JP2002101888A - アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するdna結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法 - Google Patents
アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するdna結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法Info
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- JP2002101888A JP2002101888A JP2000299295A JP2000299295A JP2002101888A JP 2002101888 A JP2002101888 A JP 2002101888A JP 2000299295 A JP2000299295 A JP 2000299295A JP 2000299295 A JP2000299295 A JP 2000299295A JP 2002101888 A JP2002101888 A JP 2002101888A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Aspergillus oryzae
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するD
NA結合タンパク質AopacCをコードする遺伝子を
単離し、その塩基配列が決定され、また、該タンパク質
のアミノ酸配列が明らかにされた。 【効果】 該遺伝子を利用することにより、アルカリプ
ロテアーゼの効率的生産が可能となっただけでなく、該
遺伝子にストップコドンを導入することにより、醤油麹
等弱酸性培地でも該酵素を高生産することができ、醤油
や味噌等の醸造を効率的に行うことができる。
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するD
NA結合タンパク質AopacCをコードする遺伝子を
単離し、その塩基配列が決定され、また、該タンパク質
のアミノ酸配列が明らかにされた。 【効果】 該遺伝子を利用することにより、アルカリプ
ロテアーゼの効率的生産が可能となっただけでなく、該
遺伝子にストップコドンを導入することにより、醤油麹
等弱酸性培地でも該酵素を高生産することができ、醤油
や味噌等の醸造を効率的に行うことができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、麹菌アスペルギル
ス・オリゼ(Aspergillus oryzae)
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するD
NA結合タンパク質に対応するアミノ酸配列及び本DN
A結合タンパク質をコードする遺伝子DNAおよび該遺
伝子を使用した麹菌の育種方法に関わるものである。
ス・オリゼ(Aspergillus oryzae)
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するD
NA結合タンパク質に対応するアミノ酸配列及び本DN
A結合タンパク質をコードする遺伝子DNAおよび該遺
伝子を使用した麹菌の育種方法に関わるものである。
【0002】
【従来の技術】醤油の味を決定している主な因子は、ア
ミノ酸であり、そのアミノ酸は小麦や大豆に含まれるタ
ンパク質が分解され生じる。また、醤油醸造において、
原料中のタンパク質をいかに効率よく利用するかという
問題は、コスト削減という面で重要である。これらに関
して、重要な役割を演じているのはアルカリプロテアー
ゼ等のタンパク質分解酵素である。特にアルカリプロテ
アーゼは、原料中のタンパク質を効率よく利用するため
には、最も有効であると考えられている。
ミノ酸であり、そのアミノ酸は小麦や大豆に含まれるタ
ンパク質が分解され生じる。また、醤油醸造において、
原料中のタンパク質をいかに効率よく利用するかという
問題は、コスト削減という面で重要である。これらに関
して、重要な役割を演じているのはアルカリプロテアー
ゼ等のタンパク質分解酵素である。特にアルカリプロテ
アーゼは、原料中のタンパク質を効率よく利用するため
には、最も有効であると考えられている。
【0003】これまでは、アルカリプロテアーゼの大量
生産株の育種には、掛け合わせ等の方法が用いられてき
た。しかし、従来の育種法は、操作が煩雑であり、膨大
な労力を要する。さらに過剰にアルカリプロテアーゼが
生産されると、最終的にオリの原因となり醤油の品質を
低下させる原因となる。そのため、アルカリプロテアー
ゼの生産量を人為的にコントロールする事が必要である
が、従来の育種法では困難である。そこで、アルカリプ
ロテアーゼの発現を制御するタンパク質の遺伝子を得
て、アルカリプロテアーゼの生産量を人為的にコントロ
ールすることが有効であると考えられる。
生産株の育種には、掛け合わせ等の方法が用いられてき
た。しかし、従来の育種法は、操作が煩雑であり、膨大
な労力を要する。さらに過剰にアルカリプロテアーゼが
生産されると、最終的にオリの原因となり醤油の品質を
低下させる原因となる。そのため、アルカリプロテアー
ゼの生産量を人為的にコントロールする事が必要である
が、従来の育種法では困難である。そこで、アルカリプ
ロテアーゼの発現を制御するタンパク質の遺伝子を得
て、アルカリプロテアーゼの生産量を人為的にコントロ
ールすることが有効であると考えられる。
【0004】アスペルギルス・オリゼに近縁種であるア
スペルギルス・ニドランスのアルカリプロテアーゼは、
アルカリ環境下で誘導発現することが知られており、そ
のプロモーター上にはDNA結合タンパク質pacCの
結合する配列が存在する。さらにアスペルギルス・オリ
ゼのアルカリプロテアーゼのプロモーターにもpacC
タンパク質が結合すると考えられる配列が存在するため
アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼもpa
cCタンパク質によって発現を制御されていると考えら
れるが、アスペルギルス・オリゼのpacC(以下、A
opacC)遺伝子は、未だに得られていない。pac
C遺伝子を用いて、アスペルギルス・オリゼを醤油やみ
そなどの醸造産業に適した性質を持つように育種する際
には、安心・安全という観点からアスペルギルス・オリ
ゼ自身の遺伝子を用いることが重要である。
スペルギルス・ニドランスのアルカリプロテアーゼは、
アルカリ環境下で誘導発現することが知られており、そ
のプロモーター上にはDNA結合タンパク質pacCの
結合する配列が存在する。さらにアスペルギルス・オリ
ゼのアルカリプロテアーゼのプロモーターにもpacC
タンパク質が結合すると考えられる配列が存在するため
アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼもpa
cCタンパク質によって発現を制御されていると考えら
れるが、アスペルギルス・オリゼのpacC(以下、A
opacC)遺伝子は、未だに得られていない。pac
C遺伝子を用いて、アスペルギルス・オリゼを醤油やみ
そなどの醸造産業に適した性質を持つように育種する際
には、安心・安全という観点からアスペルギルス・オリ
ゼ自身の遺伝子を用いることが重要である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】醤油醸造などの醸造産
業に重要な役割を演じているアルカリプロテアーゼの発
現を人為的にコントロールするためには、アルカリプロ
テアーゼの発現を制御するDNA結合タンパク質pac
Cの遺伝子を得て、アルカリプロテアーゼの生産量をコ
ントロールすることが有効であると考えられる。特に弱
酸性の環境である醤油麹において、アルカリプロテアー
ゼ生産量を増強することによって、原料窒素の利用率向
上が期待できる。
業に重要な役割を演じているアルカリプロテアーゼの発
現を人為的にコントロールするためには、アルカリプロ
テアーゼの発現を制御するDNA結合タンパク質pac
Cの遺伝子を得て、アルカリプロテアーゼの生産量をコ
ントロールすることが有効であると考えられる。特に弱
酸性の環境である醤油麹において、アルカリプロテアー
ゼ生産量を増強することによって、原料窒素の利用率向
上が期待できる。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記現状
に鑑み、各方面から検討した結果、アルカリプロテアー
ゼの生産を制御するためには遺伝子工学的手法による方
法が最適であるとの知見を得た。そして、本発明者ら
は、鋭意研究の結果、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来
のアルカリプロテアーゼの生産量を制御する事のできる
DNA結合タンパク質のアミノ酸配列を明らかにし、該
アミノ酸配列に対応する塩基配列を決定した。さらに、
該遺伝子に変異を導入し、それを導入してなる形質転換
株を作製することによって、アルカリプロテアーゼを弱
酸性の環境下においてもアルカリ環境下で培養した際と
同程度まで生産させることに成功し、本発明の成功に至
った。以下、本発明について記述する。
に鑑み、各方面から検討した結果、アルカリプロテアー
ゼの生産を制御するためには遺伝子工学的手法による方
法が最適であるとの知見を得た。そして、本発明者ら
は、鋭意研究の結果、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来
のアルカリプロテアーゼの生産量を制御する事のできる
DNA結合タンパク質のアミノ酸配列を明らかにし、該
アミノ酸配列に対応する塩基配列を決定した。さらに、
該遺伝子に変異を導入し、それを導入してなる形質転換
株を作製することによって、アルカリプロテアーゼを弱
酸性の環境下においてもアルカリ環境下で培養した際と
同程度まで生産させることに成功し、本発明の成功に至
った。以下、本発明について記述する。
【0007】本発明に係る遺伝子をクローニングするた
め、先ず、アスペルギルス・オリゼの染色体DNAを鋳
型とし、アスペルギルス・ニガーのpacCの遺伝子の
塩基配列を元に設計したプライマーを用いて、PCRに
よって本遺伝子の一部領域を増幅した。さらに得られた
領域の塩基配列を元にプライマーを設計し、得られた一
部領域の上流領域及び下流領域をPCRにより増幅し
た。その後、上流及び下流領域断片の塩基配列を決定す
ることによって、本遺伝子の全塩基配列を明らかにし
た。次に本遺伝子のcDNAの塩基配列を明らかにする
ために、RT−PCRによってcDNAを増幅し、その
断片の塩基配列を決定した。
め、先ず、アスペルギルス・オリゼの染色体DNAを鋳
型とし、アスペルギルス・ニガーのpacCの遺伝子の
塩基配列を元に設計したプライマーを用いて、PCRに
よって本遺伝子の一部領域を増幅した。さらに得られた
