u que l'homme du métier peut isoler cette région par hybridation au moyen d'une sonde co~llprenalll tout ou partie de la séquence SEQ ID nl ou de son brin complçment~ire. Les dérivés selon l'inventionpeuvenl ensuite être ple:pares à partir de cette séquence, comme indiqué dans les exemrlf~
L'invention conr~rne également un fragment d'ADN co.l,prenant tout ou partie du fragment BglII-BamHI de 3 kb décrit sur la figure 3 et pos.~l~nt une activité de promotellr transcriptionnel.
Un autre objet de l'invention concerne un ADN recombinant co.nprenant une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Cet ADN recombin~nt peut conlenir par exemple la séquence promotrice SEQ ID n 1 ou un dérivé de celle-ci, dans laquelle est inséré un site de restriction, f~ilit~nt l'utilisation de cette séquence comme promoteur "portable".
p~ iellPm.ont. cet ADN recombinant conti~nt en outre un ou plusieurs gènes de structure. En particulier, il peut s'agir de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharm~-e~ltique ou agroalimentaire. A titre d'exemple, on peut citer les el~y.l.es (tels que not~mment la superoxide dismutase, la c~t~l~ce, les amylases, les lipases, les ~m~ ~s~ la chymosine, etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha- ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, l'alpha-1 alllillypsine, etc), l'in~llline et ses variants, les lymphokin~s (telles que les interlel~kines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies [G-CSF, GM-CSF, M-CSF...], le TNF, le TRF, etc), les facteurs de croissance (tels que l'hormone de cr~iss~nce, l'ély~.,opoiétine, le FGF, l'EGF, le 35 PDGF, le TGF, etc), les apolipopro~éilles, des polypeptides antigéniques pour la wO 94/29463 216 ~ 8 6 (I PCT/FR94/00698 réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes, etc), ou encore des fusions de polypeptides telles que not~mm~nt des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilieatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fr~gmente d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur 5 de virus [CD4, etc.l).
Encore plus p~fér-~nl;çllemçnt l'ADN recombinant contiçnt également des signaux permettant la sécrétion du produit d'eApl~ssion du ou desdits gènes de structure. Ces signauA peuvent correspondre aux signaux naturels de sécrétion de la protéine considérée, mais ils pe~lv~ être d'une origine différente. En particulier des lo signaux de sécrétion dérivés de gènes de levure peuvent être utilisés, tels que ceux des gènes de la toxine killer (Stark et Boyd, EMBO J. 5 (1986) 199~5) ou de la phéromone alpha (KurJan et Herskowitz, Cell 30 (1982) 933; Brake et al., Yeast 4(1988) S436).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'ADN recombinant 15 fait partie d'un pl~emi(le d'expression, qui peut être à réplication autonome ou intégratif.
En particulier, des v~;l~ul~ à réplication autonc-me peuve~ll être obtenus en utili.e~nt des séquences à réplic~tion autonomes chez l'hôte choisi. Not~mnlent, chez la levure, il peut s'agir d'originçe de réplication dérivées de pl~emi(l~s (pKD1, 2tl, 20 etc), ou bien de séquences chromosomiques (ARS).
Les vecteurs intégratifs peuvenl être obtenus not~mmlont en utilie~nt des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Un autre objet de l'invention con.~ les cellules recomhinées contçn~nt 25 une séquence d'ADN telle que définie ci-avant.
Avantage~leç~l.ç~.l, les cellules sont choisies parmi les levures, et encore plus plerér~ iellement, parmi les levures du genre Kluyveromyces. Il est çnt~n~iu cependant que l'invention couvre toutes les cellules recombinées dans lesquelles les régions promotrices de l'invention sont actives, qu'il s'agisse de cellules euca~yotes ou 30 procaryotes. Ainsi, parmi les cellules eucaryotes, on peut citer les cellules végétales, animales, les levures, ou les ch~mpignone. En particulier, s'~giee~nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'~gies~nt de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO,Cl27, etc. Parmi les champignons susce~ibles d'être utilisés dans la présente 35 invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.

