CN102229595B

CN102229595B - 大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物及用途

Info

Publication number: CN102229595B
Application number: CN 201110111071
Authority: CN
Inventors: 李永泉; 孙一晟; 许勤勤; 吴斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-04-30
Filing date: 2011-04-30
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-04-30
Also published as: CN102229595A

Abstract

本发明提供从大团囊虫草菌人工液体深层发酵菌丝中提取的四个倍半萜类化合物：大团囊虫草菌素A-D。本发明提供的大团囊虫草菌素C跟大团囊虫草菌素D具有选择性杀伤肿瘤细胞能力，大团囊虫草菌素C具有抗人乳腺癌细胞MCF-7，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性;大团囊虫草菌素D具有抗肺癌细胞A549，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性，大团囊虫草菌素C和D对于正常人肝细胞LO₂则几乎没有毒副作用，因此可在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明提供的四种倍半萜类化合物的结构式如下所示。

Description

大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物及用途

技术领域

本发明属化合物领域，主要涉及大团囊虫草菌中的四个倍半萜类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

大团囊虫草菌（Cordyceps Ophioglossoides）是一种寄生在大团囊菌子实体上的名贵药用真菌，属麦角菌科、虫草属，我国主要分布在江苏、广西、云南、四川等地。医书记载大团囊虫草性温，味微涩,全菌入药，能提高人体免疫力。20世纪80年代，日本学者Ohmori,T等从中分离出蛋白多糖能强烈抑制小白鼠肉瘤S180的生长，并明显延长瘤细胞接种小鼠的生存期；体外实验也有明显的抑瘤作用，并具剂量相关性。

为了解决其野生资源问题，我们从云南西双版纳的丛林中采集到大团囊虫草菌子实体中分离到大团囊虫草菌，其ITS序列已提交Genebank，完成了系统分类学鉴定。菌种保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCCNo.1146，获授权国家发明专利（专利号：ZL200410025774.6）。根据其天然生态特性构建了纯液体深层发酵工艺，通过单因素实验、分因子实验和中心组合实验进行了培养基优化，完成了15L发酵罐到100L发酵罐的中试试验，菌丝产量约达16g/L，并在新昌制药且已经完成3-20吨的放大发酵，菌丝产量10g/L左右。发酵工艺已授权国家发明专利（ZL200510050196.6）。

发明内容

本发明的目的是提供大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物，主要是从大团囊虫草菌人工液体深层发酵菌丝中提取的真菌源的的四个新的倍半萜类化合物，提取用的大团囊虫草菌已在中国专利局指定的保藏单位——中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1146。

本发明提供的倍半萜类化合物为：大团囊虫草菌素A-D，结构式分别为：

本发明另一个目的是提供所述大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的倍半萜类化合物为大团囊虫草菌素C和大团囊虫草菌素D。

本发明从大团囊虫草菌人工发酵菌丝中分离得到的四个新化合物，并发现了大团囊虫草菌素C的抗人乳腺癌细胞MCF-7，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性;大团囊虫草菌素D则具有抗肺癌细胞A549，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性，大团囊虫草菌素C跟D对于正常人肝细胞LO₂则几乎没有毒副作用;具有选择性杀伤肿瘤细胞能力的大团囊虫草菌素C跟大团囊虫草菌素D可以作为抗癌新药的开发。

附图说明

图1是大团囊虫草菌素A、C、D的NOE波谱。

图2是大团囊虫草菌素A、C、D的¹H¹H COSY和HMBC。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一

四种化合物的结构、性质及波谱数据参见表1-4：

表1.大团囊虫草菌素A的NMR数据（CDCl₃）

^a，测试为125MHz.^b从DEPT谱跟HMQC谱中得到.^c测试为500MHz.

表2.大团囊虫草菌素B的NMR数据（CDCl₃）

^d测试为100MHz.^e测试为400MHz。

表3.大团囊虫草菌素C的NMR数据（CDCl₃）

表4大团囊虫草菌素D的NMR数据（CDCl₃）

结构式：

(一)、大团囊虫草菌素A，又叫11-羟基-6，12-环氧-1βH-4αH-6αH-阿拉斯加菖蒲烷-7烯，属于螺[4.5]癸烷骨架的倍半萜类化合物，其理化性质、波谱数据、结构如下：

1、无色针状晶体，易溶于甲醇、丙酮、氯仿。

2、熔点（mp）98-100℃;[α]²⁴ _D-129.1(c 0.08,CH₃OH);紫外光谱（UV）(MeOH)λ_max(logε)204(4.11)nm;红外光谱（IR）ν_max 3428,2955,2932,1463,1377,1193,1072,988,806cm^-1;¹H NMR与¹³C NMR见表1;质谱（ESIMS）m/z 236[M+H]⁺;高分辨质谱（HR-FTICRMS）m/z 237.1838[M+H]⁺(calcd for C₁₅H₂₅O₂,237.1849)。

3、参见图1和图2中大团囊虫草菌素A的NOE波谱（NOESY），¹H-¹H化学位移相关（¹H¹HCOSY）跟多键碳氢相关（HMBC）分析，证实其空间相对构型与α-菖蒲烯醇一样。化合物大团囊虫草菌素A结构为：

该化合物具有选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7，人宫颈癌细胞Hela及人肝癌细胞HepG2的活性，而对于正常人肝细胞LO₂则几乎没有什么毒副作用，可以作为抗癌新药的开发。

图1中，A是大团囊虫草菌素A的NOE波谱，C是大团囊虫草菌素C的NOE波谱，D是大团囊虫草菌素D的NOE波谱。

图2中，A是大团囊虫草菌素A的¹H¹H COSY和HMBC，C是大团囊虫草菌素C的¹H¹H COSY和HMBC，D是大团囊虫草菌素D的¹H¹H COSY和HMBC， ¹H¹HCOSY，→HMBCfrom HtoC。

