CN103987722A - 编码来自黄麻木质素生物合成途径的酶的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含关于黄麻植物中的木质素的生物合成途径。本发明一般涉及植物木质素生物合成基因、由此类基因编码的多肽、和此类多核苷酸和多肽序列用于控制植物木质素生产的用途的领域。还公开的是关于使用该多核苷酸和多肽影响由黄麻产生的纤维品质和量的方法。

Description

编码来自黄麻木质素生物合成途径的酶的多核苷酸
相关申请
本专利申请要求于2011年4月29日提交的美国临时专利申请系列号61/480,668的优先权利益。
技术领域
本发明涉及黄麻木质素生物合成途径的多个部分的鉴定和表征。更具体而言，本发明涉及来自黄麻植物的编码负责木质素合成的酶的多核苷酸，和使用这些多核苷酸和酶以用于木质素产生的基因调节和操纵的方法，以给出具有所需木质素含量及其他特征的纤维。
背景技术
木质素是通常在多步过程中源自苯丙氨酸的单木质醇(monolignol)(羟基肉桂醇)的复杂芳香族杂聚物。(Whetten，R.和Sederoff，R.，(1995)LigninBiosynthesis，Plant Cell，7，第1001-1013页)。主要沉积在细胞壁中的这些聚合物确保植物茎的必需机械强度和最重要地，确保植物维管组织的疏水性。(Vanholme，R.等人(2010)Lignin biosynthesis and structure，Plant Physiol，153，第895-905页)。由于其疏水性质，木质素充当维管组织的主要组分，并且在水转运中起必需作用。除了其结构和转运定向作用外，木质素还是植物的防御系统的关键组分(Goujon，T.等人(2003)Genes involved in thebiosynthesis of lignin precursors in Arabidopsis thaliana，Plant Physiology andBiochemistry，41，第677-687页)。并不令人惊讶地，环境条件影响沉积的木质素的量。(Boerjan，W.等人(2003)Lignin biosynthesis，Annu Rev Plant Biol，54，第519-546页)。例如，木质素生物合成响应多种应激条件如创伤、非生物胁迫和病原体感染而诱导。木质素限制病原体侵入且保护细胞壁多糖不受微生物降解作用(Vanholme等人，2010)。
我们目前对木质素生物合成的了解大部分来自这个途径在拟南芥(A.thaliana)和毛果杨(P.trichocarpa)中的完全了解。(Goujon，等人，2003；Shi，等人(2010)Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populustrichocarpa：transcript abundance and specificity of the monolignol biosyntheticgenes，Plant Cell Physiol，51，第144-163页)。存在三种基本单木质醇单体：对香豆醇、松柏醇和芥子醇。这些单木质醇掺入三个木质素单体或构件块内：对羟基苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)。参见图1。这些单木质醇在甲氧基数目中不同。对羟基苯基(H)没有甲氧基，愈创木基(G)具有一个甲氧基，而紫丁香基(S)具有两个甲氧基。(Goujon等人，2003)。然而，除了这三种单木质醇外，还可掺入少数其他类苯基丙烷，例如羟基肉桂醛、羟基肉桂酯和羟基肉桂乙酸酯。(Boerjan等人，2003)。
在这些基本木质素构件块的生物合成后，它们转运至木质化区带。在木质化区带中，聚合作用通过经由过氧化物酶或漆酶的基于氧化自由基的偶联发生，并且通过与纤维素和半纤维素交联形成网状结构。(Boerjan等人，2003；Vanholme，R.等人(2008)Lignin engineering，Curr Opin Plant Biol，11，第278-285页)。当多糖基质形成完成时，木质化在细胞壁的次生增厚过程中的不同时期中发生。木质素沉积受多糖基质的性质影响。在初生细胞壁中，它作为球状结构发现；而在次生细胞壁中，它形成薄片。(Boerjan等人，2003)。
虽然木质素在植物生命中的作用必不可少，但它是浆和生物燃料工业中植物材料的成本有效/高效使用中的主要限制因素。木质素还限制生物量用于纤维、化学品和能量生产的用途。木质素的去除是非常昂贵的过程，并且这些工业将获益于对具有更少木质素的生物量或容易降解的木质素的接近。在过去几十年中，已取得木质素生物合成途径的一些了解，尽管该过程的部分并未完全了解。
尽管木质素合成对黄麻植物的总体福利很重要，并且它对纤维质量的若干方面有影响，目前不存在详述黄麻中的木质素生物合成的可用信息。因此，存在鉴定、分离且利用来自黄麻植物的涉及木质素生物合成的基因和酶的需要。本发明解决了这个需要。
发明内容
本发明的一个方面是与选自下述的核酸序列具有至少90％序列同一性的分离的核酸分子：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、25、26、28、29、31、33、35、37、39、40、42、44、45、47、49和51。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13和15。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：16、18和20。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：22、24、25、26、28和29。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：31。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：33。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：35、37和39。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：40和42。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：44、45和47。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：49。
在一个实施例中，分离的核酸分子选自：SEQ ID NO：51。