領域の塩基配列を元にプライマーを設計し、得られた一
部領域の上流領域及び下流領域をPCRにより増幅し
た。その後、上流及び下流領域断片の塩基配列を決定す
ることによって、本遺伝子の全塩基配列を明らかにし
た。次に本遺伝子のcDNAの塩基配列を明らかにする
ために、RT−PCRによってcDNAを増幅し、その
断片の塩基配列を決定した。
【0008】その結果、本遺伝子は、2182bp(開
始コドンATG:終止コドンTAA)からなり、イント
ロンが2つ存在していることが明らかとなった。そして
cDNAには、1989bpからなるオープンリーディ
ングフレーム(ORF:読み枠(ATG〜TAA))が
存在し、662アミノ酸、約71kDaのタンパク質を
コードしていることが判明した。本タンパク質のアミノ
酸配列を解析した結果、本タンパク質のN末端付近に
は、ジンクフィンガー(Zinc Finger)と呼
ばれるDNAに結合するための機能領域が存在してい
た。また、Blastによる検索の結果、本タンパク質
のアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニガー(Aspe
rgillus niger)及びアスペルギルス・ニ
ドランス(Aspergillus nidulan
s)のpacCタンパク質のアミノ酸配列と高いホモロ
ジーを有していることから、本遺伝子は、AopacC
遺伝子であると推察された。
始コドンATG:終止コドンTAA)からなり、イント
ロンが2つ存在していることが明らかとなった。そして
cDNAには、1989bpからなるオープンリーディ
ングフレーム(ORF:読み枠(ATG〜TAA))が
存在し、662アミノ酸、約71kDaのタンパク質を
コードしていることが判明した。本タンパク質のアミノ
酸配列を解析した結果、本タンパク質のN末端付近に
は、ジンクフィンガー(Zinc Finger)と呼
ばれるDNAに結合するための機能領域が存在してい
た。また、Blastによる検索の結果、本タンパク質
のアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニガー(Aspe
rgillus niger)及びアスペルギルス・ニ
ドランス(Aspergillus nidulan
s)のpacCタンパク質のアミノ酸配列と高いホモロ
ジーを有していることから、本遺伝子は、AopacC
遺伝子であると推察された。
【0009】pacCタンパク質は、アスペルギルス・
ニガー及びアスペルギルス・ニドランスにおいて、よく
研究されており、pH応答に関与するDNA結合タンパ
ク質である。周辺環境のpHがアルカリ性になるとC末
端が欠失し、活性型となり、アルカリプロテアーゼ等の
アルカリ性の環境下で働く遺伝子の転写を活性化させ
る。また、人為的にC末端を欠失させると、常に標的タ
ンパク質の転写を活性化されることが知られている。
ニガー及びアスペルギルス・ニドランスにおいて、よく
研究されており、pH応答に関与するDNA結合タンパ
ク質である。周辺環境のpHがアルカリ性になるとC末
端が欠失し、活性型となり、アルカリプロテアーゼ等の
アルカリ性の環境下で働く遺伝子の転写を活性化させ
る。また、人為的にC末端を欠失させると、常に標的タ
ンパク質の転写を活性化されることが知られている。
【0010】そこで本発明者らは、本遺伝子においてス
トップコドンを導入することにより、発現した場合C末
端を持たないAopacCタンパク質が生産されるよう
にした遺伝子(以下、GpacCM)を構築した。次い
で、GpacCM、ストップコドンを導入していない遺
伝子(以下、GpacC)を、それぞれ、アスペルギル
ス・オリゼに導入し、pH6.0及びpH8.0の培地
で培養し、その際の各形質転換株のアルカリプロテアー
ゼ活性を比較した。
トップコドンを導入することにより、発現した場合C末
端を持たないAopacCタンパク質が生産されるよう
にした遺伝子(以下、GpacCM)を構築した。次い
で、GpacCM、ストップコドンを導入していない遺
伝子(以下、GpacC)を、それぞれ、アスペルギル
ス・オリゼに導入し、pH6.0及びpH8.0の培地
で培養し、その際の各形質転換株のアルカリプロテアー
ゼ活性を比較した。
【0011】その結果、GpacCを導入した株及び野
生株は、pH6.0の培地で培養した場合、pH8.0
の培地で培養した場合に比べて、約1/7量のアルカリ
プロテアーゼ活性しか示さなかったが、GpacCMを
導入した株はpH8.0及びpH6.0の培地ともに同
程度のアルカリプロテアーゼ活性を示した。さらにこれ
らの形質転換株を醤油麹培地で培養した際のアルカリプ
ロテアーゼ活性を測定した結果、GpacCMを導入し
た形質転換株では約pH6.5の醤油麹培地においても
アルカリプロテアーゼが大量に生産させることを確認し
た。なお、GpacC導入株は親株に比して多量のアル
カリプロテアーゼを生産させることも確認された。
生株は、pH6.0の培地で培養した場合、pH8.0
の培地で培養した場合に比べて、約1/7量のアルカリ
プロテアーゼ活性しか示さなかったが、GpacCMを
導入した株はpH8.0及びpH6.0の培地ともに同
程度のアルカリプロテアーゼ活性を示した。さらにこれ
らの形質転換株を醤油麹培地で培養した際のアルカリプ
ロテアーゼ活性を測定した結果、GpacCMを導入し
た形質転換株では約pH6.5の醤油麹培地においても
アルカリプロテアーゼが大量に生産させることを確認し
た。なお、GpacC導入株は親株に比して多量のアル
カリプロテアーゼを生産させることも確認された。
【0012】
【実施例】以下にアルカリプロテアーゼの発現を制御す
るDNA結合タンパク質の遺伝子の単離及び塩基配列及
び対応するアミノ酸配列を実施例によって示すが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
るDNA結合タンパク質の遺伝子の単離及び塩基配列及
び対応するアミノ酸配列を実施例によって示すが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【0013】(1)アスペルギルス・ニガーpacC遺
伝子の塩基配列に基づいたAopacC遺伝子の部分配
列の決定 アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC 42
149)の胞子をYPD(その培地組成を下記表1に示
す)100mlに植菌し、30℃で一晩振とう培養し
た。その後、飯村の方法(Agric.Biol.Ch
em.,323−328,51(1987))に従って
菌体から染色体DNAを抽出した。ついでこの染色体D
NAを鋳型として、アスペルギルス・ニガーの塩基配列
に基づいて合成した配列番号1(図1)と配列番号2
(図2)に示したミックスプライマーを用いてPCRを
行った。このPCRによった増幅した約830bpのD
NA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、回収した
後、この断片をpT7Blue−Tを用いてクローニン
グした。その後、クローニングした断片の塩基配列を決
定し、Blast searchによって解析した結
果、この断片がアスペルギルス・ニガーpacC遺伝子
に対して高いホモロジーを有していることを確認した。
伝子の塩基配列に基づいたAopacC遺伝子の部分配
列の決定 アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC 42
149)の胞子をYPD(その培地組成を下記表1に示
す)100mlに植菌し、30℃で一晩振とう培養し
た。その後、飯村の方法(Agric.Biol.Ch
em.,323−328,51(1987))に従って
菌体から染色体DNAを抽出した。ついでこの染色体D
NAを鋳型として、アスペルギルス・ニガーの塩基配列
に基づいて合成した配列番号1(図1)と配列番号2
(図2)に示したミックスプライマーを用いてPCRを
行った。このPCRによった増幅した約830bpのD
NA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、回収した
後、この断片をpT7Blue−Tを用いてクローニン
グした。その後、クローニングした断片の塩基配列を決
定し、Blast searchによって解析した結
果、この断片がアスペルギルス・ニガーpacC遺伝子
に対して高いホモロジーを有していることを確認した。
【0014】(表1)YPD1L グルコース 20g 酵母エキス 5g パクトペプトン 10g KH2PO4 5g MgSO4・7H2O 0.5g
【0015】(2)AopacC遺伝子の全塩基配列の
決定 Universal Genome Walker k
it(Clontech社製)を使用し、作製したアス
ペルギルス・オリゼの染色体DNAライブラリーを用い
て、AopacCの上流領域(以下、AopacC−
5′)および下流領域(以下、AopacC−3′)を
取得した。すなわち、染色体DNAをEcoRV,Sc
aI,DraI,PvuIIあるいはSspI等のそれぞ
れの制限酵素で完全消化した後、Universal
Genome Walker kitに添付のアダプタ
ーをT4リガーゼを用いて連結し、PCR用の染色体D
NAライブラリー5種類(すなわち、EcoRVライブ
ラリー、ScaI:ライブラリー、DraIライブラリ
ー、PvuIIライブラリー、SspIライブラリー)を
作製した。
決定 Universal Genome Walker k
it(Clontech社製)を使用し、作製したアス
ペルギルス・オリゼの染色体DNAライブラリーを用い
て、AopacCの上流領域(以下、AopacC−
5′)および下流領域(以下、AopacC−3′)を
取得した。すなわち、染色体DNAをEcoRV,Sc
aI,DraI,PvuIIあるいはSspI等のそれぞ
れの制限酵素で完全消化した後、Universal
Genome Walker kitに添付のアダプタ
ーをT4リガーゼを用いて連結し、PCR用の染色体D
NAライブラリー5種類(すなわち、EcoRVライブ
ラリー、ScaI:ライブラリー、DraIライブラリ
ー、PvuIIライブラリー、SspIライブラリー)を
作製した。
【0016】これらのライブラリーを鋳型として、既に
決定しているAopacC部分配列の塩基配列から合成
したプライマー(配列番号3あるいは4)およびアダプ
ターに特異的にアニーリングするプライマー(配列番号
5:図5)を用いてPCRを行った。AopacC−
5′の取得には配列番号3(図3)のプライマーを、A
opacC−3′の取得には配列番号4(図4)のプラ
イマーを使用した。PCRの結果、EcoRVライブラ
リーを使用しAopacC−5′の約2.8kbpが、
DraIライブラリーを使用しAopacC−3′の約
2.5kbpのDNA断片が増幅された(図27)。つ
いでこれらDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳
