KR100676183B1 - 아스퍼질러스 오리재 유래의 프로모터의 활성을 나타내는엠에이취에이 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)유래의 프로모터의 활성을 나타내는 mheA 유전자에 관한 것으로, 공지의 방법으로 상기 mheA 유전자를 목적물질이 코딩된 외래 유전자에 발현가능한 상태로 연결하고, 이를 아스퍼질러스 오리재에 형질전환시키게 되면, 인체에 유해하지 않은 미생물인 아스퍼질러스 오리재의 형질전환체로부터 사람에게 유용한 단백질을 대량 생산에 이용될 수 있다.

아스퍼질러스 오리재, 프로모터, mheA 유전자

Description

아스퍼질러스 오리재 유래의 프로모터의 활성을 나타내는 엠에이취에이 유전자{Aspergillus oryzae derived mheA gene as promoter}

도 1는 아스퍼질러스 오리재의 EST A07B12를 지표로 하여 mheA 유전자 클론을 콜로니 혼성화법(colony hybridization)으로 분리한 결과를 나타낸 사진,

도 2는 mheA 유전자를 포함한 DNA의 제한효소 지도,

도 3은 mheA 유전자의 발현 산물인 mRNA를 노던 블롯(Northern blot)을 통하여 분석한 결과를 나타낸 사진.

도 4는 아스퍼질러스 오리재를 여러 가지 탄소원에서 키웠을 경우의 mheA의 발현양을 전기영동으로 비교한 사진.

본 발명은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)유래의 프로모터의 활성을 나타내는 mheA 유전자에 관한 것이다.

일반적으로 아스퍼질러스 오리재는 다양한 생합성 활성과 분해활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 여러 종류의 아밀라제(amylase)와 프로테아제 (protease)를 가지고 있기 때문에 청주제조, 된장 및 간장제조와 같은 장류 제조에 매우 유용하게 이용되고 있다.

이러한 연유로, 미국 국립 보건원(NIH)에서도 GRAS(generally regarded as safe)로 인정하고 있어 다른 균주와는 달리 인체에 해롭지 않으며 그 이용가치도 매우 크다고 할 수 있다.

뿐만 아니라, 아스퍼질러스 오리재는 세포외로 다량의 효소를 분비하면서 분비체계도 매우 잘 발달되어 있고, 고등동물 세포와 같이 단백질의 당쇄형성과 같은 단백질 합성 후의 수식이 정상적으로 일어나고, 세균과는 달리 세포의 미세구조나 발현체계가 진핵세포의 체계를 가지고 있기 때문에 사람을 포함한 고등동물 유래의 유용한 외래 단백질을 발현하는 숙주세포로써 그 중요성이 날로 증대되어 가고 있는 실정이다 (Carrez et al, Gene 94, 147-154, 1990; Jeenes et al, Genet. Eng. Rev. 9, 327-367. 1991).

그래서, 아스퍼질러스 오리재에서 산업적으로 효용가치가 높은 단백질을 발현시킬 경우, 생산되는 단백질을 유전자 조작에 의하여 쉽게 세포 밖으로 분비시킬 수 있다.

그러나, 유전공학의 기술을 이용하여 이종 단백질을 생산할 때, 이종 단백질을 세포내 분비를 하는 미생물을 사용하는 경우에는 일반적으로 세포내에서 발현된 이종 단백질이 세포내 단백질 분해효소에 의하여 분해되거나 이와는 반대로 이종 단백질이 미생물의 체내에 계속 축적되면 세포 자체의 대사작용 등을 방해하여 세포의 생장을 저해하고 나아가서는 세포를 용해시켜 세포의 수가 급속히 감소되어 이종 단백질의 대량 생산이 불가해지는 문제점이 발생되기 쉽고, 또한 세포내에서 불용성 단백질체를 형성하기 때문에 분리·정제과정에서 추가 비용이 많이 드는 단점이 있다.

이러한 이유로, 아스퍼질러스 오리재를 상업적으로 많이 이용하고 있다.

그리고, 아스퍼질러스 오리재에서 이종 단백질을 대량 생산하기 위해서는 발현이 강력히 일어날 수 있도록 강력한 프로모터가 필요한데, 현재 아스퍼질러스 오리재에서 강력한 프로모터로 사용되고 있는 것은 아밀라제 계통 효소 유전자의 프로모터, 그리고 글리콜리시스에 관여하는 효소 유전자의 프로모터가 알려져 있다 (Nakajima et al., Biotechnol. Bioproc. Eng. 5, 253-262, 2000).

