JP6836904B2 - シマツナソおよびコウマ由来のｗｕｓｃｈｅｌ関連ホメオボックス４（ｗｏｘ４）タンパク質をコードするヌクレオチド配列および使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月２２日に出願された米国仮出願第６１／９０７，６１７号の利益を主張し、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、概して、分子生物学の分野、ならびに植物におけるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質（ＷＯＸ４）ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することにより繊維収量関連の形質を増強するための方法に関する。より具体的には、本発明は、２種のジュート植物、すなわち、シマツナソ（Ｃ．ｏｌｉｔｏｒｉｕｓ）およびコウマ（Ｃ．ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ）から単離されたＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同体、ならびにジュート植物、およびそのジュートのトランスジェニック植物における靱皮繊維の産生におけるその適用を提供する。

ジュートは、環境に優しく、生分解可能な天然繊維である。それは、土地の単位面積あたり高いバイオマス産生を有する再生可能資源である。１００超のジュート種（近縁野生種を含む）は、天然靱皮繊維を産生する。ジュートは、元々はシナノキ科、最近では、アオイ科に分類されていた、シナソ属（ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ）の植物から産生される。しかしながら、これらのうちの２種であるシマツナソおよびコウマが、工業目的で用いるのに適した高品質の繊維を産生する。天然繊維であるジュートは、合成繊維を補完または代替する様々な方法で使用することができ、工業から高まる注目を集めている。ジュート繊維に対する上昇する世界的需要があるため、ジュート繊維製品のさらなる改善が必要である。したがって、繊維の生合成を研究し、この繊維の生合成に関与する分子生物学を探索することへの大いなる関心がある。

ジュートの繊維は、２種の繊維：（ｉ）細胞分裂および改変を通して原生篩部領域内の前形成層から発育する一次師部繊維、および（ｉｉ）紡錘状および放射組織始原細胞の活性による形成層から発育する二次師部繊維、からなるおよび／またはそれらを含む木部外繊維である（Ｍａｉｔｉ ａｎｄ Ｍｉｔｒａ，１９７２．Ｂｕｌｌ Ｂｏｔ Ｓｏｃ Ｂｅｎｇａｌ ２６：７９−８５）。これらの前形成層および形成層組織は、管状要素分化抑制因子（ＴＩＤＦ）およびＴＤＩＦ受容体（ＴＤＲ）膜タンパク質キナーゼにより媒介される細胞間を連通し、前形成層細胞の増殖を促進し、それらの木部の分化を抑制する（図１、Ｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２２：２６１８−２６２９、Ｅｔｃｈｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４０，２２２４−２２３４）。

ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス（ＷＯＸ）遺伝子ファミリーは、様々な胚、分裂組織、および器官の始原細胞の開始および／または維持中、関連機能を行う（Ｈａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス（ＷＯＸ）遺伝子ファミリータンパク質の中で、ＷＯＸ４は、ＴＤＩＦシグナル伝達経路の重要な調節因子として作用し（Ｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１０）、前形成層および形成層において優先的に発現した（Ｓｃｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０、およびＨｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１０）。例えば、ＴＤＩＦ−ＴＤＲは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびトマトにおける前形成層／形成層幹細胞の維持を促進する、マスター転写因子であるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の転写を誘導する。

ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）ポリペプチドは、植物における靱皮繊維の開始を触媒する。しかしながら、このポリペプチドに関する先行技術に提供されるあまり多くの特徴付けの報告も既存の技術もない。米国特許第２０１１／０２８３４２０ Ａ１号（参照により組み込まれる）は、植物における収量関連の形質の増強に関するｗｕｓｃｈｅｌ関連ホメオボックス１様（ＷＯＸ１様）ポリペプチドを開示している。別の欧州特許第１４５１３０１ Ｂ１号では、植物における体細胞胚形成の促進におけるｗｕｓｃｈｅｌ遺伝子の使用が開示された。近年、一部のｗｕｓｃｈｅｌ遺伝子の相同体が、米国特許第２０１０／０１００９８１ Ａ１号（参照により組み込まれる）において開示された。

ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質がジュート繊維の生合成経路において重要な役割を果たし得るという事実を考慮して、工業にとっては、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の分子生物学的および遺伝子情報を探索し、利用することにより植物における繊維の生合成に関する遺伝学的アプローチを提供することが望ましい。さらに、植物のそれぞれの種の繊維の生合成経路および遺伝的構成が異なるため、種特異的なアプローチもまた、ジュート植物からの繊維の収量を最適化し、かつ、工業での使用を可能にする適合結果を得るために好ましい。

本発明の一態様は、特に、靱皮繊維形成の開始を触媒することに関与するシマツナソおよびコウマに由来するタンパク質をコードし、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有する遺伝子を提供することである。より具体的には、本発明は、師部繊維を誘導する能力を有し、それ故に、それによりコードされたタンパク質を提供する遺伝子、およびその使用を提供する。

本発明の別の目的は、植物シマツナソおよびコウマ、ならびに他の靱皮繊維を産生する植物における繊維の産生、成長、強度、および収量の改善のために活用される／利用されるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の分子生物学的および遺伝子情報を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、植物におけるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の生合成を調節することにより増大した繊維産生を有するシマツナソおよびコウマのトランスジェニック植物を得ることである。

本発明のさらに別の目的は、開示された方法の性能を促進し、かつシマツナソおよびコウマのトランスジェニック植物へのアクセスを提供し得る、特定のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供することである。