本发明的一个方面是与选自下述的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的分离的多肽分子：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、27、30、32、34、36、38、41、43、46、48、50和52。
在一个实施例中，对于cDNA扩增有用的一对正向引物和反向引物选自：SEQ ID NO53和SEQ ID NO54；SEQ ID NO55和SEQ ID NO56；SEQ ID NO57和SEQ ID NO58；SEQ ID NO59和SEQ ID NO60；以及SEQ ID NO61和SEQ ID NO62。
在某些实施例中，本发明涉及前述多核苷酸序列或多肽序列中的任何一个，其中所述序列与由SEQ ID NO鉴定的序列中的任一个具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
本发明的一个方面是包含本发明的分离的核酸分子的表达载体。
本发明的一个方面是与本发明的多肽分子特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。
本发明的一个方面是通过本发明的载体转染的经转染的植物细胞。
本发明的一个方面是源自本发明的转基因植物的材料。
本发明的一个方面是来自由本发明的载体转染的植物的种子。
本发明的一个方面是用于制备转基因植物的方法，其包括用本发明的载体转染至少一种植物细胞和使至少一种植物细胞生长成植物的步骤。
本发明的一个方面是改善黄麻植物的生长、纤维产量、纤维强度、疾病抗性或水利用的方法，其包括将本发明的非天然核酸序列掺入黄麻植物内。
附图说明
图1：所提议的黄麻的单木质醇生物合成途径。
图2a和2b：ColCAD1、ColCAD2、ColCAD3、ColCAD4、ColCAD5、ColCAD6和ColCAD7与植物CAD蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图3：ColCCoAOMT1、ColCCoAOMT2和ColCCoAOMT3与植物CCoAOMT蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图4：Col4CL1、Col4CL4和Col4CL6与植物4CL蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图5：Col6HCT1与植物6HCT蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图6：ColC3H与植物C3H蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图7：ColC4H1和ColC4H2与植物C4H蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图8：ColPAL1和ColPAL2与植物PAL蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图9：ColCCR2与植物CCR蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图10：ColCCR3与植物CCR蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图11：ColF5H与植物F5H蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图12：ColCOMT与植物COMT蛋白质序列的蛋白质序列比对。
图13：ColCAD2的DNA凝胶。
图14：ColCCoAOMT1的DNA凝胶。
图15：Col4CL1的DNA凝胶。
图16：ColCCR3的DNA凝胶。
图17：ColF5H的DNA凝胶。
具体实施方式
十个已知酶家族与单木质醇生物合成相关。(Goujon等人，2003)。该家族是PAL(苯丙氨酸氨裂合酶)、C4H(肉桂酸-4-羟化酶)、4CL(4-香豆酸：辅酶A连接酶)、HCT(对羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸/奎尼酸对羟基肉桂酰转移酶)、C3H(4-香豆酸3-羟化酶)、CCoAOMT(咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶)、CCR(肉桂酰辅酶A还原酶)、F5H(阿魏酸5-羟化酶)、COMT(咖啡酸O-甲基转移酶)、和CAD(肉桂醇脱氢酶)。所提议的黄麻中的单木质醇生物合成途径的简图显示于图1中。
黄麻中的木质素生物合成途径将其复杂性部分归因于若干多功能酶的存在，和跨越若干不同基因家族的组成成分酶。类苯基丙烷途径的第一个酶是PAL(苯丙氨酸氨裂合酶)，其引起苯丙氨酸的脱氨基，产生肉桂酸。该途径的第二个酶C4H(肉桂酸4-羟化酶)将肉桂酸转换为4-羟基肉桂酸，其随后为当该途径变得分支时的后续羟基化和甲基化步骤。酶4CL催化羟基肉桂酸的辅酶A连接，生成用于木质素生物合成的活化酚前体。(Hu等人(1999)Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation andgrowth in transgenic trees，Nat Biotech，17，第808-812页)。
单木质醇途径中的下一个酶(HCT)催化其为C3H底物的对香豆酰莽草酸/奎尼酸酯的产生。HCT显示将对香豆酰辅酶A的酰基转移至莽草酸或奎尼酸。(Hoffman等人(2005)Plant Biosystems，第139卷，No.1，第50-53页)。在C3和C5处的羟基化步骤分别通过两种细胞色素P450酶即4-香豆酸3-羟化酶(C3H)和阿魏酸5-羟化酶(F5H)执行。甲基化步骤通过CCoAOMT(咖啡酰辅酶A(CoA)O-甲基转移酶)和COMT(咖啡酸-O-甲基转移酶)执行。CCoAOMT是将咖啡酰辅酶A转换为阿魏酰辅酶A(feruloyl-CoA)和将5-羟基阿魏酰辅酶A转换为芥子酰辅酶A(sinapoyl-CoA)的双功能酶，并且在阿魏酸化多糖的合成中起作用。(Inoue等人，1998)。CCoAOMT已显示涉及百日菊(Zinnia elegans)的差异管状元件中的木质素生物合成。(Ye，Z.H.和Vamer J.E.(1995)Differential expression of two O-methyltransferases inlignin biosynthesis in Zinnia elegans，Plant Physiol.108，第459-467页)。CCoAOMT涉及植物细胞壁的强化，并且还涉及通过增加细胞壁结合的阿魏酸聚合物形成对创伤或病原体攻击的应答。