動に供し、回収した後、この断片をpT7Blue−T
を用いてクローニングし、部分塩基配列を決定した。そ
の後、これらの配列をコンピューター解析により連結
し、連結した配列をアスペルギルス・オリゼpacC遺
伝子の全長の配列(配列番号6:図6、図7、図8)と
した。
決定しているAopacC部分配列の塩基配列から合成
したプライマー(配列番号3あるいは4)およびアダプ
ターに特異的にアニーリングするプライマー(配列番号
5:図5)を用いてPCRを行った。AopacC−
5′の取得には配列番号3(図3)のプライマーを、A
opacC−3′の取得には配列番号4(図4)のプラ
イマーを使用した。PCRの結果、EcoRVライブラ
リーを使用しAopacC−5′の約2.8kbpが、
DraIライブラリーを使用しAopacC−3′の約
2.5kbpのDNA断片が増幅された(図27)。つ
いでこれらDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳
動に供し、回収した後、この断片をpT7Blue−T
を用いてクローニングし、部分塩基配列を決定した。そ
の後、これらの配列をコンピューター解析により連結
し、連結した配列をアスペルギルス・オリゼpacC遺
伝子の全長の配列(配列番号6:図6、図7、図8)と
した。
【0017】(3)AopacC cDNAの増幅と塩
基配列決定 本タンパク質遺伝子のcDNAの塩基配列を決定するた
めにRT−PCRによるcDNAの増幅を試みた。すな
わち、アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC
42149)の胞子を最小培地(その培地組成を下記
表2に示す)100mlで30℃、20時間振とう培養
した後、菌体をB培地(組成は後記)に移し、30℃、
6時間さらに培養した。その後、菌体を回収し、Chi
gwinらの方法(Biochemistry 18
5294−5299、(1979))に従ってtota
l RNAを得、その後オリゴ(dT)セルロースカラ
ム(アマシャム社)を使用してmRNAを取得した。そ
の後Ready−To−Go RT−PCR Bead
s(アマシャム社)を使用して本タンパク質遺伝子のc
DNAを5′上流領域および3′下流領域にわけ、増幅
した。
基配列決定 本タンパク質遺伝子のcDNAの塩基配列を決定するた
めにRT−PCRによるcDNAの増幅を試みた。すな
わち、アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC
42149)の胞子を最小培地(その培地組成を下記
表2に示す)100mlで30℃、20時間振とう培養
した後、菌体をB培地(組成は後記)に移し、30℃、
6時間さらに培養した。その後、菌体を回収し、Chi
gwinらの方法(Biochemistry 18
5294−5299、(1979))に従ってtota
l RNAを得、その後オリゴ(dT)セルロースカラ
ム(アマシャム社)を使用してmRNAを取得した。そ
の後Ready−To−Go RT−PCR Bead
s(アマシャム社)を使用して本タンパク質遺伝子のc
DNAを5′上流領域および3′下流領域にわけ、増幅
した。
【0018】(表2)最小培地1L(pH6.5) グルコース 10g NaNO3 6g KH2PO4 1.5g KCl 0.5g MgSO4・7H2O 0.05g trace element solution 1.5mLtrace element solution 1L Na2B4O7・10H2O 0.04g CuSO4・5H2O 0.4g MnSO4・nH2O(n=4〜6) 0.8g Na2MoO4・2H2O 0.8g ZnSO4・7H2O 8h FeSO4・H2O(ferric) 1.23g
【0019】5′上流領域の増幅に使用したプライマー
は、配列番号7(図9)と8(図10)であり、3′上
流領域の増幅に使用したプライマーは、配列番号9(図
11)と10(図12)である。PCRによって増幅し
た5′上流領域約2.3kbpと3′下流領域約1.5
kbpのDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動
に供し、回収した後、この断片をpT7Blue−Tを
用いてクローニングし、塩基配列を決定した。その後、
これらの配列をコンピューター解析により連結し、連結
した配列をAopacC cDNAの全長の配列(配列
番号11:図13、図14)とした。さらにこのcDN
Aの塩基配列を解析した結果、1989bpからなるオ
ープンリーディングフレームの存在が明らかとなった。
は、配列番号7(図9)と8(図10)であり、3′上
流領域の増幅に使用したプライマーは、配列番号9(図
11)と10(図12)である。PCRによって増幅し
た5′上流領域約2.3kbpと3′下流領域約1.5
kbpのDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動
に供し、回収した後、この断片をpT7Blue−Tを
用いてクローニングし、塩基配列を決定した。その後、
これらの配列をコンピューター解析により連結し、連結
した配列をAopacC cDNAの全長の配列(配列
番号11:図13、図14)とした。さらにこのcDN
Aの塩基配列を解析した結果、1989bpからなるオ
ープンリーディングフレームの存在が明らかとなった。
【0020】上述した塩基配列の決定により得られた染
色体DNA由来の本タンパク質遺伝子およびcDNAを
比較した結果、染色体DNA上の本遺伝子は、2182
bpからなり(開始コドンATG〜終止コドンTAA:
配列番号6:図6、図7、図8)、94bpと56bp
の2つのイントロンの存在が確認された。図6〜図8中
の大文字アルファベットは、アミノ酸に翻訳される領域
を示す。また、cDNAの塩基配列からアミノ酸配列を
推定し(配列番号12:図15、図16)、解析した結
果、本タンパク質のN末端付近には、本タンパク質がD
NA結合タンパク質であることを示すジンクフィンガー
(Zinc Finger)構造が存在していた。さら
に、推定されたアミノ酸配列をBlast searc
hによって解析した結果、本タンパク質がアスペルギル
ス・ニガーおよびアスペルギルス・ニドランスのpac
Cタンパク質と高いホモロジーを示したことから、本遺
伝子がAopacC遺伝子であると結論付けた。
色体DNA由来の本タンパク質遺伝子およびcDNAを
比較した結果、染色体DNA上の本遺伝子は、2182
bpからなり(開始コドンATG〜終止コドンTAA:
配列番号6:図6、図7、図8)、94bpと56bp
の2つのイントロンの存在が確認された。図6〜図8中
の大文字アルファベットは、アミノ酸に翻訳される領域
を示す。また、cDNAの塩基配列からアミノ酸配列を
推定し(配列番号12:図15、図16)、解析した結
果、本タンパク質のN末端付近には、本タンパク質がD
NA結合タンパク質であることを示すジンクフィンガー
(Zinc Finger)構造が存在していた。さら
に、推定されたアミノ酸配列をBlast searc
hによって解析した結果、本タンパク質がアスペルギル
ス・ニガーおよびアスペルギルス・ニドランスのpac
Cタンパク質と高いホモロジーを示したことから、本遺
伝子がAopacC遺伝子であると結論付けた。
【0021】(4)染色体由来のAopacC遺伝子の
増幅および変異AopacC遺伝子の作製 先に得られたAopacC遺伝子の塩基配列を基に配列
番号13(図17)と14(図18)に示されるGpa
cC−M1とGpacC−RVプライマーを作製し、ア
スペルギルス・オリゼKBN616(FERM P−1
7333)の染色体DNAを鋳型としてPCRによって
AopacC遺伝子領域(GpacC:約3.4kb
p)を増幅した。
増幅および変異AopacC遺伝子の作製 先に得られたAopacC遺伝子の塩基配列を基に配列
番号13(図17)と14(図18)に示されるGpa
cC−M1とGpacC−RVプライマーを作製し、ア
スペルギルス・オリゼKBN616(FERM P−1
7333)の染色体DNAを鋳型としてPCRによって
AopacC遺伝子領域(GpacC:約3.4kb
p)を増幅した。
【0022】C末端が欠失したAopacCを発現させ
るために、変異AopacC遺伝子(以下、GpacC
M)を作製した。すなわち、アスペルギルス・オリゼK
BN616の染色体DNAを鋳型として、配列番号13
と16(図20)に示されるGpacC−M1とGpa
cCM−MRを使用し約1.85kbpの断片を、配列
番号14と15(図19)に示されるGpacC−RV
とGpacCM−MMを使用し約1.6kbpの断片を
増幅した。それらの断片をアガロースゲル電気泳動に供
し、アマシャム社製のGFX PCR DNA and
Gel Band Purification Ki
tを用いて回収した。
るために、変異AopacC遺伝子(以下、GpacC
M)を作製した。すなわち、アスペルギルス・オリゼK
BN616の染色体DNAを鋳型として、配列番号13
と16(図20)に示されるGpacC−M1とGpa
cCM−MRを使用し約1.85kbpの断片を、配列
番号14と15(図19)に示されるGpacC−RV
とGpacCM−MMを使用し約1.6kbpの断片を
増幅した。それらの断片をアガロースゲル電気泳動に供
し、アマシャム社製のGFX PCR DNA and
Gel Band Purification Ki
tを用いて回収した。
【0023】その後、これらの断片を鋳型として、Gp
acC−M1とGpacC−RVプライマーを用いてP
CRを行い、GpacCMを増幅し、停止コドンを導入
した(GAGをTAGに変更:図22)。GpacCM
上の変異導入領域(ACTAGT:図22)は、Spe
Iで切断が可能となり、これによってGpacCと区別
する事が可能である。GpacCMの塩基配列を配列番
号17(図21、図22、図23)に、またGpacC
Mによって発現する変異AopacCのアミノ酸配列を
配列番号18(図24)に示す。図21〜23中の大文
字の領域は、翻訳される領域を示す。
acC−M1とGpacC−RVプライマーを用いてP
CRを行い、GpacCMを増幅し、停止コドンを導入
した(GAGをTAGに変更:図22)。GpacCM
上の変異導入領域(ACTAGT:図22)は、Spe
Iで切断が可能となり、これによってGpacCと区別
する事が可能である。GpacCMの塩基配列を配列番
号17(図21、図22、図23)に、またGpacC
Mによって発現する変異AopacCのアミノ酸配列を
配列番号18(図24)に示す。図21〜23中の大文
字の領域は、翻訳される領域を示す。
【0024】(5)GpacCおよびGpacCMのア
スペルギルス・オリゼへの導入 本遺伝子を効率よくアスペルギルス・オリゼKBN61
6株に導入するために、まずUnkleらの方法(Mo
l.Gen.Genet.,218,99−1041
(1989))を用いて、硝酸還元酵素遺伝子(以下、
