JP2002101888A - アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するｄｎａ結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するＤ
ＮＡ結合タンパク質ＡｏｐａｃＣをコードする遺伝子を
単離し、その塩基配列が決定され、また、該タンパク質
のアミノ酸配列が明らかにされた。 【効果】 該遺伝子を利用することにより、アルカリプ
ロテアーゼの効率的生産が可能となっただけでなく、該
遺伝子にストップコドンを導入することにより、醤油麹
等弱酸性培地でも該酵素を高生産することができ、醤油
や味噌等の醸造を効率的に行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、麹菌アスペルギル
ス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するＤ
ＮＡ結合タンパク質に対応するアミノ酸配列及び本ＤＮ
Ａ結合タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡおよび該遺
伝子を使用した麹菌の育種方法に関わるものである。

【０００２】

【従来の技術】醤油の味を決定している主な因子は、ア
ミノ酸であり、そのアミノ酸は小麦や大豆に含まれるタ
ンパク質が分解され生じる。また、醤油醸造において、
原料中のタンパク質をいかに効率よく利用するかという
問題は、コスト削減という面で重要である。これらに関
して、重要な役割を演じているのはアルカリプロテアー
ゼ等のタンパク質分解酵素である。特にアルカリプロテ
アーゼは、原料中のタンパク質を効率よく利用するため
には、最も有効であると考えられている。

【０００３】これまでは、アルカリプロテアーゼの大量
生産株の育種には、掛け合わせ等の方法が用いられてき
た。しかし、従来の育種法は、操作が煩雑であり、膨大
な労力を要する。さらに過剰にアルカリプロテアーゼが
生産されると、最終的にオリの原因となり醤油の品質を
低下させる原因となる。そのため、アルカリプロテアー
ゼの生産量を人為的にコントロールする事が必要である
が、従来の育種法では困難である。そこで、アルカリプ
ロテアーゼの発現を制御するタンパク質の遺伝子を得
て、アルカリプロテアーゼの生産量を人為的にコントロ
ールすることが有効であると考えられる。

【０００４】アスペルギルス・オリゼに近縁種であるア
スペルギルス・ニドランスのアルカリプロテアーゼは、
アルカリ環境下で誘導発現することが知られており、そ
のプロモーター上にはＤＮＡ結合タンパク質ｐａｃＣの
結合する配列が存在する。さらにアスペルギルス・オリ
ゼのアルカリプロテアーゼのプロモーターにもｐａｃＣ
タンパク質が結合すると考えられる配列が存在するため
アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼもｐａ
ｃＣタンパク質によって発現を制御されていると考えら
れるが、アスペルギルス・オリゼのｐａｃＣ（以下、Ａ
ｏｐａｃＣ）遺伝子は、未だに得られていない。ｐａｃ
Ｃ遺伝子を用いて、アスペルギルス・オリゼを醤油やみ
そなどの醸造産業に適した性質を持つように育種する際
には、安心・安全という観点からアスペルギルス・オリ
ゼ自身の遺伝子を用いることが重要である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】醤油醸造などの醸造産
業に重要な役割を演じているアルカリプロテアーゼの発
現を人為的にコントロールするためには、アルカリプロ
テアーゼの発現を制御するＤＮＡ結合タンパク質ｐａｃ
Ｃの遺伝子を得て、アルカリプロテアーゼの生産量をコ
ントロールすることが有効であると考えられる。特に弱
酸性の環境である醤油麹において、アルカリプロテアー
ゼ生産量を増強することによって、原料窒素の利用率向
上が期待できる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記現状
に鑑み、各方面から検討した結果、アルカリプロテアー
ゼの生産を制御するためには遺伝子工学的手法による方
法が最適であるとの知見を得た。そして、本発明者ら
は、鋭意研究の結果、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来
のアルカリプロテアーゼの生産量を制御する事のできる
ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列を明らかにし、該
アミノ酸配列に対応する塩基配列を決定した。さらに、
該遺伝子に変異を導入し、それを導入してなる形質転換
株を作製することによって、アルカリプロテアーゼを弱
酸性の環境下においてもアルカリ環境下で培養した際と
同程度まで生産させることに成功し、本発明の成功に至
った。以下、本発明について記述する。

【０００７】本発明に係る遺伝子をクローニングするた
め、先ず、アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡを鋳
型とし、アスペルギルス・ニガーのｐａｃＣの遺伝子の
塩基配列を元に設計したプライマーを用いて、ＰＣＲに
よって本遺伝子の一部領域を増幅した。さらに得られた
領域の塩基配列を元にプライマーを設計し、得られた一
部領域の上流領域及び下流領域をＰＣＲにより増幅し
た。その後、上流及び下流領域断片の塩基配列を決定す
ることによって、本遺伝子の全塩基配列を明らかにし
た。次に本遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を明らかにする
ために、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅し、その
断片の塩基配列を決定した。

【０００８】その結果、本遺伝子は、２１８２ｂｐ（開
始コドンＡＴＧ：終止コドンＴＡＡ）からなり、イント
ロンが２つ存在していることが明らかとなった。そして
ｃＤＮＡには、１９８９ｂｐからなるオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ：読み枠（ＡＴＧ〜ＴＡＡ））が
存在し、６６２アミノ酸、約７１ｋＤａのタンパク質を
コードしていることが判明した。本タンパク質のアミノ
酸配列を解析した結果、本タンパク質のＮ末端付近に
は、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ）と呼
ばれるＤＮＡに結合するための機能領域が存在してい
た。また、Ｂｌａｓｔによる検索の結果、本タンパク質
のアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・ニ
ドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎ
ｓ）のｐａｃＣタンパク質のアミノ酸配列と高いホモロ
ジーを有していることから、本遺伝子は、ＡｏｐａｃＣ
遺伝子であると推察された。

【０００９】ｐａｃＣタンパク質は、アスペルギルス・
ニガー及びアスペルギルス・ニドランスにおいて、よく
研究されており、ｐＨ応答に関与するＤＮＡ結合タンパ
ク質である。周辺環境のｐＨがアルカリ性になるとＣ末
端が欠失し、活性型となり、アルカリプロテアーゼ等の
アルカリ性の環境下で働く遺伝子の転写を活性化させ
る。また、人為的にＣ末端を欠失させると、常に標的タ
ンパク質の転写を活性化されることが知られている。