本発明のさらなる目的は、ジュート繊維系産物の繊維の産生を増加させるための潜在的な商業的に実現可能な方法を提供することである。

本発明は、師部繊維形成の開始を触媒することに関与する、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパク質をコードするシマツナソから単離された遺伝子を提供する。本発明はまた、師部繊維形成の開始を触媒することに関与する、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１つもしくは複数のアミノ酸の付加もしくは欠失、および／または他のアミノ酸との置換により修飾された アミノ酸配列を有し、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有 するタンパク質をコードする遺伝子をさらに提供する。本発明は、配列番号１に記載の核酸、具体的には、そのＤＮＡもしくはその一部をハイブリダイズし、かつ師部繊維形成の開始を触媒することに関与し、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに提供する。

本発明は、師部繊維形成の開始を触媒することに関与する、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパク質をコードするコウマから単離された遺伝子も提供する。本発明はまた、師部繊維形成の開始を触媒することに関与する、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１つもしくは複数のアミノ酸の付加もしくは欠失、および／または他のアミノ酸との置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに提供する。本発明は、配列番号４に記載の核酸、具体的には、そのＤＮＡまたはその一部をハイブリダイズし、かつ師部繊維形成の開始を触媒することに関与し、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパ ク質をコードする遺伝子をさらに提供する。

本発明の好ましい実施形態のうちの１つによれば、使用された植物シマツナソは、品種Ｏ−４であり、使用された植物コウマは、品種ＣＶＬ−１である。

本発明の別の実施形態は、配列番号２および／または配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物を開示し、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、宿主細胞において発現されて、植物シマツナソおよびコウマにおけるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同体を産生することができる。

本発明のさらなる実施形態は、配列番号２および／または配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを発現させて、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質の相同体を産生することができる組換え遺伝子構築物を含む形質転換体である。

本発明はまた、上記の宿主を培養および／または栽培することを含む、師部繊維の開始における触媒活性に関与し、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）様配列を有するタンパク質を産生するための方法も提供する。

本発明はまた、植物または植物細胞の師部繊維の開始を誘導するための方法も提供し、さらに、植物または植物細胞に上記の遺伝子を導入することと、前記遺伝子の発現を行うことと、を含み、かつ／またはそれらからなる方法も開示する。

当業者は、本発明が目的を実行し、上記の目的および利点ならびにその中に内在するものを得るために十分適応されることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される実施形態は、本発明の範囲の制限を意図するものではない。

本発明のこれらのおよび他の特性、態様、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲を参照すれば、より良く理解されることになるであろう。

ＴＤＩＦ−ＴＤＲシグナル伝達経路を示す。ＴＤＩＦ−ＴＤＲシグナル伝達は、２つの経路に分岐し、１つは、師部細胞の増殖に関与し、繊維細胞の開始を促進するＷＯＸ４であり、もう一方は、維管束幹細胞の木部分化を抑制する仮想因子Ｘである。 シマツナソ由来の配列番号３およびコウマ由来の配列番号６を、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質を産生する他のアミノ酸配列と比較する系統樹を示す。

本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の図面からより完全に理解され得る。

本明細書に提供される定義および／または方法は、本発明を定義し、本発明の実践において当業者を導く。特に指定されたことを除いて、用語は、関連技術分野における当業者により従来の用法に従って理解されるべきである。定義および／または方法のいずれかが本明細書に組み込まれる任意の特許または非特許文献で提供される定義および／または方法のいずれかと矛盾することが見出される範囲で、本出願に明確に提供される／導入される当該定義および／または方法が本明細書に使用されることを理解されよう。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「ｏｒ」という語は、文脈が明らかに他の意味を指示するのでない限り、「ａｎｄ」を含むことが意図される。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、ＡまたはＢ、あるいはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに対して与えられる、すべての塩基のサイズまたはアミノ酸のサイズ、ならびにすべての分子量または分子の質量の値は、近似値であり、説明のために提供されることが理解されるべきである。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本開示の実践または試験で使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載される。

本発明は、シマツナソおよびコウマから抽出されるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびそれに由来する対応するポリペプチドを含む。より具体的には、本発明は、ともに２種のジュート植物であるシマツナソおよびコウマ、ならびに関連したシマツナソおよびコウマのトランスジェニック植物における繊維収量の増強において、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４の相同体およびそれらの適用を提供する。酵素をコードする本発明のゲノム配列は、シマツナソおよびコウマのゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列と他の植物の既知の酵素遺伝子のヌクレオチド配列との比較により主に特定された。本発明の前に、これらのシマツナソおよびコウマの遺伝子のヌクレオチド配列、リーディングフレーム、エクソンおよびイントロンの位置、酵素の構造、および高繊維の収量潜在力のあるジュート植物の開発におけるそれらの潜在的有用性は、知られていなかった。

商業的に栽培されたジュート種のシマツナソおよびコウマのゲノム配列の分析は、両種が繊維産生の増強において好ましい触媒活性を有する酵素に対してコードする単一遺伝子を有することを示す。ヌクレオチド配列は、推定上コード領域、イントロン、およびスプライス部位を特定することができる、Ａｕｇｕｓｔｕｓ、Ｓｅｍｉ−ＨＭＭ ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐａｒｓｅｒ（ＳＮＡＰ）、およびＧｅｎｅｉｄ（Ｇｅｎｏｍｅ ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）等のソフトウェアプログラムにより初めに注釈を付けられた。ヌクレオチド配列のさらなる自動および手動処理を行って、コード領域および他の遺伝子特性の正確な特徴を精緻化し、構築した。

