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Verfahren zur Herstellung eines sterilen, sedimentierten Myxovirus
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Influenza- und andern Myxovirus-Vakzinen und insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung des Virus aus einem Wachstumsmedium in praktisch reiner Form und in hoher Ausbeute.
Myxovirensind Influenza-, Parainfluenza-, Masern- und Mumpsviren. Sie verursachen beim Menschen schwere und leichte akute Erkrankungen. Zur Verringerung des Auftretens dieser Krankheiten stehen aus getöteten Viren hergestellte Vakzinen zur Verfügung, die jedoch den Nachteil haben, dass sie in hochreiner Form teuer herzustellen sind. Die Viren, die bei der Herstellung der Vakzine verwendet werden sollen, werden in lebenden Zellen, beispielsweise in den Allantois-Flüssigkeitszellen von Eiern, oder in Kulturmedien gezüchtet, die tierische Gewebezellen enthalten, und anschliessend müssen die Viren in der reinsten möglichen Form frei von Kulturzellen und deren Bestandteilen gewonnen werden.
Die bisherigen Vakzinen stehen nur in einem sehr unreinen Zustand zur Verfügung und die Verunreinigungen, beispielsweise Eiprotein, können bei Personen, die für diese Stoffe empfindlich sind, heftige Reaktionen verursachen.
Bereits bekannte Verfahren zur Gewinnung von relativ gereinigten Viren sind im wesentlichen chargenweise Verfahren, die mühsame und komplizierte manuelle Arbeiten umfassen. Ausserdem werden bei bisher bekannten Verfahren aus Mikroben bestehende Verunreinigungen nicht speziell entfernt. Bei einem bekannten Verfahren werden Adsorptions/Desorptions-Methoden verwendet und wenngleich dabei ein ziemlich reiner Virus in einer relativ hohen Ausbeute erzeugt wird, so ist das Verfahren doch zeitraubend und führt deshalb zu einem teuren Produkt. Eine Verminderung des Preises des gereinigten Virus ist erwünscht, da sich damit die Zahl der Personen erhöht, die die für die Gesundheit bedeutungsvolle Vakzine kaufen können.
Erfindungsgemäss wird ein Verfahren geschaffen, das im wesentlichen kontinuierliche Arbeitsschritte umfasst, die leicht in Fabrik-Fliesssystemen in grossem Massstab durchgeführt werden können. Erfindungsgemäss wird ein in hohem Mass gereinigter Virus in einer hohen Ausbeute und in einer relativ kurzen Zeit erhalten, wodurch eine billige Vakzine hergestellt werden kann.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird in herkömmlicher Weise eine Ultrazentrifuge, die beispielsweise oberhalb 50000 g arbeitet, verwendet. Jedoch werden erfindungsgemäss Filtrationsschritte unmittelbar vor der Ultrazentrifugen-Behandlung angewandt, um Verunreinigungen, die grösser sind als der Virus, hauptsächlich Mikroben-Verunreinigungen, zu entfernen. Diese Vorbehandlungen vor der Ultrazentrifugen-Sedimentation ermöglichen die direkte Herstellung von hochreinen, sterilen Vakzinen direkt aus den zentrifugierten Produkten ohne nachfolgende Behandlungen. Die anfänglich sedimentierten Vakzinen gemäss dem Stand der Technik sind wesentlich weniger rein und nicht steril.
Bisher wurde es für unmöglich gehalten, eine vorhergehende Filtration des den Virus enthaltenden Kulturmediums vor dem Zentrifugieren anzuwenden, weil angenommen wurde, dass die Filterkörper sofort verstopfen und den Durchtritt des Virus verhindern. Es wurde angenommen, dass bei der Verwendung von grossporigen Filterkörpern zur Vermeidung des Verlustes von Viren auf den Filterkörpern zu viele
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grobe Verunreinigungen durch den Filter hindurchtreten.
Die Erfindung umfasst die an sich bekannte Anwendung einer Ultrazentrifuge zum Sedimentieren des Virus aus einer den Virus enthaltenden Flüssigkeit, wobei erfindungsgemäss spezifische Filtrationsbedungen angewandt werden, die unmittelbar vor der Behandlung mit der Ultrazentrifuge angewandt werden.
Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass bei der aufeinanderfolgenden Anwendung von Filtern mit spezifischer Porengrösse und mit grosser Oberfläche und bei einer festgelegten Fliessgeschwindigkeit durch die Filter eine Flüssigkeit erzeugt wird, die nahezu den gesamten Virus enthält und von verunreinigenden Substanzen aus den Wachstumsmedien im wesentlichen frei ist. Dieses Endfiltrat kann direkt der Ultrazentrifuge zugeführt werden, um den Virus in konzentrierter Form zu erhalten. Dieser konzentrierte Virus ist bei der Herstellung einer Vakzine verwendbar, wobei er in herkömmlicher Weise in einer injizierbaren Flüssigkeit, beispielsweise physiologischem Phosphatpuffer, wieder suspendiert wird.
Die speziellen Details des erfindungsgemässen Filtrationsschrittes werden nachfolgend erläutert. Dabei wird darauf hingewiesen, dass vor dem Filtrationsverfahren am besten ein herkömmlicher Klärungsschritt durchgeführt wird, wenngleich dies nicht wesentlich ist. Diese vorhergehende Klärung soll relativ grosse Teilchen der Kulturmedien entfernen, beispielsweise Zellklumpen aus der Allantois-Flüssigkeit, worin der Virus gezüchtet worden ist. Für diesen Zweck ist eine Zentrifuge vom Scheibentyp mit mässiger Geschwindigkeit, die im Bereich von 15000 g arbeitet, geeignet (beispielsweise DeLaval Modell PX). Es können auch andere vorhergehende Grobklärungsmethoden verwendet werden, beispielsweise gewöhnliches Absitzenlassen und Dekantieren, und diese vorhergehende Klärung kann auch völlig weggelassen werden.
Wenn sie weggelassenwird, ist jedoch ein häufigerer Austausch des nachfolgenden anfänglichen Filterkörpers erforderlich.
Die erfindungsgemässen Filtrationsschritte sind speziell festgelegt, um aufeinanderfolgend kleinere und kleinere Mikrobenteilchen u. a. Verunreinigungsteilchen zu entfernen, so dass das Filtrat eine sterile Flüssigkeit ist, die nur die Virusteilchen enthält. Diese Filtration umfasst die folgende Schrittsequenz : a) Ein relativ grossporiges Vorfilter, beispielsweise Filterkörper auf Cellulosebasis, Diatomeenerde oder Glasgespinst (Millipres Spef. Apr.), b) einen Filterkörper mit vorzugsweise l, 21l, der jedoch auch im Bereich von 0, 8 bis 2, 0 u liegen kann, c) einen Filterkörper mit vorzugsweise 0, 45 lui, der jedoch auch im Bereich von 0, 22 bis 0, 6 Il liegen kann.
Es ist wichtig, dass die Körperfläche bei jedem Filtrationsschritt etwa 100 cm2 für jeweils 1 bis 1. 5 I Flüssigkeit beträgt und dass die Fliessgeschwindigkeit für jeweils 100 cm2 im Bereich von 1 bis 1, 5 1/10 min liegt. Wenn es sich zum Erreichen dieser Fliessgeschwindigkeit für notwendig erweist, dieses Filtrationsverfahren zu beschleunigen, so kann bei einer oder bei allen drei Filtrationsstufen Luftdruck angewandt werden. Bei einem erhöhten Flüssigkeitsvolumen oberhalb dieses Bereiches kann ein gewisses Verstopfen des Filters auftreten, was zur Folge hat, dass eine gewisse Menge an Virus am Passieren gehindert ist.
Es ist wichtig, dass die Filtrationsfläche, wie oben angegeben, relativ gross ist, da sonst dieser Schritt langsam abläuft, nicht bei jeder Stufe vollständige Filtration erreicht wird und auf den Filterkörpern Verlust an Virus stattfindet.
Das Endfiltrat aus diesen Stufen erweist sich als klar und steril und enthält nahezu das gesamte ursprüngliche Viruswachstum. Für die Sedimentation der Virusteilchen in diesem Filtrat wird die Hochgeschwindigkeitszentrifuge verwendet, was in dem Bereich von 50000 bis 80000 g geschehen kann. Ein Beispiel eines solchen Gerätes ist Sharples Modell T-1P Presurtite. Auf diese Weise wird der Virus zu einer dicken Aufschlämmung konzentriert, wobei diese Arbeitsweise als kontinuierliche Arbeitsweise durchgeführt werden soll. Für die kommerzielle Herstellung wird vorzugsweise eine Ultrazentrifuge vom Zonentyp verwendet, beispielsweise die Zonenzentrifuge Spinco Md L-4 oder die Zonenzentrifuge Oak Ridge K 11.