【００１０】そこで本発明者らは、本遺伝子においてス
トップコドンを導入することにより、発現した場合Ｃ末
端を持たないＡｏｐａｃＣタンパク質が生産されるよう
にした遺伝子（以下、ＧｐａｃＣＭ）を構築した。次い
で、ＧｐａｃＣＭ、ストップコドンを導入していない遺
伝子（以下、ＧｐａｃＣ）を、それぞれ、アスペルギル
ス・オリゼに導入し、ｐＨ６．０及びｐＨ８．０の培地
で培養し、その際の各形質転換株のアルカリプロテアー
ゼ活性を比較した。

【００１１】その結果、ＧｐａｃＣを導入した株及び野
生株は、ｐＨ６．０の培地で培養した場合、ｐＨ８．０
の培地で培養した場合に比べて、約１／７量のアルカリ
プロテアーゼ活性しか示さなかったが、ＧｐａｃＣＭを
導入した株はｐＨ８．０及びｐＨ６．０の培地ともに同
程度のアルカリプロテアーゼ活性を示した。さらにこれ
らの形質転換株を醤油麹培地で培養した際のアルカリプ
ロテアーゼ活性を測定した結果、ＧｐａｃＣＭを導入し
た形質転換株では約ｐＨ６．５の醤油麹培地においても
アルカリプロテアーゼが大量に生産させることを確認し
た。なお、ＧｐａｃＣ導入株は親株に比して多量のアル
カリプロテアーゼを生産させることも確認された。

【００１２】

【実施例】以下にアルカリプロテアーゼの発現を制御す
るＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子の単離及び塩基配列及
び対応するアミノ酸配列を実施例によって示すが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

【００１３】（１）アスペルギルス・ニガーｐａｃＣ遺
伝子の塩基配列に基づいたＡｏｐａｃＣ遺伝子の部分配
列の決定 アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（ＡＴＣＣ ４２
１４９）の胞子をＹＰＤ（その培地組成を下記表１に示
す）１００ｍｌに植菌し、３０℃で一晩振とう培養し
た。その後、飯村の方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，３２３−３２８，５１（１９８７））に従って
菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。ついでこの染色体Ｄ
ＮＡを鋳型として、アスペルギルス・ニガーの塩基配列
に基づいて合成した配列番号１（図１）と配列番号２
（図２）に示したミックスプライマーを用いてＰＣＲを
行った。このＰＣＲによった増幅した約８３０ｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、回収した
後、この断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔを用いてクローニン
グした。その後、クローニングした断片の塩基配列を決
定し、Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈによって解析した結
果、この断片がアスペルギルス・ニガーｐａｃＣ遺伝子
に対して高いホモロジーを有していることを確認した。

【００１４】（表１）ＹＰＤ１Ｌ グルコース ２０ｇ 酵母エキス ５ｇ パクトペプトン １０ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ

【００１５】（２）ＡｏｐａｃＣ遺伝子の全塩基配列の
決定 Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ ｋ
ｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用し、作製したアス
ペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡライブラリーを用い
て、ＡｏｐａｃＣの上流領域（以下、ＡｏｐａｃＣ−
５′）および下流領域（以下、ＡｏｐａｃＣ−３′）を
取得した。すなわち、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＶ，Ｓｃ
ａＩ，ＤｒａＩ，ＰｖｕIIあるいはＳｓｐＩ等のそれぞ
れの制限酵素で完全消化した後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ ｋｉｔに添付のアダプタ
ーをＴ４リガーゼを用いて連結し、ＰＣＲ用の染色体Ｄ
ＮＡライブラリー５種類（すなわち、ＥｃｏＲＶライブ
ラリー、ＳｃａＩ：ライブラリー、ＤｒａＩライブラリ
ー、ＰｖｕIIライブラリー、ＳｓｐＩライブラリー）を
作製した。

【００１６】これらのライブラリーを鋳型として、既に
決定しているＡｏｐａｃＣ部分配列の塩基配列から合成
したプライマー（配列番号３あるいは４）およびアダプ
ターに特異的にアニーリングするプライマー（配列番号
５：図５）を用いてＰＣＲを行った。ＡｏｐａｃＣ−
５′の取得には配列番号３（図３）のプライマーを、Ａ
ｏｐａｃＣ−３′の取得には配列番号４（図４）のプラ
イマーを使用した。ＰＣＲの結果、ＥｃｏＲＶライブラ
リーを使用しＡｏｐａｃＣ−５′の約２．８ｋｂｐが、
ＤｒａＩライブラリーを使用しＡｏｐａｃＣ−３′の約
２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された（図２７）。つ
いでこれらＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳
動に供し、回収した後、この断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ
を用いてクローニングし、部分塩基配列を決定した。そ
の後、これらの配列をコンピューター解析により連結
し、連結した配列をアスペルギルス・オリゼｐａｃＣ遺
伝子の全長の配列（配列番号６：図６、図７、図８）と
した。

【００１７】（３）ＡｏｐａｃＣ ｃＤＮＡの増幅と塩
基配列決定 本タンパク質遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を決定するた
めにＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を試みた。すな
わち、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（ＡＴＣＣ
４２１４９）の胞子を最小培地（その培地組成を下記
表２に示す）１００ｍｌで３０℃、２０時間振とう培養
した後、菌体をＢ培地（組成は後記）に移し、３０℃、
６時間さらに培養した。その後、菌体を回収し、Ｃｈｉ
ｇｗｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８
５２９４−５２９９、（１９７９））に従ってｔｏｔａ
ｌ ＲＮＡを得、その後オリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム（アマシャム社）を使用してｍＲＮＡを取得した。そ
の後Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲ Ｂｅａｄ
ｓ（アマシャム社）を使用して本タンパク質遺伝子のｃ
ＤＮＡを５′上流領域および３′下流領域にわけ、増幅
した。

【００１８】（表２）最小培地１Ｌ（ｐＨ６．５） グルコース １０ｇ ＮａＮＯ₃ ６ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ ＫＣｌ ０．５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ trace element solution １．５ｍＬtrace element solution 1L Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ ０．０４ｇ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．４ｇ ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂Ｏ（ｎ＝４〜６） ０．８ｇ Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．８ｇ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ８ｈ ＦｅＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ（ferric） １．２３ｇ

【００１９】５′上流領域の増幅に使用したプライマー
は、配列番号７（図９）と８（図１０）であり、３′上
流領域の増幅に使用したプライマーは、配列番号９（図
１１）と１０（図１２）である。ＰＣＲによって増幅し
た５′上流領域約２．３ｋｂｐと３′下流領域約１．５
ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動
に供し、回収した後、この断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔを
用いてクローニングし、塩基配列を決定した。その後、
これらの配列をコンピューター解析により連結し、連結
した配列をＡｏｐａｃＣ ｃＤＮＡの全長の配列（配列
番号１１：図１３、図１４）とした。さらにこのｃＤＮ
Ａの塩基配列を解析した結果、１９８９ｂｐからなるオ
ープンリーディングフレームの存在が明らかとなった。

