TR201807621T4 - Corchorus olitorius ve corchorus capsularis dan wuschel-ilişkili homeobox4 (wox4) proteinini kodlayan nükleotid dizisi ve bunun kullanım yöntemleri. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, Corchorus olitorius ("C. olitorius") ve Corchorus capsularis ("C. capsularis") olarak adlandırılan jüt bitkilerinin iki türünden WUSCHEL-ilişkili homeobox4 proteinlerini ve bunlardan türetilen uygun polipeptitleri kodlayan izole polinükleotidleri açıklar. Açıklanan polinükleotid dizileri, jüt bitkisinde lif üretiminin arttırılmasında katalitik aktivitelere sahip WUSCHEL-ilişkili homeobox4 polipeptitleri (WOX4) kodlar. Mevcut buluş ayrıca doğal suş bitkilere veya diğer kontrol bitkilere göre yüksek lif verimine sahip bir WOX4 polipeptidini kodlayan bir nükleik asidin modüle edilmiş bir ifadesine sahip bitkiler ile ilgilidir. Vektörler, ifade yapıları ve proteine ait nükleotid dizilerini içeren ve/veya bunlardan oluşan konakçı hücreler de sağlanır. Ayrıca proteinlerin üretilmesine yönelik yöntemler ve istenen karakteristiklerini geliştirmek amacıyla proteinlerin modifiye edilmesine yönelik yöntemler açıklanır. Buluşa ait proteinler, bitki büyümesi, bitki yüksekliği, lif ve tohum veriminin indüklenmesi, başlatılması, geliştirilmesi veya arttırılması dahil çeşitli şekillerde kullanılabilir.

Description

TARIFNAME CORCHORUS OLITORIUS VE CORCHORUS CAPSULARIS,DAN WUSCHEL-ILISKILI HOMEOBOX4 (WOX4) PROTEININI KODLAYAN NÜKLEOTID DIZISI VE BUNUN KULLANIM YÖNTEMLERI Bulus sahasi Mevcut bulus, genellikle moleküler biyoloji alani ile ilgilidir ve WUSCHEL- iliskili homeobox4 protein (WOX4) polipeptidini kodlayan bir nükleik asidin bir bitkideki ifadesinin modüle edilmesi ile lif verimi ile iliskili niteliklerin arttirilmasina yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Daha belirgin olarak mevcut bulus, C. olitorius ve C. capsulari's olarak adlandirilan jüt bitkilerinin iki türünden izole edilen WUSCHEL-iliskili h0me0b0x4 (WOX4) homologlari ve bunun bir transgenik jüt bitkisinin yani sira jüt bitkisinde sak lifi üretiminde uygulanmasini saglar.

Bulusun alt yapisi Jüt, çevre dostu ve biyolojik olarak parçalanabilen dogal bir liftir. Birim tarla alani basina yüksek biyokütle üretimi olan yenilenebilir bir kaynaktir. 100lden fazla jüt türü (yabani akrabalar dahil) dogal sak lifi üretir. Jüt, Corchorus cinsinde bitkilerden üretilir, bu son zamanlarda Malvaceae ile olinak üzere Tiliaceae familyasi ile siniflandirilmistir. Ancak bu türlerin sadece ikisi, C. olitori'iis ve C. capsularis, endüstriyel amaçlarda kullanim için uygun yüksek kaliteli lif üretir.

Dogal bir lif olan jüt, sentetiklerin takviye edilmesi veya degistirilmesi gibi çesitli sekillerde kullanilabilir ve bu, endüstriden giderek artan bir ilgi çekmektedir. Jüt lifine yönelik küresel olarak artan bir talebin bulunmasi nedeniyle jüt lif üretiminin daha fazla gelistirilmesi gereklidir. Dolayisiyla lif biyosentezinin incelenmesi ve bu litîn biyosentezinde bulunan moleküler biyolojinin arastirilmasinda önemli bir ilgi mevcuttur.

Jüt lifi, iki türde liften olusan ve/veya bunu içeren bir ksilem disi liftir: (i) hücre bölünmesi ve modifikasyonu yoluyla protofloem bölgesinde prokambiyumdan gelisen primer Iloem lifi ve (ii) igimsi ve öz isini inisiyallerinin aktivitesi araciligiyla kambiyumdan gelisen ikincil floem lifi (Maiti ve Mitra, 1972. Bull Bot Soc Bengal 26:79-85). Bu prokambiyum ve kambiyum dokulari, prokambiyal hücrelerin proliferasyonunu destekleyen ve bunlarin ksilem farklilasmasini baskilayan trakeit elemanlari farklilasma inhibitör faktörü (TIDF) ve TDIF reseptör (TDR) membran protein kinazinin aracilik ettigi hücreden hücreye haberlesir (Sekil 1; Hirakawa et al., 2010. Plant Cell, 22:2618-2629; Etchells et al., 2013. Development 140, 2224-2234).

WUSCHEL-iliskili HOMEOBOX (WOX) gen familyasi, çesitli embriyonik, meristematik ve organ inisyal hücrelerinin baslatilinasi ve/veya bakimi sirasinda iliskili fonksiyonlari gerçeklestirir (Haecker et al., 2004). WUSCHEL-iliskili HOMEOBOX (WOX) gen proteinleri arasinda WOX4, TDIF sinyalleme yolaginin önemli bir regülatörü olarak hareket eder (Hirakawa et al. 2010) ve prokambiyum ve kambiyumda tercihen ifade edilir (Schrader et al., 2004; Ji et al., 2010 ve Hirakawa et al. 2010). Örnegin TDIF-TDR, Arabidopsz's ve Domateste prokambiyum/kambiyum kök hücrelerinin korunmasini destekleyen ana transkripsiyon faktörü WUSCHEL-iliskili HOMEOBOX4”ün (WOX4) transkripsiyonunu indükler. WUSCHEL-iliskili HOMEOBOX4 (WOX4) polipeptit, bitkideki sak lifinin baslatilmasini katalize eder. Ancak bu polipeptit ile iliskili önceki teknikte saglanan yeterli sayida karakterizasyon raporu veya mevcut teknoloji bulunmaz. U.S. Patent No. 2011/0283420 Al, bitkilerde artmis alan-iliskili niteliklere yönelik wuschel iliskili homeobox l-benzeri (WOXl- benzeri) polipeptidi açiklamistir. Bir diger E.P. Patent No. 1451301 B1, bitkilerdeki somatik embriyojenez desteginde wuschel geninin kullanimini açiklamistir. Son zamanlarda bazi wuschel geni homologlari, U.S. Patent No. 2010/0100981 A1”de açiklanmistir.

WUSCHEL-iliskili homeobox4 proteinin jüt lifinin biyosentez yolaginda önemli bir rol oynamasi göz önünde bulundurularak endüstri için WUSCHEL-iliskili homeobox4”ün (WOX4) moleküler biyolojisi ve genetik bilgisi arastirilarak ve kullanilarak bitkide lif biyosentezi ile iliskili genetik bir yaklasim saglanmasi istenir. Bunun yani sira her bir bitki türünün lif biyosentez yolagi ve genetik yapisi tipik olarak degisiklik gösterir, ayrica j üt bitkilerinden lif verimini optimize etmek ve endüstride kullanim saglamak üzere uyumlu sonuçlar elde etmek amaciyla türe spesifik bir yaklasim tercih edilebilir.

Bulusun kisa açiklamasi Mevcut bulusun bir amaci, digerleri arasinda, C. olitorius ve C. capsularifden türetilen, bir gen kodlayici proteinin saglanmasidir, bu sak lifi olusumunun baslatilmasinin katalize edilmesinde bulunur ve bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4)-benzeri diziye sahiptir. Daha spesifik olarak mevcut bulus, Iloem lifini indükleme kapasitesine sahip, dolayisiyla böylelikle kodlanan bir protein saglanarak bir gen ve kullanimlarini saglar.

Mevcut bulusun bir diger amaci, diger sak lifi üreten bitkilerin yani sira C. olitorius ve C. capsulari's bitkilerinde lif üretimi, büyütülmesi, mukavemeti ve veriminin gelistirilmesine yönelik arastirilacak/kullanilacak WUSCHEL-iliskili homeobox4”ün (WOX4) moleküler biyolojisi ve genetik bilgisinin saglanmasidir.

Mevcut bulusun yine bir diger amaci, bitkide WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) biyosentezi regüle edilerek yüksek lif üretimi olan transgenik bir C. olitorius ve C. capsularis bitkisinin elde edilmesidir.

Mevcut bulusun yine bir diger amaci, açiklanan yönteminin performansini hizlandirabilen, spesifik nükleotid dizilerine sahip izole nükleotidlerin saglanmasi ve transgenik C. olitori'us ve C. capsulari's bitkilerine erisimin saglanmasidir.

Mevcut bulusun ilave amaci, jüt lifi bazli ürünlere yönelik lif üretimini arttirmak üzere potansiyel ticari olarak kolay bir yolun saglanmasidir.

Bir birinci açida mevcut bulus, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleik asit molekülü içeren, C. oli'tori'us veya C. capsularz's bitkisinden türetilen bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptidi kodlayan bir izole polinükleotid saglar: (a) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5°te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü ve (b) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5,te belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü.

Ikinci bir açida bulus, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içeren bir izole WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptit saglar: (a) SEQ ID NO: 3 veya SEQ ID NO: 6”da belirtilen bir amino asit dizisi veya biyolojik olarak aktif parçasi ve (b) SEQ ID NO: 3 veya 65da belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizisine sahip bir amino asit dizisi içeren bir amino asit dizisi. Polipeptit, Coli'tori'us veya C. capulari's bitkisinde Iloem lif bilesimini modifiye etmek üzere baslatma, olusturma, arttirma ve varyasyonun katalize edilmesinden olusan gruptan seçilen bir fonksiyon içerir.