涉及单木质醇生物合成途径的另外的酶是肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)。CCR催化羟基肉桂酰辅酶A酯的还原，以产生肉桂醛，而CAD催化其至肉桂醇的还原。(Goujon等人，2003)。
涉及单木质醇途径的后期酶之一是肉桂醇脱氢酶(CAD)，其催化松柏醛、5-羟基-松柏醛和芥子醛至相应醇的NADPH依赖性转换。(Kim，S.J.等人(2004)Functional reclassification of the putative cinnamyl alcoholdehydrogenase multigene family in Arabidopsis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，第1455-60页)。在拟南芥属中，发现CAD基因的单一突变型AtCAD-C和AtCAD-D具有更低的CAD活性，并且通过杂交两个突变型获得的双重突变型具有茎木质素含量的40％降低，从而证实这些是涉及茎木质素合成的主要CAD基因。(Sibout，R.等人(2005)Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase-C and-D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem ofArabidopsis，Plant Cell，17，第2059-76页)。
两种酶对于单木质醇生物合成途径是特异性的。它们是咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)和肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)。COMT首先在被子植物中鉴定。COMT能够将咖啡酸转换为阿魏酸，以及将5-羟基阿魏酸转换为芥子酸。(Dixon，R.A.，等人(2001)The biosynthesis of monolignols：a"metabolic grid，″or independent pathways to guaiacyl and syringyl units？Phytochemistry，57，第1069-1084页)。在玉米(玉蜀黍(Zea mays))中COMT基因的下调已显示引起COMT活性的显著减少(70-85％的下降)，导致木质素含量和组成的改变，指示这种酶是用于木质素合成的关键酶。
由COMT生成的阿魏酸可通过阿魏酸5-羟化酶(F5H)羟基化，以形成5-羟基-阿魏酸，所述阿魏酸5-羟化酶是细胞色素P450依赖性单加氧酶。F5H还能够羟基化松柏醛和松柏醇，以分别形成5-羟基-松柏醛和5-羟基-松柏醇。(Meyer，K.等人(1996)Ferulate-5-hydroxylase from Arabidopsis thalianadefines a new family of cytochrome P450-dependent monooxygenases，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，第6869-74页)。F5H被认为是紫丁香基木质素生物合成中的限速步骤，这一提议通过观察到在F5H表达中缺陷的拟南芥属突变型也在长角果和种子中的芥子酸酯累积水平上受到影响而得到支持。(Ruegger，M.等人(1999)Regulation of ferulate-5-hydroxylase expression inArabidopsis in the context of sinapate ester biosynthesis，Plant Physiol.，119，第101-10页)。
特异性涉及木质醇生物合成的第二个酶CCR，催化阿魏酰辅酶A和5-羟基-阿魏酰辅酶A分别转换为松柏醛和5-羟基-松柏醛。这个步骤直接导致G(松柏醛)和S(5-羟基-松柏醛)木质素单元的生物合成。(Ma等人，2005)。在烟草中，使用反义构建体下调CCR基因产生具有异常发育和减少生长的植物，以及异常叶形态和维管坍塌。还存在G木质素化合物水平的相关减少。(Ralph，J.等人(1998)NMR characterization of altered lignins extracted fromtobacco plants down-regulated for lignification enzymes cinnamylalcoholdehydrogenase and cinnamoyl-CoA reductase，Proc.Natl.Acad.Sci USA，95，第12803-8页)。
基因和转录物的计算鉴定
值得注意的是，我们已测定涉及木质素生物合成的黄麻酶的序列。木质素生物合成的途径已得到充分表征，并且每种酶在大多数植物物种中由基因家族编码。从NCBI和毛果杨基因组数据库(http：//genome.jgi-psfz.org/Poptrl_l/)中检索到拟南芥和毛果杨的总共106个基因序列。(Goujon等人，2003；Shi等人，2010)。使用具有以1e-20的e值截断的程序BLASTN，由长蒴黄麻(Corchorus olitorius)基因组装配的基因模型以及长蒴黄麻和圆果黄麻(C.capsularis)的转录组数据鉴定了黄麻单木质醇生物合成基因。(Altschul，S.F.，等人(1990)Basic local alignment searchtool，JMol Biol，215，第403-410页)。使用软件AUGUSTUS对所得的gDNA重叠群实施基因模型预测。(Stanke，M.等人(2004)AUGUSTUS：a web serverfor gene finding in eukaryotes，Nucleic Acids Research，32，W309-W312)。来自长蒴黄麻和圆果黄麻的转录组数据的基因模型和isotig针对NCBI nr(非冗余)数据库进行搜索以用于进一步证实。对于长蒴黄麻，使用GMAP(具有95％截断值)在预测的基因模型上进行isotig作图。(Wu，T.D.和Watanabe，C.K.(2005)GMAP：a genomic mapping and alignment program for mRNA and ESTsequences，Bioinformatics，21，第1859-1875页)。