（二）、大团囊虫草菌素B，又叫11,12-二羟基-1βH-4αH-阿拉斯加菖蒲烷-7烯，属于螺[4.5]癸烷骨架的倍半萜类化合物，其理化性质、波谱数据、结构如下：

1、无色针状晶体，易溶于甲醇、丙酮、氯仿。

2、mp 48-50℃;[α]²⁴ _D–48.6(c 0.25,CHCl₃)；UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.07)nm;IRν_max3407,3014,2956,2923,2877,2836,1657,1460,1439,1377,1161,1142,1053,1042,967,892,802,593cm^-1;¹H NMR和¹³C NMR数据见表1;ESIMS m/z 261[M+Na]⁺;HR-FTICRMS m/z261.1824[M+Na]⁺(calcd.for C₁₅H₂₆O₂Na,261.1830).

3、由于大团囊虫草菌素B跟大团囊虫草菌素A具有相同的生物来源，认为它们具有相同的空间相对构型，其结构为：

（三）、大团囊虫草菌素C，又叫8β-过氧氢-11，12-二羟基-1βH-4αH-阿拉斯加菖蒲烷-9烯，属于螺[4.5]癸烷骨架的倍半萜类化合物，其理化性质、波谱数据、结构如下：

1、无色油状，易溶于甲醇、丙酮、氯仿。

2、[α]²⁴ _D–38.6(c 0.28,CHCl₃);UV(MeOH)λ_max(log ε)204(3.98)nm;IR ν_max 3433,2956,2925,2870,1711,1645,1463,1377,1273,1037,933,795,548cm^-1;¹H NMR和¹³C NMR数据见表1;ESIMS m/z 293[M+Na]⁺;HR-FTICRMS m/z 293.1737[M+Na]⁺(calcd.for C₁₅H₂₆O₄Na,293.1728)。

3、通过附图1、2中大团囊虫草菌素C的NOESY、HMBC相关及其相同生源分析,化合物大团囊虫草菌素C结构为：

（四）大团囊虫草菌素D，又叫3-（2-甲基-3-（3-甲基丁-2-烯）环氧乙烷-2-基）-4-亚甲基环己醇，属于fumagillane型倍半萜化合物，其理化性质、波谱数据、结构如下：

1、无色油状，易溶于甲醇、丙酮、氯仿。

2、[α]²⁴ _D-67.3(c 0.08，CH₃OH)；UV(MeOH)λ_max(logε)208(4.01)nm；IR v_max3423，2932，2857，1644，1442，1383，1328，1261，1225，1169，1077，1030，998，895，837，743cm^-1；¹H NMR和¹³CNMR数据见表2；EIMS m/z 236M⁺；TOF-EIMS m/z 236.1778M⁺(calcd.for C₁₅H₂₄O₂，236.1776)。

3、通过附图1、2中大团囊虫草菌素D的NOESY、¹H-¹H COSY、HMBC分析,得出化合物大团囊虫草菌素D结构为：

该化合物具有选择性杀伤人肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞Hela及人肝癌细胞HepG2的活性，而对于正常人肝细胞LO₂则几乎没有什么毒副作用，可以作为抗癌新药的开发。实施例二化合物大团囊虫草菌素A-D的分离纯化

1、取干燥的人工发酵大团囊虫草菌丝体3.27kg，用100L,50%的工业乙醇室温浸泡提取4次，过滤，减压浓缩滤液得到总浸膏。

2、总浸膏用少量乙醇溶解，加适量水，用乙酸乙酯萃取得到浸膏64g。

3、乙酸乙酯浸膏经200-300目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体系（1:0-1:1）梯度洗脱，通过TLC检测并合并类似组分，得到a-f六个组分。经2%甲醇洗脱的组分b再用石油醚-丙酮体系（50:1-1:1）洗脱得b1-b5共五个组分。其中10%丙酮洗脱下的组分b2用凝胶SephadexLH-20氯仿：甲醇（1:1）得b2α-b2δ四个组分，b2α再过硅胶柱层析二氯甲烷：丙酮（20:1）洗脱，得到大团囊虫草菌素D（11.6mg）.b2γ上半制备HPLC(乙腈-水,60:40-85:15洗脱25min，3ml/min)得到大团囊虫草菌素A(12.2mg),大团囊虫草菌素B(2.3mg)组分c先过SephadexLH-20氯仿：甲醇（1:1）再过半制备HPLC(乙腈-水,40:60-60:40洗脱20min，3ml/min)得大团囊虫草菌素C(8.6mg)。

实施例三化合物大团囊虫草菌素C、D的抗肿瘤活性测试结果

大团囊虫草菌素C的抗人乳腺癌细胞MCF-7，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性;大团囊虫草菌素D则具有抗肺癌细胞A549，抗人宫颈癌细胞Hela及抗人肝癌细胞HepG2的活性，而这两个化合物对于正常人肝细胞LO₂则几乎没有什么毒副作用，结果见表5。

表5大团囊虫草菌素C跟D的抗肿瘤活性

阳性对照阿霉素IC₅₀(24H,48H)<2μg/ml。

Claims

1.大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物，其特征在于，所述化合物分别为大团囊虫草菌素C和大团囊虫草菌素D，结构式分别为：

所述的大团囊虫草菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1146。

2.根据权利要求1所述的大团囊虫草菌中的倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的倍半萜类化合物为大团囊虫草菌素C和大团囊虫草菌素D。