Mevcut bulus, SEQ ID NO: 3,te belirtilen amino asit dizisine sahip bir proteini kodlayan C. olitori'ussden izole edilen bir gen saglar, bu tloem lif olusumunun baslatilmasinin katalize edilmesinde bulunur ve bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4)-benzeri diziye sahiptir. Mevcut bulus ayrica bir veya birçok amino asit ilavesi veya silinmesi ve/veya SEQ ID NO: 3°te belirtilen amino asit dizisinde diger amino asitler ile degistirilmesi yoluyla modifiye edilen bir amino asit dizisine sahip bir proteini kodlayan bir gen saglar, bu Iloem lif olusumunun baslatilmasinin katalize edilmesinde bulunur ve bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4)-benzeri diziye sahiptir. Mevcut bulus ayrica SEQ ID NO: 6°da belirtilen amino asit dizisine sahip bir proteini kodlayan C. capsulari'fden izole edilen bir gen saglar, bu floem lif olusumunun baslatilmasinin katalize edilmesinde bulunur ve bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4)-benzeri diziye sahiptir. Mevcut bulus ayrica bir veya birçok ainino asit ilavesi veya silinmesi ve/veya SEQ ID NO: 6ida belirtilen amino asit dizisinde diger amino asitler ile degistirilmesi yoluyla modifiye edilen bir amino asit dizisine sahip bir proteini kodlayan bir gen saglar, bu floem lif olusumunun baslatilmasinin katalize edilmesinde bulunur ve bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4)-benzeri diziye sahiptir.

Mevcut bulusun tercih edilen düzenlemelerin birine göre kullanilan C. oli'tori'us bitkisi, 0-4 çesididir ve kullanilan C. capsularis bitkisi CVL-l çesididir.

Mevcut bulusun üçüncü bir açisi, birinci açiya ait bir izole polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapisini açiklar, burada polinükleotid sirasiyla C. olitorius ve C. capsulari's bitkisinde bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) homologunu üretmek üzere bir konakçi hücrede ifade edilebilir niteliktedir.

Mevcut bulusa ait ilave düzenleme, bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) protein homologu üretmek üzere bir polinükleotidi ifade edebilen üçüncü açiya ait bir rekombinant gen yapisini içeren bir transformanttir.

Bir diger düzenleme, bulusa ait bir transformanttan alinan bir tohum saglar, burada söz konusu tohum birinci açiya ait bir izole polinükleotidi içerir.

Bir diger açi, asagidaki adimlari içeren, kontrol bitkilerine göre yüksek veya artmis lif verimine sahip bir bitki veya transgenik bitkinin üretilmesine yönelik bir yöntem saglar: (a) üçüncü açiya sahip bir polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapisinin bir bitki hücresine yerlestirilmesi ve (b) bitki büyümesini ve gelisimini destekleyen kosullar altinda bitki hücresinin yetistirilmesi ve (c) asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polipeptidin ifade edilmesi: (i) SEQ ID NO: 3 veya SEQ lD NO: 6lda belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit veya bir biyolojik olarak aktif parçasi ve (ii) SEQ ID NO: 3 veya SEQ ID NO: 6'da belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir polipeptit.

Bulusa ait ilave bir açi, üçüncü açiya ait rekombinant gen yapisinin bir jüt bitkisine yerlestirilmesini içeren, bir jüt bitkisinde bitki büyümesi, bitki yüksekligi, lif ve tohum veriminin indüklenmesi, baslatilmasi, gelistirilmesi veya arttirilmasina yönelik bir yöntem saglar, burada rekombinant gen yapisi ayrica (a) veya (b)7de belirtilen bir nükleik asit molekülüne islevsel olarak bagli bir promotör bölgesi içerir, burada söz konusu promotör, nükleik asit molekülünün transkripsiyonunu veya ifadesini arttirir.

Teknikte uzman bir kisi, mevcut bulusun amaçlari gerçeklestirmek ve burada dogal olarak bulunanlarin yani sira bahsedilen sonuçlari ve avantajlari elde etmek üzere iyi sekilde uyarlandigini kolay bir sekilde kabul edecektir.

Mevcut bulusun bu ve diger özellikleri, açilari ve avantajlari asagidaki açiklama ve istemlere referans ile daha iyi anlasilacaktir.

Sekillerin kisa açiklamasi Sekil 1 TDIF-TDR sinyalleme yolagini gösterir. TDIF-TDR sinyallemesi iki yolak halinde ayrilir, biri lif hücre baslatilmasini destekleyen, floem hücre proliferasyonunda bulunan WOX4itür ve digeri, vasküler kök hücrelerin ksilem farklilasmasini inhibe eden hipotetik bir faktördür.

Sekil2 WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) proteinini üreten, diger amino asit dizileri ile birlikte C. capsulari's'den SEQ lD NO. 6 ve C. oli'torius,dan SEQ ID NO. 3,ü karsilastiran filogenetik agaci gösterir.

Bulusun detayli açiklamasi Bulus asagidaki detayli açiklamadan ve bu basvurunun bir parçasini olusturan ekli sekillerden tam olarak anlasilabilir.

Burada saglanan tanimlar ve/veya yöntemler burada mevcut bulusu tanimlar ve mevcut bulusun uygulanmasinda uzman kisileri yönlendirir. Aksi belirtilmedigi yer hariç olmak üzere terimler, ilgili teknikte uzman kisilerin klasik kullanimina göre anlasilacaktir. Tanimlar ve/veya yöntemlerin herhangi birinin herhangi bir patent veya patent olmayan referansta saglanan herhangi bir tanim ve/veya yöntem ile uyusmadiginin bulundugu durumda bu basvuruda açik bir sekilde saglanan/benimsenen söz konusu tanimin ve/veya yöntemin burada kullanilacagi anlasilir. Tekil terimler “bir” ve “bu” baglam açik bir sekilde aksini belirtmedikçe çogul referanslari içerir. Benzer sekilde “veya” kelimesi, baglam açik bir sekilde aksini belirtmedikçe “ve” ifadesini içerir. Dolayisiyla “A ve B'yi içeren” A, veya B, veya A ve B dahil anlamina gelir. Ayrica nükleik asitler veya polipeptitler için göz önüne alindiginda tüm baz boyutlari ve amino asit boyutlari ve tüm moleküler agirlik ve moleküler kütle degerlerinin yaklasik oldugu ve açiklama için saglandigi anlasilacaktir. Burada açiklananlara benzer veya esdeger yöntemler ve materyaller, mevcut tarifnamenin uygulanmasinda veya test edilmesinde kullanilabilmesine ragmen uygun yöntemler ve materyaller asagida açiklanir.

Mevcut bulus, C. olitorius ve C. capsularifden ekstrakte edilen WUSCHEL- iliskili home0b0x4 proteini kodlayan izole polinükleotidler ve bundan türetilen polipeptitler ile ilgilidir. Daha belirgin olarak mevcut bulus, WUSCHEL-iliskili home0b0X4 homologlari ve iliskili transgenik C. olitorius ve C. capsulari's bitkilerinin yani sira bunlarin her ikisi jüt bitki türü olan C. olitoriiis ve C. capsularissde artmis lif veriminde uygulanmasini saglar. Bulusa ait genomik diziler, esas olarak C. olitori'us ve C. capsulari's genomik DNA,sina at nükleotid dizileri ve diger bitkilerin bilinen enzim genlerine ait nükleotid dizilerin karsilastirilmasi ile tanimlanan enzimleri kodlar. Bu bulustan önce bu C. olitori'us ve C. capsulari's genlerinin nükleotid dizileri, okuma çerçeveleri, ekzonlar ve intronlarin pozisyonlari, enzimlerin yapisi ve bunlarin yüksek lif verimli potansiyel jüt bitkilerinin gelisimindeki potansiyel faydasi bilinmemektedir.

Ticari olarak yetistirilen jüt türleri, C. olitorz'us ve C. capsularis°e ait genom dizisinin analizi, her iki türün lif üretiminin arttirilmasina yönelik tercih edilen katalitik aktivitelere sahip enzimleri kodlayan tekli genlere sahip oldugunu ortaya çikarir. Nükleotid dizileri ilk olarak varsayilan kodlama bölgeleri, intronlar ve birlesme baglantilarini tanimlayabilen, Augustus, Semi-HMM-based Nucleic Acid Parser (SNAP), Geneid (Genome Biolnformatics Research Lab) gibi yazilim programlari araciligiyla notlar ile açiklanir. Nükleotid dizilerinin ilave otomatik ve manuel tedavisi, kodlama bölgeleri ve diger gen özelliklerinin kesin karakterizasyonunu düzeltmek ve saptamak üzere gerçeklestirilmistir.

C. olitorius,den 30,096 eDNA ve C. capsulari'süen 37,031 CDNA kismen veya tamamen dizilenmistir. Bunlardan tek bir CDNA, jüt içinde lif üretiminin arttirilmasinda varsayilan rollere, tercih edilen katalitik aktivitelere sahip, yeni enzimleri kodlayan, her bir türden gelistirilmistir.

Açik okuma çerçeveleri (ORFsler), C. olitorius ve C. capsularis mRNA”dan türetilen cDNA kütüphanelerine ait klonlarin tam veya kismi dizilemesini takiben analiz edilmistir ve ayrica dizi analiz yazilimi kullanilarak ve veri tabanlarindaki (kamuya açik/özel) bilinen dizilere homolojinin belirlenmesi yoluyla analiz edilir.