【００２０】上述した塩基配列の決定により得られた染
色体ＤＮＡ由来の本タンパク質遺伝子およびｃＤＮＡを
比較した結果、染色体ＤＮＡ上の本遺伝子は、２１８２
ｂｐからなり（開始コドンＡＴＧ〜終止コドンＴＡＡ：
配列番号６：図６、図７、図８）、９４ｂｐと５６ｂｐ
の２つのイントロンの存在が確認された。図６〜図８中
の大文字アルファベットは、アミノ酸に翻訳される領域
を示す。また、ｃＤＮＡの塩基配列からアミノ酸配列を
推定し（配列番号１２：図１５、図１６）、解析した結
果、本タンパク質のＮ末端付近には、本タンパク質がＤ
ＮＡ結合タンパク質であることを示すジンクフィンガー
（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ）構造が存在していた。さら
に、推定されたアミノ酸配列をＢｌａｓｔ ｓｅａｒｃ
ｈによって解析した結果、本タンパク質がアスペルギル
ス・ニガーおよびアスペルギルス・ニドランスのｐａｃ
Ｃタンパク質と高いホモロジーを示したことから、本遺
伝子がＡｏｐａｃＣ遺伝子であると結論付けた。

【００２１】（４）染色体由来のＡｏｐａｃＣ遺伝子の
増幅および変異ＡｏｐａｃＣ遺伝子の作製 先に得られたＡｏｐａｃＣ遺伝子の塩基配列を基に配列
番号１３（図１７）と１４（図１８）に示されるＧｐａ
ｃＣ−Ｍ１とＧｐａｃＣ−ＲＶプライマーを作製し、ア
スペルギルス・オリゼＫＢＮ６１６（ＦＥＲＭ Ｐ−１
７３３３）の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって
ＡｏｐａｃＣ遺伝子領域（ＧｐａｃＣ：約３．４ｋｂ
ｐ）を増幅した。

【００２２】Ｃ末端が欠失したＡｏｐａｃＣを発現させ
るために、変異ＡｏｐａｃＣ遺伝子（以下、ＧｐａｃＣ
Ｍ）を作製した。すなわち、アスペルギルス・オリゼＫ
ＢＮ６１６の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３
と１６（図２０）に示されるＧｐａｃＣ−Ｍ１とＧｐａ
ｃＣＭ−ＭＲを使用し約１．８５ｋｂｐの断片を、配列
番号１４と１５（図１９）に示されるＧｐａｃＣ−ＲＶ
とＧｐａｃＣＭ−ＭＭを使用し約１．６ｋｂｐの断片を
増幅した。それらの断片をアガロースゲル電気泳動に供
し、アマシャム社製のＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ
Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔを用いて回収した。

【００２３】その後、これらの断片を鋳型として、Ｇｐ
ａｃＣ−Ｍ１とＧｐａｃＣ−ＲＶプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、ＧｐａｃＣＭを増幅し、停止コドンを導入
した（ＧＡＧをＴＡＧに変更：図２２）。ＧｐａｃＣＭ
上の変異導入領域（ＡＣＴＡＧＴ：図２２）は、Ｓｐｅ
Ｉで切断が可能となり、これによってＧｐａｃＣと区別
する事が可能である。ＧｐａｃＣＭの塩基配列を配列番
号１７（図２１、図２２、図２３）に、またＧｐａｃＣ
Ｍによって発現する変異ＡｏｐａｃＣのアミノ酸配列を
配列番号１８（図２４）に示す。図２１〜２３中の大文
字の領域は、翻訳される領域を示す。

【００２４】（５）ＧｐａｃＣおよびＧｐａｃＣＭのア
スペルギルス・オリゼへの導入 本遺伝子を効率よくアスペルギルス・オリゼＫＢＮ６１
６株に導入するために、まずＵｎｋｌｅらの方法（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４１
（１９８９））を用いて、硝酸還元酵素遺伝子（以下、
ｎｉａＤ）の変異によって、亜硝酸要求性を示すアスペ
ルギルス・オリゼＫＢＮ６１６−３９株を作製した。次
に、組換えプラスミドｐＧｐａｃＣ−ｎｉａＤおよびｐ
ＧｐａｃＣＭ−ｎｉａＤ（図２８）をそれぞれ構築し
た。

【００２５】構築方法は、まず、すでにＧｅｎＢａｎｋ
等に登録されているアスペルギルス・オリゼ由来のｎｉ
ａＤの塩基配列を基に配列番号１９（図２５）と２０
（図２６）に示されるｎｉａＤ−Ｍ１とｎｉａＤ−ＲＶ
プライマーを作製し、アスペルギルス・オリゼＫＢＮ６
１６の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｎｉａ
Ｄ（約５．２ｋｂｐ）を取得した。ついで得られたｎｉ
ａＤを制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理し、ｐＵＣ１１８の
ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローニングし、ｐｎｉａＤ
（図２８）を構築した。次に、先に作製したＧｐａｃＣ
およびＧｐａｃＣＭをＰｓｔＩで処理し、両断片をそれ
ぞれｐｎｉａＤのＰｓｔＩサイトに導入し、ｐＧｐａｃ
Ｃ−ｎｉａＤおよびｐＧｐａｃＣＭ−ｎｉａＤをそれぞ
れ構築した。

【００２６】このようにして得られたｐＧｐａｃＣ−ｎ
ｉａＤあるいは、ｐＧｐａｃＣＭ−ｎｉａＤをアスペル
ギルス・オリゼＫＢＮ６１６−３９株にＢａｌｌａｎｃ
ｅとＴｕｒｎｅｒの方法（Ｇｅｎｅ，３６，３２１（１
９８５))により導入した。その結果、それぞれ約６０株
の形質転換体を得た。その中から各１０株を選択し、そ
れぞれをＡ培地およびＢ培地（培地組成を下記表３に示
す）で３０℃、５日間培養した後、培養上清のアルカリ
プロテアーゼ活性を牛島らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ，５４（７）,１６６７〜１６７６（１９
９０）)にしたがって測定した。

【００２７】（表３）Ａ培地（ｐＨ６．０） 最小培地＋１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０） ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸Ｂ培地（ｐＨ８．０） 最小培地＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）