Comme hôtes procaryotes, on peut utiliser les bactéries telles que Escherichia coli, ou celles appa, lenan~ aux genres Corynebacterium, R~7cill7/~ ou Streptomyces.
L'activité de promoteur de la transcription des séquences de l'invention dans ces dirrer~ s hôtes peut être vérifiée par exemple en introcllli.s~nt dans la cellule hôte conc;dçrée un ADN recombinant co",prena"l, sous le controle de la séquence promotrice étudiée, un gène epolleur dont l'expression peut être mise en évidence dans l'hote cnnc;cleré.
Les cellules recombinées de l'invention ~uvell~ être obtenues par toute méthode permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule. Il peut s'agirnot~mm~-nt de transformation, élecllopo,~tion, conjl~g~i~on, fusion de protoplastes, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. S'~gi.~s~nt de la traP,sform~tion, dirré,e"~ protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, elle peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la technique de Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7). Un protocole alt~orn~tif a é~lem~nt été décrit dans la ~çm~llde de brevet EP 361 991. S'agiCc~nt d'électroporation, elle peut être réalisée selon Becker et Gua~ e (in: Methods in Enzymology Voll94 (1991) 182).
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence telle que précé~çmment définie pour l'expression de gènes recombinés. Les séquences d'ADN
selon l'invention peuvent en effet permettre une production à des ~iveau~ élevés de protéines recombinantes.
Avantageilcç.-.~nt. les séquences de l'invention peuvent être l~tili.sees pour 2s l'expression de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharm~ceuti~lue ouagroalimentaire. A titre d'exemple, on peut citer les ~ éines énumérées précéclemment.
La présente invention permet également la réalisation d'un procédé de production de protéines recombinantes, selon lequel on cultive une cellule recombinée telle que définie ci-avant et on récupère la protéine produite. A titre d'exemple de protéine, on peut citer les protéines énumérées précéclçmm~nt Par ailleurs, un aspect particulièrement avantageux de l'invention réside dans la possibilité de réguler l'activité des promoteurs. La ~lçm~n-l~resse a en effet montré
que le promoteur de la séquence SEQ ID n 1 était réprimé par le glucose et actif en présence de lactose. Ainsi, dans la souche SD6 (Cf exemple I/B.1.), le promoteur de la séquence SEQ ID n 1 est 50 à 100 fois plus actifs en présence de lactose qu'en présence de glucose. Ce résultat est inlélessan~ car il permet de réaliser un procédé de proclt1ction de protéines recombinantes dans lequel les phases de croissance descelltlles et d'eA~Ie~ion du gène recombiné désiré sont séparées. Ainsi, en milieu 5 glucose, les cellules recombinantes se divisent jusqu'à une phase stationnaire. A cet instant, la concentration en glucose du milieu de culture a fortement baissé, ce qui permet de dél~plill-er l'~A~ression du gène d'intérêt.
Pr~él~,.L;ellement, le procédé de l'invention est applicable à la production de sérum-albumine ht-m~ine, ou un de ses variants moléc~ ires. On entend par 10 variant moléculaire de l'albumine, les variants naturels résl~lt~nt du polymorphisme de l'albumine, les formes tronquées, ou toute protéine hybride à base d'~ mine D'autres avantages de la présente invention appa,~ n~ à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non li.~ irs.
LEGENDE DES FIGURES
15 SEO IDn 1: Séquence nucléotidique du fragment de 1 kb co,les~ondant au promoteur d'un gène transpû"eur de sucre de K. lactis.
Fi~ure 1: Pr~paralion du transposon Mini Mu MudIIZKl.
Fi~ure 2: Carte de restriction du transposon Mini Mu MudIIZKl.
F;~ure 3: Carte de restriction du clone 2C5.
20 Fi~ure 4: Carte de restriction du fragment BglII-BamHI de 3 kb portant la séquence SEQ ID n 1.
TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE

Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions pl~dtives d'ADN pl~m~ que~ la centrifugation d'ADN pl~mi~iique en 25 gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragment~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloru~,me, la pré~ipit~tion d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli etc, sont bien conn~les de l'homme de métier et sont abon~m~nt décrites dans la lill~,alure 30 [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Labo,~lo,.y Manual", Cold Spring Harbor ---') 94/2g463 216 4 8 6 ll PCT/FR94/00698 -Labo,alo~y, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New F.ngl~n<l Biolabs (Biolabs), ou Pharmacia et sont ~1tili~s selon les recomm~n-l~tions des fo~lrni~.se1lrs.
Les pl~mides de type pBR322 et pUC sont d'origine commerciale (Bethesda Research Labol~ories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchlon~fo,l~,e, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de o l'ADN ligase du phage T4 (Boehringer) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le rempli~s~e des e~ lilés 5' proéminente,s peut être eff~stué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Boehringer) selon les spécific~tions du foltrnis.sellr. La destruction des e~l emilés 3' prQemin~ntes peut être effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~ations du fabricant. La destruction des e~lre-l,ilés 5' proéminentç,s peut être effectuée par un tr~item~nt ménagé par la mlclé~e S1.
La m lt~n~,se dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].
L'~mplific~tion enzymatique de fr~gm~?nt~ d'ADN par la technique dite de PCR Lolymérase-catalyzed Chain_eaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en l~tili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
2s La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la métho~1e développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
Les transformations de K lactis sont effectuées par toute technique connue de l'homme de l'art, et dont un exemple est donné dans le texte.
Sauf indication contraire, les souches bactériennes utili~ees sont E.coli DH1 (H~n~h~n D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) ou E.coli JM109::(Mucts) (Daignan-fornier et Bolotin-Fukuhara, Gene 62 (1988) 45).
Les souches de levures utili~eçs apparti~nn~nt aux levures bourgeonn~ntes et plus particulièrement aux levures du genre Kluyveromyces. Les souche K lactis 2359/152 et K lactis SD6 ont été particulièrement ~ltili~ées.

216~64 8 Les souches de levures transformées par les pl~mi~les sont cultivées en erlenmeyers ou en fermente Irs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28C en milieu riche (YPD: 1 % extrait de levure, 2 ~o Ba~;~ope~u~c,ne, 2 ~o glucose ou YPL: 1 ~o extrait de levure, 2 % Ba~:~opeplone, 2 % lactose) sous agitation con~tqnte s EXEMPLES

I - Isolement du fragment BgllI-RqmH~ de 3 kb de K. Iactis.
La séquence SEQ ID n 1 a été isolée à partir d'une banque de fusion entre des fr~gm~nt~ du génome de Klactis 2359/152 et le gène lacZ de E.coli. Cet exemple décrit en (A) la p~ata~ion de la banque de fusion, et en (B) la sélection et la o caractérisation d'un clone de cette banque portant la séquence promotrice SEQ ID n 1 deKlactis.
A/ Préparation de la banque de fusion A.l. ~lepal~lion du l-~lsposon Mini Mu MudIIZK1 (figures 1 et 2).

Le Mini Mu MudIIZK1 a été construit à partir du Mini Mu ~ rlTT771 décrit par Daignan-Fornier et Bolotin-Fukuhara (Gene 62 (1988) 45). Il a été obtenu en substituant l'origine de réplication du mini l~ sposon Mll-lTT771 par une origine de réplication fon~tionn~lle dans Kl~d.~e pKD1 (EP231 435).
A l.l. Construction d'une c~e.sett~ portant l'origine de réplication du 20 pl~cmi~le pKD1 (fragment S11).

Afin de faciliter les maniplll~ti~ n~ ultérieures, le fragment S11 (portant l'origine de réplication du pl~mitle pKD1) a été mis sous forme d'une cassette NotI.
Pour cela, un dérivé du pl~mi~]e pUC18 a été consL~ dans lequel les sites externes du multisite de clonage (sites HindIII et EcoRI) ont été changés en sites NotI. Cela a 2s été fait par digestion avec l'enzyme correspo~ nte, action de l'enzyme de Klenow et ligature avec un oligonucléotide synthétique correspondant à un site NotI [oligod(AGCGGCCGCT); Biolabs]. Le pl~mi-le obtenu est désigné pGM67. Le fragment S11 de 960 pb obtenu par digestion par l'enzyme Sau3A du pl~mi-le KEp6 (Chen et al, Nucl. Acids Res. 114 (1986) 4471) a ensuite été inséré au site co.-.pd~;hle BamHI

~16~86'~
- ~ 94l29463 PCT/FR94/00698 , du pl~micle pGM67. Le pl~cmide ainsi obtenu désigné pGM68 contient, sous forme d'une c~sette NotI, le fragment S11.
A.1.2. Supprèssion de l'origine de réplication 2,u du transposon Mu~lTT77l.

