JPH0759571A - アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーター - Google Patents
アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーターInfo
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- JPH0759571A JPH0759571A JP21265893A JP21265893A JPH0759571A JP H0759571 A JPH0759571 A JP H0759571A JP 21265893 A JP21265893 A JP 21265893A JP 21265893 A JP21265893 A JP 21265893A JP H0759571 A JPH0759571 A JP H0759571A
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- aspergillus
- promoter
- aspergillus niger
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アスペルギルス・ニガー由来の新規強力プロ
モーターの提供および、該新規プロモーター配列を含む
アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニガー
の高発現形質転換株の提供。 【構成】 配列表に示すＤＮＡ配列からなるアスペルギ
ルス・ニガー由来の新規強力プロモーター、該新規プロ
モーターを挿入したベクターによるアスペルギルス・オ
リゼおよびアスペルギルス・ニガーの高発現形質転換株
ならびにこれらの株を用いる有用タンパク質の製造法。 【効果】 アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギル
ス・ニガーで高発現するプロモーターが得られ、それに
より高発現の形質転換株が得られる。
モーターの提供および、該新規プロモーター配列を含む
アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニガー
の高発現形質転換株の提供。 【構成】 配列表に示すＤＮＡ配列からなるアスペルギ
ルス・ニガー由来の新規強力プロモーター、該新規プロ
モーターを挿入したベクターによるアスペルギルス・オ
リゼおよびアスペルギルス・ニガーの高発現形質転換株
ならびにこれらの株を用いる有用タンパク質の製造法。 【効果】 アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギル
ス・ニガーで高発現するプロモーターが得られ、それに
より高発現の形質転換株が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスペルギルス属糸状
菌の新規プロモーターに関する。さらに詳しくは、本発
明は、アスペルギルス・オリゼまたはニガーを宿主とし
て用いる遺伝子組換技術に関するものであり、アスペル
ギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列をクローニ
ングし、アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス
・ニガーで異種タンパク質を高発現するプロモーターと
して発現系に使用するものである。
菌の新規プロモーターに関する。さらに詳しくは、本発
明は、アスペルギルス・オリゼまたはニガーを宿主とし
て用いる遺伝子組換技術に関するものであり、アスペル
ギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列をクローニ
ングし、アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス
・ニガーで異種タンパク質を高発現するプロモーターと
して発現系に使用するものである。
【０００２】
【従来の技術】アスペルギルス・オリゼおよびアスペル
ギルス・ニガーは古くから有用酵素の生産源として用い
られており、さらに、アスペルギルス・オリゼは清酒醸
造の麹として用いられる微生物であり、歴史的に安全で
あることが証明されている。そこで最近、これらのアス
ペルギルス属糸状菌が異種タンパク質生産の宿主として
注目され、形質転換系の開発が活発に行われている。し
かし、アスペルギルス属の遺伝子の解析例は少ない。こ
れまで、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーターを利用したタンパク質生産法の報告
(特開昭６２−２７２９８８号)、そのプロモーターを人
為的に変化させた報告(特開平４−１２１１９４号)、ア
スペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーのグリ
セルアルデヒド−３−ホスフェイト デヒドロゲナーゼ
(ＧＡＰ−ＤＨ)のプロモーターを利用しての異種タンパ
ク質の製造方法の報告がある(特開平３−１８７３９２
号)等があるにすぎず、いずれも、発現効率が低く、よ
り強力なプロモーターの開発が望まれている。
ギルス・ニガーは古くから有用酵素の生産源として用い
られており、さらに、アスペルギルス・オリゼは清酒醸
造の麹として用いられる微生物であり、歴史的に安全で
あることが証明されている。そこで最近、これらのアス
ペルギルス属糸状菌が異種タンパク質生産の宿主として
注目され、形質転換系の開発が活発に行われている。し
かし、アスペルギルス属の遺伝子の解析例は少ない。こ
れまで、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーターを利用したタンパク質生産法の報告
(特開昭６２−２７２９８８号)、そのプロモーターを人
為的に変化させた報告(特開平４−１２１１９４号)、ア
スペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーのグリ
セルアルデヒド−３−ホスフェイト デヒドロゲナーゼ
(ＧＡＰ−ＤＨ)のプロモーターを利用しての異種タンパ
ク質の製造方法の報告がある(特開平３−１８７３９２
号)等があるにすぎず、いずれも、発現効率が低く、よ
り強力なプロモーターの開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明はアスペルギル
ス属糸状菌から、発現効率のよい、より強力なプロモー
ター配列をクローニングし、これをアスペルギルス属に
おける異種タンパク質の生産に利用することを目的とす
る。
ス属糸状菌から、発現効率のよい、より強力なプロモー
ター配列をクローニングし、これをアスペルギルス属に
おける異種タンパク質の生産に利用することを目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは鋭意研究を行い、アスペルギルス・ニ
ガーから新規な、強力なプロモーター配列をクローニン
グすることに成功し、本発明を完成するに至った。
に、本発明者らは鋭意研究を行い、アスペルギルス・ニ
ガーから新規な、強力なプロモーター配列をクローニン
グすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）以下の配列表
に示した塩基配列で表されるＤＮＡ、（２）該ＤＮＡか
らなるプロモーター、（３）該プロモーターを挿入した
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ、
（４）該プロモーターを挿入したベクターにより形質転
換したアスペルギルス・ニガー、（５）上記（３）項の
アスペルギルス・オリゼを培養し、生成、蓄積された有
用タンパク質を採取することを特徴とする有用タンパク
質の製造法、および（６）上記（４）項のアスペルギル
ス・ニガーを培養し、生成、蓄積された有用タンパク質
を採取することを特徴とする有用タンパク質の製造法、
を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明す
る。
に示した塩基配列で表されるＤＮＡ、（２）該ＤＮＡか
らなるプロモーター、（３）該プロモーターを挿入した
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ、
（４）該プロモーターを挿入したベクターにより形質転
換したアスペルギルス・ニガー、（５）上記（３）項の
アスペルギルス・オリゼを培養し、生成、蓄積された有
用タンパク質を採取することを特徴とする有用タンパク
