DE2803240A1

DE2803240A1 - Tollwut-impfstoff

Info

Publication number: DE2803240A1
Application number: DE19782803240
Authority: DE
Inventors: Gosse Bijlenga
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1977-01-26
Filing date: 1978-01-25
Publication date: 1978-08-10
Also published as: ES466359A1; NO780156L; NL7800708A; NL174371C; DK36378A; AT368005B; IT7867143A0; SE444453B; SE7800781L; SE8201768L; ES469937A1; JPS5877822A; CH659084A5; IE46498B1; JPS637754B2; IE780161L; IT1192756B; FI59812B; FI780184A; DE2803240B2

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Tollwut-Impfstoff, der in Zellkulturen hergestellt und inaktiviert oder vermehrungsfähig verwendet wird, ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes sowie den entsprechenden Tollwut-Virusstamm und

20 ein Verfahren zur Isolierung dieses Virusstammes.

Im Einzelnen "bezieht sich die Erfindung auf einen vermehrungsfähigen oder inaktivierten Tollwut-Impfstoff, der postinfektionell oder prophylaktisch an Haustiere, wildlebende Tiere und den Menschen über verschiedene Routen verabreichbar ist. Der vermehrungsfähige Impfstoff eignet sich besonders gut für die orale Verabreichung. Eine orale Verabreichung (nachstehend als orale Impfung bezeichnet) ist besonders bei der Immunisierung von wildlebenden Tieren, wie z.B. Füchsen, erwünscht. Einen weiteren Teil dieser Erfindung bilden die orale und andere, nicht-parenterale Applikationsformen, wie z.B. die intestinale oder intranasale Verabreichung z. B. durch Köder oder Spray, bei anderen, epidemiologisch wichtigen, wildlebenden Tieren, bei Haustieren und beim Menschen.

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Es ist bekannt, daß die Tollwutvirusinfektion in Warmblütern durch die prophylaktische parenterale Verabreichung von Impfstoffen, z.B. LEP Flury-Impfstoff oder HEP Flury-Impfstoff bekämpft werden kann. LEP bedeutet niedrige Eipassage,

•⁵ HEP hohe Eipassage. Die Gewinnung dieser Impfstoffe wird nachstehend beschrieben.

Am 29· Januar 1939 starb im Bundesstaat Georgia in den V.St.v.A. ein Mädchen mit dem Namen "Flury". Als Todesursache wurde Tollwut als Folge einer Infektion durch einen tollwütigen Hund, festgestellt. Tollwutvirus wurde aus dem Gehirn, aus den Tränendrüsen und aus den Speicheldrüsen des Mädchens über intracerebrale Mauspassagen isoliert; vgl. CN. Leach

und H.N. Johnson, Amer. J.Trop.Med., Bd. 20 (1940), S. 335. 15

Das Gehirn der infizierten Mäuse wurde später intracerebral auf Eintagsküken verimpft und im Gehirn von Eintagsküken insgesamt 136 mal passagiert; vgl. H. Koprowski und H.R. Cox, J. Immunol^ Bd. 60 (1948), S. 533. Nach zwei weiteren intracerebralen Passagen wurde dieses Tollwutvirus auf den Dottersack von Hühnerembryonen adaptiert. Nach. 60 Dottersack-Passagen war dieser Virusstamra für eine Reihe von Säugetieren praktisch apathogen. Er wird unter der Bezeichnung "LEP Flury Impfstoff" als Tollwutimpfstoff für Hunde verwendet. Nach weiteren 170-174 Passagen im bebrüteten Hühnerei verlor das Virus weiter an Pathogenität. Zwei Wochen alte Mäuse überleben die intracerebrale Infektion mit diesem Stamm, während neugeborene Mäuse tödlich erkranken. Dieser attenuierte Virusstamm wird unter der Bezeichnung "HEP Flury" .'als Impfstoff verwen-

³⁰ det.

Die LEP- und HEP-Impfstoffe vermitteln einen wirksamen Schutz gegen die Tollwut, wenn sie prophylaktisch eingesetzt werden. Trotzdem besteht ein Bedarf nach anderen Tollwut-Impfstoffen, wie kürzlich durch Kontrolluntersuchungen auf nationaler und internationaler Ebene festgestellt wurde. So ist z.B. die

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Kontrolle der sylvatischen Tollwut in den Industrieländern, in denen die Tollwut seit längerer Zeit endemisch ist, oder wo sie erst seit kurzem eingeschleppt wurde, eines der kompliziertesten und aus ökologischen Gründen schwierigsten Probleme. In der gegenwärtigen Situation gibt es noch keine voll befriedigende, ökonomisch vertretbare Bekämpfungsmaßnahme.

