JPS6359679B2

JPS6359679B2 -

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Publication number: JPS6359679B2
Application number: JP56077789A
Authority: JP
Priority date: 1981-05-22
Filing date: 1981-05-22
Publication date: 1988-11-21
Also published as: EP0067000A2; EP0067000B1; DE3270733D1; EP0067000A3; JPS57193415A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はノムシタケ属（Cordyceps）に属する
ハナヤスリタケ（Cordyceps ophioglossoides
Fr.）を培養することにより抗腫瘍性物質を製造
する方法に関する。近年、担子菌類を培養することにより多糖類を
主要成分とする抗腫瘍性物質の製造法が数多く提
案されており、工業的に実施されているものもあ
る。本発明者は冬虫夏草と称せられる子のう菌類が
古くから強精薬として常用されていることに着目
し、冬虫夏草に属する子のう菌類について検討し
た結果、ノムシタケ属（Cordyceps）に属するハ
ナヤスリタケ（Cordyceps cphioglossoides
Fr.）を培養することにより抗腫瘍活性を有する、
多糖類を主要成分とする物質が生産されることの
知見を得て本発明をなすに至つた。以下本発明を詳述する。本発明は、ハナヤスリタケと称せられるコルダ
イセプス・オフイオグロソイデス（Cordyces
ophioglossoides Fr.）を寒天平板培地で培養し
て得られる菌糸体を液体培地中で培養し、培養物
から抗腫瘍活性を有する、多糖類を主要成分とす
る物質を採取することを特徴とする。本発明で利用するコルダイセプス・オフイオグ
ロソイデスは肉座菌目（Hypoc也eales）、肉座菌
科（Hypocreaceae）、ノムシタケ属
（Cordyceps）に属し、地中の虫体に寄生して生
ずる子のう菌であつて公知に属する。その形態上
の特性は今関六也、本郷次雄共著「原色日本菌類
図鑑」（保育社発行）の第129頁に記載されてい
る。コルダイセプス・オフイオグロソイデス（以下
ハナヤスリタケと称する）の菌株は財団法人発酵
研究所にIFO8992として登録、保管されている。本発明ではハナヤスリタケを先づ寒天平板培地
で培養して培地表面に生育したその菌糸体を得
る。この培養は通常20〜30℃、好ましくは25〜27
℃で10〜14日間行なう。ここで使用する寒天平板
培地は通常糸状菌、酵母の培養に用いられるポテ
ト・デキストスロース寒天培地に0.1〜0.3wt％の
酵母エキスを添加し、PHを４〜７に調整したもの
である。次に、本発明では上述のごとく培養して得られ
る白色乃至淡褐色の菌糸体を種母とし、これを液
体培地中で培養する。この液体培地中での培養に
当つては、培養初期（一般には３〜６日間）には
静置培養で行ない、次いで振とう培養又は通気撹
拌培養を４〜６日間程度行なうことが好ましい。
このような培養方式を採用するのは、種母として
の菌糸体を液体培養に接種し、静置培養を行なう
ことなく、直ちに振とう培養又は通気撹拌培養を
行なうときには菌糸体の増殖は旺盛となる反面目
的物質である多糖類を主要成分とする抗腫瘍活性
物質の生産が低減することに因る。液体培地中で
の培養温度は上記２段階の期間を通して20〜30
℃、好ましくは25〜27℃である。上記液体培養に用いる培地は一般に微生物の培
養に適用される公知の液体培地でよく、例えばグ