Bu tarifname baglaminda spesifikasyon boyunca kullanilan birkaç terim, açik bir sekilde farkli bir anlama sahip oldugu gösterilmedikçe belirtilen anlamlara sahiptir.

Burada kullanildigi üzere bir "polinükleotid", bir nükleik asit parçasi gibi bir nükleotid dizisidir. Bir polinükleotid, tek veya çift iplikli olan, istege bagli olarak sentetik, dogal olmayan veya degistirilmis nükleotid bazlari içeren bir RNA veya DNA polimeri olabilir. Bir DNA polimeri formundaki bir polinükleotid, bir veya daha fazla CDNA, genomik DNA, sentetik DNA segmenti veya bunlarin karisimlari/kombinasyonunu içerebilir ve/veya bunlardan olusabilir. Tarifnameye ait bir izole polinükleotid, SEQ ID No. 1 ve SEQ ID No. 4'ten türetilen 150 bitisik nükleotidin (yukari yönlü ve asagi yönlü) en az birini veya bu tür dizilerin tamamlayici parçasini içerebilir.

Burada kullanildigi üzere “polipeptit”, peptit baglari ile birlikte baglanan ve genellikle uzunluk bakimindan IOOSden daha büyük bir amino asit dizisine sahip amino asitlerin tek lineer bir zinciridir.

“Izole”, dogal durumda “insan eliyle” degistirilmis anlamina gelir. Bir bilesim veya maddesinin dogada meydana gelmesi halinde bu, orijinal çevresinden degistirilmesi veya uzaklastirilmasi veya her iki durumda olmasi halinde “izole edilmistir”. Örnegin bir polinükleotid veya bir polipeptit dogal olarak canli bir bitki veya hayvanda “izole” edilmemis olarak bulunur ancak bunun dogal durumunda birlikte bulunan materyallerden ayrilan ayni polinükleotid veya polipeptit, burada kullanilan terim gibi “izole edilmis” durumdadir.

Burada kullanildigi üzere “gen” terimi, özellikle jüt bitkisinde lif üretiminin arttirilmasinda tercih edilen katalitik aktivitelerde bulunan WUSCHEL-iliskili home0b0x4 enzimlerinin polipeptit dizisini kodlayan polinükleotid dizisi olmak üzere C. olitori'us ve C. capsulari's bitkisinin genomik dizileri olarak tanimlanir.

Terim ayrica yukari yönlü, asagi yönlü ve/veya intron nükleotid dizilerini içeren nükleik asit moleküllerini içerebilir.

Bir “kodlama dizisi” veya “kodlama bölgesi”, dizi ifade edildiginde, bir amino asit veya polipeptit gibi bir gen ürününü üretmek üzere gerekli dizi bilgisine sahip bir nükleik asit molekülüne refere eder. Kodlama dizisi, transle edilmis bölgeler içerisinde transle edilmemis dizileri (intronlar veya 5' veya 3' transle edilmemis bölge dahil) içerebilir ve/veya bunlardan olusabilir veya bu tür müdahaleci transle edilmemis dizileri (Örnegin cDNAida oldugu gibi) içermeyebilir.

Burada kullanildigi üzere “oligonükleotid” terimi, tercihen uzunluk bakimindan -1000, en çok tercih edildigi üzere 12 ila 50 nükleotid içerebilen, kisa bir polinükleotid veya bir polinükleotid parçasidir. Mevcut bulusun düzenlemesine göre oligonükleotidlerin içerisinde bulunan nükleotidler, dogal olarak meydana gelen nükleotidlerin analoglari veya deriveleri olabilir.

Burada kullanildigi üzere “primer” terimi, bir hedef nükleik asit dizisine baglanabilen ve nükleik asit sentezini baslatabilen bir oligonükleotiddir. Burada tanimlandigi üzere bir amplifikasyon oligonükleotidi uzunluk bakimindan tercihen 10 ila 50, en çok tercih edildigi üzere 15 ila 25 nükleotid olabilir. Ek olarak mevcut bulusa ait amplifikasyon oligonükleotidler kimyasal olarak sentezlenebilir ve bu tür oligonükleotidler dogal olarak meydana gelen nükleik asitler degildir.

Nükleotid dizilerini içeren nükleik asitlere refere etmek üzere spesifikasyon boyunca kullanilan kisaltma, klasik tek harfli kisaltmalardir. Dolayisiyla bir nükleik asit içinde bulundugunda dogal olarak meydana gelen kodlama nükleotidleri su sekilde kisaltilir: adenin (A), guanin (G), sitozin (C), timin (T) ve urasil (U). Ayrica aksi belirtilmedikçe burada sunulan nükleik asit dizileri 5' -›3' yönündedir.

Burada kullanildigi üzere “tamamlayici” terimi veya bunun türevleri, A,nin T veya U ile eslestigi ve C”nin G ile eslestigi gibi iyi bilinen kurallar araciligiyla nükleik asitlerin eslesmesine referansta kullanilir. Tamamlayici parça “kismi” veya “tam” olabilir. Kismi tamamlayici parçada nükleik asit bazlarinin sadece bir kismi, baz eslestirme kurallarina göre eslestirilirken tam veya toplam tamamlayici parçada bazlarin tümü eslestirme kuralina göre eslestirilir. Nükleik asit iplikleri arasindaki tamamlayici derecesi, teknikte iyi bilindigi üzere nükleik asit iplikleri arasindaki melezlesme etkinligi ve mukavemeti üzerinde önemli etkilere sahip olabilir. Söz konusu melezlesme etkinligi ve mukavemeti tespit yöntemine baglidir.

Burada kullanildigi üzere “konakçi hücre” terimi, mevcut bulusa ait bir polinükleotidi içeren ve/veya bundan olusan bir nükleik asit yapisi veya ifade vektörü ile transformasyon, transfeksiyon, transdüksiyon, ifade ve benzerine duyarli olan herhangi bir hücre tipini içerir. Uygun konakçi hücre, özellikle saf lifi üreten bitki hücreleri olmak üzere mantar ve/veya bitki hücrelerini içerir.

“Islevsel olarak bagli” terimi genellikle burada bir kontrol dizisinin, kontrol dizisi bir polipeptidine ait kodlama dizisinin ifadesini yönlendirecek sekilde polinükleotid dizisinin kodlama dizisine göre uygun bir pozisyonda yerlestirildigi bir konfigürasyonu gösterir. Örnegin bir promotör, bu kodlama dizisinin ifadesini etkilediginde, diger bir ifadeyle kodlama dizisi promotörün transkripsiyonel kontrolü altinda oldugunda bir kodlama dizisi ile islevsel olarak baglanabilir.

Bir “vektör” genellikle seginent replikasyonunu veya ifadesini gerçeklestirmek amaciyla bir diger nükleik asit segmentinin islevsel olarak yerlestirilebildigi plazmid, faj, kozmid, mantar veya virüs gibi bir replikona refere eder. “Vektör” teriminin ayrica bunun baglandigi bir diger nükleik asidi tasiyabilen bir nükleik asit molekülüne refere etmesi tasarlanir. Bir vektör türü bir “plazmiddir”, bu ek DNA segmentlerinin baglanabildigi dairesel çift iplikli bir DNA,ya refere eder.

Bir diger vektör türü bir viral vektördür, burada ek DNA segmentleri viral genoma baglanabilir. Belirli genomlar, bunlarin eklenebildigi bir konakçi hücrede (örnegin bir bakteriyel replikasyon kaynagina sahip bakteriyel vektörler ve epizomal memeli vektörleri) otonom replikasyona sahip olabilir. Diger vektörler, konakçi hücreye yerlestirilmesi üzerine bir konakçi hücrenin genoinuna entegre edilebilir ve böylelikle konakçi genom ile birlikte kopyalanir. Ek olarak belirli vektörler bunlarin islevsel olarak baglandigi genlerin ifadesini yönlendirebilir. Bu tür vektörler burada “rekombinant ifade vektörleri” (veya basit sekilde “ifade vektörleri”) olarak refere edilir. Genellikle rekombinant DNA tekniklerinde kullanilan ifade vektörleri genellikle plazmidler formundadir. Mevcut spesifikasyonda “plazmid” ve “vektör”, plazmidin en yaygin kullanilan vektör formu olmasi nedeniyle degistirilebilir bir biçimde kullanilabilir. Ancak bulus, esdeger fonksiyonlari sergileyen viral vektörler gibi bu tür diger ifade vektörleri formlarini (örnegin replikasyon eksik retrovirüsler, adenovirüsler ve adeno iliskili Virüsler) içerecek sekilde tasarlanir.

"Nükleik asit yapisi" veya "DNA yapisi" terimi bazen uygun regülatör dizilere islevsel olarak baglanan veya bir hücrenin transforme edilmesine yönelik bir vektöre yerlestirilen bir kodlama dizisi veya dizilerine refere etmek üzere kullanilir. Bu terim, "transforme edici DNA" veya "transgen" terimi ile degistirilebilir bir biçimde kullanilabilir.