niaD)の変異によって、亜硝酸要求性を示すアスペ
ルギルス・オリゼKBN616−39株を作製した。次
に、組換えプラスミドpGpacC−niaDおよびp
GpacCM−niaD(図28)をそれぞれ構築し
た。
スペルギルス・オリゼへの導入 本遺伝子を効率よくアスペルギルス・オリゼKBN61
6株に導入するために、まずUnkleらの方法(Mo
l.Gen.Genet.,218,99−1041
(1989))を用いて、硝酸還元酵素遺伝子(以下、
niaD)の変異によって、亜硝酸要求性を示すアスペ
ルギルス・オリゼKBN616−39株を作製した。次
に、組換えプラスミドpGpacC−niaDおよびp
GpacCM−niaD(図28)をそれぞれ構築し
た。
【0025】構築方法は、まず、すでにGenBank
等に登録されているアスペルギルス・オリゼ由来のni
aDの塩基配列を基に配列番号19(図25)と20
(図26)に示されるniaD−M1とniaD−RV
プライマーを作製し、アスペルギルス・オリゼKBN6
16の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、nia
D(約5.2kbp)を取得した。ついで得られたni
aDを制限酵素HindIIIで処理し、pUC118の
HindIIIサイトにサブクローニングし、pniaD
(図28)を構築した。次に、先に作製したGpacC
およびGpacCMをPstIで処理し、両断片をそれ
ぞれpniaDのPstIサイトに導入し、pGpac
C−niaDおよびpGpacCM−niaDをそれぞ
れ構築した。
等に登録されているアスペルギルス・オリゼ由来のni
aDの塩基配列を基に配列番号19(図25)と20
(図26)に示されるniaD−M1とniaD−RV
プライマーを作製し、アスペルギルス・オリゼKBN6
16の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、nia
D(約5.2kbp)を取得した。ついで得られたni
aDを制限酵素HindIIIで処理し、pUC118の
HindIIIサイトにサブクローニングし、pniaD
(図28)を構築した。次に、先に作製したGpacC
およびGpacCMをPstIで処理し、両断片をそれ
ぞれpniaDのPstIサイトに導入し、pGpac
C−niaDおよびpGpacCM−niaDをそれぞ
れ構築した。
【0026】このようにして得られたpGpacC−n
iaDあるいは、pGpacCM−niaDをアスペル
ギルス・オリゼKBN616−39株にBallanc
eとTurnerの方法(Gene,36,321(1
985))により導入した。その結果、それぞれ約60株
の形質転換体を得た。その中から各10株を選択し、そ
れぞれをA培地およびB培地(培地組成を下記表3に示
す)で30℃、5日間培養した後、培養上清のアルカリ
プロテアーゼ活性を牛島らの方法(Agric.Bio
l.Chem,54(7),1667〜1676(19
90))にしたがって測定した。
iaDあるいは、pGpacCM−niaDをアスペル
ギルス・オリゼKBN616−39株にBallanc
eとTurnerの方法(Gene,36,321(1
985))により導入した。その結果、それぞれ約60株
の形質転換体を得た。その中から各10株を選択し、そ
れぞれをA培地およびB培地(培地組成を下記表3に示
す)で30℃、5日間培養した後、培養上清のアルカリ
プロテアーゼ活性を牛島らの方法(Agric.Bio
l.Chem,54(7),1667〜1676(19
90))にしたがって測定した。
【0027】(表3)A培地(pH6.0) 最小培地+10mM MES(pH6.0) MES:2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸B培地(pH8.0) 最小培地+10mM Tris−HCl(pH8.0)
【0028】その結果、pGpacC−niaDを導入
した10株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値は、A
培地で30units/mL、B培地で210unit
s/mLであった。さらに、pGpacCM−niaD
を導入した10株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値
は、A培地で280units/mL、B培地で300
units/mLであり、pH8.0およびpH6.0
の培地の場合でもアスペルギルス・オリゼKBN616
株のアルカリプロテアーゼ活性よりも優位に増加してい
た。
した10株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値は、A
培地で30units/mL、B培地で210unit
s/mLであった。さらに、pGpacCM−niaD
を導入した10株のアルカリプロテアーゼ活性の平均値
は、A培地で280units/mL、B培地で300
units/mLであり、pH8.0およびpH6.0
の培地の場合でもアスペルギルス・オリゼKBN616
株のアルカリプロテアーゼ活性よりも優位に増加してい
た。
【0029】これらの形質転換体の内、発現プラスミド
pGpacC−niaD及びpGpacCM−niaD
をそれぞれ導入した形質転換体をアスペルギルス・オリ
ゼ(Aspergillus oryzae)PCC及
びPCCMと命名し、アスペルギルス・オリゼPCCM
を工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−
18060として寄託した。
pGpacC−niaD及びpGpacCM−niaD
をそれぞれ導入した形質転換体をアスペルギルス・オリ
ゼ(Aspergillus oryzae)PCC及
びPCCMと命名し、アスペルギルス・オリゼPCCM
を工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−
18060として寄託した。
【0030】(6)アスペルギルス・オリゼPCC及び
アスペルギルス・オリゼPCCMの醤油麹培地でのアル
カリプロテアーゼ活性の比較 アスペルギルス・オリゼPCCあるいはアスペルギルス
・オリゼPCCM(FERM P−?????)を醤油麹
培地(培地組成を下記表4に示す)で培養し、アルカリ
プロテアーゼ活性を測定した。すなわち、醤油麹培地に
104/g個の胞子を植菌後、30℃で28時間培養
後、25℃で17時間培養した。その後、培地5gに滅
菌水50mLを加え、アスペルギルス・オリゼの生産す
る酵素を抽出した後、アルカリプロテアーゼ活性および
pHを測定した。その結果を表5に示す。アスペルギル
ス・オリゼPCCMは、親株アスペルギルス・オリゼK
BN616(FERM P−17333)及びアスペル
ギルス・オリゼPCCに比べ、アルカリプロテアーゼを
優位に多量に生産していることが確認された。なお、ア
スペルギルス・オリゼPCCも親株に比して、アルカリ
プロテアーゼを多量に生産していることも確認された。
アスペルギルス・オリゼPCCMの醤油麹培地でのアル
カリプロテアーゼ活性の比較 アスペルギルス・オリゼPCCあるいはアスペルギルス
・オリゼPCCM(FERM P−?????)を醤油麹
培地(培地組成を下記表4に示す)で培養し、アルカリ
プロテアーゼ活性を測定した。すなわち、醤油麹培地に
104/g個の胞子を植菌後、30℃で28時間培養
後、25℃で17時間培養した。その後、培地5gに滅
菌水50mLを加え、アスペルギルス・オリゼの生産す
る酵素を抽出した後、アルカリプロテアーゼ活性および
pHを測定した。その結果を表5に示す。アスペルギル
ス・オリゼPCCMは、親株アスペルギルス・オリゼK
BN616(FERM P−17333)及びアスペル
ギルス・オリゼPCCに比べ、アルカリプロテアーゼを
優位に多量に生産していることが確認された。なお、ア
スペルギルス・オリゼPCCも親株に比して、アルカリ
プロテアーゼを多量に生産していることも確認された。
【0031】(表4)醤油麹培地 脱脂加工大豆 10g 焙煎割砕小麦 10g H2O 15mL
【0032】 (表5) 各形質転換株のA、B及び醤油麹培地でのアルカリプロテアーゼ活性値 ──────────────────────────────────── A培地 B培地 醤油麹培地 醤油麹培地 (pH6.0) (pH8.0) 最終pH ──────────────────────────────────── A.oryzae 20 150 700 KBN616-39 (unit/mL (unit/mL (unit/g 6.48 (対照) 培養上清) 培養上清) 醤油麹) ──────────────────────────────────── A.oryzae KBN616-39 30 210 830 6.46 +pGpacC-niaD ──────────────────────────────────── A.oryzae KBN616-39 280 300 1200 6.49 +pGpacCM-niaD ────────────────────────────────────
【0033】
【発明の効果】本発明によって、アルカリプロテアーゼ
生産量をコントロールするタンパク質AopacCの遺
伝子およびアミノ酸配列を明らかにした。さらに構造遺
伝子の途中にストップコドンを導入し、C末端の欠失し
たAopacCタンパク質を菌体内で発現させることに
よって、弱酸性の培地(醤油麹培地)において、アルカ
リプロテアーゼの活性が増強した株を得ることができ
た。この方法に従って、麹菌を育種し醤油やみそなどの
醸造産業に利用することによって、原料窒素の利用率を
向上させることが期待できるだけでなく、アルカリプロ
テアーゼ自体を効率的に製造することもでき、試薬その
他の用途に広範に利用できる。
生産量をコントロールするタンパク質AopacCの遺
伝子およびアミノ酸配列を明らかにした。さらに構造遺
伝子の途中にストップコドンを導入し、C末端の欠失し
たAopacCタンパク質を菌体内で発現させることに
よって、弱酸性の培地(醤油麹培地)において、アルカ
リプロテアーゼの活性が増強した株を得ることができ
た。この方法に従って、麹菌を育種し醤油やみそなどの
醸造産業に利用することによって、原料窒素の利用率を
向上させることが期待できるだけでなく、アルカリプロ
テアーゼ自体を効率的に製造することもでき、試薬その
他の用途に広範に利用できる。
【0034】