그런데, 이전에 보고된 아스퍼질러스 오리재에서는 배지의 탄소원으로 포도당을 주로 사용하였기 때문에, 가장 많은 양의 mRNA를 만드는 유전자의 부분 염기서열을 분석한 결과, 아밀라제 계통 효소 유전자 또는 글리콜리시스에 관여하는 효소 유전자의 염기서열은 알려져 있지 않았다(Hwang et al., J. Microbiol. 36, 111-117, 1998).

이는, 공업용 효소 생산의 프로모터는 전분질이나 말토스를 탄소원으로 사용할 경우, 탄소원 이화작용 억제(carbon catabolite repression)를 받는 등 장점이 크지 않았기 때문이다.

이에, 본 발명자는 탄소원으로 포도당 뿐만아니라, 전분, 설탕 등에서도 강력히 작동할 수 있는 프로모터를 아스퍼질러스 오리재에서 찾고자 하였다.

본 발명의 목적은, 탄소원으로 포도당 뿐만아니라, 전분, 설탕 등에서도 전 사를 가장 효율적으로 하는 프로모터를 제공하기 위해, 아스퍼질러스 오리재에서 이미 공지된 324 개의 EST 클론들의 분석 결과를 활용하여 (Hwang et al., J. Microbiol. 36, 111-117, 1998), 상기 유전자 중에서 4 회의 발현빈도를 가진 클론을 선정하고, 상기 선정된 클론을 지표(Hwang et al., J. Microbiol. 36, 111-117, 1998)로 하여, 아스퍼질러스 오리재의 유전자로부터 강력한 프로모터의 역할을 할 수 있는 유전자를 분리하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae)유래의 프로모터의 활성을 나타내는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 mheA 유전자를 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자에 작동가능하도록 연결된 목적단백질을 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 미생물에 삽입하여 형질전환시킨다음, 상기 형질전환된 미생물을 배지에 배양하여 목적단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 mheA 유전자를 이용한 단백질의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

먼저, 본 명세서에서 사용하는 참고문헌과 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

본 발명에서는 프로모터의 활성을 나타내며, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 아스퍼질러스 오리재 유래의 신규한 유전자를 mheA 유전자로 명명하였다.

본 발명에서 mheA 유전자의 염기서열은 서열번호 1 내지 2 에 설명된 바와같이 표시된다.

이때, 서열번호 1은 아스퍼질러스 오리재의 전체 유전자의 염기서열을 나타내는 것이고, 서열번호 2는 mheA 유전자의 염기서열을 나타낸 것이며, 서열번호 1에서 4,962 내지 5,179의 염기서열은 mheA 유전자를 탐색하는 데 사용하는 EST(A07B12)의 염기서열을 나타낸 것이다.

통상적으로 알려진 프로모터와 같이, 본 발명에서 프로모터로 사용되는 mheA 유전자는 그 일부분인 프로모터서열, 신호서열 및 종결서열을 프로브나 프라이머로 용도로 사용한다.

본 발명에서 형질전환 대상의 미생물로는 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus)균주의 미생물을 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거를 사용한다.

이는 본 발명에서 사용되는 서열번호 2의 유전자는 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae)로부터 유래된 것이고, 아스퍼질러스 나이거는 상기 아스퍼질러스 오리재와 유전적으로 상동성이 67%이기 때문이다.

그러나, 본 발명에서 형질전환의 대상 미생물이 아스퍼질러스 속 미생물로 국한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는 형질전환된 아스퍼질러스 속 균주를 배양할 때, 배지에 탄소원으로 포도당, 설탕, 녹말을 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 포도당을 사용한다.

이는 탄소원을 달리한 배지에서 아스퍼질러스 오리재를 배양할때, 탄소원이 포도당인 배지에서 mheA 유전자의 발현양이 다른 탄소원의 경우보다 매우 높았기 때문이다.

그리고, 일반적인 프로모터 활성방법(Nakajima et al., Biotechnol. Bioproc. Eng. 5, 253-262, 2000)을 이용하여, 본 발명의 mheA 유전자를 활성은

(a) 프로모터로서 mheA 유전자를 목적단백질이 코딩된 외래 유전자에 발현가능한 상태로 연결한 재조합 유전자를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 유전자를 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조하고, 이를 미생물에 형질전환시키는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 미생물을 배지에 배양한 다음, 상기 배양산물로부터 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하여 이루어진 방법을 사용하면 된다.