【００２８】その結果、ｐＧｐａｃＣ−ｎｉａＤを導入
した１０株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値は、Ａ
培地で３０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Ｂ培地で２１０ｕｎｉｔ
ｓ／ｍＬであった。さらに、ｐＧｐａｃＣＭ−ｎｉａＤ
を導入した１０株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値
は、Ａ培地で２８０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Ｂ培地で３００
ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、ｐＨ８．０およびｐＨ６．０
の培地の場合でもアスペルギルス・オリゼＫＢＮ６１６
株のアルカリプロテアーゼ活性よりも優位に増加してい
た。

【００２９】これらの形質転換体の内、発現プラスミド
ｐＧｐａｃＣ−ｎｉａＤ及びｐＧｐａｃＣＭ−ｎｉａＤ
をそれぞれ導入した形質転換体をアスペルギルス・オリ
ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＰＣＣ及
びＰＣＣＭと命名し、アスペルギルス・オリゼＰＣＣＭ
を工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−
１８０６０として寄託した。

【００３０】（６）アスペルギルス・オリゼＰＣＣ及び
アスペルギルス・オリゼＰＣＣＭの醤油麹培地でのアル
カリプロテアーゼ活性の比較 アスペルギルス・オリゼＰＣＣあるいはアスペルギルス
・オリゼＰＣＣＭ(ＦＥＲＭ Ｐ−？？？？？)を醤油麹
培地（培地組成を下記表４に示す）で培養し、アルカリ
プロテアーゼ活性を測定した。すなわち、醤油麹培地に
１０⁴／ｇ個の胞子を植菌後、３０℃で２８時間培養
後、２５℃で１７時間培養した。その後、培地５ｇに滅
菌水５０ｍＬを加え、アスペルギルス・オリゼの生産す
る酵素を抽出した後、アルカリプロテアーゼ活性および
ｐＨを測定した。その結果を表５に示す。アスペルギル
ス・オリゼＰＣＣＭは、親株アスペルギルス・オリゼＫ
ＢＮ６１６（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３３）及びアスペル
ギルス・オリゼＰＣＣに比べ、アルカリプロテアーゼを
優位に多量に生産していることが確認された。なお、ア
スペルギルス・オリゼＰＣＣも親株に比して、アルカリ
プロテアーゼを多量に生産していることも確認された。

【００３１】（表４）醤油麹培地 脱脂加工大豆 １０ｇ 焙煎割砕小麦 １０ｇ Ｈ₂Ｏ １５ｍＬ

【００３２】 （表５） 各形質転換株のＡ、Ｂ及び醤油麹培地でのアルカリプロテアーゼ活性値 ──────────────────────────────────── Ａ培地 Ｂ培地 醤油麹培地 醤油麹培地 (pH6.0) (pH8.0) 最終ｐＨ ──────────────────────────────────── A.oryzae ２０ １５０ ７００ KBN616-39 (unit/mL (unit/mL (unit/g ６．４８ (対照) 培養上清) 培養上清) 醤油麹) ──────────────────────────────────── A.oryzae KBN616-39 ３０ ２１０ ８３０ ６．４６ +pGpacC-niaD ──────────────────────────────────── A.oryzae KBN616-39 ２８０ ３００ １２００ ６．４９ +pGpacCM-niaD ────────────────────────────────────

【００３３】

【発明の効果】本発明によって、アルカリプロテアーゼ
生産量をコントロールするタンパク質ＡｏｐａｃＣの遺
伝子およびアミノ酸配列を明らかにした。さらに構造遺
伝子の途中にストップコドンを導入し、Ｃ末端の欠失し
たＡｏｐａｃＣタンパク質を菌体内で発現させることに
よって、弱酸性の培地（醤油麹培地）において、アルカ
リプロテアーゼの活性が増強した株を得ることができ
た。この方法に従って、麹菌を育種し醤油やみそなどの
醸造産業に利用することによって、原料窒素の利用率を
向上させることが期待できるだけでなく、アルカリプロ
テアーゼ自体を効率的に製造することもでき、試薬その
他の用途に広範に利用できる。