【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 Secretary of Agency of Industrial Science and Technology; Higeta Shoyu Co., Ltd. 〈120〉 Gene Encoding DNA-binding Protein, Regulating Alkalineprotease Gene Expression, Amino Acid Sequence Thereof, And Method of Producing A Large Amount of Alkaline protease by Using Said Gene 〈130〉 6373 〈141〉 2000-9-29 〈160〉 20 〈210〉 1 〈211〉 37 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 1 gaacatgtst gcgagcgtca cgtyggccgm aagagca 37 〈210〉 2 〈211〉 39 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 2 catctgctgc aggaactgrt cratgttgat caagtcgtt 39 〈210〉 3 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 3 gaaggccttt ccacagaagt cacacttgtg 30 〈210〉 4 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 4 cacaagtgtg acttctgtgg aaaggccttc 30 〈210〉 5 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 5 gtaatacgac tcactatagg gc 22 〈210〉 6 〈211〉 3399 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 6 acccccgtct ttccagggtc tgattggcgc taacccatca cttttgtaag cggggcccga -835 gggttcgcag gtctccggta atgctgttgt atggtacgtt tcaggtcggc tgccgatcgt -775 gacatgtgga cactatattg gggaataata ttgagttaag tagtgtcatt ctgacggtgc -715 attggaggta tcattctgag aaacgaatcc gtttccaggg gattgattat gccaggttgc -655 ctttctcctt tttcccattt tgtttttttc tttctccttg ctttgctagt aagatgtgtc -595 cactcttcct gtgaaatatt acggagtaga acaaggaaaa aagtggtggc ctaattttcc -535 tgcacgtgcg gtatcgtacc agaccaatac gggaagtaag gagcgccaca gccccgcatc -475 attcttggcc cggtcttgtc gtcttgtccc tgtcctccgc cgggctgtgc aagcggtctt -415 ttctgggcaa ggctcggctc cggatgtccg cacaggacaa gaacccaagc ctccccctct -355 tgcttccaag acttcctctc ttcttatctc tccccatatt tccccctgaa ttgtcctgtc -295 tgtctttttc ccagtcttcc cttcactccc ccctttcatt tatatcatct tgtgtttttc -235 acaacagttc tatattcggt aacatacgcg tgttgcattg gtagttgttg tcattgccaa -175 ctcatcgcgt cttaccttct ctccccatcc ctgatcttcc ttattagcca gaagtccctt -115 ggcttggaca tctttggttg tctattgagg aacatcccac ttggtttgac ttgtattgag -55 tcctttcacg acgacttccg ctcccaagaa aagggacaag aaattttctt ggcaatgtcg 6 gaaccccaag acaccacttc cccttcgact gcggctgctc ctattgccgc gtcgacttcg 66 catgagcaac cccaaaccca gtcgccgcct caagtctctg ctaccacgac atcctcggtg 126 acggcaaccg cagccgcagc gaccgcagct gtggcatctc cccctgttaa tggtgctgcg 186 cgcccgaccg aagagttgtc ttgtctttgg caaggatgtt ctgagaagtg tcccacccca 246 gaatccctct atgtaagctc acccgtgatc ccatactcct gcgatcatcg tcaccccaca 306 cagcaggcat tgttgccact tgtcctttcg acatatcaca tgggagcacc tcaatcgctt 366 acttttgaac gtagctgatc atgttatagg agcacgtctg cgaacgtcac gtaggtcgca 426 agagcacaaa taatctcaac ttgacttgcc aatggggcag ttgccgaact actactgtta 486 agcgcgacca tatcacctct catatccgag tacatgtgcc tttaaaacct cacaagtgtg 546 acttctgtgg aaaggccttc aagcgccctc aggacttgaa gaaacatgtc aagacacatg 606 cagatgattc ggttctggtt cggtcacctg aaccgggttc ccggaatcca gatataatgt 666 ttggaggtaa cccagcaaaa ggtgtgtcct gtgtctctag ctgcattcgc tgcgtaactg 726 accctatgga gctctaggct atgctaccgc tacgcattac ttcgaacccg ccttaaaccc 786 cgtccccagc cagggttatg ctcacggagc tcctcagtac tatcaatctc atcatccacc 846 tcaaccagcg aacccgtctt acggtaacgt ttactatgcg cttaatcacg gacatgaggc 906 cggccacgca tcatacgagt cgaaaaagcg tggatatgat gccctaaacg agtttttcgg 966 tgacctcaag cgtcgccagt tcgatccaaa ctcgtacacc gcagttgggc aacgcctact 1026 tggtttacaa agcctgtctc ttcccattct cagcggtggc ccactccctg aatatcaacc 1086 catgcctgcg cctgtggcag taggtggcgg aggctatagc cctggtggac atcctcccgc 1146 tcccgcgtat catctccctc ccatgagtaa cgtccgtacc aagaacgacc tgatcaacat 1206 cgatcagttc ttgcagcaga tgcaggatac catctatgaa aatgacgaca acgtggcagc 1266 tgctggtgtt gctcagccgg gtgcccatta cgttcatggc ggcatgagct atcgcaccac 1326 ccactcgcca cccagtcagc tgcctccaag ccatgctacg gccaccactt ccgcaggccc 1386 cattatggct aatcctgcga cccattcgcc gactgggaca cccgcactca caccaccctc 1446 gagcgcgcaa tcgtatacct ctggtcggtc gcccatctcc ctgccgtcaa caagccgggt 1506 atctcctcct catcacgaag gtggctcaag catgtacccc cgccttccat cggctactat 1566 gtctgacagc atggccgctg gctacccgac cacatcaagc gcagctcctc cgtccactct 1626 tggtggtatc tttgaccatg atgatcgtcg ccggtatacc ggtggcacct tacaacgcgc 1686 aaggccagag gagcgtcatc tacctgagcc aatggatctg tctcatgata ataaggatga 1746 cggagagcgg acaccacctg ccaagccgcg tcaagcaccc tcgtcacccg gtcgcatctc 1806 cgctagcttg attgaccctg ctctttcggg ctcggcaaac gaagcagaga cgatgcggac 1866 ggcccaagcc gcgactgagg tcgctgagcg atcagacgtg cagtgggttg aaaaggttcg 1926 ccttatcgag tacctgcgca attacatcgc gtctcgtctc gaacggggtg aatatgacgg 1986 cgattcaggc atgactcgtg agtcgcgcac cccagaggct ggacccgatg gccacatgga 2046 aggtgtggag accgagcccg tttctcatcc tgccaagtgt gagtccccgg tgaaacctga 2106 ggcgggaggt gatacggtga tgtacccaac actacgggga gtggatgagg atggtgattc 2166 taagatgcct aattaagcga tattcttcag actggtctgt ttgcgtttcc atgatctgtt 2226 actctactct tgtgcatcct tttatttacg gctcgttacg aaaccgttgt gggagtttgt 2286 cttatctcgc tttgtttctt tgcactgaat tgtggatctt gactaccgaa tacctactat 2346 ttttgtaacc gccggtcgtg tatttgtttt tgtaagaacg tttggttcga acatttctcg 2406 ttcttgtata gtggggagtt ctgaatgtaa aggataggga tttgggtaca atttatctta 2466 ttattttccc ccctcttttt aattattatt ttccttccc 2505 〈210〉 7 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 7 ggcaatgtcg gaaccccaag acacc 25 〈210〉 8 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 8 cacaggcgca