이때, 상기 목적단백질에는 상업적으로 이용이 가능한 단백질, 효소 또는 항체를 적용하여 사용할 수 있으며, 특히 아밀라제와 프로테아제를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

본 실시예는 신규하고 효율적인 프로모터를 찾고자, 아스퍼질러스 오리재로부터 공지된 324개의 EST(Expressed Sequence Tag)에서 발현빈도가 가장 높은 유전 자를 분리하여, 상기 분리된 유전자 클론의 제한효소 지도를 작성하고, 상기 유전자가 실제적으로 발현하는 지의 여부 및 상기 유전자의 mRNA 크기를 확인하고자 하였다.

그리고, 아스퍼질러스 오리재를 여러 가지 탄소원에서 키웠을 경우, 상기 유전자의 발현양을 비교 분석하여, 상기 유전자를 프로모터로 사용하였을 경우, 형질전환 미생물의 배양방법에 적용하고자 하였다.

[실시예 1] 아스퍼질러스 오리재로부터 mheA 유전자의 분리

아스퍼질러스 오리재의 EST인 A07B12 (Hwang et al., J. Microbiol. 36, 111-117, 1998)의 DNA를 지표로 사용하여, 아스퍼질러스 오리재의 전체 DNA를 제한효소 HindIII로 절단한 유전자에서 mheA 유전자를 분리하여 클론을 확보하였다. 그리고, 상기 클론을 다시 지표로 사용하여 제한효소 PstI으로 절단한 유전자에서 전체 mheA 유전자를 포함하는 PstI 절편의 클론을 확보하였다.

이때, 도 1은 상기 클론을 콜로니 혼성화법(colony hybridization)하여 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.

콜로니 혼성화법은 먼저 LB 플레이트에서 밤새 배양한 대장균을 콜로니/플라크 스크린 혼성화 전이 막(Colony/Plaque Screen^TM Hybridization Transfer Membrane)으로 떠내고, 상기 막을 변성 용액(denaturation solution)과 중화 용액(neutralizing solution)에 각각 5분간 워싱(washing)을 하였다. 그리고, 상기 막을 실온에서 20분 정도 말린 다음 UV 하에서 5 분간 교차결합(cross-linking)을 유도하였다.

그런다음, 2 X SSC 용액으로(SSC용액은 NaCl 8.77g, sodium citrate 4.41g이 1ℓ의 증류수에 들어있고 pH를 7.0으로 조절한 용액이다.)로 씻고, 혼성화 용기 (hybridization bottle)에 넣고 변형 처치 완충용액[modified church buffer; 0.5 M EDTA (pH8.0)1.0 ㎖, Na₂HPO₄(7H₂O) 33.5 g, 85% H₃PO₄ 1.0 ㎖, Hydrolysated casein 5.0 g, SDS 35g을 400 ㎖ H₂O에 녹인후 최종적으로 부피를 500 ㎖로 맞춘 완충용액]를 적당량 넣어서 전혼성화반응(prehybridization)을 수행하였다.

이때, 혼성화 유도물(Hybridizer)은 Techne Hybidizer HB-1D(UK)를 사용하였고, 전혼성화반응은 1시간 수행하였다.

그리고, Prime-a-Gene system^TM (Promega, WI)를 사용하고, 동위원소는 α-³²P dCTP (NEN, MA)를 사용하여 랜덤 프라임 표식(random prime labelling)을 한 프로브(probe)를 세파덱스 G-50(Sephadex G-50; Amersham-Pharmacia, UK) 컬럼으로 정제 한 후, 변성(denaturation)시켜 전혼성화반응 용액(prehybridiztion solution)에 첨가하였다. 이때, 혼성화반응은 약 16시간 정도 수행하였다.

혼성화반응이 끝난 후 2X SSC + 0.5% SDS의 용액으로 실온에서 두 번 씻어주고, 2X SSC + 0.1% SDS 용액으로 65℃에서 1번, 1X SSC + 0.1% SDS 용액으로 65℃에서 1번씩 각각 30 분씩 씻어 주었다. 그리고, 만일 잘 씻어지지 않을 경우 0.1X SSC + 0.1% SDS 용액으로 65℃에서 30 분간 한번 더 씻어주었다.

그리고, 혼성화 정도의 확인은 x-ray 필름에 감광하여 확인하였다(도 1의 A는 첫번째 스크리닝 결과이고, B는 두번째 스크리닝한 결과 참조).