使用CLUSTAL W程序，由ColCAD基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他CAD蛋白质的氨基酸序列比对显示于图2a和2b中。下文是与推定的ColCAD蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：PtcCADL4(毛果杨肉桂醇脱氢酶样蛋白质，CADL4，gi224138226)；RcoCAD(蓖麻(Ricinus communis)醇脱氢酶，推定的，gi25558709)；FraCAD(草莓(Fragaria x ananassa)，肉桂醇脱氢酶，gil3507210)(Chandler等人(2002)Cloning，expression and immunolocalization pattern of acinnamyl alcohol dehydrogenase gene from strawberry(Fragaria x ananassa)，J.Exp.Bot.，53(375)，第1723-1734页)；GhiCAD5(陆地棉(Gossypium hirsatum)，肉桂醇脱氢酶5，gi268528129)；PtcCAD(毛果杨，gil83585165)((2010)Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa：transcript abundance and specificity of the monolignol biosynthetic genes，PlantCell Physiol.，51(1)，第144-163页)；GhiCAD3(陆地棉，gi229368450)(在发育中的棉纤维中克隆和表达的类苯基丙烷途径的基因(Genes ofphenylpropanoid pathway cloning and expression in developing cotton fibre))；和GhiCAD(陆地棉，gil66865124)((2009)Molecular and biochemical evidencefor phenylpropanoid synthesis and presence of wall-linked phenolics in cottonfibers，JIntegr Plant Biol，51(7)，第626-637页)。
使用CLUSTAL W程序，由ColCCoAOMT基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他CCoAOMT蛋白质的氨基酸序列比对显示于图3中。下文是与推定的ColCCoAOMT蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：PtrCCoAOMT(颤杨(Populus tremuloides)，gi3023436)；GhiCCoAOMT2(陆地棉，gi229368460)；和GhiCCoAOMT1(陆地棉，gi253509567)。
使用CLUSTAL W程序，由Col4CL基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他4CL蛋白质的氨基酸序列比对显示于图4中。下文是与推定的Col4CL蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：Ccap4CL1(圆果黄麻，gi294514718)；Rco4CL(蓖麻，gi255565415)；和Ptc4CL(毛果杨，gi224074401)。
使用CLUSTAL W程序，由Col6HCT基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他Col6HCT蛋白质的氨基酸序列比对显示于图5中。下文是与推定的Col6HCT蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：CycarHCT(刺苞菜蓟(Cynara cardunculus)，gi：73671233)((2007)Isolation and functional characterization of a cDNA coding ahydroxycinnamoyltransferase involved in phenylpropanoid biosynthesis inCynara cardunculus，BMC Plant Biol.7，14)；和PtcHCT(毛果杨，gil83585181)。
使用CLUSTAL W程序，由ColC3H基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他C3H蛋白质的氨基酸序列比对显示于图6中。下文是与推定的ColC3H蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：EglC3H(蓝桉(Eucalyptus globulus)，gi：295413824)；PtcC3H(毛果杨，gi：224139664)；和PalxPgrC3H(银中杨X大齿杨(Poplus alba XPopulusgrandidentata)，gi166209291)。
使用CLUSTAL W程序，由ColC4H基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他C4H蛋白质的氨基酸序列比对显示于图7中。下文是与推定的ColC4H蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：GarC4H(亚洲棉(Gossypium arborium)，gi9965897)和GarC4H(亚洲棉，gi9965899)。
使用CLUSTAL W程序，由ColPAL基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他PAL蛋白质的氨基酸序列比对显示于图8中。下文是与推定的ColPAL蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：JcoPAL(麻疯树(Jatropha Curcas)，gi113203757)和PtrPAL(毛果杨，gi：183585195)。
使用CLUSTAL W程序，由ColCCR2基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他CCR蛋白质的氨基酸序列比对显示于图9中。下文是与推定的ColCCR2蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：AthCCR(拟南芥，gi：15237678)；CofCCR(油茶(Camellia oleifera)，gi228480464)；和AlyCCR(琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)，gi：297793385)。