Burada kullanildigi üzere “promotör” terimi, bir asagi yönlü genin transkripsiyonunu yönlendirmek üzere fonksiyon gösteren bir nükleik asit dizisine refere eder. Promotör genellikle hedef genin içerisinde ifade edildigi konakçi hücreye uygun olacaktir. Diger transkripsiyonel ve translasyonel regülatör nükleik asit dizileri (ayrica “kontrol dizileri” olarak adlandirilir) ile birlikte promotör, belirli bir geni ifade etmek üzere gereklidir. Genellikle transkripsiyonel ve translasyonel regülatör diziler bunlarla sinirli olmamak üzere promotör diziler, ribozomal baglanma alanlari, transkripsiyonel baslatma ve durdurma dizileri, translasyonel baslatma ve durdurma dizileri ve arttirici veya aktivatör dizileri içerir.

Burada kullanildigi üzere "WUSCHEL polipeptidi" veya "WUS polipeptidi", wuschel aktivitesine sahip, diger bir ifadeyle bitkilerde kök hücrelerin baslatilmasi ve korunmasina dahil olan bir polipeptit anlamina gelir. Wuschel aktivitesi, kök hücreler dahil olmak üzere hücre büyümesini uyarir. Wuschel, domen kivrimi ve/veya döngüsünde ekstra ainino asit kalintilarini içeren bir “atipik, (hayvan homeodomen motifine kiyasla) heliks-kivrim-heliks-dönü-heliks homeodomen motifi içeren, bir bitki homeodomen proteinidir. Wuschel proteinleri ayrica iki korumali wuschel C-terminal domeni, (E/R)TLPLFP ve A(A/S)LEL(S/T)L domenleri gibi diger korumali motifleri içerebilir ve/veya bunlardan olusabilir.

Terim ayrica yukarida belirtilen fonksiyonlarin herhangi biri ile parçalari, varyantlari ve homologlari kapsayicidir.

Burada kullanildigi üzere “homolog” terimi, söz konusu modifiye edilmemis proteine göre amino asit sübstitüsyonlari, delesyonlari ve/veya insersiyonlarina sahip ve bunlarin türetildigi modifiye edilmemis protein ile benzer biyolojik ve fonksiyonel aktiviteye sahip peptitler, oligopeptitler, polipeptitler, proteinler ve enzimleri kapsayan bir proteine refere eder.

Bir delesyon, bir veya daha fazla amino asidin bir proteinden uzaklastirilmasina refere eder.

Bir insersiyon, bir proteinde önceden belirlenen bir alana yerlestirilen bir veya daha fazla ainino asit kalintisina refere eder. Insersiyonlar, N-terminal ve/Veya C- terminal füzyonlarmi ve ayrica tekli veya çoklu amino asitlerin dizi arasi insersiyonlarini içerebilir. Genellikle amino asit dizisi içine insersiyonlar, yaklasik 1 ila 10 kalinti sirasinin, N- veya C-terminal füzyonlarindan daha küçük olacaktir.

Bir sübstitüsyon, proteine ait amino asitlerin benzer özelliklere (benzer hidrofobisite, hidrofilisite, antijenlik, a-helis yapilar veya ß-levha yapilari olusturma veya koparma egilimi) sahip olan diger amino asitler ile degistirilmesine refere eder. Amino asit sübstitüsyonlari tipik olarak tekli kalintilara sahiptir ancak polipeptit üzerine yerlestirilen fonksiyonel kisitlamalara dayanarak kümelenebilir ve 1 ila 10 amino asit araliginda olabilir; insersiyonlar genellikle yaklasik 1 ila 10 amino asit kalinti sirasinda olacaktir. Amino asit sübstitüsyonlari tercihen konservatif ainino asit sübstitüsyonlaridir. Konservatif sübstitüsyon tablolari teknikte iyi bilinir (bakiniz örnegin Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman ve Company (Eds) ve asagidaki Tablo 1).

Tablo 1: Korumali amino asit sübstitüsyonlarinin örnekleri Kalinti Konservatif Sübstitüsyonlar Kalinti KonservatifSübstitüsyonlar Ala Ser Leu Ile; Va] Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gln; His Met Leu; Ile Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val Ile; Leu lle Leu, Val Amino asit sübstitüsyonlari, delesyonlari ve/veya insersiyonlari, kati fazli peptit sentezi ve/veya diger herhangi bir sentetik teknik gibi teknikte iyi bilinen peptit sentetik teknikleri kullanilarak veya rekombinant DNA manipülasyonu yoluyla kolay bir sekilde yapilabilir. Bir proteinin sübstitüsyon, insersiyon veya delesyon varyasyonlarini üretmek üzere DNA dizilerinin manipülasyonuna yönelik yöntemler teknikte iyi bilinir. Örnegin DNA içerisinde önceden belirlenen alanlarda sübstitüsyon mutasyonlarinin yapilmasina yönelik teknikler teknikte uzman kisilerce iyi bilinir ve Ml3 mutajenezi, T7-Gen in vitro mutajenez (USB, Cleveland, OH), Quick Change Site Directed mutajenez (Stratagene, San Diego, CA), PCR aracili alan yönelimli mutajenez veya diger alan yönelimli mutajenez protokollerini içerir.

Burada kullanildigi üzere “biyolojik olarak aktif parça”, C. oli'torius veya C. capsularis bitkisinde Iloem lif bilesiminde baslatma, olusturma, arttirma veya varyasyonun katalize edilmesine yönelik biyolojik bir aktiviteye sahip bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 protein parçasina refere edebilir. Bir WUSCHEL- iliskili homeobox4 proteininin biyolojik olarak aktif parçalari, WUSCHEL-iliskili homeobox4 proteinine ait amino asit dizisi, örnegin tam uzunlukta WUSCHEL- iliskili homeobox4 proteinlerden daha az amino asit içeren ve bir WUSCHEL- iliskili homeobox4 proteine ait en az bir aktiviteyi sergileyen, SEQ 1D NO: 3 veya SEQ lD NO: 6,da belirtilen amino asit dizisi ile yeterli ölçüde ayni veya bunlardan türetilen amino asit dizilerini içeren peptitleri veya polipeptitleri içerir.

Tipik olarak biyolojik olarak aktif kisimlar, WUSCHEL-iliskili homeobox4 proteinine ait en az bir aktiviteye sahip bir domen veya motif içerir. Bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 proteininin biyolojik olarak aktif bir kismi, uzunluk bakimindan örnegin 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, veya 223 amino asit olan bir polipeptit olabilir. WUSCHEL-iliskili homeobox4 protein, SEQ lD NO: 3 veya SEQ lD NO: 67da belirtilen bir amino asit dizisine sahip olabilir. Diger düzenlemelerde WUSCHEL-iliskili homeobox4 protein, SEQ 1D NO: 3 veya SEQ 1D NO: 6 ile büyük ölçüde aynidir ve SEQ 1D NO: 3 veya SEQ ID NO: 6,ya ait proteinin fonksiyonel aktivitesini bulundurur ancak dogal allelik varyasyon veya mutajenez nedeniyle ainino asit dizisinde farklilik gösterir. Bir diger düzenlemede WUSCHEL-iliskili homeobox4 proteini, SEQ ID NO: 3 veya SEQ ID NO: 6 ile en az yaklasik %95, %96, %97, %98, %99, %991, %992, %993, %994, %99,5, %996, %997, %998, %999 veya daha fazla ayni olan bir amino asit dizisi içerir.

Burada kullanildigi üzere “domen” terimi, evrimsel olarak iliskili proteinlere ait dizilerin bir hizasi boyunca spesifik pozisyonlarda korunan bir dizi amino aside refere eder. Diger pozisyonlardaki amino asitler, homologlar arasinda degiskenlik gösterebilirken spesifik pozisyonlarda yüksek derecede korunan amino asitler, bir protein yapisi, stabilitesi veya fonksiyonunda muhtemelen önemli olan amino asitleri gösterir. Bir protein homolog familyasinin hizalanmis dizilerinde yüksek koruma dereceleri ile tanimlandiktan sonra bunlar, söz konusu herhangi bir polipeptidin önceden tanimlanan bir polipeptit familyasina ait olup olmadigini belirlemek üzere tanimlayicilar olarak kullanilabilir.

Burada kullanildigi üzere "motif terimi, evrimsel olarak iliskili proteinler dizisinde kisa korunan bir bölgeye refere eder. Motifler, domenlerin genellikle yüksek derecede korunan parçalaridir ancak ayrica sadece domen parçasini içerebilir veya korunan domenin disina yerlestirilebilir (motife ait amino asitlerinin tümünün tanimlanan bölge disinda olmasi halinde).

Uzman veri tabanlari, domenlerin tanimlamasi için mevcuttur, örnegin SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl.

Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher ve Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomoleeular sequences motifs ve its function in automatic sequence interpretation. (In) lSMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-6l, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl.

Acids. Res. 32:Dl34-Dl37, (2004)) veya Pfam (Bateman et al., Nucleic acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Protein dizilerinin bilgisayar ortamindaki analizine yönelik bir dizi araç, ExPASy proteomics sunucusunda bulunabilir (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: The Proteomics Server for In-depth Protein Knowledge and Analysis, Nucleic acids Res. 3123784- 3788(2003)). Domenler veya motifler ayrica dizi hizalama gibi rutin teknikler kullanilarak da tanimlanabilir.

Bulusun amaçlarina yönelik olarak “transgenik”, “transgen” veya “rekombinant”, örnegin bir nükleik asit dizisi, bir ifade kaseti, gen yapisi veya nükleik asit dizisini içeren ve/veya bundan olusan bir vektör veya bulusa göre nükleik asit dizileri, ifade kasetleri veya vektörler ile transforme edilen bir organizma anlamina gelir, tüm bu yapilar rekombinant yöntemler araciligiyla gerçeklestirilir, burada: (a) bulusa ait yöntemlerde faydali proteinleri kodlayan nükleik asit dizileri veya (b) örnegin bir promotör olmak üzere bulusa göre nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli olan genetik kontrol dizileri veya ((3) a) ve b), bunlarin dogal genetik çevresinde bulunmaz veya rekombinant yöntemler ile modifiye edilmistir.