Die postinfektionelle Impfung des Menschen hat in den tollwutverseuchten Ländern in der ganzen Welt zahlreiche Probleme aufgeworfen. Aus diesen Gründen richtete sich das Augenmerk der Forschung auf die Möglichkeit der prophylaktischen wie postinfektionellen Immunisierung durch eine nicht-parenterale, bevorzugt die orale Applikation.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Tollwutvirus-Impfstamm zu entwickeln, der auf verschiedene Weise appliziert werden kann, z.B. parenteral oder nicht-parenteral, und der trotzdem einen voll wirksamen Impfschutz vermittelt, wenn er vor oder nach einer stattgefundenen Tollwutinfektion gegeben

²⁰ wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Möglichkeit der oralen Applikation bei wildlebenden Tieren, die ja die wichtigsten Vektoren und zugleich ein ständiges Reservoir für die Tollwut sind, durch die ein wirksamer ünmunschutz aufgebaut wird, ist eine der wichtigsten Fortschritte, die die vorliegende Erfindung bringt.

Der vermehrungsfähige .Impfstamm 675 ist, soweit gegenwärtig bekannt, von allen existierenden Tollwut-Virusstammen der am meisten apathogene. Dies ermöglicht den Schutz gegen das Straßenvirus auch nach stattgefundener Infektion bereits durch eine einzige Applikation einer geeigneten Dosis. Auch der inaktivierte Impfstoff, der mit diesem Stamm 675 hergestellt wird, gestattet die postinfektionelle Anwendung. Der erzielte Schutz ist allerdings nicht ganz so gut. Der vermehrungsfähige Impfstoff sowie der inaktivierte Impfstoff besitzen eine sehr

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gute Antigenität, die fast gleich ist. Beide Impfstoff-Typen werden in Zellkulturen hergestellt und sind fast völlig frei von Fremdeiweiß, wodurch der Grad und die Häufigkeit von unerwünschten Nebenwirkungen praktisch vollständig beseitigt

5 werden.

Der neue Virusstamm wurde folgendermaßen isoliert: Virus aus dem HEP Flury-Impfstoff wurde in primären oder sekundären Fibroblastenkultüren aus spf-Hühnerembryonen vermehrt. Er wurde durch fluoreszenzserologische Untersuchungen in diesen Fibroblastenkulturen, durch den Mäuseschutztest intraperitoneale Impfung und nachfolgende Belastungsinfektion mit einem standardisierten challenge-Tollwutstamm (CVS) - sowie durch die in vitro Neutralisation mit bekannt positiven Seren - International Rabies Reference Serum - auf seine Spezifität überprüft.

Durch die Verwendung des Plaquetestes in Hühnerembryofibroblastenkulturen oder in anderen Tollwutvirus-empfindlichen Zellinien oder diploiden Zellstämmen nach der Methode von

K. Yoshina u. Mitarb., Arch.ges. Virusforsch., Bd. 18 (I966), S. 370_/und die Plaque-Zellsuspensionsmethode nach G. Bijlenga und L. Joubert, Bull.Soc.Sei. Vet. et Med. Comparee Lyon, Bd. 76 (1974), S. 429, war es möglich, ein Plaque zu isolieren, welches sich von der Ausgangs-Viruspopulation klar durch seinen cytopathisehen Effekt in Zellkulturen unterscheidet. Dieses Plaque wurde über weitere 3 Plaquepassagen (Klonisierung) gezüchtet, um eine Viruspopulation zu gewinnen, die rein und homogen ist.

30

Die Original-Plaque wurde als Nummer 675 und der nach der Reinigung gewonnene Tollwut-Virusstamm als Stamm 675 bezeichnet. Eine Probe dieses Stammes wurde in der Tschechoslovakischen Nationalen KuItürSammlung, Institut für Hygiene und Epidemiologie, Prag, am 13. Januar 1977 hinterlegt. Sie wurde dort unter der Bezeichnung CNCTC Nr. AO 4/77 registriert.