質の製造法、および（６）上記（４）項のアスペルギル
ス・ニガーを培養し、生成、蓄積された有用タンパク質
を採取することを特徴とする有用タンパク質の製造法、
を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明す
る。
【０００６】本発明においては、まず、アスペルギルス
属糸状菌で自己複製可能な配列であるＡＭＡ１配列[ゲ
ムス（Gems）ら、ジーン（Gene）第９８巻、６１頁（１
９９１年）]を用い、レポーター遺伝子としてイー・コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
遺伝子[ジェファーソン（Jefferson）ら、エムボー・ジ
ャーナル（EMBO.J.）第６巻、３９０１頁（１９８７
年）]を連結し、高形質転換効率系のプロモーター検索
用のプラスミドを構築する。このプラスミドは、ＡＭＡ
１配列を有し、インテグレート型に比べて数百倍の形質
転換効率が得られ、アスペルギルス属糸状菌の遺伝子の
ショットガンクローニングを可能にする。
属糸状菌で自己複製可能な配列であるＡＭＡ１配列[ゲ
ムス（Gems）ら、ジーン（Gene）第９８巻、６１頁（１
９９１年）]を用い、レポーター遺伝子としてイー・コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
遺伝子[ジェファーソン（Jefferson）ら、エムボー・ジ
ャーナル（EMBO.J.）第６巻、３９０１頁（１９８７
年）]を連結し、高形質転換効率系のプロモーター検索
用のプラスミドを構築する。このプラスミドは、ＡＭＡ
１配列を有し、インテグレート型に比べて数百倍の形質
転換効率が得られ、アスペルギルス属糸状菌の遺伝子の
ショットガンクローニングを可能にする。
【０００７】該プラスミドを用い、アスペルギルス・ニ
ガー由来の種々のプロモーター配列を自体公知の方法に
よりクローニングし、最少培地で高発現する新規なプロ
モーターを得る。プロモーター配列を得るアスペルギル
ス・ニガー株としては、特に限定するものではないが、
例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ア
ワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソ
ーヤ、アスペルギルス・オリゼなどが挙げられる。ま
た、最少培地としては、例えば、０．２％ＮａＮＯ3、
０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4、０．０５
％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ4、３％グルコースま
たは３％澱粉、ｐＨ５．５のツァペック−ドックス（Cz
apek-Dox）培地が用いられる。なお、本発明における
「高発現」とは、従来までに報告されている中では（タ
ダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第
５５巻、１９３９頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuch
iya）ら、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・ア
ンド・バイオケミストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂioc
hem．）第５６巻、１８４９頁(１９９２年)）、アスペ
ルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ーにレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を発現する誘
導条件以上のＧＵＳ活性の発現量を意味し、一方、これ
に及ばない発現は低発現である。
ガー由来の種々のプロモーター配列を自体公知の方法に
よりクローニングし、最少培地で高発現する新規なプロ
モーターを得る。プロモーター配列を得るアスペルギル
ス・ニガー株としては、特に限定するものではないが、
例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ア
ワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソ
ーヤ、アスペルギルス・オリゼなどが挙げられる。ま
た、最少培地としては、例えば、０．２％ＮａＮＯ3、
０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4、０．０５
％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ4、３％グルコースま
たは３％澱粉、ｐＨ５．５のツァペック−ドックス（Cz
apek-Dox）培地が用いられる。なお、本発明における
「高発現」とは、従来までに報告されている中では（タ
ダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第
５５巻、１９３９頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuch
iya）ら、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・ア
ンド・バイオケミストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂioc
hem．）第５６巻、１８４９頁(１９９２年)）、アスペ
ルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ーにレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を発現する誘
導条件以上のＧＵＳ活性の発現量を意味し、一方、これ
に及ばない発現は低発現である。
【０００８】本発明のプロモーターは、特に、アスペル
ギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーに導入し
た場合に高発現するものであり、該プロモーターの下流
に、所望の有用タンパク質遺伝子を連結してベクターを
構築し、該ベクターでこれらの宿主アスペルギルス属糸
状菌を形質転換し、それを培養することにより、有用タ
ンパク質を著量生産させることができる。
ギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーに導入し
た場合に高発現するものであり、該プロモーターの下流
に、所望の有用タンパク質遺伝子を連結してベクターを
構築し、該ベクターでこれらの宿主アスペルギルス属糸
状菌を形質転換し、それを培養することにより、有用タ
ンパク質を著量生産させることができる。
【０００９】得られたプロモーターへの有用タンパク質
遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、自体公知の方法で
行うことができる。有用タンパク質遺伝子としては、特
に限定するものではないが、例えば、仔牛キモシン、ヒ
トＥＧＦ、各種成長ホルモン、各種インターフェロンな
どが挙げられる。また、ベクターとしては、アルギニン
要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化
などの炭素・窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性な
どの薬剤耐性遺伝子などを用いることができる。
遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、自体公知の方法で
行うことができる。有用タンパク質遺伝子としては、特
に限定するものではないが、例えば、仔牛キモシン、ヒ
トＥＧＦ、各種成長ホルモン、各種インターフェロンな
どが挙げられる。また、ベクターとしては、アルギニン
要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化
などの炭素・窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性な
どの薬剤耐性遺伝子などを用いることができる。
【００１０】宿主は、アスペルギルス属糸状菌に限定す
るものではなく、ノイロスポラ属（Neurospora）、ペニ
シリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichod
erma）なども使用できるが、発現効率の点から、上記の
ごとく、アスペルギルス属糸状菌を用いることが好まし