Le pl~mi-ie pGM15 portant le mini Mu MudIIZZ1 (Daignan-Fornier et 5 Bolotin-Fukuhara précitée) a été délété des régions 2,u par digestion au moyen de l'enzyme SalI. Le site SalI unique ainsi obtenu a ensuite été transformé en site NotI
par ligature d'un oligonucléotide synthétique correspondant à un site NotI aprèsaction de l'enzyme de Klenow. Le pl~mide rés~lt~nt est appelé pGM59.
A.1.3. Insertion du fragment S11 0 La c~sette NotI portant l'origine de réplication du plasmide pKD1 (fragment S11), provenant du pl~mi~ç pUC18 modifié a ensuite été introduite au site NotI
unique du pl~mi~le pGM59.
Le pl~mide obtenu, désigné pGM83, porte un mini Mu, appelé MudIIZK1, qui est adapté à la levure Kluyveromyces lactis, ainsi qu'une copie fonctionnelle du gène LEU2 de S.cerevisiae capable de complémPnter une mutation leu2 chez Klactis(Kamper et al, Curr. Genet. 19 (1991) 109). La carte de restriction du mini-mu MudIIZK1 est représentée sur la figure 2.
A.2. Introduction du Mini Mu MudIIZK1 dans la souche E.coli portant le Mu helper JM109:: (Mucts): Obtention de la souche JM109:: (Mucts):: (MudIIZK1).
La souche JM109::(Mucts) a été transformée par le pl~mi~l~ pGM83 co.... ..lçil~nl le mini mu MudIIZK1 en présence de chlorure de c~lçil-m. Après transformation, la transposition a été induite par choc thermique selon la technique décrite par Castilho et al. (J. Bacteriol. 158 (1984) 488). Le lysat phagique obtenu après induction est ensuite utilisé pour surinfecter la souche JM109::(Mucts). La souche JM109::(Mucts) étant recA, l'ADN linéaire çnc~psi~ç par le phage ne peut se refermer pour donner un pl~smi~e réplicatif. Les intégrants [souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)] sont donc sélectionnés comme clones chlor~mph~nicol r~si~t~nt.~ (CmR), ampicilline sensibles (AmpS).
A.3. Plépalllion de la banque génomique de Klactis dans E.coli DH1

2~ ~48~4 L'ADN de haut poids moléculaire a été préparé à partir de la souche K lactis 2359/152, et digéré partiellement par l'enzyme Sau3A. Les fragments d'une taille de 4 à 8 kb ont été récupérés sur gel d'agarose LMP ("Low Melting Point", SEAKEM) et clonés dans le pl~mi(le pBR322 linéarisé par BamHI et déphosphorylé par action de la phosph~t~ce ;n~e~ le de veau (Biolabs). 35 pools de 1000 colonies dans E.coliDH1 ont ainsi été réalisés. Les 1000 colonies de chaque pool sont ~mpicilline-rési~t~ntes et tétracycline-sensibles, ce qui montre qu'elles ont toutes inséré un fragment d'ADN génomique de Klactis dans pBR322.
A.4. F`r~p~ dlion de la banque de fusion lo A.4.1. Introduction de la banque génomique de Klactis dans la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1).
L'ADN pl~mitlique de chaque pool réalisé dans DH1 est extrait (Maniatis).
Cet ADN est ensuite utilisé pour transformer la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) en présence de chlorure de calcium. Pour être représPnt~tif des 1000 colonies cont~ es dans chaque pool de la banque génomique, plus de 3000 clones par pool ont été récupérés dans la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) permettant la tr~n~uction.
A.4.2. Transposition du Mini Mu MudIIZK1 La banque de fusion est réalisée par transposition extensive du Mini Mu MudIIZK1 sur les pl~mi~les formant la banque d'ADN génomique de Klactis. Les mini-muductions ont été faites selon le protocole décrit par Castilho et al. (J.Bacteriol. 158 (1984) 488) et les tr~n~e~lct~nt.~ ont été sélectionnés sur milieu sélectif LBAC (milieu LB (Gibco BRL) supplémenté avec 50 mg/l d'~mpicilline et 30 mg/l de chlol~lllphPnicol), le ll,arquetlr AmpR étant apporté par le pl~mi~e, et le ~ quellr CmR par le mini-mu. Pour chaque pool, des transpositions sont faites ensérie, et entre 10 000 et 20 000 tr~n~uct~nt-c sont récupérés par pool. L'ADN des trAn~(luct~nt~ est ensuite extrait d'une pr~lion de 100 ml, purifié par précipitation au polyéthylène glycol (Maniatis et al, 1989) et resuspendu dans 100,ul d'eau. Cet ADN a ensuite été utilisé pour transformer K lactis et sélectionnPr des clones portant des promoteurs.