Modifikasyon, örnegin, bir veya daha fazla nükleotid kalintisinin bir sübstitüsyonu, ilavesi, delesyonu, insersiyonu formunu alabilir. Dogal genetik çevre, orijinal bitkide dogal genomik veya kromozomal lokus veya bir genomik kütüphanedeki mevcudiyet olarak anlasilir. Bir genomik kütüphane durumunda nükleik asit dizisinin dogal genetik çevresi en azindan kismen, tercihen muhafaza edilir. Çevre nükleik asit dizilerini en azindan bir tarafta yan yana tutar ve tercihen500 bp olmak üzere yaklasik 50 hp olan bir dizi uzunluguna sahiptir.

Dogal olarak meydana gelen ifade kaseti - örnegin yukarida tanimlandigi üzere mevcut bulus yöntemlerinde faydali bir polipeptidi kodlayan uygun nükleik asit dizisi ile nükleik asit dizilerinin dogal promotörünün dogal olarak meydana gelen kombinasyonu - bu ifade kaseti, örnegin mutajenik islemi gibi dogal olmayan, sentetik ("yapay") yöntemler ile modifiye edildiginde bir transgenik ifade kaseti olur. Uygun yöntemler örnegin US 5,565,350 veya WC 00/ 15815“te açiklanir.

Bulus amaçlarina yönelik olarak bir transgenik bitki dolayisiyla bulusa ait yöntemde kullanilan nükleik asitlerin söz konusu bitki genomunda dogal lokuslarinda olmadigi bu bitkileri içerdigi anlasilir ve dolayisiyla nükleik asitlerin homolog olarak veya heterolog olarak ifade edilmesi mümkündür. Ancak bununla birlikte, açiklandigi üzere transgenik, bulusa göre veya bulus yönteminde kullanilan nükleik asitleri bir bitki genomunda dogal pozisyonlarinda bulunurken dizinin, dogal diziye göre modifiye edildigi ve/veya dogal dizilerin regülatör dizilerin modifiye edildigi anlamina gelir. Transgenik tercihen genomda dogal olmayan bir lokusta bulusa göre nükleik asitlerin ifadesi anlamina geldigi anlasilir, burada nükleik asitlerin homolog veya tercihen heterolog ifadesi gerçeklesir.

Burada kullanildigi üzere “yerlestirme” veya “transformasyon” terimi, transfer için kullanilan yönteme bakilmaksizin bir ekzojenöz polinükleotidin bir konakçi hücreye transferini içerir. Organogenez veya embriyogenez yoluyla daha sonraki klonal çogalmayi gerçeklestirebilen bitki dokusu, mevcut bulusa ait genetik bir yapi ve bundan yeniden üretilen bir bütün bitki ile transforme edilebilir. Seçilen belirli doku, transforme edilen belirli türler için temin edilebilir veya bunlar için en uygun olan klonal çogalma sistemlerine bagli olarak degisiklik gösterecektir. Örnek niteliginde hedef dokular yaprak diskleri, polen, embriyo, çenek, hipokotil, megagametotit, kallus dokusu, mevcut merismetatik doku (örnegin apikal meristem, aksiller toinurcuklar ve kök meristemleri) ve indüklenmis meristem doku (örnegin çenek meristemi ve hipokotil meristemi) içerir. Polinükleotid geçici olarak veya stabil olarak bir konakçi hücreye yerlestirilebilir ve örnegin bir plazmid gibi entegre olmamis formda muhafaza edilebilir. Alternatif olarak bu, konakçi genoma entegre edilebilir. Ortaya çikan transforme edilmis bitki hücresi daha sonra teknikte uzman kisilerce bilinen bir sekilde transforme edilen bir bitkiyi yeniden üretmek üzere kullanilabilir.

Yabanci genlerin bir bitki genomuna transferi transformasyon olarak adlandirilir.

Bitki türlerinin transformasyonu bu noktada uygun rutin bir tekniktir. Avantajli olarak birkaç transformasyon yönteminin herhangi biri, ilgili geni uygun bir ata hücreye yerlestirmek üzere kullanilabilir. Bitkinin bitki dokulari veya bitki hücrelerinden transformasyonu ve rejenerasyonuna yönelik açiklanan yöntemler, geçici veya stabil transformasyona yönelik kullanilabilir. Transfonnasyon yöntemleri lipozomlar, elektroporasyon ve kimyasallarin kullanimini içerir, bu serbest DNA alimini, DNA”n1n direkt olarak bitkiye enjeksiyonunu, partikül tabancasi bombardimani, virüsleri veya polen içeren transformasyon ve mikro enjeksiyon içerir. Transgenik kültür bitkileri dahil transgenik bitkiler tercihen Agrobacterium-aracili transformasyon vasitasiyla üretilir. Avantajli bir transformasyon yöntemi, plantadaki transformasyondur (Sajib et. al. Plant Cell Tiss. Organ Cult. (2008) 95, 333-34).

Genellikle transfomiasyon sonrasinda bitki hücreleri veya hücre gruplari, transforme edilmis materyalin bir tam bitkide yeniden üretilmesini takiben ilgili gen ile birlikte transfer edilen bitki-ifade edilebilir genler araciligiyla kodlanan bir veya daha fazla markörün varligi için seçilir. Transforme edilen bitkileri seçmek üzere transformasyonda elde edilen bitki materyali, bir kural olarak, seçici kosullara tabi tutulur böylece transforme bitkiler, transforme edilmemis bitkilerden ayrilabilir. Örnegin yukarida açiklanan sekilde elde edilen tohumlar ekilebilir ve baslangiçtaki bir büyütme periyodundan sonra püskürtme yoluyla uygun bir seçim islemine tabi tutulabilir. Diger bir olasilik, sterilizasyon sonrasinda uygun olmasi halinde, tohumlarin uygun bir seçim ajani kullanarak agar bitkileri üzerinde büyütülmesini içerir böylece sadece transforme edilen tohumlar bitki olarak büyüyebilir. Alternatif olarak transforme edilen bitkiler, yukarida açiklananlar gibi seçilebilir bir markör varligina yönelik taranir.

DNA transferi ve rejenerasyonu takiben tahminen transforme edilen bitkiler ayrica ilgili gen varligi, kopya numarasi ve/veya genomik organizasyona yönelik, örnegin Southern analizi kullanilarak degerlendirilebilir. Alternatif olarak veya ek olarak yeni yerlestirilen DNA3nin ifade seviyeleri, Northern ve/veya Western analizi kullanilarak izlenebilir, her iki teknik teknikte uzman kisilerce iyi bilinir. Üretilen transforme bitkiler, klonal çogalma veya klasik yetistirme teknikleri gibi çesitli yollar ile çogaltilabilir. Örnegin bir birinci jenerasyon (veya Tl) transforme bitki seçilebilir ve homozigot ikinci jenerasyon (veya T2) transformantlar seçilebilir ve T2 bitkileri daha sonra klasik yetistirme teknikleri yoluyla çogaltilabilir. Üretilen transforme organizmalar çesitli formlari alabilir. Örnegin bunlar, transforme hücreler ve transforme edilmemis hücrelerin kimeralari; klonal transformantlar (örnegin ifade kasetini içermek üzere transforme edilen bütün hücreler); transforme ve transforme edilmemis dokularin greftleri (örnegin bitkilerde, transforme edilmemis bir asi kalemine grefte edilen transforme edilmis bir köksap) olabilir.

Burada kullanildigi üzere “yüksek ifade” veya “asiri ifade” terimi, orijinal dogal sus ifade seviyesine ek herhangi bir ifade formuna refere eder.

Genlerin veya gen ürünlerinin ifadesinin arttirilmasina yönelik yöntemler teknikte iyi sekilde belgelendirilir ve örnegin uygun promotörler ile tahrik edilen asiri ifadeyi, transkripsiyon arttiricilarin veya translasyon arttiricilarin kullanimini içerir. Promotör veya arttirici elemanlar olarak fonksiyon gösteren izole nükleik asitler, ilgili polipeptidi kodlayan bir nükleik asidin ifadesini yukari regüle etinek amaciyla bir polinükleotidin heterolog olmayan bir formunun uygun bir pozisyonunda (tipik olarak yukari yönlü) yerlestirilebilir. Örnegin endojenöz promotörler, mutasyon, delesyon ve/veya sübstitüsyon yoluyla in vivo degistirilebilir (bakiniz Kmiec, US 5,565,350; Zarling et al., W09322443) veya izole promotörler, bir bitki hücresine gen ifadesini kontrol etmek amaciyla mevcut bulusa ait bir genden uygun oryantasyonda ve mesafede yerlestirilebilir.

Polipeptit ifadesinin istenmesi halinde genellikle bir polinükleotid kodlama bölgesinin 3'-ucunda bir poliadenasyon bölgesini içermesi istenebilir.

Poliadenasyon bölgesi, dogal geriden, çesitli diger bitki genlerinden ve T- DNA°dan türetilebilir. Eklenecek 3' uç dizisi, örnegin nopalin sentaz veya oktapin sentaz genlerinden veya alternatif olarak diger bitki genlerinden veya daha az tercihen diger ökaryotik genden türetilebilir.