シマツナソ由来の３０，０９６超のｃＤＮＡおよびコウマ由来の３７，０３１のｃＤＮＡは、部分的または完全に配列決定された。それらから、ジュートにおける繊維産生の増強における推定上の役割、および好ましい触媒活性を有する新しい酵素をコードするそれぞれの種から単一のｃＤＮＡが開発された。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、シマツナソおよびコウマのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーのクローンの完全または部分的な配列決定後に分析され、配列分析ソフトウェアを用い、データベース（公共／私用）の既知の配列に対する相同性を決定することによりさらに分析される。

本開示の文脈において、本明細書の全体を通じて使用される多くの用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、示された意味を有する。

本明細書に使用される、「ポリヌクレオチド」は、核酸断片等のヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を任意に含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり得る。ＤＮＡのポリマー形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１つ以上のセグメント、またはその混合物／組み合わせを含み得、かつ／またはそれからなり得る。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号４に由来する１５０の連続したヌクレオチド（上流および下流の両方）のうちの少なくとも１つ、またはそのような配列の相補体を含み得る。

本明細書に使用される、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により一緒に結合され、通常、１００超のアミノ酸長さの配列を有するアミノ酸の単一の直鎖である。

「単離された」とは、天然状態から「人間の手により」修飾されたことを意味する。組成物または物質が天然に存在するのであれば、それはその元の環境から変化しているか分離されており、またはその両方である場合、「単離されている」。例えば、自然に生存している植物または動物に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単離された」ものである。

本明細書に使用される、「遺伝子」という用語は、植物シマツナソおよびコウマのゲノム配列、具体的には、ジュートにおける繊維産生を増強する際に好ましい触媒活性に関与するＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４酵素のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列として定義される。この用語は、上流、下流、および／またはイントロンのヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含み得る。

「コード配列」または「コード領域」とは、配列が発現される場合、アミノ酸またはポリペプチド等の遺伝子産物を産生するために必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内の非翻訳配列（イントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域を含む）を含み、かつ／またはそれからなる場合があるか、あるいはそのような介在する非翻訳配列を欠く場合もある（例えば、ｃＤＮＡにおいて見られるように）。

本明細書に使用される、「オリゴヌクレオチド」という用語は、好ましくは、１０〜１０００、最も好ましくは、１２〜５０のヌクレオチド長を有し得る短ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部である。本発明の実施形態に関して、オリゴヌクレオチド内に含まれるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドの類似体または誘導体であり得る。

本明細書に使用される、「プライマー」という用語は、標的核酸配列と結合し、核酸合成をプライミングすることができるオリゴヌクレオチドである。本明細書に定義される増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１０〜５０、最も好ましくは、１５〜２５のヌクレオチド長であり得る。さらに、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そのようなオリゴヌクレオチドは、天然に生じる核酸ではない。

ヌクレオチド配列を含む核酸を指すための本明細書の全体を通じて使用される略語は、従来の１文字の略語である。したがって、核酸に含まれるとき、天然に生じるコードするヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）のように短縮される。また、特に明記されない限り、本明細書に示される核酸配列は、５’→３’の方向である。

本明細書に使用される、その「相補性」という用語および誘導体は、ＡはＴまたはＵと対合し、ＣはＧと対合する周知の規則により核酸の対合に関して使用される。相補体は、「部分的」または「完全」であり得る。部分的相補体では、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致するが、完全または全相補体では、すべての塩基が対合規則に従って一致する。核酸鎖間の相補性の程度は、当該技術分野で周知の核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに有意な効果を及ぼし得る。前記ハイブリダイゼーションの効率および強さは、検出方法に応じて異なる。

本明細書に使用される、「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ／またはそれからなる核酸構築物または発現ベクターを有する、形質転換、トランスフェクション、形質導入、発現等に影響を受けやすい任意の細胞型を含む。好適な宿主細胞は、菌類および／または植物細胞、特に、靱皮繊維を産生する植物細胞を含む。

「作動可能に連結される」という用語は、一般に、本明細書では、対照配列がポリペプチドのコード配列の発現を導くように、対照配列が、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置で置かれる配置を示す。例えば、プロモーターは、それが、そのコード配列の発現に影響を及ぼす、すなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にあることが可能であるとき、コード配列と作動可能に連結され得る。

「ベクター」は、一般に、別の核酸セグメントがそのセグメントの複製または発現をもたらすために、作動可能に挿入され得る、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母、またはウイルス等のレプリコンを指す。「ベクター」という用語はまた、それが連結される別の核酸を伝播することができる核酸分子を指すことも意図される。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。あるベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製することができる。他のベクターは、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態にある。本明細書中では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たすそのような他の発現ベクターの形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等）が含まれることが意図される。

「核酸構築物」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結され、細胞を形質転換するためにベクターに挿入されるコード配列（複数を含む）を指すために使用される場合がある。この用語は、「形質転換ＤＮＡ」または「トランス遺伝子」という用語と交換可能に使用され得る。