【００３４】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ 〈110〉 Secretary of Agency of Industrial Science and Technology; Higeta Shoyu Co., Ltd. 〈120〉 Gene Encoding DNA-binding Protein, Regulating Alkalineprotease Gene Expression, Amino Acid Sequence Thereof, And Method of Producing A Large Amount of Alkaline protease by Using Said Gene 〈130〉 6373 〈141〉 2000-9-29 〈160〉 20 〈210〉 1 〈211〉 37 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 1 gaacatgtst gcgagcgtca cgtyggccgm aagagca 37 〈210〉 2 〈211〉 39 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 2 catctgctgc aggaactgrt cratgttgat caagtcgtt 39 〈210〉 3 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 3 gaaggccttt ccacagaagt cacacttgtg 30 〈210〉 4 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 4 cacaagtgtg acttctgtgg aaaggccttc 30 〈210〉 5 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 5 gtaatacgac tcactatagg gc 22 〈210〉 6 〈211〉 3399 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 6 acccccgtct ttccagggtc tgattggcgc taacccatca cttttgtaag cggggcccga -835 gggttcgcag gtctccggta atgctgttgt atggtacgtt tcaggtcggc tgccgatcgt -775 gacatgtgga cactatattg gggaataata ttgagttaag tagtgtcatt ctgacggtgc -715 attggaggta tcattctgag aaacgaatcc gtttccaggg gattgattat gccaggttgc -655 ctttctcctt tttcccattt tgtttttttc tttctccttg ctttgctagt aagatgtgtc -595 cactcttcct gtgaaatatt acggagtaga acaaggaaaa aagtggtggc ctaattttcc -535 tgcacgtgcg gtatcgtacc agaccaatac gggaagtaag gagcgccaca gccccgcatc -475 attcttggcc cggtcttgtc gtcttgtccc tgtcctccgc cgggctgtgc aagcggtctt -415 ttctgggcaa ggctcggctc cggatgtccg cacaggacaa gaacccaagc ctccccctct -355 tgcttccaag acttcctctc ttcttatctc tccccatatt tccccctgaa ttgtcctgtc -295 tgtctttttc ccagtcttcc cttcactccc ccctttcatt tatatcatct tgtgtttttc -235 acaacagttc tatattcggt aacatacgcg tgttgcattg gtagttgttg tcattgccaa -175 ctcatcgcgt cttaccttct ctccccatcc ctgatcttcc ttattagcca gaagtccctt -115 ggcttggaca tctttggttg tctattgagg aacatcccac ttggtttgac ttgtattgag -55 tcctttcacg acgacttccg ctcccaagaa aagggacaag aaattttctt ggcaatgtcg 6 gaaccccaag acaccacttc cccttcgact gcggctgctc ctattgccgc gtcgacttcg 66 catgagcaac cccaaaccca gtcgccgcct caagtctctg ctaccacgac atcctcggtg 126 acggcaaccg cagccgcagc gaccgcagct gtggcatctc cccctgttaa tggtgctgcg 186 cgcccgaccg aagagttgtc ttgtctttgg caaggatgtt ctgagaagtg tcccacccca 246 gaatccctct atgtaagctc acccgtgatc ccatactcct gcgatcatcg tcaccccaca 306 cagcaggcat tgttgccact tgtcctttcg acatatcaca tgggagcacc tcaatcgctt 366 acttttgaac gtagctgatc atgttatagg agcacgtctg cgaacgtcac gtaggtcgca 426 agagcacaaa taatctcaac ttgacttgcc aatggggcag ttgccgaact actactgtta 486 agcgcgacca tatcacctct catatccgag tacatgtgcc tttaaaacct cacaagtgtg 546 acttctgtgg aaaggccttc aagcgccctc aggacttgaa gaaacatgtc aagacacatg 606 cagatgattc ggttctggtt cggtcacctg aaccgggttc ccggaatcca gatataatgt 666 ttggaggtaa cccagcaaaa ggtgtgtcct gtgtctctag ctgcattcgc tgcgtaactg 726 accctatgga gctctaggct atgctaccgc tacgcattac ttcgaacccg ccttaaaccc 786 cgtccccagc cagggttatg ctcacggagc tcctcagtac tatcaatctc atcatccacc 846 tcaaccagcg aacccgtctt acggtaacgt ttactatgcg cttaatcacg gacatgaggc 906 cggccacgca tcatacgagt cgaaaaagcg tggatatgat gccctaaacg agtttttcgg 966 tgacctcaag cgtcgccagt tcgatccaaa ctcgtacacc gcagttgggc aacgcctact 1026 tggtttacaa agcctgtctc ttcccattct cagcggtggc ccactccctg aatatcaacc 1086 catgcctgcg cctgtggcag taggtggcgg aggctatagc cctggtggac atcctcccgc 1146 tcccgcgtat catctccctc ccatgagtaa cgtccgtacc aagaacgacc tgatcaacat 1206 cgatcagttc ttgcagcaga tgcaggatac catctatgaa aatgacgaca acgtggcagc 1266 tgctggtgtt gctcagccgg gtgcccatta cgttcatggc ggcatgagct atcgcaccac 1326 ccactcgcca cccagtcagc tgcctccaag ccatgctacg gccaccactt ccgcaggccc 1386 cattatggct aatcctgcga cccattcgcc gactgggaca cccgcactca caccaccctc 1446 gagcgcgcaa tcgtatacct ctggtcggtc gcccatctcc ctgccgtcaa caagccgggt 1506 atctcctcct catcacgaag gtggctcaag catgtacccc cgccttccat cggctactat 1566 gtctgacagc atggccgctg gctacccgac cacatcaagc gcagctcctc cgtccactct 1626 tggtggtatc tttgaccatg atgatcgtcg ccggtatacc ggtggcacct tacaacgcgc 1686 aaggccagag gagcgtcatc tacctgagcc aatggatctg tctcatgata ataaggatga 1746 cggagagcgg acaccacctg ccaagccgcg tcaagcaccc tcgtcacccg gtcgcatctc 1806 cgctagcttg attgaccctg ctctttcggg ctcggcaaac gaagcagaga cgatgcggac 1866 ggcccaagcc gcgactgagg tcgctgagcg atcagacgtg cagtgggttg aaaaggttcg 1926 ccttatcgag tacctgcgca attacatcgc gtctcgtctc gaacggggtg aatatgacgg 1986 cgattcaggc atgactcgtg agtcgcgcac cccagaggct ggacccgatg gccacatgga 2046 aggtgtggag accgagcccg tttctcatcc tgccaagtgt gagtccccgg tgaaacctga 2106 ggcgggaggt gatacggtga tgtacccaac actacgggga gtggatgagg atggtgattc 2166 taagatgcct aattaagcga tattcttcag actggtctgt ttgcgtttcc atgatctgtt 2226 actctactct tgtgcatcct tttatttacg gctcgttacg aaaccgttgt gggagtttgt 2286 cttatctcgc tttgtttctt tgcactgaat tgtggatctt gactaccgaa tacctactat 2346 ttttgtaacc gccggtcgtg tatttgtttt tgtaagaacg tttggttcga acatttctcg 2406 ttcttgtata gtggggagtt ctgaatgtaa aggataggga tttgggtaca atttatctta 2466 ttattttccc ccctcttttt aattattatt ttccttccc 2505 〈210〉 7 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 7 ggcaatgtcg gaaccccaag acacc 25 〈210〉 8 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 8 cacaggcgca ggcatgggtt ga 22 〈210〉 9 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 9 cctgtctctt cccattctca gc 22 〈210〉 10 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 10 ttaattaggc atcttagaat ca 22 〈210〉 11 〈211〉 1989 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 11 atgtcggaac cccaagacac cacttcccct tcgactgcgg ctgctcctat tgccgcgtcg 60 acttcgcatg agcaacccca aacccagtcg ccgcctcaag tctctgctac cacgacatcc 120 tcggtgacgg caaccgcagc cgcagcgacc gcagctgtgg catctccccc tgttaatggt 180 gctgcgcgcc cgaccgaaga gttgtcttgt ctttggcaag gatgttctga gaagtgtccc 240 accccagaat ccctctatga