Bir intron dizi ayrica sitozolde biriken olgunlasma mesaji miktarini arttirmak üzere kismi kodlama dizisinin kodlama dizisine veya 5' transle edilmemis bölgeye (UTR) eklenebilir. Birlesebilir bir intronun bitki ve hayvan ifade yapilarinda transkripsiyon birimine dahil edilmesinin mRNA ve protein seviyelerinde gen ifadesini 1000 kata kadar arttirdigi gösterilmistir (Buchman ve Berg (1988) Mol.

Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes DeV 1:1183-1200). Gen ifadesinin bu tür intron artimi tipik olarak transkripsiyon biriminin 5' ucuna yakin yerlestirildigin en büyüktür. Dari intronlari Adhl-S intron l, 2, ve 6, Bronz-1 intron kullanimi teknikte bilinir. Genel bilgi için bakiniz: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling ve Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Iki amino asit dizisinin veya iki nükleik asit dizisinin aynilik yüzdesini belirlemek üzere diziler, optimal karsilastirma amaçlari için hizalanabilir (örnegin bosluklar, bir birinci ve ikinci bir amino asidin bir tanesinde veya her ikisinde eklenebilir veya optimal hizalama ve ayni olmayan dizilere yönelik nükleik asit dizisi, karsilastirma amaçlari için dikkate alininayabilir). Karsilastirma amaçlarina yönelik hizalanan bir referans dizi uzunlugu, referans dizi uzunlugunun en az %95,i olabilir. Daha sonra uygun amino asit pozisyonlari veya nükleotid pozisyonlarinda amino asit kalintilari veya nükleotidler karsilastirilabilir. Birinci dizideki bir pozisyon, ikinci dizideki uygun pozisyon ile ayni amino asit kalintisi veya nükleotid tarafindan isgal edildiginde moleküller bu pozisyonda ayni olur (burada kullanildigi üzere amino asit veya nükleik asit “ayniligi” amino asit veya nükleik asit “homolojisine” esdegerdir). Iki dizi arasindaki aynilik yüzdesi, iki dizinin optimal hizasi için eklenmesi gereken, bosluk sayisi ve her bir bosluk uzunlugu göz önünde bulundurularak, dizilerin paylastigi ayni pozisyonlarin sayisinin bir fonksiyonudur.

Dizilerin karsilastirilmasi ve iki dizi arasindaki aynilik yüzdesinin belirlenmesi, matematiksel bir algoritma kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bir düzenlemede iki amino asit dizisi arasindaki aynilik yüzdesi, bir Blosum 62 matriksi veya bir PAM250 matriksi ve 16, 14, 12, 10, 8, 6 veya 4 olan bir bosluk agirligi ve 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 olan bir uzunluk agirligi kullanilarak, GCG yazilim paketinde (http://www.gcg.com internet sitesinde mevcuttur) GAP programina katilmis olan Needleman ve Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritmasi kullanilarak belirlenebilir. Tercih edilen bir diger düzenlemede iki nükleotid dizisi arasindaki aynilik yüzdesi, bir NWSgapdna.CMP matriksi ve 40, 50, 60, 70 veya 80 olan bir bosluk uzunlugu ve 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 olan bir uzunluk agirligi kullanilarak GCG yazilim paketinde (http://WWW.gcg.com internet sitesinde mevcuttur) GAP programi kullanilarak belirlenebilir. Bir diger düzenlemede iki amino asir veya nükleotid dizisi arasindaki aynilik yüzdesi, bir PAM120 agirlik kalinti tablosu, 12 olan bir bosluk uzunluk cezasi ve 4 olan bir bosluk cezasi kullanilarak ALIGN programina (versiyon 2.0 veya 2.0U) katilmis olan E. Meyers ve W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17 (1988)) algoritmalari kullanilarak belirlenebilir.

Iki dizi arasindaki ayniligi belirlemek üzere kullanilabilen örnek niteliginde bilgisayar programlari bunlarla sinirli olmamak üzere WWW.ncbi.nlm.nih.g0v/BLAST internet adresinde halka açik olarak erisilebilir BLAST programlari takimini, örnegin, BLASTN, BLASTX, ve TBLASTX, BLASTP ve TBLASTN içerir.

GenBank DNA Dizileri ve diger halka açik veri tabanlarindaki nükleik asit dizilerine göre belirli bir nükleik asit dizisi degerlendirildiginde dizi arastirmalari tipik olarak BLASTN programi kullanilarak gerçeklestirilir. BLASTX programi, GenBank Protein Dizileri ve diger halka açik veri tabanlarindaki amino asit dizilerine karsi tüm okuma çerçevelerinde transle edilmis nükleik asit dizilerinin arastirilmasi için tercih edilir.

Iki veya daha fazla dizi arasindaki “aynilik %”sini” belirlemek üzere seçilen dizilerin tercih edilen bir hizalamasi, örnegin CLUSTAL-W programi kullanilarak gerçeklestirilir.

Belirtildigi üzere mevcut bulusa ait bir düzenleme, sirasiyla SEQ ID NO 2 ve olitori'us ve C. capsularis bitkisinde bulunan WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayan izole polinükleotidlerdir. Buna uygun olarak nükleotid dizileri tarafindan kodlanan ilgili WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptitleri, SEQ ID NO 3 ve SEQ ID NO 6”da belirtilen amino asit dizilerine sahiptir.

Mevcut bulusa ait bir düzenlemeye göre SEQ 1D NO 3, C. olitori'us-türevli WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) homologun polipeptit dizisine refere eder ve SEQ ID NO 6, C. capsulari's-deriveli WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) homologunun polipeptit dizisine refere eder. Bu her iki enzim, bitkideki lif hücresinin biyosentezinin hazirlanmasina yönelik baslatici moleküllerin katalize edilmesine yönelik olarak C. olitorius ve C. capsulari's bitkilerindeki lifin biyosentez yolaginda bulunur.

Mevcut bulus ayrica C. olitorius ve C. capsulari's bitkilerinden WUSCHEL- iliskili home0b0x4 (WOX4) hoinologlarini kodlayan bir gen dizisi saglar.

Bir varyanta SEQ ID No. l”de gösterilen 1250 bp uzunlugunda polinükleotid, C. olitori'ussden izole edilen tam uzunluktaki gendir. Bu gen dizisi, genin yukari ve asagi yönünden en az 150 bitisik nükleotidi içerir. Bu ayrica gene ait intronik diziyi saglar.

Bir varyanta SEQ ID No. 47te gösterilen 1237 bp uzunlugunda polinükleotid, C. capsularz'.s”den izole edilen tam uzunluktaki gendir. Bu gen dizisi, genin yukari ve asagi yönünden en az 150 bitisik nükleotidi içerir. Bu ayrica gene ait intronik diziyi saglar.

Mevcut bulusun bir düzenlemesinde SEQ ID NO 2 ve/veya SEQ ID NO 5,te belirtilen nükleotid dizisini içeren bir polipeptidi kodlayan bir izole polinükleotid saglanir. SEQ 1D NO 2, C. oli'torius-deriveli WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) homolog dizinin polinükleotid dizisine refere eder ve SEQ ID NO 5, C. capsularis-deriveli WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) homolog dizinin polinükleotid dizisine refere eder.

Yine bir diger düzenlemede bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayabilen bir izole nükleik asit molekülü veya biyolojik olarak aktif parçasi, SEQ 1D NO: 2, SEQ ID NO: 5”te belirtilen nükleotid dizisinin veya herhangi bir tamamlayici parçasinin tam uzunlugu ile en az yaklasik %95, %96, %97, %98, %99, %991, %992, %993, %994, %99,5, %996, %997, %998, %999 veya daha fazla ayni olan bir nükleotid asit dizisi içerir.

Bir düzenlemede SEQ ID No. 27de gösterilen 669 hp uzunlugunda polinükleotid, yaklasik 25.54 kD olan hesaplanmis bir moleküler kütle ile, SEQ ID No. 3°te oldugu gibi, 222 amino asit polipeptidi kodlayan bir açik okuma çerçevesi sergileyen WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) proteini kodlayan tam uzunlukta cDNA klonudur. SEQ ID No. 3,ün SMART analizi yoluyla dizideki homeobox domenin varligi ortaya çikar. Bu, bitkinin önemli gelisimsel prosesinin transkripsiyonel regülasyonuna dahil edilen bir DNA baglanma faktörüdür. Bu, bitkinin vasküler hücre proliferasyonuna dahil edilen WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) proteinidir.

Bir düzenlemede SEQ ID No. 5”te gösterilen 672 bp uzunlugunda polinükleotid, yaklasik 25.67 kD olan hesaplanmis bir moleküler kütle ile, SEQ ID No. 6”da oldugu gibi, 223 amino asit polipeptidi kodlayan bir açik okuma çerçevesi sergileyen WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) proteini kodlayan tam uzunlukta cDNA klonudur. SEQ lD No. 69nin SMART analizi yoluyla dizideki hoineobox domenin varligi ortaya çikar. Bu, bitkinin önemli gelisimsel prosesinin transkripsiyonel regülasyonuna dahil edilen bir DNA baglanma faktörüdür. Bu, bitkinin vasküler hücre proliferasyonuna dahil edilen WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) proteinidir.

Mevcut bulusa ait tercih edilen düzenlemeye göre SEQ ID NO 2”de gösterilen izole polinükleotid, C. olitorius bitkisinden izole edilen toplam RNA kullanilarak genin korunan bölgesinin PCR amplifikasyonu ile elde edilebilir ve SEQ ID NO , C. capsulari's bitkisinden izole edilen toplam RNA kullanilarak genin korunan bölgesinin PCR amplitîkasyonu ile elde edilebilir. Önceki açiklamada belirtildigi üzere uygulanan C. olitorius bitkisi 0-4 çesididir ve uygulanan C. capsularis CVL-l Çesididir.