ggcatgggtt ga 22 〈210〉 9 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 9 cctgtctctt cccattctca gc 22 〈210〉 10 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 10 ttaattaggc atcttagaat ca 22 〈210〉 11 〈211〉 1989 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 11 atgtcggaac cccaagacac cacttcccct tcgactgcgg ctgctcctat tgccgcgtcg 60 acttcgcatg agcaacccca aacccagtcg ccgcctcaag tctctgctac cacgacatcc 120 tcggtgacgg caaccgcagc cgcagcgacc gcagctgtgg catctccccc tgttaatggt 180 gctgcgcgcc cgaccgaaga gttgtcttgt ctttggcaag gatgttctga gaagtgtccc 240 accccagaat ccctctatga gcacgtctgc gaacgtcacg taggtcgcaa gagcacaaat 300 aatctcaact tgacttgcca atggggcagt tgccgaacta ctactgttaa gcgcgaccat 360 atcacctctc atatccgagt acatgtgcct ttaaaacctc acaagtgtga cttctgtgga 420 aaggccttca agcgccctca ggacttgaag aaacatgtca agacacatgc agatgattcg 480 gttctggttc ggtcacctga accgggttcc cggaatccag atataatgtt tggaggtaac 540 ccagcaaaag gctatgctac cgctacgcat tacttcgaac ccgccttaaa ccccgtcccc 600 agccagggtt atgctcacgg agctcctcag tactatcaat ctcatcatcc acctcaacca 660 gcgaacccgt cttacggtaa cgtttactat gcgcttaatc acggacatga ggccggccac 720 gcatcatacg agtcgaaaaa gcgtggatat gatgccctaa acgagttttt cggtgacctc 780 aagcgtcgcc agttcgatcc aaactcgtac accgcagttg ggcaacgcct acttggttta 840 caaagcctgt ctcttcccat tctcagcggt ggcccactcc ctgaatatca acccatgcct 900 gcgcctgtgg cagtaggtgg cggaggctat agccctggtg gacatcctcc cgctcccgcg 960 tatcatctcc ctcccatgag taacgtccgt accaagaacg acctgatcaa catcgatcag 1020 ttcttgcagc agatgcagga taccatctat gaaaatgacg acaacgtggc agctgctggt 1080 gttgctcagc cgggtgccca ttacgttcat ggcggcatga gctatcgcac cacccactcg 1140 ccacccagtc agctgcctcc aagccatgct acggccacca cttccgcagg ccccattatg 1200 gctaatcctg cgacccattc gccgactggg acacccgcac tcacaccacc ctcgagcgcg 1260 caatcgtata cctctggtcg gtcgcccatc tccctgccgt caacaagccg ggtatctcct 1320 cctcatcacg aaggtggctc aagcatgtac ccccgccttc catcggctac tatgtctgac 1380 agcatggccg ctggctaccc gaccacatca agcgcagctc ctccgtccac tcttggtggt 1440 atctttgacc atgatgatcg tcgccggtat accggtggca ccttacaacg cgcaaggcca 1500 gaggagcgtc atctacctga gccaatggat ctgtctcatg ataataagga tgacggagag 1560 cggacaccac ctgccaagcc gcgtcaagca ccctcgtcac ccggtcgcat ctccgctagc 1620 ttgattgacc ctgctctttc gggctcggca aacgaagcag agacgatgcg gacggcccaa 1680 gccgcgactg aggtcgctga gcgatcagac gtgcagtggg ttgaaaaggt tcgccttatc 1740 gagtacctgc gcaattacat cgcgtctcgt ctcgaacggg gtgaatatga cggcgattca 1800 ggcatgactc gtgagtcgcg caccccagag gctggacccg atggccacat ggaaggtgtg 1860 gagaccgagc ccgtttctca tcctgccaag tgtgagtccc cggtgaaacc tgaggcggga 1920 ggtgatacgg tgatgtaccc aacactacgg ggagtggatg aggatggtga ttctaagatg 1980 cctaattaa 1989 〈210〉 12 〈211〉 662 〈212〉 PRT 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 12 Met Ser Glu Pro Gln Asp Thr Thr Ser Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ser Thr Ser His Glu Gln Pro Gln Thr Gln Ser Pro Pro 20 25 30 Gln Val Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Pro Pro Val Asn Gly Ala Ala Arg Pro 50 55 60 Thr Glu Glu Leu Ser Cys Leu Trp Gln Gly Cys Ser Glu Lys Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Glu Ser Leu Tyr Glu His Val Cys Glu Arg His Val Gly Arg 85 90 95 Lys Ser Thr Asn Asn Leu Asn Leu Thr Cys Gln Trp Gly Ser Cys Arg 100 105 110 Thr Thr Thr Val Lys Arg Asp His Ile Thr Ser His Ile Arg Val His 115 120 125 Val Pro Leu Lys Pro His Lys Cys Asp Phe Cys Gly Lys Ala Phe Lys 130 135 140 Arg Pro Gln Asp Leu Lys Lys His Val Lys Thr His Ala Asp Asp Ser 145 150 155 160 Val Leu Val Arg Ser Pro Glu Pro Gly Ser Arg Asn Pro Asp Ile Met 165 170 175 Phe Gly Gly Asn Pro Ala Lys Gly Tyr Ala Thr Ala Thr His Tyr Phe 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Asn Pro Val Pro Ser Gln Gly Tyr Ala His Gly Ala 195 2OO 205 Pro Gln Tyr Tyr Gln Ser His His Pro Pro Gln Pro Ala Asn Pro Ser 210 215 220 Tyr Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Leu Asn His Gly His Glu Ala Gly His 225 230 235 240 Ala Ser Tyr Glu Ser Lys Lys Arg Gly Tyr Asp Ala Leu Asn Glu Phe 245 250 255 Phe Gly Asp Leu Lys Arg Arg Gln Phe Asp Pro Asn Ser Tyr Thr Ala 260 265 270 Val Gly Gln Arg Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Ser Leu Pro Ile Leu 275 280 285 Ser Gly Gly Pro Leu Pro Glu Tyr Gln Pro Met Pro Ala Pro Val Ala 290 295 300 Val Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Pro Gly Gly His Pro Pro Ala Pro Ala 305 310 315 320 Tyr His Leu Pro Pro Met Ser Asn Val Arg Thr Lys Asn Asp Leu Ile 325 330 335 Asn Ile Asp Gln Phe Leu Gln Gln Met Gln Asp Thr Ile Tyr Glu Asn 340 345 350 Asp Asp Asn Val Ala Ala Ala Gly Val Ala Gln Pro Gly Ala His Tyr 355 360 365 Val His Gly Gly Met Ser Tyr Arg Thr Thr His Ser Pro Pro Ser Gln 370 375 380 Leu Pro Pro Ser His Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala Gly Pro Ile Met 385 390 395 400 Ala Asn Pro Ala Thr His Ser Pro Thr Gly Thr Pro Ala Leu Thr Pro 405 410 415 Pro Ser Ser Ala Gln Ser Tyr Thr Ser Gly Arg Ser Pro Ile Ser Leu 420 425 430 Pro