使用CLUSTAL W程序，由ColCCR3基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他CCR蛋白质的氨基酸序列比对显示于图10中。下文是与推定的ColCCR3蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：RcoCCR(蓖麻，gi：255556687)和AthCCR(拟南芥，gi：15226955)。
使用CLUSTAL W程序，由ColF5H基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他F5H蛋白质的氨基酸序列比对显示于图11中。下文是与推定的ColF5H蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：EglF5H(蓝桉，gi：255970299)和PtcF5H(毛果杨，gi：6688937)。
使用CLUSTAL W程序，由ColCOMT基因编码的推定蛋白质与在NCBI数据库中可获得的其他COMT蛋白质的氨基酸序列比对显示于图12中。下文是与推定的ColCOMT蛋白质比对的蛋白质列表，其中GeneBank登记号在圆括号中：GhiCOMT(陆地棉，gi：253509569)和EcaCOMT(赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)，gi：262474806)。
启动子区的基序分析
对于预测的基因模型中的每一个，提取2000bp的上游区的两条链，并且针对PlantCARE数据库(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索顺式基序序列(Lescot，M.，等人(2002)PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatoryelements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences，Nucleic Acids Res，30，第325-327页)。如果发现所选序列的任何部分与附近基因重叠，则上游区的该部分排除在进一步分析外。汇集已知涉及响应多个发育过程和胁迫的重要基序列表(表1)。
表1：在黄麻单木质醇生物合成基因的启动子区中发现的基序列表
通过包含从长蒴黄麻中收集的黄麻植物组织的cDNA文库的高通量测序分离本发明的多核苷酸。本发明的多核苷酸中的一些可以是部分序列，因为它们不代表编码全长多肽的全长基因。此类部分序列可通过使用引物和/或探针和众所周知的杂交和/或PCR技术分析和测序多个DNA文库进行延伸。部分序列可延伸直至鉴定编码多肽的开放读码框、全长多核苷酸、能够表达多肽的基因、或另一有用的基因组部分。
基因组DNA和异源物种DNA的鉴定可通过标准DNA/DNA杂交技术在合适的严格条件下完成，其中使用多核苷酸序列的全部或部分作为探针以筛选合适文库。作为另外一种选择，使用寡核苷酸引物的PCR技术可用于扩增且鉴定基因组和cDNA序列，所述寡核苷酸引物基于已知基因组DNA、cDNA或蛋白质序列进行设计。
可通过将编码所需多肽的本发明的多核苷酸序列插入表达载体内并且在合适的宿主中表达该多肽，来产生本发明的多肽。可采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任一个。表达可在任何合适的宿主细胞中实现，所述宿主细胞已用含有多核苷酸分子的表达载体转化或转染，所述多核苷酸分子编码重组多肽。合适的宿主细胞包括原核、酵母和高等真核细胞。
从黄麻中纯化或通过重组方法产生的包含木质素生物合成途径的多肽，可用于根据已知方法生成如本文定义的单克隆抗体、抗体片段或衍生物。还考虑了识别且结合包含本发明的木质素生物合成途径的多肽的片段的抗体，条件是该抗体对于包含木质素生物合成途径的多肽是特异性的。
本发明的遗传构建体还可含有在植物细胞中有效的选择标记，以允许检测含有本发明构建体的转化细胞。本领域众所周知的此类标记一般赋予对一种或多种毒素的抗性，或者产生在荧光显微镜下关于其存在的视觉信号。作为另外一种选择，所需构建体在转化细胞中的存在可借助于本领域众所周知的其他技术例如DNA和蛋白质印迹进行测定。本发明的遗传构建体可连接至具有至少一个复制系统例如大肠杆菌(E.coli)或酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的载体，由此在每次操作后，所得的构建体可得到克隆和测序。
本发明的遗传构建体可用于转化多种植物，例如单子叶的(例如稻)和双子叶的(例如黄麻、拟南芥属)。在优选实施例中，本发明的遗传构建体用于转化黄麻。如上文讨论的，用本发明的遗传构建体转化植物可用于在植物中产生改变的木质素含量。
用于将遗传构建体稳定掺入靶标植物的基因组内的技术是本领域众所周知的，并且包括根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的引入、电穿孔、注入分生组织或生殖器官内、注入未成熟胚内等。技术的选择将取决于待转化的靶标植物/组织/宿主。
术语“植物”包括全植物、枝条营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)、及其后代。可在本发明的方法中使用的植物种类一般与顺应转化技术的高等和低等植物一样广泛，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、苔藓植物和多细胞藻类。它包括具有多种倍数性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
使用用于若干黄麻酶的正向和反向引物的PCR反应的DNA凝胶显示于图13-17中。在图13中，DNA凝胶是来自长蒴黄麻的CAD2。泳道1是使用cDNA作为模板的CAD2的PCR产物。正向引物和反向引物分别为SEQ IDNO.53和54。泳道2是1Kb+梯。在图14中，DNA凝胶是来自长蒴黄麻的CCoAOMT1。泳道1是1Kb+梯，并且泳道2是使用cDNA作为模板的CCoAOMT1的PCR产物。正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.55和56。在图15中，DNA凝胶是来自长蒴黄麻的4CL1。泳道1是1Kb+梯，并且泳道2是使用cDNA作为模板的4CL1的PCR产物。正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.57和58。在图16中，DNA凝胶是来自长蒴黄麻的CCR3。泳道1是1Kb+梯，并且泳道2是使用cDNA作为模板的CCR3的PCR产物。正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.59和60。在图17中，DNA凝胶是来自长蒴黄麻的F5H。泳道1是1Kb+梯，并且泳道2是使用cDNA作为模板的F5H的PCR产物。正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.61和62。