Mevcut bulusun bir diger düzenlemesinde SEQ ID NO 2 ve/veya SEQ lD NO 5”te belirtilen nükleotid dizisine sahip bir polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapisi açiklanir, burada polinükleotid bir konakçi hücrede ifade edilebilir niteliktedir ve C. olitorius ve C. capsularis bitkilerinde WUSCHEL-iliskili home0b0x4 (WOX4) proteininin homologunu üretmek üzere transle edilebilir niteliktedir. C. olitori'us ve C. capsulari's bitkilerinden WUSCHEL-iliskili homeobox4`ün (WOX4) çogaltilmasi, klonlanmasi ve dizilenmesine yönelik prosedür ayrica Örnek 2'de detayli olarak açiklanir. Tercihen rekombinant gen yapisi ayrica polinükleotid sablonunun ifadesini arttirmak üzere islevsel olarak bagli bir promotör bölgesi içerir. Spesifik promotörün transkripsiyonel kontrolü altinda kodlama bölgesinin SEQ ID NO 2 ve/Veya SEQ 1D NO 5,e ait polinükleotidi içeren rekombinant gen yapilari içerisinde ifadesi, WUSCHEL- iliskili home0b0x4 (WOX4) proteininin daha yüksek veriinine yol açarak arttirilabilir.

Bulusa ait bir düzenlemeye göre modüle edilmis ifade, yüksek ifade veya aktivite, örnegin nükleik asit molekülünü kodlayan bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptidin örnegin SEQ ID NO 2 ve SEQ ID NO 5°i kodlayan nükleik asit molekülünün asiri ifadesidir. Nükleik asitler veya genler veya gen ürünlerinin ifadesinin artirilmasina yönelik yöntemler teknikte iyi sekilde belgelendirilir ve örnekler, tanimlar bölümünde saglanir.

Bulus ayrica burada tanimlandigi üzere bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayan herhangi bir nükleik asidin bir bitkide yerlestirilmesi ve ifadesini içeren, kontrol bitkilerine göre tüksek lif` verimine sahip transgenik bitkilerin üretimine yönelik bir yöntem saglar.

Daha spesifik olarak mevcut bulus, bos kontrol bitkileri ile karsilastirildiginda arttirilmis lif verimine sahip transgenik bitkilerin üretimine yönelik bir yöntem saglar, bu yöntem asagidakileri içerir: (i) bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayan nükleik asidin veya bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayan nükleik asidi içeren ve/veya bundan olusan genetik bir yapinin bir bitki veya bitki hücresine yerlestirilmesi veya ifade edilmesi; ve (ii) bitki hücresinin lif hücre büyümesi ve gelisimini destekleyen kosullar altinda yetistirilmesi.

Bulusun bir diger açisi, bir WUSCHEL-iliskili home0b0x4 polipeptidi kodlayan ve C. olitori'us bitkisinden türetilen izole polinükleotidi ile ilgilidir, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleik asit molekülünü içerir: a) SEQ lD NO 2°de belirtilen bir nükleotid dizisi veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve b) SEQ lD NO: 27de belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisi veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü.

Belirli düzenlemelerde C. olitorz'us bitkisi O-4 çesididir.

Bulusun bir diger açisi, bir WUSCHEL-iliskili homeob0x4 polipeptidi kodlayan ve C. capsularis bitkisinden türetilen bir izole polinükleotid ile ilgilidir, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleik asit molekülünü içerir: a) SEQ lD NO: 5 ”te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve b) SEQ ID NO: 5”te belirtilen nükleotid dizisini ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisi veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü.

Belirli düzenlemelerde C. capsularis bitkisi CVL-l çesididir.

Bulusun belirli bir açisi, SEQ ID: NO: 3,te belirtilen bir amino asit dizisini veya biyolojik olarak aktif parçasini içeren bir izole WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptit ile ilgilidir, söz konusu polipeptit, C. olitori'us bitkisinde floem lif bilesimini modifiye etmek üzere baslatma, olusturma, arttirma ve varyasyonun katalize edilmesinden olusan gruptan seçilen bir fonksiyonu içerir.

Belirli düzenlemelerde C. olitorius bitkisi, O-4 çesididir.

Belirli düzenlemelerde söz konusu polipeptit, SEQ lD NO: 3ate belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizi ayniligi içerir.

Bulusa ait bir diger açi, SEQ ID NO: 69da belirtilen bir amino asit dizisi veya biyolojik olarak aktif parçasini içeren bir izole WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptit ile ilgilidir, söz konusu polipeptit, C. capsulari's bitkisinde floem lif bilesimini modifiye etmek üzere baslatma, olusturma, arttirma ve varyasyonun katalize edilmesinden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla fonksiyonu içerir.

Belirli düzenlemelerde C. capsularis bitkisi CVL-l çesididir.

Belirli düzenlemelerde söz konusu polipeptit, SEQ ID NO: 6°da belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizi ayniligi içerir.

Bulusun bir diger açisi, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polinükleotid içeren bir rekombinant gen yapisi ile ilgilidir: a) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5'te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve b) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5'te belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü, burada polinükleotid C. oli'torius ve C. capsulari's bitkilerinde bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptit homologu üretmek üzere bir konakçi hücrede ifade edilebilir niteliktedir.

Belirli düzenlemelerde söz konusu yapi ayrica islevsel olarak asagidakilere bagli bir promotör bölgesi içerir a) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5°te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; veya b) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5,te belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü, burada söz konusu promotör nükleik asit molekülünün transkripsiyonunu veya ifadesini arttirir.

Bulusun bir diger açisi, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polinükleotidi ifade edebilen bir rekombinant gen yapisini içeren bir transfonnant ile ilgilidir: a) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 57te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve b) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5,te belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü, burada söz konusu transformant bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptit homologu üretir.

Bulusa ait bir diger açi, kontrol bitkilerine göre yüksek veya artmis lif verimine sahip bir bitki veya transgenik bitki üretilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir, yöntem asagidakileri içerir: a) asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapisinin bir bitki hücresine yerlestirilmesi: i) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: Sate belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve ii) SEQ ID NO: 2 veya SEQ lD NO: Slte belirtilen nükleotid dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü, b) bitki büyümesini ve gelisimini destekleyen kosullar altinda bitki hücresinin yetistirilmesi; ve c) asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polipeptidin ifade edilmesi: i) SEQ ID: NO: 3 veya SEQ ID NO: 6”da belirtilen bir amino asit dizisi veya biyolojik olarak aktif bir parçasini içeren bir polipeptit ve ii) SEQ ID NO: 3 veya SEQ lD NO: 6,da belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir polipeptit.

Mevcut bulus araciligiyla saglanan diziler ayrica enzimlerin talep edilen proseslerde daha iyi performans göstermesini saglayan karakteristikler ile yeni enzimlerin rasyonel modifikasyonu veya tasarimina yönelik hazirlayici materyaller olarak kullanilabilir.

Bu bulusun, bir özellik derecesine sahip tercih edilen formda açiklanmasina ragmen tercih edilen formda mevcut tarifnamenin sadece örnek yoluyla yapildigi ve yapi detaylarindaki çesitli degisiklikler ve parçalarin kombinasyonu ve düzenlemelere bulus kapsamindan ve istemlerden ayrilmaksizin basvurulabildigi anlasilir. Örnekler Asagidaki örneklerin, bulusun burada açiklanan spesifik düzenlemeler ile sinirlandirilmasina yönelik herhangi bir istek olmaksizin bulusu daha fazla göstermesi tasarlanir. Örnek 1 Primerlerin tasarlanmasi ve sentezi Çalismada kullanilan primerler, dizilerin tam ORFiler ile manuel olarak seçilmesi ile veya benzer genlerin diger bitkilerden basarili sekilde izole edildigi veri tabanlari kullanilarak genomik C. oli'torius ve C. capsularis dizilerinden ön görülen “gen modelleri” ve manuel olarak düzenlenen transkriptomdan tasarlanmistir. Transkriptomdan elde edilen nükleotid dizilerinin karsilastirmali biyoinformatik analizi, iliskili genlerin homologunu tanimlamak üzere be düzgün gen tanimlamasi için NCBI BLAST, BLASTP, RPS-BLAST, BLASTX ve PSl- BLAST kullanilarak gerçeklestirilmistir. Nükleotid dizi hizalari, çoklu diziler “gen havuzundan” bulundugunda clustalW versiyon 1.82 yoluyla gerçeklestirilmistir. Hizalama daha sonra düzenlenmistir. Gen spesifik primerler (hem ileri hem de geri) manuel olarak veya Primer 3 plus aleti ile seçilmistir ve primerler istege göre sentezlenmistir.

Bu çalismada kullanilan tüm oligonükleotidler sentezleninistir ve HPLC tedarikçi tarafindan saflastirilmistir ve Integrated DNA Technologies'den (IDT) satin alinmistir. Yaklasik 100 pmol stok solüsyonu, otoklavmis ddHZO içerisinde hazirlanmistir ve kullanim için alikuotlar içerisinde yaklasik -20°C,de saklanmistir.