[실시예 2] 분리된 클론의 제한효소 지도 작성

상기 실시예 1에서 분리된 HindIII 클론과 PstI 클론을 재조합하여 5.5 kb의 절편을 갖는 클론을 얻었고, 이의 제한효소 지도를 작성하여 도 2와 같은 결과를 얻었다.

[실시예 3] mheA 유전자의 발현 확인 및 mheA 유전자의 mRNA 크기 확인

YEPD 배지에서 아스퍼질러스 오리재를 48시간을 키운 후 전체 RNA을 얻었으며, 상기 전체 RNA에 A07B12 DNA를 지표로 사용하여 노던 하이브리드(Northern hybridization)을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, mheA 유전자의 mRNA가 발현됨을 확인하였다. 이 mheA 유전자의 mRNA의 크기는 400 ∼ 450 bp 임을 확인하였다.

노던 혼성화반응은 상기 전체 RNA를 RNA 샘플 로딩 완충용액(sample loading buffer)에녹여서, 1X MOPS 런닝 완충용액 상의 포름알데히드 RNA 젤(gel)에 로딩 (loading)하고 전기영동을 수행하였다.

전기영동이 완료된 후, 상기 RNA가 분리된 젤을 하이본드-N⁺막(Hybond- N⁺membrane)에 붙인다음, RNA가 전이되도록 20X SSC용액 내에서 모세관 전이(capillary transfer)를 수행하였다.

그리고, 젤에서 상기 막을 떼어내고, 80℃에서 2시간 동안 굽고(baking), 2X SSC 용액으로 린스한 다음, 혼성화반응 용기에 넣고 변형 처치 완충용액을 적당량 넣고 전혼성화반응을 수행하였다.

이때, RNA 샐플 로딩 완충용액은 700 ㎕에 대해 포름아미드(Formamide) 360 ㎕, 10X MOPS 70 ㎕, DEPC로 처리된 증류수 70 ㎕, 포름알데히드 130 ㎕, 10X 로딩 염료(dye) 70 ㎕를 넣어 제조하였고, 10X 로딩 염료는 글리세롤 5 ㎖, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 0.02 ㎖, 브로모페놀 블루 0.025 g, 자일렌 시아놀 FF 0.025 g을 넣은 후, 증류수로 최종10 ㎖로 맞춘 것을 사용하였다.

그리고, 포름알데히드 RNA 젤은 100 ㎖를 제조하기 위해 아가로즈(SeaKem^® LE) 1 g, 물(H₂O) 72 ㎖를 넣고 전자렌지에서 2분간 끓인 후 60 ℃로 식히고, 10X MOPS 10 ㎖, 포름알데히드 18 ㎖를 첨가하여 제조한 젤을 사용하였으며, 10X MOPS 러닝 완충용액(running buffer)은 1ℓ당 NaOAc (3 M, pH 5.2) 26.7 ㎖, DEPC 처리한 증류수 700 ㎖, MOPS 41.2 g을 넣고 pH를 7.0으로 조절한 후 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ㎖를 가하고 증류수로 최종 1ℓ로 맞춘 스톡 용액(Stock solution)을 사용하였다.

[실시예 4] 아스퍼질러스 오리재를 여러 가지 탄소원에서 키웠을 경우의 mheA 의 발현양 비교

상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 아스퍼질러스 오리재를 탄소원(2% 포도당, 2% 설탕, 2% 녹말, 2% 피루베이트)만 달리한 YEPD 배지에 14 시간동안 각각 배양한 다음, 각 배지의 아스퍼질러스 오리재로부터 얻은 전체 RNA를 대상으로 노던 블롯(Northern blot)을 실시하여 mheA 유전자의 발현 양상을 비교하였다.

이의 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 포도당을 탄소원으로 가진 YEPD에서 가장 많이 발현이 되는 것으로 확인할 수 있었고 피루베이트를 사용한 배지에서는 발현양이 매우 적은 것을 알 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명은 아스퍼질러스 오리재에서 mheA 유전자를 분리함으로써, 추후 상기 mheA 유전자를 프로모터로 이용하여, 사람에게 유용한 물질이 코딩된 유전자를 아스퍼질러스 오리재에서 발현시킴으로써, 산업상 사람에게 유용한 물질을 효과적으로 다량 발현시킬 수 있다.

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Claims (4)

1. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)유래의 프로모터의 활성을 나타내는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 mheA 유전자.
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