く、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス
・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス
・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・
ニドランスなどが挙げられる。
るものではなく、ノイロスポラ属（Neurospora）、ペニ
シリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichod
erma）なども使用できるが、発現効率の点から、上記の
ごとく、アスペルギルス属糸状菌を用いることが好まし
く、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス
・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス
・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・
ニドランスなどが挙げられる。
【００１１】これらの宿主アスペルギルス属糸状菌の形
質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該
形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に
適した培地、培養条件を適宜選択するこのにより行うこ
とができ、得られたタンパク質の採取も公知の方法で行
うことができる。
質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該
形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に
適した培地、培養条件を適宜選択するこのにより行うこ
とができ、得られたタンパク質の採取も公知の方法で行
うことができる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、これに限定されるものではない。 実施例１ アスペルギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列の
クローニング 選択マーカーとして、アスペルギルス・ニドランス由来
のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(a
rgＢ)(バクストン（Ｂuxton）ら、ジーン（Ｇene）第３
７巻、２０７頁(１９８５年))およびＡＭＡ１配列を組
み込み、さらにレポーター遺伝子としてβ−グルクロニ
ダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を組み込んだ、ＢamＨＩサイト
をユニークサイトとするブルースクリプト（Ｂluescrip
t）ＩＩ誘導体のプロモーター検索用プラスミドを２種
類構築した(pＢＸＧＡlおよびpＢＧＡＲ)。それぞれの
ＢamＨＩサイトに、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４２
９０とアスペルギルス・ニガーＩＦＯ４６３４の染色体
ＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡＩで部分分解したＤＮＡ断片
(０．５〜２ Ｋbp)を挿入したプラスミドライブラリー
を４種類作成した。それぞれのプラスミドＤＮＡを調製
後、argＢ-株のアスペルギルス・オリゼ(ＩＦＯ５２４
０から変異処理により取得)とアスペルギルス・ニガー
(ＡＴＣＣ２０７３９)をヤタラーゼ[Ｙatalase(宝酒造
製)]を用いてプロトプラスト化し、ＰＥＧ−ＣaＣl2存
在下で上記プラスミドＤＮＡと混合した。スクリーニン
グ用培地として、炭素源としてグルコース、マルトー
ス、スターチと変化させた最少培地(Ｃzapek−Ｄox)
に、スタビライザーとして０．８ＭのＮaＣlとβ−グル
クロニダーゼが発現するとき青色の色素を生産するＸ−
グルクロナイドを含むプレートに重層後、３０℃の恒温
槽で数日間培養後、青色に発色するコロニーを選択し
た。このうち２４株の青色を示す形質転換株をスクリー
ニングし、炭素源をグルコースとスターチの２種類の最
少培地で２４株を培養後、菌体内のβ−グルクロニダー
ゼの酵素活性を最も強く発現している形質転換株を選択
し、Ｎｏ．８株と命名した。Ｎｏ．８株は、アスペルギ
ルス・ニガー由来のプロモーター領域を含む配列を上記
ｐＢＸＧＡ１のＢａｍＨＩサイトに組み込んだベクター
により形質転換したアスペルギルス・オリゼであり、ア
スペルギリス オリゼＮＰ−８と命名し、平成５年８月
５日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所の受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７８５の下、寄託してある。
説明するが、これに限定されるものではない。 実施例１ アスペルギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列の
クローニング 選択マーカーとして、アスペルギルス・ニドランス由来
のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(a
rgＢ)(バクストン（Ｂuxton）ら、ジーン（Ｇene）第３
７巻、２０７頁(１９８５年))およびＡＭＡ１配列を組
み込み、さらにレポーター遺伝子としてβ−グルクロニ
ダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を組み込んだ、ＢamＨＩサイト
をユニークサイトとするブルースクリプト（Ｂluescrip
t）ＩＩ誘導体のプロモーター検索用プラスミドを２種
類構築した(pＢＸＧＡlおよびpＢＧＡＲ)。それぞれの
ＢamＨＩサイトに、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４２
９０とアスペルギルス・ニガーＩＦＯ４６３４の染色体
ＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡＩで部分分解したＤＮＡ断片
(０．５〜２ Ｋbp)を挿入したプラスミドライブラリー
を４種類作成した。それぞれのプラスミドＤＮＡを調製
後、argＢ-株のアスペルギルス・オリゼ(ＩＦＯ５２４
０から変異処理により取得)とアスペルギルス・ニガー
(ＡＴＣＣ２０７３９)をヤタラーゼ[Ｙatalase(宝酒造
製)]を用いてプロトプラスト化し、ＰＥＧ−ＣaＣl2存
在下で上記プラスミドＤＮＡと混合した。スクリーニン
グ用培地として、炭素源としてグルコース、マルトー
ス、スターチと変化させた最少培地(Ｃzapek−Ｄox)
に、スタビライザーとして０．８ＭのＮaＣlとβ−グル
クロニダーゼが発現するとき青色の色素を生産するＸ−
グルクロナイドを含むプレートに重層後、３０℃の恒温
槽で数日間培養後、青色に発色するコロニーを選択し
た。このうち２４株の青色を示す形質転換株をスクリー
ニングし、炭素源をグルコースとスターチの２種類の最
少培地で２４株を培養後、菌体内のβ−グルクロニダー
ゼの酵素活性を最も強く発現している形質転換株を選択
し、Ｎｏ．８株と命名した。Ｎｏ．８株は、アスペルギ
ルス・ニガー由来のプロモーター領域を含む配列を上記
ｐＢＸＧＡ１のＢａｍＨＩサイトに組み込んだベクター
により形質転換したアスペルギルス・オリゼであり、ア
スペルギリス オリゼＮＰ−８と命名し、平成５年８月
５日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所の受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７８５の下、寄託してある。
【００１３】Ｎo．８株よりＤＮＡ画分を調製し、イー
・コリＨＢ１０１を形質転換して得られるプラスミドＤ
ＮＡよりＮo．８のプロモーター領域の入ったＸbaＩ−
ＳmaＩ断片をＢluescriptＩＩのＸbaＩ−ＳmaＩ領域に
挿入し、シークエンスを行った。その配列を配列表に示
す。この配列は、最新のデーターベースとのホモロジー
検索の結果、全く新規なＤＮＡ配列であることが判明し
た。
・コリＨＢ１０１を形質転換して得られるプラスミドＤ
ＮＡよりＮo．８のプロモーター領域の入ったＸbaＩ−
ＳmaＩ断片をＢluescriptＩＩのＸbaＩ−ＳmaＩ領域に
挿入し、シークエンスを行った。その配列を配列表に示
す。この配列は、最新のデーターベースとのホモロジー