PCR için primerler olarak kullanilan Oligonükleotid Dizileri Primer SEQ Oligonükleotid dizisi cDNA,den ürün ismi ID NO çogaltilmistir COL F 1 CCATGGGAAACATGAAGGTGC COL R 1 TGAAACGTCCATCATCTGCCT 682 CCA F 4 CCATGGGAAACATGAAGGTGC CCA R 4 TTCATGATCTGCCTTCCGGG 675 Örnek 2 C. olitorius ve C. capsularis”den WUSCHEL-iliskili home0b0x49ün amplifikasyonu, klonlanmasi ve dizilenmesi Toplam RNA, Chomczynski P ve Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. (Anal Biochem 1987, 162: 156-159) tarafindan daha önce açiklandigi üzere MS ortaminda büyütülen üç günlük fidelerden izole edilmistir. RNA kalitesi veya entegresi, agaroz jel elektroforez ile kontrol edilmistir ve standart prosedürlere göre Thermo Scientific Nano Drop 2000 kullanilarak miktari belirlenmistir. cDNA birinci ipligi, üretici talimatlarini takiben SuperScript III revers transkriptaz (Invitrogen) kullanilarak sentezlenmistir. Gen, gen spesifik primerleri kullanilarak PCR araciligiyla cDNATlan çogaltilmistir. PCR reaksiyonu (50 aL), 1 ML cDNA, her primer 20 pmol, 5 LLL 10X PCR Tamponu, 5 ”L 2.5 mM dNTP karisimi ve 1.0 birim of` PfuTaq DNA polimerazi içerir. PCR, asagidaki kosullar kullanilarak Thermal Cycler (Applied Biosystems) içerisinde gerçeklestirilmistir: yaklasik 30 saniye yaklasik olarak 95°C”de 35 denatürasyon döngüsünü takiben yaklasik olarak 95°C`de yaklasik 5 dakika ilk denatürasyon, yaklasik 30 saniye yaklasik olarak 59-61°C`de tavlama ve yaklasik 7 dakika yaklasik olarak 72°C`de nihai bir uzatma ile yaklasik 1 dakika yaklasik olarak 72°C3de uzatma. PCR ürünü, lX TAE tamponu kullanilarak %1 agaroz jel ile analiz edilmistir ve amplikon, üretici talimatlarini takiben QlAGEN jel ekstraksiyonu kullanilarak jelden ayristirilmistir. Saflastirilmis PCR ürünü, pCR®8/GW/TOPO® TA klonlama kitinde (Invitrogen) baglanmistir ve tainainlayici E. coli' hücrelerine (Invitrogen) transforme edilmistir. Plazmidler, üretici talimatlarini takiben QIAprip Spin Miniprep Kit (QlAGEN) kullanilarak varsayilan kolonilerden izole edilmistir. Ek parça varligi, gen spesifik primerler kullanilarak kontrol edilmistir ve pozitif plazmidler Dizileme islemine tabi tutulmustur. Örnek 3 Dizi analizi Nükleotid dizi ve amino asit dizisi, sirasiyla BLASTN ve BLASTP programlari ile analiz edilmistir. Diger dizilerden belirtilen diziler ClustalW ile hizalanmistir.

Filogenetik analiz, Komsu Birlestirme (NJ) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Örnek 4 Lif biyosentezinin yolak yapisi Lif biyosentezinde WUSCHEL-iliskili homeobox4,ün (WOX4) rolünü gösteren otomatik metabolik yolak rekonstrüksiyonu, Arbidopsis genomu ile karsilastirilan C. olitorus ve C. capsularz's proteinden ortologlarin tanimlanmasi ile yapilmistir.

C. olitorus ve C. capsulari's genomu içerisinde kodlanan WUSCHEL-iliskili homeobox4 (WOX4) katalize enzimatik reaksiyonlar, metabolik yolak veri tabanlarinin yani sira Pathway Studio için Resnet-Plant 3.0 veri tabaninda bulunabilen enzimatik reaksiyonlar kullanilarak yapilmistir.

Mevcut bulusa ait birkaç düzenleme burada açiklanirken ve gösterilirken teknikte uzman kisiler, fonksiyonlarin gerçeklestirilmesi ve/veya sonuçlarin ve/veya burada açiklanan avantajlarin bir veya daha fazlasinin elde edilmesine yönelik çesitli diger yollar ve/veya yapilari kolay bir sekilde göz önünde bulunduracaktir.

Bu nedenle önceki düzenlemelerin sadece örnek yoluyla gösterildigi ve bulusun ekli istemler araciligiyla tanimlandigi anlasilacaktir.

Mevcut bulusa ait birkaç düzenleme burada açiklanirken ve gösterilirken teknikte uzman kisiler, fonksiyonlarin gerçeklestirilmesi ve/veya sonuçlarin ve/veya burada açiklanan avantajlarin bir veya daha fazlasinin elde edilmesine yönelik çesitli diger yollar ve/veya yapilari kolay bir sekilde göz önünde bulunduracaktir ve bu tür varyasyonlar ve/veya modifikasyonlarin her birinin, mevcut bulus kapsami içerisinde oldugu düsünülür. Teknikte uzman kisiler, rutin deneyden daha fazlasini kullanmaksizin, burada açiklanan bulusa ait spesifik düzenlemelere birçok esdegeri bileceklerdir veya ögrenebileceklerdir. Bu nedenle daha önceki düzenlemelerin sadece örnek yoluyla gösterildigi ve ekli islemler ve esdegerleri kapsaminda oldugu anlasilacaktir, bulus spesifik olarak açiklanan ve talep edilenden baska sekilde uygulanabilir.

Claims (14)

ISTEMLER
1. C. olitori'us veya C. capsulari's bitkisinden türetilen bir WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptidini kodlayan izole bir polinükleotiddir, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleik asit molekülü içerir: a) SEQ ID NO 2 veya SEQ ID NO: 5”te belirtilen bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü; ve b) SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 5,te belirtilen nükleotid dizisine en az %95 dizi ayniligina sahip bir nükleotid dizisini veya bir tamamlayici parçasini içeren bir nükleik asit molekülü.
2. Istem lae göre kodlama yapan izole polinükleotiddir, burada C. olitorius bitkisi 0-4 çesididir.
3. Istem 1°e göre izole polinükleotiddir, burada C. capsulari's bitkisi CVL-l çesididir.
4. Bir izole WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptittir, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içerir: (a) SEQ ID: NO: 3 veya SEQ ID NO. 6lda belirtilen bir amino asit dizisi veya biyolojik olarak aktif parçasi; (b) SEQ ID NO: 3 veya 6,da belirtilen amino asit dizisi ile en az %95 dizi ayniligina sahip olan bir amino asit dizisi içeren bir amino asit dizisi; söz konusu polipeptit, C. ali'torius veya C. capularz's bitkisinde Iloem lif bilesimini modifiye etmek üzere baslatma, olusturma, arttirma ve varyasyonun katalize edilmesinden olusan gruptan seçilen bir fonksiyon
5. . Istem 4,e göre izole polipeptittir, burada C. oli'torius bitkisi 0-4 çesididir.
6. Istem 4,e göre izole polipeptittir, burada C. capsulari'sis bitkisi CVL-l çesididir.
7. . Istemler 1 ila 3iten herhangi birine göre izole polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapisidir, burada polinükleotid C. olitorz'us ve C. capsularz's bitkilerinin WUSCHEL-iliskili homeobox4 polipeptidinin bir homologunu üretmek üzere bir konakçi hücrede ifade edilebilir niteliktedir. lstem Tye göre rekombinant gen yapisidir, ayrica a) veya b)9de belirtilen bir nükleik asit molekülüne islevsel olarak bagli bir promotör bölgesi içerir, burada söz konusu promotör nükleik asit inolekülünün transkripsiyonunu veya ifadesini arttirir.
8. Bir polinükleotidi ifade edebilen istem 7°ye göre bir rekombinant gen yapisini içeren bir transformanttir, burada söz konusu transformant
9. WUSCHEL-iliskili homeob0x4 polipeptidin bir homologunu üretir.
10. Kontrol bitkilerine göre yüksek veya artmis lif verimine sahip bir bitki veya transgenik bitki üretilmesine yönelik bir yöntemdir, asagidakileri a) istem 77ye göre bir polinükleotid içeren bir rekombinant gen yapisinin bir bitki hücresine yerlestirilmesi; ve b) bitki büyümesini ve gelisimini destekleyen kosullar altinda bitki hücresinin yetistirilmesi; ve c) asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir polipeptidin ifade edilmesi: i) SEQ lD: NO: 3 veya SEQ lD NO: 6,da belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit veya biyolojik olarak aktif bir parçasi ve ii) SEQ ID NO: 3 veya SEQ lD NO: 6”da belirtilen amino asit dizileri ile en az %95 dizi ayniligina sahip bir polipeptit.
11. 11.Istem 1”e göre izole polinükleotiddir, burada söz konusu polinükleotid SEQ ID NO 2 veya SEQ ID NO: 5°te belirtilen nükleotid dizisi ile en az
12. 12. Istem 4,6 göre izole polipeptittir, burada söz konusu polipeptit, SEQ 1D: NO: 3 veya SEQ ID NO: 6,da belirtilen söz konusu amino asit dizisi ile en az %98 dizi ayniligina sahiptir.
13. 13. Istem 9`a göre bir transformanttan alinan bir tohumdur, burada söz konusu tohum, istemler 1-3 ve ll°den herhangi birine göre izole polinükleotid
14. 14. Bir jüt bitkisinde bitki büyümesi, bitki yüksekligi, lif ve tohum veriminin indüklenmesi, baslatilmasi, gelistirilmesi veya aittirilmasina yönelik bir yöntemdir, istem 8,e göre rekombinant gen yapisinin bir jüt bitkisine yerlestirilmesini içerir.