ルコースを糖源とし、ペプトン、酵母エキスを含
む培地であればよい。更に、この培地に無機塩
類、アミノ酸、ビタミンあるいは乳成分等を添加
したものも用い得る。又、液体培地のPHは４〜７の範囲が適当であ
り、滅菌前のPHが5.5である液体培地の使用が特
に好ましい。なお、液体培地中での培養は継代的に行なうこ
とが可能であるが、継代回数の増加に伴つて多糖
類の生産性が次第に低下するので液体培地のみに
よる菌の植えつぎは３〜５回以内にすべきである
が、多糖体の生産性の観点からすれば、寒天平板
培地上に生育させた菌糸体を種母として新たに液
体培養することが有利である。しかし、培養規模が大きくなると（例えば10
以上の液体培養を行う場合）上記菌糸体を種母と
して用いることは操作上困難となるので前培養と
しての静置培養物を種母として用いてもよい。本発明で利用するハナヤスリタケの菌糸体を上
述のようにして液体培養すると高粘性物質を生産
して培養物自体が高粘性を示すようになる。この
高粘性培養物から目的とする抗腫瘍活性を有す
る、多糖類を主要成分とする物質を採取するに
は、抽出手法を適用し得るが、培養物そのままで
は粘性が高い故に抽出効率がよくないので、培養
物を２〜３培の蒸留水で希釈し、80〜90℃で30分
間加熱処理し、ミキサーでよく撹拌混合し、この
混合物に遠心分離、ろ過等の手法を施して水溶液
画分を得る。また、上記分別により得られる残渣
（菌糸体）を蒸留水で２〜３回洗浄し、再び加水
後、例えばワーリングブレンダーで菌糸体を破砕
し、遠心分離して得られる水溶液画分を用いるこ
ともでき、更に該画分を上記水溶液画分と更には
菌糸体の懸濁液をそのままの状態で用いることも
できる。次いで、これらの水溶液画分中の遊離蛋白、遊
離核酸、環元糖などの爽雑物を除去するために、
該画分を活性炭、弱塩基性イオン交換樹脂又はク
ロマトグラフイーで処理する。これらの処理によ
り上記画分の脱色、低分子物質の除去も行われ
る。さらに、硫安による塩析、低級アルコールや
アセトンを用いる沈殿法、分子篩、限外過等の
処理を単独或は組合わせて適用してもよく、その
地培養物からの多糖類の抽出に用いられるセバグ
法や酵素法なども適用し得る。上述のごとくして培養物から採取した多糖類を
主要成分とする物質は蒸留水に対する透析を行な
い、必要に応じて濃縮した後、凍結乾燥して製品
とする。次に、このようにして得られた多糖類を主要成
分とする物質の物性について説明する。外観…白色を呈し、加熱すると分解して炭化す
る。融点…本物質は明確な融点を示さない。赤外吸収スペクトル…KBr錠剤法により測定し
た結果添付図に示すとおりである。溶解性…水及びジメチルスルホキサイドに可溶性
であるが、一般有機溶剤並びに有機酸には不
溶。なお、本物質の水溶液は半透膜を通過せず、
２〜10％水溶液のPHは6.2〜6.4であり、0.1％水
溶液の紫外部吸収は認められない。呈色反応…モーリツシユ反応、アンスロン反応及
びニンヒドリン反応は陽性であり、エルソンモ
ルガン反応、バハアル反応及びヨードデンプン
反応は陰性である。本物質は種々の条件下で薄層クロマトグラフイ
ーを行なつても原点は移動しない。本物質を２〜
4N硫酸で加水分解し、中和後トリメチルシリル
化を行つたものについてガスクロマトグラフイー
で分析した結果、グルコースと少量のマンノース
及びガラクトースを検出した。また、本物質を
4N塩酸で14時間加水分解した試料についてアミ
ノ酸自動分析計で分析した結果ガラクトサミンと
少量のグルコサミンを検出した。更に、本物質を水で50mg／50mlの懸濁液とな
し、超音波のような処理を施して十分に可溶化さ
せた後遠心分離して得られる上清について分析し
た結果中性糖並びにアミノ糖の各重合体と蛋白と
から成つていた。なお、これらの含量比率は本物
質を得るための培養条件や培養物の抽出条件によ