'' ') 94/29463 216 4 8 5 ll PCT/FR94/00698 Il B/ Isolement du fragment BglII-BamHI de Klactis L'ADN de fusion préparé ci-dessus a été utilisé pour transformer, par éle~;L,~po~tion, une souche réceptrice de Klactis. Cette souche réceptrice, ~é~ign~e SD6, porte les mutations leu2 (correspondant au marqueur de sélection du mini-mu5 MudIIZKl) et lac4-8. Cette dernière mutation em~h~ la souche de pousser sur unmilieu c~ n~..l du lactose comme seule source de carbone, mais elle peut être complémentée par la sure~,ession du gène lacZ d'E.coli codant pour la ~-galactosidase (Chen et al., J. Basic Microbiol. 28 (1988) 211). De ce fait, l'eA~ssion d'une protéine fusionnée à la ~-g~l3ctosi~ e doit permettre la croi~nce de la souche 10 SD6 sur lactose après tran~ro~,lla~ion. Ce crible positif a été utilisé pour sélectionner rapirl~m-?nt des clones portant des promoteurs forts.
B.l. Construction de la souche réceptrice Klactis SD6.
La souche SD6 (Chen et al., Mol. Gen. Genet. ~ (1992) 97) a été obtenue par croi.~m~nt de la souche Klactis CXJ1-7A (a, lac4-8, ura3A, adel-1, Kl, K2, 15 pKDl) (Chen et Fukuhara, Gene 69 (1988) 181) avec la souche AWJ-137 (leu2, trpl, homothallique) (Kamper et al, Curr. Genet. 19 (1991) 109), et sélection des spores ayant le génotype ADE+, uraA, leæ, lac4-8. Comme les spores obtenues n'étaient pas capables de régénérer après tlanro. m~ion par protoplastes, un croi~m~ont retour a été fait avec la souche CXT1-7A. Après sporulation en masse, les spores du 20 génotype choisi ont été testées par transformation au chlorure de lithium avec le pl~mi~ie KEp6 selon une technique dérivée de celle décrite par Ito et al. ~J. Bacteriol.
153 (1983) 163) (la concentration en LiCl est de 20 mM, soit 10 fois moins que celle utilisée par Ito pour S.cerevisiae). La souche CXJl-7A a servi de témoin de transformation.
La souche SD6, selectionnée sur ces critères, se transforme correctement: 1 à 3 . 104 transformants par ,ug d'ADN; et les transformants ont une st~hilité
satisfaisante: 30 à 40 ~o des colonies gardent le phénotype [Ura+] après 6 générations en milieu non sélectif.
B.2. Isolement du fragment BglII-BamHI.
La souche SD6 a été transformée par électroporation selon Becker et Garante (in Methods in Enzymology voll94 (1991) 182) (appareil Jouan;