定义
当外源或异源DNA已引入细胞内时，细胞已由此类DNA“转化”或“转染”。转化DNA可整合到或不整合到(共价交联)细胞的基因组内。在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，例如转化DNA可维持在附加型元件例如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是其中转化DNA已变得整合到染色体内、使得它通过染色体复制由子细胞继承的细胞。本发明的实践考虑广泛多样的稳定转化的植物细胞。
“表达盒”是指核酸构建体，其当引入宿主细胞内时，导致RNA和/或多肽分别的转录和/或翻译。表达盒可包括这样的的核酸：其包含启动子序列，连同或不连同含有mRNA多腺苷酸化信号的序列，和位于启动子下游的一个或多个限制性酶位点，从而允许插入异源基因序列。当编码异源蛋白质的基因通过插入限制位点之一内而可操作地连接至启动子时，表达盒能够指导异源蛋白质的表达。当含有异源蛋白质的表达盒引入宿主细胞内时，重组表达盒允许异源蛋白质在宿主细胞中表达。表达盒可源自多种来源，取决于待用于表达的宿主细胞。例如，表达盒可含有源自病毒、细菌、昆虫、植物或哺乳动物来源的组分。在转基因表达和内源基因抑制(例如通过反义或有义抑制)的情况下，插入的多核苷酸序列无需是等同的，并且可与它所源自的基因的序列是“基本上等同的”。优选地，重组表达盒允许在感染早期时的表达和/或它允许在生物体例如植物的基本上所有细胞中的表达。适合于植物转化的表达盒的例子可在美国专利号5,880,333和6,002,072；国际专利公开号WO/1990/002189和WO/2000/026388；Ainley和Key(1990)Plant Mol.Biol.，14，第949-967页；和Birch(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48，第297-326页中找到，所有所述参考文献均通过引用并入本文。
术语“宿主细胞”是指来自任何生物体的细胞。优选的宿主细胞源自植物、细菌、酵母、真菌、昆虫或其他动物。术语“重组宿主细胞”(或简单的“宿主细胞”)是指重组表达载体已引入其内的细胞。应当理解术语“宿主细胞”不仅意指特定的受试细胞还意指此类细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响在随后的世代中出现，所以此类后代事实上可不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。用于将多核苷酸序列引入多个类型的宿主细胞内的方法是本领域众所周知的。提供的是用本发明的重组表达盒转化的宿主细胞或宿主细胞的后代。宿主细胞可以是植物细胞。优选地，植物细胞是黄麻细胞。
术语“可操作地连接的”或“可操作地插入的”意指编码序列表达所需的调节序列置于核酸分子中相对于编码序列的合适位置中，以便使得编码序列能够表达。这个相同定义有时应用于其他转录控制元件(例如增强子)在表达盒中的排列。转录和翻译控制序列是提供编码序列在宿主细胞中的表达的DNA调节序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等。
术语“启动子”、“启动子区”或“启动子序列”一般是指基因的转录调节区，其可在编码区的5′或3′侧、或在编码区内、或在内含子内发现。一般地，启动子是能够结合细胞的RNA聚合酶且起始下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调节区。典型的5′启动子序列在其3′末端由转录起始位点结合且上游(5′方向)延伸，以包括以超过本底可检测的水平起始转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内的是转录起始位点(方便地通过用核酸酶S1作图限定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
术语“核酸构建体”或“DNA构建体”有时用于指可操作地连接合适的调节序列且插入用于转化细胞的表达盒内的一个或多个编码序列。这个术语可与术语“转化DNA”或“转基因”互换使用。此类核酸构建体可含有关于目的基因产物的编码序列，连同可选标记基因和/或报道基因。术语“可选标记基因”是指编码产物的基因，当表达时，所述产物对经转化的细胞赋予可选表型例如抗生素抗性。术语“报道基因”是指编码可直接或间接地通过标准方法容易地检测的产物的基因。
核酸构建体的“异源”区是在较大分子内可鉴定的一个或多个核酸分子区段，其在自然界中未发现与该较大分子结合。当异源区编码植物基因时，该基因通常侧接在来源生物体的基因组中不侧接植物基因组DNA的DNA。在另一例子中，异源区是其中编码序列自身在自然界中未发现的构建体(例如其中基因组编码序列含有内含子的cDNA，或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不引起如本文定义的DNA的异源区。术语“DNA构建体”还用于指异源区，特别是构建用于在细胞转化中使用的异源区。
术语“载体”意指能够转运它已与之连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指另外的DNA区段可连接到其内的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体可在引入宿主细胞内之后整合到宿主细胞的基因组内，并且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单的“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而，本发明意欲包括发挥等价功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“序列同一性百分比”通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列进行测定，其中与参考序列(其不含添加或缺失)相比较，比较窗中的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即缺口)以用于两个序列的最佳比对。百分比通过下述进行计算：测定在其处等同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置数目，以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的总位置数目，并且将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。