本明細書に使用される、「プロモーター」という用語は、下流遺伝子の転写を指向する役目を果たす核酸配列を指す。プロモーターは、一般に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に適切である。他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と共にプロモーターは、対象の遺伝子を発現するのに必要である。一般に、転写および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に使用される、「ＷＵＳＣＨＥＬポリペプチド」または「ＷＵＳポリペプチド」は、ｗｕｓｃｈｅｌ活性を有する、すなわち、植物における幹細胞の開始および維持に関与するポリペプチドを意味する。Ｗｕｓｃｈｅｌの活性は、幹細胞を含む細胞の成長を刺激する。Ｗｕｓｃｈｅｌは、ドメインのループおよび／またはターンにおいて余分なアミノ酸残基を含む「変種」（動物ホメオドメインモチーフと比較して）のらせん−ループ−らせん−ターン−らせんのホメオドメインモチーフを含む、植物ホメオドメインタンパク質である。Ｗｕｓｃｈｅｌタンパク質は、他の保存モチーフ、例えば、２つの保存されたｗｕｓｃｈｅｌのＣ末端ドメインである（Ｅ／Ｒ）ＴＬＰＬＦＰドメインおよびＡ（Ａ／Ｓ）ＬＥＬ（Ｓ／Ｔ）Ｌドメイン等をさらに含み得る、および／またはそれらからなり得る。この用語はまた、上述の機能のうちのいずれか１つを有する断片、変異体、および相同体も含む。

本明細書に使用される、「相同体」という用語は、問題になっている非修飾タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有し、それらを誘発する非修飾タンパク質として同様の生物学的および機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含するタンパク質を指す。

欠失は、タンパク質からの１つ以上のアミノ酸の除去を指す。

挿入は、タンパク質において所定の部位に導入される１つ以上のアミノ酸残基を指す。挿入は、Ｎ末端および／またはＣ末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含み得る。概して、アミノ酸配列内の挿入は、Ｎ末端またはＣ末端の融合より小さい、約１〜１０個の残基である。

置換とは、タンパク質のアミノ酸の、同様の特性（例えば、類似した疎水性、親水性、抗原性、αらせん構造またはβシート構造を形成または破壊する傾向）を有する他のアミノ酸との置換を指す。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基の置換であるが、ポリペプチドに設定された機能的制約条件に応じてクラスタ化され得、１〜１０個の範囲のアミノ酸であり得、挿入は、通常は、約１〜１０個のアミノ酸残基の序列である。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換表は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｄｓ）および以下の表１を参照のこと）。

アミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、固相ペプチド合成等の当該技術分野で周知のペプチド合成技術および／もしくは任意の他の合成技術を用いて、または組換えＤＮＡ操作により容易に作製され得る。タンパク質の置換、挿入、または欠失変異体を生成するためのＤＮＡ配列の操作方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＤＮＡ中の規定部位での置換突然変異体を作製する技術は、当業者にはよく知られており、これには、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎインビトロ突然変異誘発（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰＣＲ媒介性部位特異的突然変異誘発または他の部位特異的突然変異誘発プロトコルが含まれる。

本明細書に使用される、「生物学的に活性な部分」は、植物シマツナソおよびコウマにおいて師部繊維の組成における開始、形成、増強、または変形を触媒するための生物学的活性を有するＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質の断片を指し得る。ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質の生物学的に活性な部分には、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質のアミノ酸配列と同一であるか、またはそれに由来するのに十分なアミノ酸配列、例えば、配列番号３または配列番号６に記載 のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドが含まれ、これには、完全長ＷＵＳＣ ＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質よりも少ないアミノ酸が含まれ、ＷＵＳＣＨＥＬ 関連ホメオボックス４タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質の少なくとも１つの活 性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２ １５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、または２２３のアミ ノ酸長であるポリペプチドであり得る。ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質は、配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し得る。他の実施形態におい て、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質は、配列番号３または配列番号６と 実質的に同一であり、配列番号３または配列番号６のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然対立遺伝子変異または突然変異誘発によりアミノ酸配列の点で異なる。別の実施 形態において、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質は、配列番号３または配列番号６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に使用される、「ドメイン」という用語は、進化的に関連したタンパク質の配列のアラインメントに沿った特定の位置に保存された一連のアミノ酸を指す。他の位置におけるアミノ酸は、相同体の間で変化し得るが、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または機能に不可欠である可能性が高いアミノ酸を示す。タンパク質の相同体のファミリーのアラインされた配列においてそれらの高度の保存により特定され、問題になっているいずれかのポリペプチドが既に特定されたポリペプチドファミリーに属するかどうかを判定するための識別子として使用され得る。

本明細書に使用される「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の配列における短い保存領域を指す。モチーフは、ドメインの高度に保存された部分である場合が多いが、ドメインの一部のみを含み得るか、または保存ドメインの外側に位置し得る（モチーフのアミノ酸のすべてが画定されたドメインから外れる場合）。