り異なるが、一般には下記のとおりである。中性糖 65〜80重量％（フエノール硫酸法による
全ヘキソースとして）アミノ糖 10〜20重量％（インドール塩酸法によ
るヘキソサミンとして）蛋白５〜15重量％（ローリーフオーリン法によ
る蛋白として）次に、本物質の薬理学的特性について説明す
る。 (1) 急性毒性マウスはICR−JCL系、４〜５週令、体重20
〜25ｇのものを、ラツトはウイスター系、４〜
５週令、体重110〜140ｇのものをそれぞれ用い
て、各試験群25匹に対し本物質を経口並びに腹
腔内投与してその急性毒性試験を下記により行
なつた。本物質を投与後、１週間にわたつて各試験動
物の一般症状、体重変化及び死亡例につき観察
した後屠殺剖検した。結果は下記表のとおりで
あつてLD₅₀値が極めて高いことがわかる。【表】 (2) 抗腫瘍活性本物質の抗腫瘍活性の検定はSarcoma180固
型腫瘍を皮下接種したマウス、及びEhrlish腫
瘍細胞を腹腔内に移植したマウスにおけるin
vivo試験法で行なつた。 (イ) Sarcoma180固型腫瘍に対する抗腫瘍活
性：試験動物はICR−JCL、６週令雌マウス
（体重25ｇ±３ｇ）を採用し、Sarcoma180
腫瘍細胞はマウスの腹腔内に腹水型で１週間
毎に継代しているものを用いた。試験に当つ
ては接種後一週間目の腹水中の細胞を取り出
し、約400万個を含有する生理食塩水0.1mlを
試験マウスの右脇腹下部皮下に移植した。移
植して24時間後に本物質を生理食塩水に50
mg／10mlの濃度になるように溶解し、120℃
15分間滅菌した溶液を0.25mlマウスの腹腔内
に投与し、以後10日間連続して投与を行なつ
た。対照マウスには滅菌生理食塩水を0.25ml同
様に投与した。腫瘍移植後30日経過してマウスを解剖し、
増殖した固型腫瘍を摘出してその重量を測定
することで対照群との比較を行なつた。尚マ
ウスは10匹を１群とした。その結果、本物質は腫瘍抑制率83.5％の強
い抗腫瘍活性を示し治療群10匹中５匹の腫瘍
は完全に消失していた。ここにおいてSarcoma180固型腫瘍に対す
る腫瘍抑制率は次式を用いて算出した値であ
る。腫瘍抑制率＝Cs−Ts／Cs×100 Cs：対照群の平均腫瘍重量 Ts：試験群の平均腫瘍重量本物質のSarcoma180固型腫瘍に対する有
効な投与量は１日当り５〜15mg／Kg（体重）
であつて、常法により製剤化して適用し得
る。 (ロ) Ehrlish腹水腫瘍に対する抗腫瘍活性：試験動物はICR−JCL、８週令雌マウス
（体重25ｇ±３ｇ）を採用し、このマウス11
匹を１群とする４群の各々に１×10⁶個の
Ehrlish腫瘍細胞を移植し、24時間後対照群
以外の各３群に本物質を25mg／Kg（体重）／
日、10mg／Kg（体重）／日並びに2.5mg／Kg
（体重）／日宛それぞれ10日間腹腔内与して
各群の延命効果及び治療効果を観察した。な
お、対照群には生理的食塩水のみを投与し
た。結果は下記のとおりであつた。【表】なお、本発明により得られる物質は
Sarcoma180腹水腫瘍に対しても上記と同様な
抗腫瘍活性を示した。以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。実施例１培地組成：ポリペプトン 10ｇ酵母エキス 0.5ｇグルコース 30ｇ水１ PH＝5.5 の比率から成る液体培地を200mlずつ500ml容の三
角フラスコ50本に分注し、綿栓を附した後に120
℃で15分間滅菌し、別に0.3％酵母エキスを添加
したポテトデキストロース寒天培地で斜面培養し
ておいたCordyceps ophioglossoides IFO
8992を上記液体培地に接種し、23〜27℃で５日間
静置培養を行なつた。ひきつづいてこれを23〜27