gcacgtctgc gaacgtcacg taggtcgcaa gagcacaaat 300 aatctcaact tgacttgcca atggggcagt tgccgaacta ctactgttaa gcgcgaccat 360 atcacctctc atatccgagt acatgtgcct ttaaaacctc acaagtgtga cttctgtgga 420 aaggccttca agcgccctca ggacttgaag aaacatgtca agacacatgc agatgattcg 480 gttctggttc ggtcacctga accgggttcc cggaatccag atataatgtt tggaggtaac 540 ccagcaaaag gctatgctac cgctacgcat tacttcgaac ccgccttaaa ccccgtcccc 600 agccagggtt atgctcacgg agctcctcag tactatcaat ctcatcatcc acctcaacca 660 gcgaacccgt cttacggtaa cgtttactat gcgcttaatc acggacatga ggccggccac 720 gcatcatacg agtcgaaaaa gcgtggatat gatgccctaa acgagttttt cggtgacctc 780 aagcgtcgcc agttcgatcc aaactcgtac accgcagttg ggcaacgcct acttggttta 840 caaagcctgt ctcttcccat tctcagcggt ggcccactcc ctgaatatca acccatgcct 900 gcgcctgtgg cagtaggtgg cggaggctat agccctggtg gacatcctcc cgctcccgcg 960 tatcatctcc ctcccatgag taacgtccgt accaagaacg acctgatcaa catcgatcag 1020 ttcttgcagc agatgcagga taccatctat gaaaatgacg acaacgtggc agctgctggt 1080 gttgctcagc cgggtgccca ttacgttcat ggcggcatga gctatcgcac cacccactcg 1140 ccacccagtc agctgcctcc aagccatgct acggccacca cttccgcagg ccccattatg 1200 gctaatcctg cgacccattc gccgactggg acacccgcac tcacaccacc ctcgagcgcg 1260 caatcgtata cctctggtcg gtcgcccatc tccctgccgt caacaagccg ggtatctcct 1320 cctcatcacg aaggtggctc aagcatgtac ccccgccttc catcggctac tatgtctgac 1380 agcatggccg ctggctaccc gaccacatca agcgcagctc ctccgtccac tcttggtggt 1440 atctttgacc atgatgatcg tcgccggtat accggtggca ccttacaacg cgcaaggcca 1500 gaggagcgtc atctacctga gccaatggat ctgtctcatg ataataagga tgacggagag 1560 cggacaccac ctgccaagcc gcgtcaagca ccctcgtcac ccggtcgcat ctccgctagc 1620 ttgattgacc ctgctctttc gggctcggca aacgaagcag agacgatgcg gacggcccaa 1680 gccgcgactg aggtcgctga gcgatcagac gtgcagtggg ttgaaaaggt tcgccttatc 1740 gagtacctgc gcaattacat cgcgtctcgt ctcgaacggg gtgaatatga cggcgattca 1800 ggcatgactc gtgagtcgcg caccccagag gctggacccg atggccacat ggaaggtgtg 1860 gagaccgagc ccgtttctca tcctgccaag tgtgagtccc cggtgaaacc tgaggcggga 1920 ggtgatacgg tgatgtaccc aacactacgg ggagtggatg aggatggtga ttctaagatg 1980 cctaattaa 1989 〈210〉 12 〈211〉 662 〈212〉 PRT 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 12 Met Ser Glu Pro Gln Asp Thr Thr Ser Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ser Thr Ser His Glu Gln Pro Gln Thr Gln Ser Pro Pro 20 25 30 Gln Val Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Pro Pro Val Asn Gly Ala Ala Arg Pro 50 55 60 Thr Glu Glu Leu Ser Cys Leu Trp Gln Gly Cys Ser Glu Lys Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Glu Ser Leu Tyr Glu His Val Cys Glu Arg His Val Gly Arg 85 90 95 Lys Ser Thr Asn Asn Leu Asn Leu Thr Cys Gln Trp Gly Ser Cys Arg 100 105 110 Thr Thr Thr Val Lys Arg Asp His Ile Thr Ser His Ile Arg Val His 115 120 125 Val Pro Leu Lys Pro His Lys Cys Asp Phe Cys Gly Lys Ala Phe Lys 130 135 140 Arg Pro Gln Asp Leu Lys Lys His Val Lys Thr His Ala Asp Asp Ser 145 150 155 160 Val Leu Val Arg Ser Pro Glu Pro Gly Ser Arg Asn Pro Asp Ile Met 165 170 175 Phe Gly Gly Asn Pro Ala Lys Gly Tyr Ala Thr Ala Thr His Tyr Phe 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Asn Pro Val Pro Ser Gln Gly Tyr Ala His Gly Ala 195 2OO 205 Pro Gln Tyr Tyr Gln Ser His His Pro Pro Gln Pro Ala Asn Pro Ser 210 215 220 Tyr Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Leu Asn His Gly His Glu Ala Gly His 225 230 235 240 Ala Ser Tyr Glu Ser Lys Lys Arg Gly Tyr Asp Ala Leu Asn Glu Phe 245 250 255 Phe Gly Asp Leu Lys Arg Arg Gln Phe Asp Pro Asn Ser Tyr Thr Ala 260 265 270 Val Gly Gln Arg Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Ser Leu Pro Ile Leu 275 280 285 Ser Gly Gly Pro Leu Pro Glu Tyr Gln Pro Met Pro Ala Pro Val Ala 290 295 300 Val Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Pro Gly Gly His Pro Pro Ala Pro Ala 305 310 315 320 Tyr His Leu Pro Pro Met Ser Asn Val Arg Thr Lys Asn Asp Leu Ile 325 330 335 Asn Ile Asp Gln Phe Leu Gln Gln Met Gln Asp Thr Ile Tyr Glu Asn 340 345 350 Asp Asp Asn Val Ala Ala Ala Gly Val Ala Gln Pro Gly Ala His Tyr 355 360 365 Val His Gly Gly Met Ser Tyr Arg Thr Thr His Ser Pro Pro Ser Gln 370 375 380 Leu Pro Pro Ser His Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala Gly Pro Ile Met 385 390 395 400 Ala Asn Pro Ala Thr His Ser Pro Thr Gly Thr Pro Ala Leu Thr Pro 405 410 415 Pro Ser Ser Ala Gln Ser Tyr Thr Ser Gly Arg Ser Pro Ile Ser Leu 420 425 430 Pro Ser Thr Ser Arg Val Ser Pro Pro His His Glu Gly Gly Ser Ser 435 440 445 Met Tyr Pro Arg Leu Pro Ser Ala Thr Met Ser Asp Ser Met Ala Ala 450 455 460 Gly Tyr Pro Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro Pro Ser Thr Leu Gly Gly 465 470 475 480 Ile Phe Asp His Asp Asp Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Gly Thr Leu Gln 485 490 495 Arg Ala Arg Pro Glu Glu Arg His Leu Pro Glu Pro Met Asp Leu Ser 500 505 510 His Asp Asn Lys Asp Asp Gly Glu Arg Thr Pro Pro Ala Lys Pro Arg 515 520 525 Gln Ala Pro Ser Ser Pro Gly Arg Ile Ser Ala Ser Leu Ile Asp Pro 530 535 540 Ala Leu Ser Gly Ser Ala Asn Glu Ala Glu Thr Met Arg Thr Ala Gln 545 550 555 560 Ala Ala Thr Glu Val Ala Glu Arg Ser Asp Val Gln Trp Val Glu Lys 565 570 575 Val Arg Leu Ile Glu Tyr Leu Arg Asn Tyr Ile Ala Ser Arg Leu Glu 580 585 590 Arg Gly Glu Tyr Asp Glu Asp Ser Gly Met Thr Arg Glu Ser Arg Thr 595 600 605 Pro Glu Ala Gly Pro Asp Gly His Met Glu Gly Val Glu Thr Glu Pro 610 615 620 Val Ser His Pro Ala Lys Cys Glu Ser Pro Val Lys Pro Glu Ala Gly 625 630 635 640 Gly Asp Thr Val Met Tyr Pro Thr Leu Arg Gly Val Asp Glu Asp Gly 645 650 655 Asp Ser Lys Met Pro Asn 660 〈210〉 13 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 13 ggctgcagac ccccgtcttt ccagggtctg attgg 35 〈210〉 14 〈211〉 37 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 14 ggctgcaggg aaggaaaata ataattaaaa agagggg 37 〈210〉 15 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 