ドメインの特定のための専門のデータベース、例えば、ＳＭＡＲＴ（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，５８５７−５８６４、Ｌｅｔｕｎｉｃ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０，２４２−２４４）、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｍｕｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１，３１５−３１８）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（Ｂｕｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂａｉｒｏｃｈ（１９９４），Ａ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｙｎｔａｘ ｆｏｒ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．（Ｉｎ）ＩＳＭＢ−９４、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｌｔｍａｎ Ｒ．，Ｂｒｕｔｌａｇ Ｄ．，Ｋａｒｐ Ｐ．，Ｌａｔｈｒｏｐ Ｒ．，Ｓｅａｒｌｓ Ｄ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ５３−６１，ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｈｕｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３２：Ｄ１３４−Ｄ１３７，（２００４））、またはＰｆａｍ（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１）：２７６−２８０（２００２））等が存在する。タンパク質配列のコンピュータ内での分析用の一組のツールが、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥｘＰＡＳｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ Ｉｎ−ｄｅｐｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３７８４−３７８８（２００３））で利用可能である。ドメインまたはモチーフはまた、通常の技術を用いて、例えば、配列アラインメント等により特定され得る。

本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「トランス遺伝子」、または「組換え」とは、例えば、核酸配列、発現カセット、遺伝子構築物、または核酸配列を含み、かつ／またはそれからなるベクター、あるいは本発明による核酸配列、発現カセット、またはベクターで形質転換した生物に関して、組換え法により生成するすべてのこれらの構築物を意味し、その中で、（ａ）本発明の方法に有用なタンパク質をコードする核酸配列、または（ｂ）本発明による核酸配列と作動可能に連結される遺伝子制御配列（複数を含む）、例えば、プロモーター、または（ｃ）ａ）およびｂ）がそれらの本来の遺伝子環境に位置せず、または組換え法により修飾されている。この修飾は、例えば、１つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位、または挿入の形態を取り得る。本来の遺伝子環境は、元の植物中の本来のゲノムまたは染色体座、またはゲノムライブラリー中の存在を意味するとして理解される。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の本来の遺伝子環境は、少なくとも一部分は保持されることが好ましい。この環境は、少なくとも片側で核酸配列の側面に位置し、かつ、約５０ｂｐ、好ましくは約５００ｂｐの配列長を有する。本来存在する発現カセット、例えば、核酸配列の本来のプロモーターと、上に定義されるような、本発明の方法に有用なポリペプチドをコードする対応する核酸配列との組み合わせは、この発現カセットを例えば、突然変異誘発処理等の非天然、合成（「人工」）法により修飾するとき、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は、例えば、米国特許第５，５６５，３５０号（参照により組み込まれる）または国際公開第ＷＯ００／１５８１５号（参照により組み込まれる）中に記載される。

本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、本発明の方法に使用される核酸が当該植物のゲノム中のそれらの本来の遺伝子座に存在せず、それ故に、核酸配列を同種または異種発現させることが可能であるような植物を含むことが理解される。しかしながら、上述のように、トランスジェニックはまた、本発明による核酸または本発明の方法に使用される核酸は、植物のゲノム中のそれらの本来の位置に存在するが、その配列は、本来の配列に対して修飾されていること、および／または本来の配列の調節配列が修飾されていることも意味する。トランスジェニックは、ゲノム中の非天然遺伝子座における本発明による核酸の発現、核酸の同種、または好ましくは異種発現が起こることを意味するとして理解されることが好ましい。

本明細書に使用される、「導入」または「形質転換」という用語は、導入に用いられる方法とは無関係に、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を含む。器官形成または胚形成による、後のクローン増殖が可能である植物組織は、本発明の遺伝子構築物で形質転換され得、植物全体がそこから再生する。選択された特定の組織は、利用可能なクローン増殖系に応じて異なり、形質転換する特定の種に最も適合させる。例示的な組織標的には、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂、腋芽、および根茎分裂）、ならびに誘導分裂組織（例えば、子葉分裂および胚軸分裂）が含まれる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に一時的または安定的に導入され得、例えば、プラスミドとして非組み込み状態で維持され得る。あるいは、それは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。結果として得られる形質転換植物細胞を使用して、当業者に既知の方法で形質転換植物を再生し得る。

植物のゲノムへの外来遺伝子の導入は、形質転換と呼ばれる。

植物種の形質転換は、現在、非常に一般的な技法である。有利なことに、いくつかの形質転換法のいずれかを使用して、適切な原細胞に目的とする遺伝子を導入することができる。植物組織または植物細胞からの植物の形質転換および再生に関して記載される方法は、一時的または安定的形質転換に使用され得る。形質転換法には、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを増大する化学物質の使用、植物へのＤＮＡの直接注射、微粒子銃照射、ウイルスまたは花粉を使用する形質転換、ならびにマイクロプロジェクションが含まれる。トランスジェニック作物を含むトランスジェニック植物は、アグロバクテリウムにより媒介された形質転換により生成されることが好ましい。有利な形質転換法は、植物体における形質転換である（Ｓａｊｉｂ ｅｔ．ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ．（２００８）９５，３３３−３４）。

一般に、形質転換後、植物細胞または細胞集団を、目的とする遺伝子と共導入される植物発現可能遺伝子によってコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択し、その後、形質転換物質を完全な植物に再生する。形質転換植物を選択するために、形質転換において得られた植物物質は、一般に、形質転換植物を非形質転換植物と区別することができるような選択条件に曝す。例えば、上述の方法で得られた種を植えることができ、初期生長期後、散布により適切な選択に曝す。さらなる可能性は、滅菌後適切な場合、形質転換種子のみが植物に生長することができるように適切な選択物質を使用する寒天プレート上での、種子の生長にある。あるいは、形質転換植物を、上述したもの等の選択可能なマーカーの存在に関してスクリーニングする。