术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含这样的序列，如使用本文描述的程序，优选如所述的使用标准参数的BLAST测定地，与参考序列相比较，所述序列具有至少25％序列同一性。作为另外一种选择，同一性百分比可以是25％-100％的任何整数。更优选的实施例包括与参考序列相比较具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸序列。通过考虑密码子简并、氨基酸相似性、读码框定位等，可适当地调整这些值，以测定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
术语氨基酸序列(和具有这些氨基酸序列的多肽)的“基本同一性”通常意指如使用本文描述的程序，优选如所述的使用标准参数的BLAST测定地，与参考序列相比较至少40％的序列同一性。优选的氨基酸同一性百分比可以是40％-100％的任何整数。更优选的实施例包括与参考序列相比较具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。“基本上等同的”多肽共享如上所述的氨基酸序列，除了并非等同的残基位置可通过保守氨基酸变化而不同外。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪酸羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
通过引用并入
所有美国专利、美国公开专利申请和本文引用指定美国的公开PCT申请在此通过引用并入。
等价物
虽然本发明的若干实施例已在本文中得到描述且举例说明，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文描述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的多种其他方法和/或结构，并且此类变化和/或修饰各自视为在本发明的范围内。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过例行实验确定，关于本文描述的本发明的具体实施例的许多等价物。因此应当理解前述实施例仅呈现作为例子，并且在附加权利要求及其等价物的范围内，本发明可以如具体描述且请求保护外的其他方式进行实践。

Claims (68)

1.一种与选自下述的核酸序列具有至少90%序列同一性的分离的核酸分子：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、25、26、28、29、31、33、35、37、39、40、42、44、45、47、49和51。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子与所述核酸序列具有至少95%序列同一性。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子与所述核酸序列具有至少98%序列同一性。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子与所述核酸序列具有至少99%序列同一性。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子与所述核酸序列具有至少100%序列同一性。
6.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
7.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
8.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
9.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
10.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
11.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:16、18和20。
12.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:16、18和20。
13.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:16、18和20。
14.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:16、18和20。
15.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:16、18和20。
16.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:22、24、25、26、28和29。
17.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:22、24、25、26、28和29。
18.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:22、24、25、26、28和29。
19.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:22、24、25、26、28和29。
20.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:22、24、25、26、28和29。
21.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:31。
22.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:31。
23.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:31。
24.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:31。