15 gcatcatact agtcgaaaaa gcgtggatat 30 〈210〉 16 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 16 atatccacgc tttttcgact agtatgatgc 30 〈210〉 17 〈211〉 3414 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 17 ggctgcagac ccccgtcttt ccagggtctg attggcgcta acccatcact tttgtaagcg -843 gggcccgagg gttcgcaggt ctccggtaat gctgttgtat ggtacgtttc aggtcggctg -783 ccgatcgtga catgtggaca ctatattggg gaataatatt gagttaagta gtgtcattct -723 gacggtgcat tggaggtatc attctgagaa acgaatccgt ttccagggga ttgattatgc -663 caggttgcct ttctcctttt tcccattttg tttttttctt tctccttgct ttgctagtaa -603 gatgtgtcca ctcttcctgt gaaatattac ggagtagaac aaggaaaaaa gtggtggcct -543 aattttcctg cacgtgcggt atcgtaccag accaatacgg gaagtaagga gcgccacagc -483 cccgcatcat tcttggcccg gtcttgtcgt cttgtccctg tcctccgccg ggctgtgcaa -423 gcggtctttt ctgggcaagg ctcggctccg gatgtccgca caggacaaga acccaagcct -363 ccccctcttg cttccaagac ttcctctctt cttatctctc cccatatttc cccctgaatt -303 gtcctgtctg tctttttccc agtcttccct tcactccccc ctttcattta tatcatcttg -243 tgtttttcac aacagttcta tattcggtaa catacgcgtg ttgcattggt agttgttgtc -183 attgccaact catcgcgtct taccttctct ccccatccct gatcttcctt attagccaga -123 agtcccttgg cttggacatc tttggttgtc tattgaggaa catcccactt ggtttgactt -63 gtattgagtc ctttcacgac gacttccgct cccaagaaaa gggacaagaa attttcttgg -3 caatgtcgga accccaagac accacttccc cttcgactgc ggctgctcct attgccgcgt 58 cgacttcgca tgagcaaccc caaacccagt cgccgcctca agtctctgct accacgacat 118 cctcggtgac ggcaaccgca gccgcagcga ccgcagctgt ggcatctccc cctgttaatg 178 gtgctgcgcg cccgaccgaa gagttgtctt gtctttggca aggatgttct gagaagtgtc 238 ccaccccaga atccctctat gtaagctcac ccgtgatccc atactcctgc gatcatcgtc 298 accccacaca gcaggcattg ttgccacttg tcctttcgac atatcacatg ggagcacctc 358 aatcgcttac ttttgaacgt agctgatcat gttataggag cacgtctgcg aacgtcacgt 418 aggtcgcaag agcacaaata atctcaactt gacttgccaa tggggcagtt gccgaactac 478 tactgttaag cgcgaccata tcacctctca tatccgagta catgtgcctt taaaacctca 538 caagtgtgac ttctgtggaa aggccttcaa gcgccctcag gacttgaaga aacatgtcaa 598 gacacatgca gatgattcgg ttctggttcg gtcacctgaa ccgggttccc ggaatccaga 658 tataatgttt ggaggtaacc cagcaaaagg tgtgtcctgt gtctctagct gcattcgctg 718 cgtaactgac cctatggagc tctaggctat gctaccgcta cgcattactt cgaacccgcc 778 ttaaaccccg tccccagcca gggttatgct cacggagctc ctcagtacta tcaatctcat 838 catccacctc aaccagcgaa cccgtcttac ggtaacgttt actatgcgct taatcacgga 898 catgaggccg gccacgcatc atactagtcg aaaaagcgtg gatatgatgc cctaaacgag 958 tttttcggtg acctcaagcg tcgccagttc gatccaaact cgtacaccgc agttgggcaa 1018 cgcctacttg gtttacaaag cctgtctctt cccattctca gcggtggccc actccctgaa 1078 tatcaaccca tgcctgcgcc tgtggcagta ggtggcggag gctatagccc tggtggacat 1138 cctcccgctc ccgcgtatca tctccctccc atgagtaacg tccgtaccaa gaacgacctg 1198 atcaacatcg atcagttctt gcagcagatg caggatacca tctatgaaaa tgacgacaac 1258 gtggcagctg ctggtgttgc tcagccgggt gcccattacg ttcatggcgg catgagctat 1318 cgcaccaccc actcgccacc cagtcagctg cctccaagcc atgctacggc caccacttcc 1378 gcaggcccca ttatggctaa tcctgcgacc cattcgccga ctgggacacc cgcactcaca 1438 ccaccctcga gcgcgcaatc gtatacctct ggtcggtcgc ccatctccct gccgtcaaca 1498 agccgggtat ctcctcctca tcacgaaggt ggctcaagca tgtacccccg ccttccatcg 1558 gctactatgt ctgacagcat ggccgctggc tacccgacca catcaagcgc agctcctccg 1618 tccactcttg gtggtatctt tgaccatgat gatcgtcgcc ggtataccgg tggcacctta 1678 caacgcgcaa ggccagagga gcgtcatcta cctgagccaa tggatctgtc tcatgataat 1738 aaggatgacg gagagcggac accacctgcc aagccgcgtc aagcaccctc gtcacccggt 1798 cgcatctccg ctagcttgat tgaccctgct ctttcgggct cggcaaacga agcagagacg 1858 atgcggacgg cccaagccgc gactgaggtc gctgagcgat cagacgtgca gtgggttgaa 1918 aaggttcgcc ttatcgagta cctgcgcaat tacatcgcgt ctcgtctcga acggggtgaa 1978 tatgacggcg attcaggcat gactcgtgag tcgcgcaccc cagaggctgg acccgatggc 2038 cacatggaag gtgtggagac cgagcccgtt tctcatcctg ccaagtgtga gtccccggtg 2098 aaacctgagg cgggaggtga tacggtgatg tacccaacac tacggggagt ggatgaggat 2158 ggtgattcta agatgcctaa ttaagcgata ttcttcagac tggtctgttt gcgtttccat 2218 gatctgttac tctactcttg tgcatccttt tatttacggc tcgttacgaa accgttgtgg 2278 gagtttgtct tatctcgctt tgtttctttg cactgaattg tggatcttga ctaccgaata 2338 cctactattt ttgtaaccgc cggtcgtgta tttgtttttg taagaacgtt tggttcgaac 2398 atttctcgtt cttgtatagt ggggagttct gaatgtaaag gatagggatt tgggtacaat 2458 ttatcttatt attttccccc ctctttttaa ttattatttt ccttccctgc agcc 2512 〈210〉 18 〈211〉 243 〈212〉 PRT 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 18 Met Ser Glu Pro Gln Asp Thr Thr Ser Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ser Thr Ser His Glu Gln Pro Gln Thr Gln Ser Pro Pro 20 25 30 Gln Val Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Pro Pro Val Asn Gly Ala Ala Arg Pro 50 55 60 Thr Glu Glu Leu Ser Cys Leu Trp Gln Gly Cys Ser Glu Lys Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Glu Ser Leu Tyr Glu His Val Cys Glu Arg His Val Gly Arg 85 90 95 Lys Ser Thr Asn Asn Leu Asn Leu Thr Cys Gln Trp Gly Ser Cys Arg 100 105 110 Thr Thr Thr Val Lys Arg Asp His Ile Thr Ser His Ile Arg Val His 115 120 125 Val Pro Leu Lys Pro His Lys Cys Asp Phe Cys Gly Lys Ala Phe Lys 130 135 140 Arg Pro Gln Asp Leu Lys Lys His Val Lys Thr His Ala Asp Asp Ser 145 150 155 160 Val Leu Val Arg Ser Pro Glu Pro Gly Ser Arg Asn Pro Asp Ile Met 165 170 175 Phe Gly Gly Asn Pro Ala Lys Gly Tyr Ala Thr Ala Thr His Tyr Phe 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Asn Pro Val Pro Ser Gln Gly Tyr Ala His Gly Ala 195 200 205 Pro Gln Tyr Tyr Gln Ser His His Pro Pro Gln Pro Ala Asn Pro Ser 210 215 220 Tyr Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Leu Asn His Gly His Glu Ala Gly His 225 230 235 240 Ala Ser Tyr 243 〈210〉 19 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 19 gggaagctta acaggcccca aattcaatta 30 〈210〉 20 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 20 gggaagcttt ggatttccta cgtcttcaat 30