ＤＮＡ導入および再生後、推定上形質転換された植物は、例えば、サザン分析を使用して、目的とする遺伝子の存在、コピー数、および／またはゲノム編成に関して評価され得る。あるいは、またはさらに、新たに導入されたＤＮＡの発現レベルは、いずれかの技法も当業者に周知のノーザンおよび／またはウェスタン分析を用いてモニタリングされ得る。

生成した形質転換植物は、クローン増殖または古典的交配技法等による、様々な手段により増殖させ得る。例えば、第１世代（またはＴ１）の形質転換植物が選択され得、同型第２世代（またはＴ２）の形質転換体が選択され得、古典的な交配技法によりＴ２植物をさらに増殖させ得る。生成した形質転換生物は様々な形態を取り得る。例えば、それらは形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ、クローナル形質転換体（例えば、全細胞が形質転換されて発現カセットを含有する）、形質転換および非形質転換組織の移植片（例えば、植物中では、非形質転換接ぎ穂に移植した形質転換根茎）であってもよい。

本明細書に使用される、「発現の増加」または「過剰発現」という用語は、本来の野生型の発現レベルへのさらなる任意の発現形態を指す。

遺伝子または遺伝子産物の発現を増加する方法は、当該技術分野において十分に立証されており、例えば、適切なプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして作用する単離された核酸は、非異種型のポリヌクレオチドの適切な位置（典型的には、上流）に導入して、目的とするポリペプチドをコードする核酸の発現を上方調節し得る。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、および／または置換（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号、Ｚａｒｌｉｎｇらの国際公開第ＷＯ９３／２２４４３号を参照）によりインビボで修飾することができるか、または単離されたプロモーターを、本発明の遺伝子から適切な方向および距離で植物細胞中に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。

ポリペプチドの発現が望ましい場合、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことが一般に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。加えられる３’末端配列は、例えば、ノパリン合成またはオクトピン合成遺伝子、またはあるいは、別の植物遺伝子、またはあまり好ましくないが任意の他の真核生物遺伝子に由来してもよい。

また、イントロン配列を、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または部分的コード配列のコード領域に加えて、サイトゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増大させることもできる。植物および動物の両方の発現構築物における転写単位中のスプライシング可能なイントロンの導入は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で最大１０００倍まで遺伝子発現を増加することが示されている（Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５、Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：１１８３−１２００）。そのようなイントロンの遺伝子発現の増大は、転写単位の５’末端近くに位置するとき、典型的には最大である。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用が当該技術分野で既知である。一般情報に関しては、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１６，Ｆｒｅｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｌｂｏｔ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を判定するために、配列は、最適な比較目的のために整列させることができる（例えば、ギャップは、最適アラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも９５％であり得る。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することができる。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である（本明細書で用いる場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一位置の数の関数である。

配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。一実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ重量、および１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重量を使用して決定され得る。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、もしくは８０のギャップ重量、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を使用して決定され得る。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に導入されているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用して決定され得る。

２つの配列間の同一性を判定するために使用することができる例示的なコンピュータプログラムとしては、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで公的にアクセス可能なＢＬＡＳＴプログラムのサイト、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。

配列サーチは、所定の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列および他の公共データベースにおける核酸配列と比較して評価する場合、一般的にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公共データベース中のアミノ酸配列に対して全リーディングフレーム内で翻訳されている核酸配列をサーチするのに好ましい。

２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するために選択された配列の好ましいアラインメントは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを用いて行われる。

記載されるように、本発明の一実施形態は、配列番号２および配列番号５に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ含み、かつ／またはそれからなる植物シマツナソおよびコウマに見出されるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドである。同様に、ヌクレオチド配列によりコードされるそれぞれのＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドは、配列番号３および配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するものとする。本発明の一実施形態によれば、配列番号３は、シマツナソ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同体のポリペプチド配列を指し、配列番号６は、コウマ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同体のポリペプチド配列を指す。これらの酵素の両方は、植物における繊維細胞の生合成をプライミングするためのイニシエーター分子を触媒するために、植物シマツナソおよびコウマにおいて繊維の生合成経路中に存在する。

本発明はまた、植物シマツナソおよびコウマ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同体をコードする遺伝子配列も提供する。

一実施形態において、配列番号１に示された１２５０ｂｐ長のポリヌクレオチドは、シマツナソから単離された完全長遺伝子である。この遺伝子配列は、遺伝子の上流および下流の両方からの少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを含む。これはまた、遺伝子のイントロン配列も提供する。

別の実施形態において、配列番号４に示された１２３７ｂｐ長のポリヌクレオチドは、コウマから単離された完全長遺伝子である。この遺伝子配列は、遺伝子の上流および下流の両方からの少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを含む。これはまた、遺伝子のイントロン配列も提供する。

本発明のさらに別の実施形態において、配列番号２および／または配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。配列番号２は、シマツナソ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同配列のポリヌクレオチド配列を指し、配列番号５は、コウマ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の相同配列のポリヌクレオチド配列を指す。

さらに別の実施形態において、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードすることができる単離された核酸分子、またはその生物学的に活性な断片は、配列番号２、配列番号５に記載のヌクレオチド配列の全長と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、またはその任意の相補体を含む。