検索の結果、全く新規なＤＮＡ配列であることが判明し
た。
【００１４】実施例２ Ｎｏ．８株によるβ−グルクロニダーゼ活性発現に及ぼ
す培地の炭素源および窒素源の影響 上記方法により取得したＮo．８のアスペルギルス・オ
リゼの形質転換株を表１に示す炭素源と窒素源で培養
後、菌体内に生産するβ−グルクロニダーゼの活性を比
較した。その結果を表１に示す。
す培地の炭素源および窒素源の影響 上記方法により取得したＮo．８のアスペルギルス・オ
リゼの形質転換株を表１に示す炭素源と窒素源で培養
後、菌体内に生産するβ−グルクロニダーゼの活性を比
較した。その結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】β−グルクロニダーゼ活性の発現誘導は、
炭素源の違いによる誘導は見られず、今までに報告され
ているα−アミラーゼ、グルコアミラーゼのアミラーゼ
系のプロモーター[タダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａgric．
Ｂiol．Ｃhem．）第５３巻、５９３頁(１９８９年)およ
びハタ（Ｈata）ら、カレント・ジェネティクス（Ｃur
r．Ｇenet．）第２２巻、８５頁(１９９２年)]とは異な
ることは、配列表のシークエンス結果からも明らかであ
る。また、窒素源による違いを調べたところ、アスパラ
ギンやカザミノ酸などの有機態のものよりも硝酸ソーダ
や硫安などの無機態の窒素源の方が高いβ−グルクロニ
ダーゼ比活性を示した。
炭素源の違いによる誘導は見られず、今までに報告され
ているα−アミラーゼ、グルコアミラーゼのアミラーゼ
系のプロモーター[タダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａgric．
Ｂiol．Ｃhem．）第５３巻、５９３頁(１９８９年)およ
びハタ（Ｈata）ら、カレント・ジェネティクス（Ｃur
r．Ｇenet．）第２２巻、８５頁(１９９２年)]とは異な
ることは、配列表のシークエンス結果からも明らかであ
る。また、窒素源による違いを調べたところ、アスパラ
ギンやカザミノ酸などの有機態のものよりも硝酸ソーダ
や硫安などの無機態の窒素源の方が高いβ−グルクロニ
ダーゼ比活性を示した。
【００１７】実施例３ 既知のプロモーターとの比較 本発明のアスペルギルス・ニガー由来の新規プロモータ
ー活性と、これまでに報告されている強力なプロモータ
ーであるアスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーター活性を、β−グルクロニダーゼ遺伝子
をレポーター遺伝子として比較した。双方ともインテグ
レート型のベクターとして比較するために、Ｎo．８の
プロモーターが入ったプラスミッド検索用ベクターから
自己複製配列であるＡＭＡ１を除き、インテグレート型
のベクターに変換してアスペルギルス・オリゼとアスペ
ルギルス・ニガーを再度形質転換した。糸状菌の形質転
換の特徴として、導入された遺伝子は、相同的な部位に
インテグレートされるだけでなく、非相同的な部位にも
何コピーもタンデムに連なってインテグレートされる。
したがって、コピー数の制御は難しいので、何個かの形
質転換株のβ−グルクロニダーゼ活性の比活性の平均を
比較した。その結果を表２に示す。
ー活性と、これまでに報告されている強力なプロモータ
ーであるアスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーター活性を、β−グルクロニダーゼ遺伝子
をレポーター遺伝子として比較した。双方ともインテグ
レート型のベクターとして比較するために、Ｎo．８の
プロモーターが入ったプラスミッド検索用ベクターから
自己複製配列であるＡＭＡ１を除き、インテグレート型
のベクターに変換してアスペルギルス・オリゼとアスペ
ルギルス・ニガーを再度形質転換した。糸状菌の形質転
換の特徴として、導入された遺伝子は、相同的な部位に
インテグレートされるだけでなく、非相同的な部位にも
何コピーもタンデムに連なってインテグレートされる。
したがって、コピー数の制御は難しいので、何個かの形
質転換株のβ−グルクロニダーゼ活性の比活性の平均を
比較した。その結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】Ｎo．８のアスペルギルス・オリゼの再形
質転換株におけるβ−グルクロニダーゼ活性の発現は、
α−アミラーゼのプロモーターとターミネーターの間に
β−グルクロニダーゼ遺伝子の構造遺伝子をそれぞれＰ
ＣＲ(サイキ（Ｓaiki）ら、サイエンス（Ｓcience）第
２３９巻、４８７頁(１９８８年))により構築し、argＢ
遺伝子のマーカーの入ったインテグレート型のベクター
に挿入したＴaka−ＧＵＳの形質転換株により、デキス
トリンあるいはデンプンを炭素源とする培地で誘導生産
される活性よりも非常に高く、１回目の形質転換では、
８株の平均で２．８倍、２回目の形質転換では、６株の
平均で４．３倍のβ−グルクロニダーゼ活性を発現して
いた。このＴaka−ＧＵＳの形質転換株における誘導、
非誘導(炭素源がグルコースの場合)のβ−グルクロニダ
ーゼ活性は、従来報告されている値[タダ（Ｔada）ら、
アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第５５巻、１９３９
頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuchiya）ら、バイオ
サイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミ
ストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．）第５６
巻、１８４９頁(１９９２年)]と同程度であった。
質転換株におけるβ−グルクロニダーゼ活性の発現は、
α−アミラーゼのプロモーターとターミネーターの間に
β−グルクロニダーゼ遺伝子の構造遺伝子をそれぞれＰ
ＣＲ(サイキ（Ｓaiki）ら、サイエンス（Ｓcience）第
２３９巻、４８７頁(１９８８年))により構築し、argＢ
遺伝子のマーカーの入ったインテグレート型のベクター
に挿入したＴaka−ＧＵＳの形質転換株により、デキス
トリンあるいはデンプンを炭素源とする培地で誘導生産
される活性よりも非常に高く、１回目の形質転換では、
８株の平均で２．８倍、２回目の形質転換では、６株の
平均で４．３倍のβ−グルクロニダーゼ活性を発現して
いた。このＴaka−ＧＵＳの形質転換株における誘導、
非誘導(炭素源がグルコースの場合)のβ−グルクロニダ
ーゼ活性は、従来報告されている値[タダ（Ｔada）ら、
アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第５５巻、１９３９
頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuchiya）ら、バイオ
サイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミ
ストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．）第５６
巻、１８４９頁(１９９２年)]と同程度であった。
【００２０】アスペルギルス・ニガーの形質転換株を用
いて同様の実験を行った。宿主のタンパクの生産能力の
差により、アスペルギルス・オリゼの宿主よりも１／１
０程度のβ−グルクロニダーゼ活性の発現量であった
が、Ｎo．８のアスペルギルス・ニガー由来の該新規プ
ロモーターが入ったものは、アスペルギルス オリゼの
α−アミラーゼのプロモーターが入ったものよりも、６
株の平均で、β−グルクロニダーゼ活性はやはり３．２
倍高くなった。このことにより、アスペルギルスの既知
のプロモーターよりも、格段に強いプロモーター配列あ
るいはＵＡＳ(Ｕpstream Ａctivation Ｓequence)配
列がアスペルギルス・オリゼ以外の菌種にも存在するこ
とが明らかとなった。上記の結果は、本発明のプロモー
ターが炭素源がグルコースでも非常に強い発現量を示す
プロモーターであることを示唆しており、ノーザンハン
ブリダイゼーションの結果においても、アスペルギルス
・ニガー由来の該新規プロモーターが挿入されたβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子の転写産物の量がアスペルギルス
・オリゼのα−アミラーゼのプロモーターの同転写産物
の量よりもはるかに多いことからも結論付けられる。
いて同様の実験を行った。宿主のタンパクの生産能力の
差により、アスペルギルス・オリゼの宿主よりも１／１