3 PCT/FR94/00698 216~8 S~ -2500 V/cm; 80-100 ng d'ADN/transformation) avec l'ADN de 11 pools de tr~n~uct~nt~ obtenus en A.4.2. (correspondant à une banque de 11000 clones dans E.coli). Après 5 heures de régénération en milieu YPD (extrait de levure 10 g/l;peptone 10 g/l; glucose 20 g/l), les cellules ont été étalées sur milieu ."ini..-ul~l 5 lactose. Les transfc~ c~pables de po~s~er sur lactose ont été restriés et, pou r chaque clone, le plasmide a été extrait, ~mplifié dans E.coii, et, après vérification rapide de la carte de restriction du vecteur et du mini-mu, utilisé pour retransformer la levure SD6. Parmi les clones de Klactis obtenus après retransformation, l'un d'entre-eux, le clone 2C5, a été étudié par restriction (voir figure 3) et par analyse de 10 la séquence de la jonction entre la protéine de Klactis et la 13-g~l~cto~ e. Pour cela, la séquence de la jonction, à partir de l'e~lle,.,ilé lacZ du mini-mu (séquence double brin) a été déterminée par séquençage, au moyen de l'oligonucléotide suivant situé à -59 nucléotides de la jonction:
5'-CTGl~TCAl'rTGAAGCGCG-3' L'analyse de la séquence protéique déduite de la séquence nucléotidique ainsi obtenue par compardison avec les séquences de banques de protéines d'autres levures ou euc~u yoles (G~nh~nk, MIPS, EMBL, etc), montre que la séquence portéepar le clone 2C5 correspond à un gène impliqué dans le transport de sucres. Le fragment BglII-BamHI de 3 kb co..l~n~.l la région en amont de la fusion a ensuite 20 été sous-cloné dans le vecteur Bluescript KS+ (Stratagène), une carte de restriction a été faite (figure 4), et la séquence a été de~e--,.;llee par délétions séquentielles sur 1 kb (SEQ ID n 1). L'obtention d'éléments de séquence permet également à l'homme du métier de préparer des sondes spécifiques et de recloner la région promotrice de l'invention par hybridation selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
25 Il - Tra,~olaffon de Kluy,ei~"~ces.

Dir~elel,les techniques permettant l'introduction d'ADN dans la levure peuvent être l~sili~eçs.
Avantagell~çm~nt, les différentes souches de Kluyveromyces utili~ées ont été
transformées en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par Ito et al. ~J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168). La technique de transformation décrite par Durrens et al. (Curr.Genet. 18 (1990) 7) lltili~nt l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée.

~") 94/29463 21 6 4 8`6 4 PCT/FR94/00698 Il est aussi possible de transformer les levures par électroporation, par exemple selon la méthoc~e décrite par Karube et al. (F~:BS Letters 182 (1985) 90).
Un protocole ~lt~rn~tif a encore été dé~crit en détail dans la ~lem~n~e EP 361 991.
5 III - Ut;l;cqtion du promoteur de la SEQ ID n l pour l'e~. ~;on de gènes hétérologues.
L'activité de promoteur tl~lscriplionnel de la région de Klactis décrite sur la séquence SEQ ID n 1 a été mise en évidence lors même de son isolement, par sa c~l~aç;ler à induire la comrlçm~nt~tion de la mutation lac4-8 de la souche SD6. Cette 10 c~r~ité résulte en effet de l'e~s~ion du gène lacZ de E.coli, et ~l~motltre par là
même la c~p~citç d'~ sion de gènes hétérologues.
IV - Construction d'un promoteur portable Un promoteur portable est préparé par PCR, par insertion sur le fragment BglII-BamHI de 3 kb d'un site de restriction en position +1 par rapport au codon15 ATG.
L'insertion de ce site permet de générer un fragment comprenant la région promotrice et d'introduire en aval du promoteur ainsi obtenu tout gène que l'on désire exprimer.