一実施形態において、配列番号２に示される６６９ｂｐ長のポリヌクレオチドは、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質をコードし、かつ２２２のアミノ酸ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを示し、配列番号３と同様に、約２５．５４ｋＤの計算された分子量を有する、完全長ｃＤＮＡクローンである。配列番号３のＳＭＡＲＴ分析全体を通じて、それは、配列中のホメオボックスドメインの存在を示す。これは、ＤＮＡ結合因子であり、植物の重要な発育過程の転写調節に関与する。これは、植物における維管束細胞増殖に関与する、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質である。

一実施形態において、配列番号５に示される６７２ｂｐ長のポリヌクレオチドは、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質をコードし、かつ２２３のアミノ酸ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを示し、配列番号６と同様に、約２５．６７ｋＤの計算された分子量を有する、完全長ｃＤＮＡクローンである。配列番号６のＳＭＡＲＴ分析全体を通じて、それは、配列中のホメオボックスドメインの存在を示す。これは、ＤＮＡ結合因子であり、植物の重要な発育過程の転写調節に関与する。これは、植物における維管束細胞増殖に関与する、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質である。

本発明の好ましい実施形態に従って、配列番号２に示される単離されたポリヌクレオチドは、植物シマツナソから単離された全ＲＮＡを用いて遺伝子の保存領域のＰＣＲ増幅により得られ得、配列番号５は、植物コウマから単離された全ＲＮＡを用いてこの遺伝子の保存領域のＰＣＲ増幅により得られ得る。前述の説明に記載されるように、適用される植物シマツナソは、品種Ｏ−４であり、適用されるコウマは、品種ＣＶＬ−１である。

本発明の別の実施形態、配列番号２および／または配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物が開示され、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現され、かつ翻訳されて、植物シマツナソおよびコウマにおいてＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質の相同体を産生することができる。植物シマツナソおよびコウマ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）を増幅、クローン、および配列決定するための手順は、実施例２にさらに詳述される。好ましくは、組換え遺伝子構築物は、ポリヌクレオチド鋳型の発現を増強するために作動可能に連結されたプロモーター領域をさらに含む。特定のプロモーターの転写制御下で、配列番号２および／または配列番号４のポリヌクレオチドを含有する組換え遺伝子構築物内のコード領域の発現が増強され得、より高い収量のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）タンパク質をもたらす。

本発明の実施形態に従って、調節された発現は、増加した発現または活性、例えば、配列番号２および配列番号５をコードする核酸分子の、例えば、核酸分子をコードするＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドの過剰発現である。核酸もしくは遺伝子、または遺伝子産物の発現を増加させるための方法は、当該技術分野において文書で十分に立証されており、例は、定義の項に提供される。

本発明はまた、対照植物と比較して、増強した繊維収量を有するトランスジェニック植物の産生のための方法も提供し、本方法は、本明細書に上で定義される、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードする任意の核酸の植物における導入および発現を含む。

より具体的には、本発明は、ヌル対照植物と比較して増強した繊維収量を有するトランスジェニック植物の産生のための方法を提供し、本方法は、
（ｉ）植物または植物細胞において、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードする核酸あるいはＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつ／またはそれからなる遺伝子構築物を導入し、発現することと、
（ｉｉ）繊維細胞の成長および発育を促進するための条件下で植物細胞を栽培することと、を含む。

本発明の別の態様は、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードし、かつ植物シマツナソ由来の単離されたポリヌクレオチドに関し、
ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
ｂ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む。

ある実施形態において、植物シマツナソは、品種Ｏ−４である。

本発明の別の態様は、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４タンパク質をコードし、かつ植物コウマ由来の単離された に関し、
ａ）配列番号５に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
ｂ）配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む。

ある実施形態において、植物コウマは、品種ＣＶＬ−１である。

本発明の別の態様は、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む単離されたＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、開始、形成、増強、および変形を触媒することから成る群より選択される機能を含み、それにより、植物シマツナソにおける師部繊維の組成を改変する

ある実施形態において、植物シマツナソは、品種Ｏ−４である。

ある実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。

本発明の別の態様は、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断 片を含む単離されたＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、開始、形成、増強、および変形を触媒することから成る群より選択される一つ以上の機能を含み、それにより、植物コウマにおける師部繊維の組成を改変する。

ある実施形態において、植物コウマは、品種ＣＶＬ−１である。

ある実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を含む。

本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物に関し、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）配列番号２または配列番号５に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
ｂ）配列番号２または配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択され、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現されて、植物シマツナソおよびコウマにおけるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドの相同体を産生することができる。

ある実施形態において、前記構築物は、
ａ）配列番号２または配列番号５に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、または
ｂ）配列番号２または配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子に作動可能に連結されるプロモーター領域をさらに含み、前記プロモーターは、核酸分子の転写または発現を増強する。

本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを発現することができる組換え遺伝子構築物を含む形質転換体に関し、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）配列番号２または配列番号５に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
ｂ）配列番号２または配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択され、前記形質転換体は、ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドの相同体を産生する。

本発明の別の態様は、対照植物と比較して、繊維収量の増加または増強を有する、植物またはトランスジェニック植物を産生するための方法に関し、本方法は、
ａ）植物細胞にポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物を導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、ｉ）配列番号２または配列番号５に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、およびｉｉ）配列番号２または配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される、ステップと、
ｂ）植物成長および発育を促進するための条件下で前記植物細胞を栽培するステップと、
ｃ）ポリペプチドを発現するステップであって、前記ポリペプチドが、ｉ）配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチド、およびｉｉ）配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される、ステップと、を含む。