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号１のミックスプライマーを示す。

【図２】配列番号２のミックスプライマーを示す。

【図３】配列番号３のＡｏｐａｃＣ−５′取得用プライ
マーを示す。

【図４】配列番号４のＡｏｐａｃＣ−３′取得用プライ
マーを示す。

【図５】配列番号５のアニーリング用プライマーを示
す。

【図６】配列番号６のｐａｃＣ遺伝子の塩基配列を示
す。

【図７】同上つづきを示す。

【図８】同上つづきを示す。

【図９】配列番号７の５′上流領域の増幅用プライマー
を示す。

【図１０】配列番号８の５′上流領域の増幅用プライマ
ーを示す。

【図１１】配列番号９の３′上流領域の増幅用プライマ
ーを示す。

【図１２】配列番号１０の３′上流領域の増幅用プライ
マーを示す。

【図１３】配列番号１１の本遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列
を示す。

【図１４】同上つづきを示す。

【図１５】配列番号１２のＡｏｐａｃＣのアミノ酸配列
を示す。

【図１６】同上つづきを示す。

【図１７】配列番号１３のプライマーＧｐａｃＣ−Ｍ１
を示す。

【図１８】配列番号１４のプライマーＧｐａｃＣ−ＲＶ
を示す。

【図１９】配列番号１５のプライマーＧｐａｃＣＭ−Ｍ
Ｍを示す。

【図２０】配列番号１６のプライマーＧｐａｃＣＭ−Ｍ
Ｒを示す。

【図２１】配列番号１７のＧｐａｃＣＭの塩基配列を示
す。

【図２２】同上つづきを示す。

【図２３】同上つづきを示す。

【図２４】配列番号１８の変異ＡｏｐａｃＣのアミノ酸
配列を示す。

【図２５】配列番号１９のプライマーｎｉａＤ−Ｍ１を
示す。

【図２６】配列番号２０のプライマーｎｉａＤ−ＲＶを
示す。

【図２７】アスペルギルス・オリゼのｐａｃＣの染色体
上の遺伝子の制限酵素地図を示す。図中、ＡｏｐａｃＣ
−５′およびＡｏｐａｃＣ−３′は、染色体ＤＮＡライ
ブラリーを使用し、増幅された領域。制限酵素地図は、
塩基配列を決定した領域のみを示している。

【図２８】ｐＧｐａｃＣ−ｎｉａＤ、ｐＧｐａｃＣＭ−
ｎｉａＤの構築法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 田中 昭光 千葉県銚子市飯沼町８−６ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA14 BA80 CA03 CA04 DA11 EA04 FA01 GA11 GA19 GA27 4B050 CC03 DD03 EE01 LL02 LL04 LL05 4B065 AA63X AA63Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BB01 BC01 BC03 BC31 CA33 CA42

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１２のアミノ酸配列で
   示されるＤＮＡ結合タンパク質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号６の塩基配列で示さ
   れ、請求項１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   結合タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１８のアミノ酸配列で
   示されるＤＮＡ結合タンパク質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１７の塩基配列で示さ
   れ、請求項３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   結合タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項２又は４に記載のＤＮＡの少なく
   ともひとつを含有してなる組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えプラスミドを導
   入してなる形質転換体アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ
   ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＰＣＣ又はアスペル
   ギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
   ｅ）ＰＣＣＭ（ＦＥＲＭ Ｐ−１８０６０）。
7. 【請求項７】 請求項２又は４に記載のＤＮＡを利用す
   ること、を特徴とする麹菌アルカリプロテアーゼ生産量
   の増強法。