Ser Thr Ser Arg Val Ser Pro Pro His His Glu Gly Gly Ser Ser 435 440 445 Met Tyr Pro Arg Leu Pro Ser Ala Thr Met Ser Asp Ser Met Ala Ala 450 455 460 Gly Tyr Pro Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro Pro Ser Thr Leu Gly Gly 465 470 475 480 Ile Phe Asp His Asp Asp Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Gly Thr Leu Gln 485 490 495 Arg Ala Arg Pro Glu Glu Arg His Leu Pro Glu Pro Met Asp Leu Ser 500 505 510 His Asp Asn Lys Asp Asp Gly Glu Arg Thr Pro Pro Ala Lys Pro Arg 515 520 525 Gln Ala Pro Ser Ser Pro Gly Arg Ile Ser Ala Ser Leu Ile Asp Pro 530 535 540 Ala Leu Ser Gly Ser Ala Asn Glu Ala Glu Thr Met Arg Thr Ala Gln 545 550 555 560 Ala Ala Thr Glu Val Ala Glu Arg Ser Asp Val Gln Trp Val Glu Lys 565 570 575 Val Arg Leu Ile Glu Tyr Leu Arg Asn Tyr Ile Ala Ser Arg Leu Glu 580 585 590 Arg Gly Glu Tyr Asp Glu Asp Ser Gly Met Thr Arg Glu Ser Arg Thr 595 600 605 Pro Glu Ala Gly Pro Asp Gly His Met Glu Gly Val Glu Thr Glu Pro 610 615 620 Val Ser His Pro Ala Lys Cys Glu Ser Pro Val Lys Pro Glu Ala Gly 625 630 635 640 Gly Asp Thr Val Met Tyr Pro Thr Leu Arg Gly Val Asp Glu Asp Gly 645 650 655 Asp Ser Lys Met Pro Asn 660 〈210〉 13 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 13 ggctgcagac ccccgtcttt ccagggtctg attgg 35 〈210〉 14 〈211〉 37 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 14 ggctgcaggg aaggaaaata ataattaaaa agagggg 37 〈210〉 15 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 15 gcatcatact agtcgaaaaa gcgtggatat 30 〈210〉 16 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 16 atatccacgc tttttcgact agtatgatgc 30 〈210〉 17 〈211〉 3414 〈212〉 DNA 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 17 ggctgcagac ccccgtcttt ccagggtctg attggcgcta acccatcact tttgtaagcg -843 gggcccgagg gttcgcaggt ctccggtaat gctgttgtat ggtacgtttc aggtcggctg -783 ccgatcgtga catgtggaca ctatattggg gaataatatt gagttaagta gtgtcattct -723 gacggtgcat tggaggtatc attctgagaa acgaatccgt ttccagggga ttgattatgc -663 caggttgcct ttctcctttt tcccattttg tttttttctt tctccttgct ttgctagtaa -603 gatgtgtcca ctcttcctgt gaaatattac ggagtagaac aaggaaaaaa gtggtggcct -543 aattttcctg cacgtgcggt atcgtaccag accaatacgg gaagtaagga gcgccacagc -483 cccgcatcat tcttggcccg gtcttgtcgt cttgtccctg tcctccgccg ggctgtgcaa -423 gcggtctttt ctgggcaagg ctcggctccg gatgtccgca caggacaaga acccaagcct -363 ccccctcttg cttccaagac ttcctctctt cttatctctc cccatatttc cccctgaatt -303 gtcctgtctg tctttttccc agtcttccct tcactccccc ctttcattta tatcatcttg -243 tgtttttcac aacagttcta tattcggtaa catacgcgtg ttgcattggt agttgttgtc -183 attgccaact catcgcgtct taccttctct ccccatccct gatcttcctt attagccaga -123 agtcccttgg cttggacatc tttggttgtc tattgaggaa catcccactt ggtttgactt -63 gtattgagtc ctttcacgac gacttccgct cccaagaaaa gggacaagaa attttcttgg -3 caatgtcgga accccaagac accacttccc cttcgactgc ggctgctcct attgccgcgt 58 cgacttcgca tgagcaaccc caaacccagt cgccgcctca agtctctgct accacgacat 118 cctcggtgac ggcaaccgca gccgcagcga ccgcagctgt ggcatctccc cctgttaatg 178 gtgctgcgcg cccgaccgaa gagttgtctt gtctttggca aggatgttct gagaagtgtc 238 ccaccccaga atccctctat gtaagctcac ccgtgatccc atactcctgc gatcatcgtc 298 accccacaca gcaggcattg ttgccacttg tcctttcgac atatcacatg ggagcacctc 358 aatcgcttac ttttgaacgt agctgatcat gttataggag cacgtctgcg aacgtcacgt 418 aggtcgcaag agcacaaata atctcaactt gacttgccaa tggggcagtt gccgaactac 478 tactgttaag cgcgaccata tcacctctca tatccgagta catgtgcctt taaaacctca 538 caagtgtgac ttctgtggaa aggccttcaa gcgccctcag gacttgaaga aacatgtcaa 598 gacacatgca gatgattcgg ttctggttcg gtcacctgaa ccgggttccc ggaatccaga 658 tataatgttt ggaggtaacc cagcaaaagg tgtgtcctgt gtctctagct gcattcgctg 718 cgtaactgac cctatggagc tctaggctat gctaccgcta cgcattactt cgaacccgcc 778 ttaaaccccg tccccagcca gggttatgct cacggagctc ctcagtacta tcaatctcat 838 catccacctc aaccagcgaa cccgtcttac ggtaacgttt actatgcgct taatcacgga 898 catgaggccg gccacgcatc atactagtcg aaaaagcgtg gatatgatgc cctaaacgag 958 tttttcggtg acctcaagcg tcgccagttc gatccaaact cgtacaccgc agttgggcaa 1018 cgcctacttg gtttacaaag cctgtctctt cccattctca gcggtggccc actccctgaa 1078 tatcaaccca tgcctgcgcc tgtggcagta ggtggcggag gctatagccc tggtggacat 1138 cctcccgctc ccgcgtatca tctccctccc atgagtaacg tccgtaccaa gaacgacctg 1198 atcaacatcg atcagttctt gcagcagatg caggatacca tctatgaaaa tgacgacaac 1258 gtggcagctg ctggtgttgc tcagccgggt gcccattacg ttcatggcgg catgagctat 1318 cgcaccaccc actcgccacc cagtcagctg cctccaagcc atgctacggc caccacttcc 1378 gcaggcccca ttatggctaa tcctgcgacc cattcgccga ctgggacacc cgcactcaca 1438 ccaccctcga gcgcgcaatc gtatacctct ggtcggtcgc ccatctccct gccgtcaaca 1498 agccgggtat ctcctcctca tcacgaaggt ggctcaagca tgtacccccg ccttccatcg 1558 gctactatgt ctgacagcat ggccgctggc tacccgacca catcaagcgc agctcctccg 1618 tccactcttg gtggtatctt tgaccatgat gatcgtcgcc ggtataccgg tggcacctta 1678 caacgcgcaa ggccagagga gcgtcatcta cctgagccaa tggatctgtc tcatgataat 1738 aaggatgacg gagagcggac accacctgcc aagccgcgtc aagcaccctc gtcacccggt 1798 cgcatctccg ctagcttgat tgaccctgct ctttcgggct