本発明により提供される配列はまた、酵素がより良好に需要過程を行うことができる特徴を有する新規の酵素の合理的改変または設計のための準備的材料としても使用することができる。

本開示は、添付の特許請求の範囲内に含まれる通りに、および上述の説明のものが含まれる。本発明は、その好ましい形態で、ある程度詳述に記述されているが、好ましい形態の本開示は、単なる例としてなされているに過ぎず、本発明の範囲および主張から逸脱せずに、構築の詳細ならびに部分の組み合わせおよび配置における多数の変更を行使し得ることが理解される。

種々の参照が本明細書に引用され、それらの開示は参照することによりその全体が組み込まれる。

以下の実施例は、本発明に対してその中に記載される特定の実施形態に限定されることはいかなる点でも意図されておらず、本発明をさらに例示することが意図される。

実施例１ プライマーの設計および合成
研究に使用されるプライマーは、手動処理したトランスクリプトームから設計されたか、あるいは完全ＯＲＦを用いて手動で配列を選択するか、または同様の遺伝子が他の植物から首尾よく単離されたデータベースを使用することにより、シマツナソおよびコウマのゲノム配列から予測された「遺伝子モデル」から設計された。トランスクリプトームから得られたヌクレオチド配列の比較バイオインフォマティクス分析は、関連遺伝子の相同体を特定するために、および遺伝子の適切な特定のために、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて実行された。複数の配列が「遺伝子プール」から見出されたときはいつでも、ヌクレオチド配列アラインメントが、ｃｌｕｓｔａｌＷバージョン１．８２を通して行われた。次いで、このアラインメントが編集された。遺伝子特異的なプライマー（順方向および逆方向の両方）が、手動でまたはＰｒｉｍｅｒ ３ ｐｌｕｓ ｔｏｏｌを通して選択され、これらのプライマーはカスタム合成された。

この研究に使用されたすべてのオリゴヌクレオチドが合成され、ＨＰＬＣは、供給業者により精製され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から調達した。約１００ｐｍｏｌの原液を、オートクレーブ処理したｄｄＨ_２Ｏにおいて調製し、用いる一定分量で約−２０℃で保存した。
ＰＣＲのためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド配列

実施例２ シマツナソおよびコウマ由来のＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４の増幅、クローニング、および配列決定
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＰおよびＳａｃｃｈｉ Ｎにより前述されるような、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出法によるＲＮＡ単離の単一ステップ法で、全ＲＮＡは、ＭＳ培地上に成長した３日齢の苗から単離された（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８７，１６２：１５６−１５９）。ＲＮＡの質または完全性は、アガロースゲル電気泳動により確認し、標準手順によりＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００を用いて定量化した。ｃＤＮＡの第１の鎖は、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。遺伝子は、遺伝子特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによりｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｃＤＮＡ、２０ｐモルの各プライマー、５μＬの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液、５μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合、および１．０単位のＰｆｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有した。ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、約９５℃で約５分間の初期変性、続いて、約９５℃で約３０秒間の３５サイクルの変性、約５９〜６１℃で約３０秒間のアニーリング、約７２℃で約１分間の伸長、約７２℃で約７分間の最終伸長、の条件を用いて行った。ＰＣＲ産物は、１Ｘ ＴＡＥ緩衝液を用いた１％アガロースゲルにより分析し、アンプリコンは、製造業者の説明書に従って、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出キットを用いてゲルから溶出した。精製されたＰＣＲ産物は、ｐＣＲ（登録商標）８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。プラスミドは、製造業者の説明書に従って、ＱＩＡｐｒｉｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて推定上のコロニーから単離した。挿入の存在は、遺伝子特異的なプライマーにより確認し、陽性プラスミドは、配列決定に供した。

実施例３ 配列の分析
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムにより分析した。他の植物から報告された配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷでアラインされた。系統活性的分析は、近接結合（ＮＪ）を用いて行われた。

実施例４ 繊維の生合成の経路構築
繊維の生合成におけるＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）の役割を示す自動代謝経路の再構成は、Ａｒｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムと比較してシマツナソおよびコウマタンパク質からオルソログを特定することにより構成された。シマツナソおよびコウマゲノム内にコードされたＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４（ＷＯＸ４）に触媒された酵素反応は、Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｔｕｄｉｏ用のＲｅｓｎｅｔ−Ｐｌａｎｔ３．０データベースおよび代謝経路データベースから入手可能な酵素反応を用いて構成された。

参照による組み込み
本明細書で引用される、米国特許、米国公開特許出願、および公開ＰＣＴ出願のすべては、これにより参照により組み込まれる。

同等物
本発明のいくつかの実施形態が本明細書で記載および説明されてきたが、当業者は、本明細書に記載される機能を行い、かつ／あるいは結果および／または利点のうちの１つ以上を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に認識するであろう。そして、そのような変形および／または修正の各々が本発明の範囲内にあると見なされる。当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、あるいは確認することができるであろう。そのため、前述の実施形態は単なる例として提示されていること、および添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明を具体的に記載および請求されているものとは別の方法で実施することができることを理解すべきである。

Claims (3)

1. 植物シマツナソまたはコウマを由来とするＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス４ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
   配列番号２または配列番号５に記載のヌクレオチド配列と１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
2. 前記植物シマツナソが、品種Ｏ−４である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. 前記植物コウマが、品種ＣＶＬ−１である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。