Dieser fertige konzentrierte Virus aus der Zentrifuge kann sofort zur Herstellung einer Vakzine verwendetwerden, indem er zu einer geeigneten Verdünnung einer injizierbaren Flüssigkeit zugesetzt wird, oder die Aufschlämmung kann in steriler Form, gewünschtenfalls nach Lyophilisation, zur anschliessenden erneuten Suspendierung aufbewahrt werden.
Der Virus kann in jeder Stufe des Verfahrens getötet werden. Dies kann vor der anfänglichen Klärung, wenn diese angewandt wird, während einer der Filtrationsstufen oder nach der Behandlung mit der Ultrazentrifuge sein. Es können bekannte Inaktivierungsmittel, wie Formalin, verwendet werden, wobei Menge und Konzentration feststehenden Standardwerten entsprechen.
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Die Erfindung wird in den Beispielen unter spezieller Bezugnahme auf Influenzavirus beschrieben, der in Allantois-Flüssigkeit gezüchtet und anschliessend getötet worden ist. Die Erfindung kann jedoch auch mit andern Viren durchgeführt werden, die in einem andern Kulturmedium gezüchtet werden, beispielsweise in einem Kulturmedium, das Gewebezellen enthält, und der Virus kann abgetötet oder nicht abgetötet werden.
Die nachfolgenden repräsentativen Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: 450 befruchtete Hühnereier werden mit dem Influenzastamm A2 (JAP 170) infiziert und 40 h lang bei 370C gehalten. Die Allantois-Flüssigkeit, die den gezüchteten Virus enthält, wird von den Eiern durch Absaugen entfernt und in einem Behälter mit etwa 4500 ml gesammelt. Die Flüssigkeit wird dann zur Inaktivierung des Virus bei 35 C 24h lang mit Paraformaldehyd bei 1/400 Volumverhältnis behandelt.
Der gesamte Behälterinhalt wird mit 300 ml/min durch einen DeLaval Gyro Tester oder eine ähnliche Zentrifuge laufen gelassen, die mit 12000 Umdr/min (etwa 15000 g) arbeitet, und die geklärte Flüssigkeit wird gesammelt.
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(20 psi) angewandt und die Gesamtfiltrationszeit beträgt 8 min. Die Vakzine-Gewinnung an diesem Punkt beträgt 86% auf der Basis von normalen CCA-Versuchen.
Die abschliessende Konzentrierung der Vakzine wird durch Sedimentation in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge erreicht, die bei 50 000 Umdr/min mit einem Flüssigkeitsstrom von etwa 1, 0 l/h arbeitet. Der sedimentierte Virus wird zur Herstellung der Vakzine verwendet.
Bei s pie I 2 : 3500 befruchtete Hühnereier werden mit einem Stamm B von Influenza (B/Masse)
EMI3.2
Der gesamte Behälterinhalt wird mit 300 ml/min durch eine Zentrifuge, beispielsweise einen DeLaval Gyro Tester, laufen gelassen, die mit 12000 Umdr/min arbeitet. Es wird Luftdruck angewandt. um die Flüssigkeit durch die Zentrifuge zu treiben, wobei die Geschwindigkeit mit einem Strömungsmesser gemessen wird, um die Geschwindigkeit etwa beizubehalten. Die geklärte Flüssigkeit wird in einem Druckbehälter gesammelt.
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Basis eines normalen CCA-Versuches.
Die abschliessendeKonzentrierung der Vakzine wird in einer Sharples Hi-Speed-Zentrifuge erreicht, die bei 50 000 Umdr/min mit einem Flüssigkeitsstrom von 1, 5 l/h arbeitet. Der sedimentierte Virus wird zur Herstellung der Vakzine verwendet.
Beispiel 3 : Die Arbeitsweise von jedem der obigen Beispiele wird mit der Abänderung durch-
EMI3.4
Filterkörper kann öfter ersetzt werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines sterilen, durch Zentrifugieren sedimentierten Myxovirus aus einem flüssigen Wachstumsmedium, worin der Virus vermehrt worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass man
A) das Wachstumsmedium nacheinander durch Filterkörper mit der festgelegten Porosität von
1. einem relativ grossporigen Vorfilter,
2. Poren mit 0,8 bis 2, 0 bol und
3. Poren mit 0, 22 bis 0, 6 P. leitet und anschliessend
B) das Filtrat in einem Bereich von 50 000 bis 89 000 g zentrifugiert.