０程度のβ−グルクロニダーゼ活性の発現量であった
が、Ｎo．８のアスペルギルス・ニガー由来の該新規プ
ロモーターが入ったものは、アスペルギルス オリゼの
α−アミラーゼのプロモーターが入ったものよりも、６
株の平均で、β−グルクロニダーゼ活性はやはり３．２
倍高くなった。このことにより、アスペルギルスの既知
のプロモーターよりも、格段に強いプロモーター配列あ
るいはＵＡＳ(Ｕpstream Ａctivation Ｓequence)配
列がアスペルギルス・オリゼ以外の菌種にも存在するこ
とが明らかとなった。上記の結果は、本発明のプロモー
ターが炭素源がグルコースでも非常に強い発現量を示す
プロモーターであることを示唆しており、ノーザンハン
ブリダイゼーションの結果においても、アスペルギルス
・ニガー由来の該新規プロモーターが挿入されたβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子の転写産物の量がアスペルギルス
・オリゼのα−アミラーゼのプロモーターの同転写産物
の量よりもはるかに多いことからも結論付けられる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、アスペルギルス・ニガー
由来の新規強力プロモーターが提供され、該プロモータ
ー配列を含むベクターにより形質転換されたアスペルギ
ルスオリゼおよびニガーにおける外来性タンパク質の著
量生産が可能となる。
由来の新規強力プロモーターが提供され、該プロモータ
ー配列を含むベクターにより形質転換されたアスペルギ
ルスオリゼおよびニガーにおける外来性タンパク質の著
量生産が可能となる。
【００２２】
配列の長さ：７８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・ニガー 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 １０ ２０ ３０
４０ ５０ ６０ ５’ ＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣ ＧＡＣＴＧＣＧＡＧＧ ＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴ
ＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣ ＧＧＧＡＴＴＧＣＣＡ ＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴ ３’ ＣＴＡＧＣＣＧＡＣＧ ＣＴＧＡＣＧＣＴＣＣ ＴＡＡＡＡＴＧＡＧＡ
ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧ ＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴ ＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡ ７０ ８０ ９０
１００ １１０ １２０ ＧＧＧＡＣＴＴＣＡＣ ＡＴＣＣＴＴＴＣＧＣ ＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴ
ＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣ ＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣ ＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧ ＴＡＧＧＡＡＡＧＣＧ ＡＡＧＡＣＧＡＧＴＡ
ＧＴＴＣＣＣＧＣＣＧ ＡＧＡＣＣＣＴＣＣＧ ＣＡＣＣＣＣＧＴＡＧ １３０ １４０ １５０
１６０ １７０ １８０ ＡＧＣＧＡＣＴＡＧＣ ＴＴＧＣＧＧＡＴＡＧ ＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧ
ＧＣＧＧＴＡＧＡＡＧ ＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣ ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＴ ＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧ ＡＡＣＧＣＣＴＡＴＣ ＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣ
ＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣ ＴＡＣＣＴＣＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡ １９０ ２００ ２１０
２２０ ２３０ ２４０ ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴ ＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧ ＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧ
ＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧ ＴＡＧＧＡＧＧＧＧＡ ＴＴＴＴＴＡＧＴＴＧ ＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡ ＧＴＡＧＧＧＣＣＡＣ ＣＣＴＣＣＴＡＡＣＣ
ＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣ ＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴ ＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣ ２５０ ２６０ ２７０
２８０ ２９０ ３００ ＡＴＧＧＡＡＣＴＡＴ ＴＡＴＴＡＴＧＡＣＣ ＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧ
ＡＧＣＡＧＴＡＡＣＣ ＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧ ＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴ ＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡ ＡＴＡＡＴＡＣＴＧＧ ＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣ
ＴＣＧＴＣＡＴＴＧＧ ＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣ ＣＧＴＴＡＣＡＴＴＡ ３１０ ３２０ ３３０
３４０ ３５０ ３６０ ＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡ ＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡ ＡＴＧＣＣＴＡＧＧＡ
ＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣ ＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴ ＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴ ＴＣＡＧＴＣＴＡＡＴ ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴ ＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴ
ＡＣＧＡＴＡＧＧＴＧ ＴＴＴＴＧＧＴＣＧＡ ＡＡＡＣＣＡＣＴＴＡ ３７０ ３８０ ３９０
４００ ４１０ ４２０ ＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴ ＡＣＴＡＧＣＡＴＴＣ ＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ
ＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴ ＧＧＴＣＣＧＴＴＣＧ ＧＧＣＡＡＡＡＣＴＡ ＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡ ＴＧＡＴＣＧＴＡＡＧ ＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣ
ＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡ ＣＣＡＧＧＣＡＡＧＣ ＣＣＧＴＴＴＴＧＡＴ ４３０ ４４０ ４５０
４６０ ４７０ ４８０ ＡＣＧＡＡＧＧＡＡＣ ＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡ ＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧ
ＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧ ＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴ ＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡ ＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧ ＡＣＧＴＡＣＡＡＣＴ ＣＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
ＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣ ＧＧＧＧＴＣＧＧＡＡ ＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ ４９０ ５００ ５１０
５２０ ５３０ ５４０ ＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴ ＣＧＴＴＣＣＴＴＴＴ ＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴ
ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡ ＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣ ＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣ ＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡ ＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡ ＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡ
ＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ ＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧ ＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧ ５５０ ５６０ ５７０
５８０ ５９０ ６００ ＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣ ＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣ ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ
ＣＡＣＣＴＣＣＣＴＡ ＣＣＣＡＴＴＧＡＧＣ ＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣ ＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ ＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧ
ＧＴＧＧＡＧＧＧＡＴ ＧＧＧＴＡＡＣＴＣＧ ＴＣＴＡＡＡＡＡＧＧ ６１０ ６２０ ６３０
６４０ ６５０ ６６０ ＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ ＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣ ＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴ
ＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡ ＴＣＴＴＧＣＧＣＧＴ ＣＡＡＴＣＧＣＧＣＡ ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ ＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧ ＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡ
ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴ ＡＧＡＡＣＧＣＧＣＡ ＧＴＴＡＧＣＧＣＧＴ ６７０ ６８０ ６９０
７００ ７１０ ７２０ ＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧ ＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡ ＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴ
ＴＴＡＡＴＡＧＧＧＴ ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡ ＴＧＣＣＡＣＴＡＣＴ ＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣ ＡＧＴＣＧＴＡＣＣＴ ＡＴＡＣＴＴＧＧＴＡ
ＡＡＴＴＡＴＣＣＣＡ ＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴ ＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡ ７３０ ７４０ ７５０
７６０ ７７０ ７８０ ＧＧＴＣＴＧＡＡＣＣ ＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧ ＣＧＧＣＴＡＧＧＣＧ
ＧＧＡＧＴＴＡＡＣＡ ＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣ ＡＧＣＧＴＴＴＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧ ＴＣＣＣＡＡＡＣＡＣ ＧＣＣＧＡＴＣＣＧＣ
ＣＣＴＣＡＡＴＴＧＴ ＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧ ＴＣＧＣＡＡＡＧＴＴ ＣＣＴＧＡＴＣ ３’ ＧＧＡＣＴＡＧ ５’
４０ ５０ ６０ ５’ ＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣ ＧＡＣＴＧＣＧＡＧＧ ＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴ
ＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣ ＧＧＧＡＴＴＧＣＣＡ ＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴ ３’ ＣＴＡＧＣＣＧＡＣＧ ＣＴＧＡＣＧＣＴＣＣ ＴＡＡＡＡＴＧＡＧＡ
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ＧＴＴＣＣＣＧＣＣＧ ＡＧＡＣＣＣＴＣＣＧ ＣＡＣＣＣＣＧＴＡＧ １３０ １４０ １５０
１６０ １７０ １８０ ＡＧＣＧＡＣＴＡＧＣ ＴＴＧＣＧＧＡＴＡＧ ＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧ
ＧＣＧＧＴＡＧＡＡＧ ＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣ ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＴ ＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧ ＡＡＣＧＣＣＴＡＴＣ ＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣ
ＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣ ＴＡＣＣＴＣＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡ １９０ ２００ ２１０
２２０ ２３０ ２４０ ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴ ＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧ ＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧ
ＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧ ＴＡＧＧＡＧＧＧＧＡ ＴＴＴＴＴＡＧＴＴＧ ＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡ ＧＴＡＧＧＧＣＣＡＣ ＣＣＴＣＣＴＡＡＣＣ
ＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣ ＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴ ＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣ ２５０ ２６０ ２７０
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ＡＧＣＡＧＴＡＡＣＣ ＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧ ＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴ ＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡ ＡＴＡＡＴＡＣＴＧＧ ＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣ
ＴＣＧＴＣＡＴＴＧＧ ＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣ ＣＧＴＴＡＣＡＴＴＡ ３１０ ３２０ ３３０
３４０ ３５０ ３６０ ＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡ ＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡ ＡＴＧＣＣＴＡＧＧＡ
ＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣ ＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴ ＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴ ＴＣＡＧＴＣＴＡＡＴ ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴ ＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴ
ＡＣＧＡＴＡＧＧＴＧ ＴＴＴＴＧＧＴＣＧＡ ＡＡＡＣＣＡＣＴＴＡ ３７０ ３８０ ３９０
４００ ４１０ ４２０ ＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴ ＡＣＴＡＧＣＡＴＴＣ ＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ
ＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴ ＧＧＴＣＣＧＴＴＣＧ ＧＧＣＡＡＡＡＣＴＡ ＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡ ＴＧＡＴＣＧＴＡＡＧ ＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣ
ＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡ ＣＣＡＧＧＣＡＡＧＣ ＣＣＧＴＴＴＴＧＡＴ ４３０ ４４０ ４５０
４６０ ４７０ ４８０ ＡＣＧＡＡＧＧＡＡＣ ＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡ ＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧ
ＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧ ＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴ ＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡ ＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧ ＡＣＧＴＡＣＡＡＣＴ ＣＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
ＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣ ＧＧＧＧＴＣＧＧＡＡ ＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ ４９０ ５００ ５１０
５２０ ５３０ ５４０ ＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴ ＣＧＴＴＣＣＴＴＴＴ ＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴ
ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡ ＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣ ＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣ ＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡ ＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡ ＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡ
ＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ ＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧ ＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧ ５５０ ５６０ ５７０
５８０ ５９０ ６００ ＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣ ＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣ ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ
ＣＡＣＣＴＣＣＣＴＡ ＣＣＣＡＴＴＧＡＧＣ ＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣ ＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ ＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧ
ＧＴＧＧＡＧＧＧＡＴ ＧＧＧＴＡＡＣＴＣＧ ＴＣＴＡＡＡＡＡＧＧ ６１０ ６２０ ６３０
６４０ ６５０ ６６０ ＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ ＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣ ＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴ
ＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡ ＴＣＴＴＧＣＧＣＧＴ ＣＡＡＴＣＧＣＧＣＡ ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ ＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧ ＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡ
ＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴ ＡＧＡＡＣＧＣＧＣＡ ＧＴＴＡＧＣＧＣＧＴ ６７０ ６８０ ６９０
７００ ７１０ ７２０ ＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧ ＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡ ＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴ
ＴＴＡＡＴＡＧＧＧＴ ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡ ＴＧＣＣＡＣＴＡＣＴ ＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣ ＡＧＴＣＧＴＡＣＣＴ ＡＴＡＣＴＴＧＧＴＡ
ＡＡＴＴＡＴＣＣＣＡ ＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴ ＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡ ７３０ ７４０ ７５０
７６０ ７７０ ７８０ ＧＧＴＣＴＧＡＡＣＣ ＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧ ＣＧＧＣＴＡＧＧＣＧ
ＧＧＡＧＴＴＡＡＣＡ ＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣ ＡＧＣＧＴＴＴＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧ ＴＣＣＣＡＡＡＣＡＣ ＧＣＣＧＡＴＣＣＧＣ
ＣＣＴＣＡＡＴＴＧＴ ＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧ ＴＣＧＣＡＡＡＧＴＴ ＣＣＴＧＡＴＣ ３’ ＧＧＡＣＴＡＧ ５’
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】これらの宿主アスペルギルス属糸状菌の形
質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該
形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に
適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うこ
とができ、得られたタンパク質の採取も公知の方法で行
うことができる。
質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該
形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に
適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うこ
とができ、得られたタンパク質の採取も公知の方法で行
うことができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【表２】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:685） (72)発明者 布川 彌太郎 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表に示した塩基配列で表されるＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡからなるプロモー
ター。 - 【請求項３】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）由来である請求項２記載のプロモーター。 - 【請求項４】 アスペルギルス・ニガーにおいて高発現
する請求項２記載のプロモーター。 - 【請求項５】 アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
oryzae）において高発現する請求項２記載プロモータ
ー。 - 【請求項６】 請求項２記載のプロモーターを挿入した
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ。 - 【請求項７】 請求項２記載のプロモーターを挿入した
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・ニガー。 - 【請求項８】 請求項６記載のアスペルギルス・オリゼ
を培養し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取する
ことを特徴とする有用タンパク質の製造法。 - 【請求項９】 請求項７記載のアスペルギルス・ニガー
を培養し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取する
ことを特徴とする有用タンパク質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21265893A JP3372087B2 (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21265893A JP3372087B2 (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759571A true JPH0759571A (ja) | 1995-03-07 |
| JP3372087B2 JP3372087B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=16626268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21265893A Expired - Lifetime JP3372087B2 (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3372087B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006054997A1 (en) * | 2004-11-18 | 2006-05-26 | Genencor International, Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
| KR100676183B1 (ko) * | 2004-05-14 | 2007-01-30 | 채건상 | 아스퍼질러스 오리재 유래의 프로모터의 활성을 나타내는엠에이취에이 유전자 |
| US7378256B2 (en) | 2004-11-18 | 2008-05-27 | Genencor International, Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
-
1993
- 1993-08-27 JP JP21265893A patent/JP3372087B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100676183B1 (ko) * | 2004-05-14 | 2007-01-30 | 채건상 | 아스퍼질러스 오리재 유래의 프로모터의 활성을 나타내는엠에이취에이 유전자 |
| WO2006054997A1 (en) * | 2004-11-18 | 2006-05-26 | Genencor International, Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
| US7378256B2 (en) | 2004-11-18 | 2008-05-27 | Genencor International, Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
| US8008042B2 (en) | 2004-11-18 | 2011-08-30 | Danisco Us Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3372087B2 (ja) | 2003-01-27 |
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