25.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:31。
26.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:33。
27.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:33。
28.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:33。
29.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:33。
30.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:33。
31.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:35、37和39。
32.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:35、37和39。
33.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:35、37和39。
34.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:35、37和39。
35.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:35、37和39。
36.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:40和42。
37.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:40和42。
38.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:40和42。
39.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:40和42。
40.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:40和42。
41.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:44、45和47。
42.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:44、45和47。
43.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:44、45和47。
44.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:44、45和47。
45.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:44、45和47。
46.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:49。
47.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:49。
48.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:49。
49.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:49。
50.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:49。
51.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:51。
52.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:51。
53.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:51。
54.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:51。
55.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述分子选自：SEQID NO:51。
56.一种与选自下述的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的分离的多肽分子：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、27、30、32、34、36、38、41、43、46、48、50和52。
57.根据权利要求31所述的分离的多肽分子，其中所述分子与所述氨基酸序列具有至少95%序列同一性。
58.根据权利要求31所述的分离的多肽分子，其中所述分子与所述氨基酸序列具有至少98%序列同一性。
59.根据权利要求31所述的分离的多肽分子，其中所述分子与所述氨基酸序列具有至少99%序列同一性。
60.根据权利要求31所述的分离的多肽分子，其中所述分子与所述氨基酸序列具有至少100%序列同一性。
61.选自下述的对于cDNA扩增有用的一对正向引物和反向引物：SEQ ID NO53和SEQ ID NO54；SEQ ID NO55和SEQ ID NO56；SEQIDNO57和SEQ ID NO58；SEQ ID NO59和SEQID NO60；以及SEQ ID NO61和SEQ ID NO62。
62.一种包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子的表达载体。
63.一种与根据权利要求31所述的多肽分子特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。
64.一种包含根据权利要求37所述的载体的经转染的植物细胞。
65.一种源自根据权利要求39所述的转基因植物的材料。
66.一种来自根据权利要求39所述的转染植物的种子。
67.一种用于制备转基因植物的方法，所述方法包括下述步骤：
用根据权利要求37所述的载体转染至少一种植物细胞；和
使所述至少一种植物细胞生长成植物。
68.一种改善黄麻植物的生长、纤维产量、纤维强度、疾病抗性或水利用的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的非天然核酸序列掺入黄麻植物内。
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