WO 94/29463 2 1 6 g 8 6 4 14 PCT/FR94/00698 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20i avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR DE LEVURE ET SON
UTILISATION.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC co.. pdl;hle (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1119 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Klllyverol~yces lactis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1018.. 1119 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

''~94/29463 216 ~ 8 6 4 PCT/~941UU698 TCTGACATGT CACGGAAAAA CTGTTCCCCA GAAA'l'l'l'l'l'C TTTCCCCGCC

AAGACGTAAC AAATATGAGA AATGACTTTG CACACAGAAA CATTTGCAGC
AG'l'l'll'CCGA 180 AGACATACAG CAAAACCGCC ATCTCAGAAA TGAAAAAGTA ATTTCAGGGA

TTCGACGATT CGTAATTTAC ATTTCGTATC ACTTTCATCA GCAGACCGAC

GTGATTGTTC CGTATTGCTA ATTTGGTGTC ATTGTTGCAA CTCGGTCATT

GAAGGGGTGG CTGGTTTCGT TAGTCAGGAG GATTATACTC CGGTCAGCGG

CATTTACAAA CGATATTATC AATGGTATAG TTGGGCTGGA AGAAAAGTGA

AATTCCGAGC AGTGAGTGAG AACGGTAATG TTGAGGATTG TAGTG'l'l'l'l'l' TAGAAGATGC TCATCGCATC GTCGTGTTCC GTGAAAGCTC TCCATGTTAG

GTTGCCAGTT GGCAGGCTGT ATCCTCCCCG CTCTTCCTTG GTGCCGGATT

CCTTACACAA TGACGCTTTG GGACAATGTT TCGTTATTCC ATCGACGATG

CTAATTAATC AACGGGCTAA GAAATTAGCG TAACTGATGT AGAATGATCA
GAGGGl-l'll'l' 780 TTTTCTTTCT TAGTTCTATT TACACTATTT TCCAGCTTGA ATGGTTTAAG

TTGTTTCTGA TATAAAAGCC AGGTAATAAA CCTTCTAACT TGCCTCTTCT

TCGAAAACAC TTTTCGGTTG TTTGTTTCTG 'l'l'l'l'l'l'l'CCC TTTCGATTCA

WO 94l29463 PCT/FR94/00698 2~4864 16 TAAAAAACGT ATTATAACAA ACTATAACAA ACATCAACTT TAGCTAATAA

ATG TCA TTG AAA AAT TGG CTT TTG CTA CGT GAT ATC CAA TAC GAG GGA

Met Ser Leu Lys Asn Trp Leu Leu Leu Arg Asp Ile Gln Tyr Glu Gly ACG TTT TAT AAA AAG TTC CCC CAT GTC TAC AAC ATT TAC GTC ATC GGT
o 1113 Thr Phe Tyr Lys Lys Phe Pro His Val Tyr Asn Ile Tyr Val Ile Gly 1~ Phe Ile

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Fragment d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire, ou d'un dérivé de celles-ci, et possédant une activité
de promoteur transcriptionnel.

2. Fragment d'ADN comprenant tout ou partie du fragment BglII-BamHI de 3 kb présenté sur la figure 4.

3. ADN recombinant comprenant un fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2.

4. ADN recombinant selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il contient en outre un ou plusieurs gènes de structure.

5. ADN recombinant selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il contient également des signaux permettant la sécretion du produit d'expression du ou desdits gènes de structure.

6. ADN recombinant selon les revendications 4 et 5 caractérisé en ce que le ou les gènes de structure codent pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire.

7. ADN recombinant selon la revendication 6 caractérisé en ce que le ou les gènes de structure codent pour des protéines choisies parmi les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc.), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha- ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine etc.), l'insuline et ses variants, les lymphokines (telles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF...), le TNF, le TRF etc.), les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF etc.), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc.), ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur de virus (CD4, etc.)).

8. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 3 à 7 caractérisé en ce qu'il fait partie d'un plasmide d'expression, qui peut être à
réplication autonome ou intégratif.

9. Cellule recombinée contenant une séquence d'ADN ou un ADN
recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes.

10. Cellule recombinée selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure.

11. Cellule recombinée selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Kluyveromyces.

12. Utilisation d'une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour l'expression de gènes recombinés.

13. Utilisation selon la revendication 12 pour l'expression de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire.

14. Procédé de production de protéines recombinantes caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinée selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et on récupère les protéines produites.

15. Procédé selon la revendication 14 pour la production de protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire.

16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la protéine est préférentiellement la sérum-albumine humaine ou un de ses variants moléculaires.