cggcaaacga agcagagacg 1858 atgcggacgg cccaagccgc gactgaggtc gctgagcgat cagacgtgca gtgggttgaa 1918 aaggttcgcc ttatcgagta cctgcgcaat tacatcgcgt ctcgtctcga acggggtgaa 1978 tatgacggcg attcaggcat gactcgtgag tcgcgcaccc cagaggctgg acccgatggc 2038 cacatggaag gtgtggagac cgagcccgtt tctcatcctg ccaagtgtga gtccccggtg 2098 aaacctgagg cgggaggtga tacggtgatg tacccaacac tacggggagt ggatgaggat 2158 ggtgattcta agatgcctaa ttaagcgata ttcttcagac tggtctgttt gcgtttccat 2218 gatctgttac tctactcttg tgcatccttt tatttacggc tcgttacgaa accgttgtgg 2278 gagtttgtct tatctcgctt tgtttctttg cactgaattg tggatcttga ctaccgaata 2338 cctactattt ttgtaaccgc cggtcgtgta tttgtttttg taagaacgtt tggttcgaac 2398 atttctcgtt cttgtatagt ggggagttct gaatgtaaag gatagggatt tgggtacaat 2458 ttatcttatt attttccccc ctctttttaa ttattatttt ccttccctgc agcc 2512 〈210〉 18 〈211〉 243 〈212〉 PRT 〈213〉 Aspergillus oryzae 〈400〉 18 Met Ser Glu Pro Gln Asp Thr Thr Ser Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ser Thr Ser His Glu Gln Pro Gln Thr Gln Ser Pro Pro 20 25 30 Gln Val Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Pro Pro Val Asn Gly Ala Ala Arg Pro 50 55 60 Thr Glu Glu Leu Ser Cys Leu Trp Gln Gly Cys Ser Glu Lys Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Glu Ser Leu Tyr Glu His Val Cys Glu Arg His Val Gly Arg 85 90 95 Lys Ser Thr Asn Asn Leu Asn Leu Thr Cys Gln Trp Gly Ser Cys Arg 100 105 110 Thr Thr Thr Val Lys Arg Asp His Ile Thr Ser His Ile Arg Val His 115 120 125 Val Pro Leu Lys Pro His Lys Cys Asp Phe Cys Gly Lys Ala Phe Lys 130 135 140 Arg Pro Gln Asp Leu Lys Lys His Val Lys Thr His Ala Asp Asp Ser 145 150 155 160 Val Leu Val Arg Ser Pro Glu Pro Gly Ser Arg Asn Pro Asp Ile Met 165 170 175 Phe Gly Gly Asn Pro Ala Lys Gly Tyr Ala Thr Ala Thr His Tyr Phe 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Asn Pro Val Pro Ser Gln Gly Tyr Ala His Gly Ala 195 200 205 Pro Gln Tyr Tyr Gln Ser His His Pro Pro Gln Pro Ala Asn Pro Ser 210 215 220 Tyr Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Leu Asn His Gly His Glu Ala Gly His 225 230 235 240 Ala Ser Tyr 243 〈210〉 19 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 19 gggaagctta acaggcccca aattcaatta 30 〈210〉 20 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 20 gggaagcttt ggatttccta cgtcttcaat 30
【図1】配列番号1のミックスプライマーを示す。
【図2】配列番号2のミックスプライマーを示す。
【図3】配列番号3のAopacC−5′取得用プライ
マーを示す。
マーを示す。
【図4】配列番号4のAopacC−3′取得用プライ
マーを示す。
マーを示す。
【図5】配列番号5のアニーリング用プライマーを示
す。
す。
【図6】配列番号6のpacC遺伝子の塩基配列を示
す。
す。
【図7】同上つづきを示す。
【図8】同上つづきを示す。
【図9】配列番号7の5′上流領域の増幅用プライマー
を示す。
を示す。
【図10】配列番号8の5′上流領域の増幅用プライマ
ーを示す。
ーを示す。
【図11】配列番号9の3′上流領域の増幅用プライマ
ーを示す。
ーを示す。
【図12】配列番号10の3′上流領域の増幅用プライ
マーを示す。
マーを示す。
【図13】配列番号11の本遺伝子cDNAの塩基配列
を示す。
を示す。
【図14】同上つづきを示す。
【図15】配列番号12のAopacCのアミノ酸配列
を示す。
を示す。
【図16】同上つづきを示す。
【図17】配列番号13のプライマーGpacC−M1
を示す。
を示す。
【図18】配列番号14のプライマーGpacC−RV
を示す。
を示す。
【図19】配列番号15のプライマーGpacCM−M
Mを示す。
Mを示す。
【図20】配列番号16のプライマーGpacCM−M
Rを示す。
Rを示す。
【図21】配列番号17のGpacCMの塩基配列を示
す。
す。
【図22】同上つづきを示す。
【図23】同上つづきを示す。
【図24】配列番号18の変異AopacCのアミノ酸
配列を示す。
配列を示す。
【図25】配列番号19のプライマーniaD−M1を
示す。
示す。
【図26】配列番号20のプライマーniaD−RVを
示す。
示す。
【図27】アスペルギルス・オリゼのpacCの染色体
上の遺伝子の制限酵素地図を示す。図中、AopacC
−5′およびAopacC−3′は、染色体DNAライ
ブラリーを使用し、増幅された領域。制限酵素地図は、
塩基配列を決定した領域のみを示している。
上の遺伝子の制限酵素地図を示す。図中、AopacC
−5′およびAopacC−3′は、染色体DNAライ
ブラリーを使用し、増幅された領域。制限酵素地図は、
塩基配列を決定した領域のみを示している。
【図28】pGpacC−niaD、pGpacCM−
niaDの構築法を示す。
niaDの構築法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 田中 昭光 千葉県銚子市飯沼町8−6 Fターム(参考) 4B024 AA03 AA05 BA14 BA80 CA03 CA04 DA11 EA04 FA01 GA11 GA19 GA27 4B050 CC03 DD03 EE01 LL02 LL04 LL05 4B065 AA63X AA63Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BB01 BC01 BC03 BC31 CA33 CA42
Claims (7)
- 【請求項1】 配列表の配列番号12のアミノ酸配列で
示されるDNA結合タンパク質。 - 【請求項2】 配列表の配列番号6の塩基配列で示さ
れ、請求項1に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
結合タンパク質遺伝子を含むDNA。 - 【請求項3】 配列表の配列番号18のアミノ酸配列で
示されるDNA結合タンパク質。 - 【請求項4】 配列表の配列番号17の塩基配列で示さ
れ、請求項3に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
結合タンパク質遺伝子を含むDNA。 - 【請求項5】 請求項2又は4に記載のDNAの少なく
ともひとつを含有してなる組換えプラスミド。 - 【請求項6】 請求項5に記載の組換えプラスミドを導
入してなる形質転換体アスペルギルス・オリゼ(Asp
ergillus oryzae)PCC又はアスペル
ギルス・オリゼ(Aspergillus oryza
e)PCCM(FERM P−18060)。 - 【請求項7】 請求項2又は4に記載のDNAを利用す
ること、を特徴とする麹菌アルカリプロテアーゼ生産量
の増強法。
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---|---|---|---|
JP2000299295A JP2002101888A (ja) | 2000-09-29 | 2000-09-29 | アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するdna結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法 |
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ID=18781126
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JP2000299295A Pending JP2002101888A (ja) | 2000-09-29 | 2000-09-29 | アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するdna結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法 |
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-
2000
- 2000-09-29 JP JP2000299295A patent/JP2002101888A/ja active Pending
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