℃で６日間、180rpmにて回転式の振とう培養を
行い、高粘性の培養物10を得た。これに10の
熱水を加えて、ミキサーで撹拌混合した後10000
ｇにて20分間遠心分離を行い菌糸体を除去し、粘
稠な透明液を得た。この液の中に予め濃塩酸処理
後充分水洗し次いでエタノール、アセトンで洗つ
て乾燥した活性炭−セライト（１：１）混合物を
重量比で４％加え、室温で16時間撹拌した。過により活性炭−セライト混合物を除去して
得られた液を蒸留水に対して５℃で48時間透析し
た後、凍結乾燥したところ灰白色の粉末25.0ｇを
得た。このようにして得られた物質はグルコース
から成る多糖体を主要成分とする物質でその抗腫
瘍効果を検定した結果、ICR−JCL、６週令マウ
スにおける腹腔内投与量10mg／Kgでの
Sarcoma180固型腫瘍に対する抑制率は83.5％で
あつた。実施例２培地組成：ポリペプトン５ｇ酵母エキス３ｇリン酸１カリウム 0.5ｇリン酸２カリウム 0.5ｇ塩化マグネシウム 0.3ｇ塩化マンガン 0.05ｇ水１ PH＝5.5 の比率から成る液体培地を100mlずつ500ml容三角
フラスコに分注し、綿栓を附した後に120℃で15
分間滅菌したものに、別に寒天斜面剖地で培養し
ておいた、Cordyceps ophioglossoides IFO
8992を常法により接種し、25℃で６日間静置培養
した。一方、20容ジヤーフアーメンターに前記
の組成の液体培地10を入れ、120℃で30分間滅
菌、冷却し、これに上記の培養物を移植して、25
℃にて２日間静置培養の後、つづいて通気量
0.4vvm、撹拌数250rpmの条件下で７日間通気撹
拌培養を行なつた。得られた培養物を２倍に稀釈し、80℃で30分間
加熱後、布を用いて菌糸体を分別除去した。こ
のようにして得た透明な粘稠液に容量比で10％の
アンバーライトXAD−２を加え、室温で２時間
混合撹拌した。上記アンバーライト樹脂を分別
後、上清液を凍結乾燥したところ灰白色の粉末
25.5ｇを得た。この粉末はグルコースから成る多
糖体を主要成分とする物質でその抗腫瘍活性を検
定した結果、ICR−JCL、６週令マウスにおける
腹腔内投与量10mg／KgによりSarcoma180固型腫
瘍に対する抑制率は83.5％であつた。

【図面の簡単な説明】

添附図は本発明により得られる抗腫瘍活性物質
のKBr錠剤法により測定した赤外吸収スペクト
ルを例示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１コルダイセプス・オフイオグロソイデス
（Cordyceps ophioglossoides Fr.）を寒天平板培
地で培養して得られる菌糸体を液体培地中で培養
し、培養物から抗腫瘍活性を有する、多糖類を主
要成分とする物質を採取することを特徴とする下
記に示す特性を有する抗腫瘍性物質の製造法；白色を呈し、加熱すると分解して炭化し、水及びジメチルスルホキサイドに可溶性であ
るが、一般有機溶剤並びに有機酸には不溶であ
り、且つ、水溶液は半透膜を通過せず、２〜10
％水溶液のPHは6.2〜6.4であり、0.1％水溶液の
紫外部吸収は認められない、呈色反応としてのモーリツシユ反応、アンス
ロン反応及びニンヒドリン反応は陽性であり、
エルソンモルガン反応、バハアル反応及びヨー
ドデンプン反応は陰性であり、及び中性糖約65〜80重量％（フエノール硫酸法に
よる全ヘキソースとして）、アミノ糖約10〜20
重量％（インドール塩酸法によるヘキソサミン
として）及び蛋白約５〜15重量％（ローリーフ
アーリン法による蛋白として）を主要な構成成
分として含有する。２液体培地中での培養は、25〜27℃で３〜５日
間静置培養し、次いで25〜27℃で４〜６日間振と
う培養又は通気撹拌培養することにより行う特許
請求の範囲第１項記載の製造法。