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Der Stamm kann vom Original-Stamm HEP Flury an hand folgender Charakteristika unterschieden werden:

a) durch einen sehr ausgeprägten cytopathischen Effekt (cpE) in Zellkulturen (in vitro), der sich deutlich von dem durch den HEP Flury Stamm verursachten. cpE unterscheidet?

b) durch einen verkürzten primären Viruszyklus, der zwischen 9 und 11 Stunden beträgt, wodurch schneller Plaques ausgebildet werden;

c) sehr klare Plaques, die im Durchschnitt etwas größer als die durch den HEP Flury Stamm gebildeten sind (1 mm

größer);

d) verstärkte Adsorption des Virus an die Zelloberfläche in vitro, was vor allem für die Wirksamkeit einer oralen Impfung notwendig ist;

e) eine schnellere Induktion der Interferonproduktion in v£vo nach der Impfung aufgrund der zuvor beschriebenen Eigenschaften des Stammes. Diese Eigenschaft spielt vor allem bei der postinfektionellen Impfung eine große Rolle; f) höhere Infektiositätstiter in Zellkulturen;

g) durch die Klonselektion und -reinigung ist das Risiko einer möglichen Reversion des Virus zur Ausgangs-Virulenz praktisch ausgeschlossen, da eine homogene Viruspopulation erhalten wird;
h) der Stamm besitzt von allen zur Zeit verfügbaren Tollwut-

25 Stämmen die geringste Pathogenität.

Die unter (a') bis (h) genannten Eigenschaften gestatten eine eindeutige Differenzierung des Stammes vom Stamm HEP Flury.

30 Die vorliegende Erfindung schließt auch artifiziell vom

Stamm 675 gewonnene Mutanten(u.Varianten) ein, die die gleichen Eigenschaften haben wie dieser Stamm.

Aufgrund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, vor allem durch die Klonselektion (g)_f ist gewährleistet, daß mit dem erfindungsgemäßen Stamm 675 Impfstoffchargen gleichbleibender Qualität hergestellt werden können.

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^Γ 9

Dieser verbesserte Impfstoff der Erfindung hat folgende Vorteile:

1. der erfindungsgemäße Lebendimpfstoff vermehrt sich im Gegensatz zu dem HEP -Flury-Impfstoff nicht mehr im Impfling;

-5 Restvirus wird nicht nachgewiesen und ausgeschieden;

2. Der Impfstoff induziert eine sehr rasche Interferonproduktion und -ausschüttung sowie die Aktivierung von anderen, noch nicht genau bekannten bzw. definierten interferierenden Mechanismen, wie z.B. der zellulären Immunitat. Eine einzige Applikation des Impfstoffes verleiht deshalb einen ausreichenden Immunschutz gegen die Infektion mit einem natürlich vorkommenden Virus (Straßenvirus). Im Hinblick auf die schnelle Interferonproduktion und die Aktivierung der zellulären Immunität ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Impfstoffes für die postinfektionelle Impfung für kurz zuvor infizierte Tiere bei einem Tollwut-Ausbruch nun möglich. Es wurde vor allem auch die Möglichkeit der postinfektionellen Impfung des Menschen durch diesen Impfstoff sehr stark verbessert, da nachgewiesen werden konnte, daß der Impfstoff auch nach einer stattgefundenen Infektion im Tier außerordentlich wirksam ist und sogar in einem relativ weit fortgeschrittenen Stadium der Infektion noch die Genesung einleiten kann/ 3· Nicht-parenterale Applikationsformen, wie z.B. die orale Impfung mit dem Lebendimpfstoff, erlauben organisierte große Impfkampagnen.

Ein Lebendimpfstoff, der mit dem Stamm 675 hergestellt wird, hat für die prophylaktische Impfung folgende Vorteile: A) in Tieren

1. die Immunisierung von Füchsen und anderen epidemiologisch wichtigen, wildlebenden Tieren mit Hilfe von Ködern, die Impfstoff enthalten;

2. die orale Impfung von Haustieren, z.B. von streunenden Hunden, in denjenigen Ländern, in denen aus religiösen und/oder gesetzlichen Gründen die Tötung nicht erlaubt ist;

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Γ · Π

3. eine starke Vereinfachung von Impfkampagnen durch die Möglichkeit, gleichzeitig eine große Zahl von Individuen zu impfen, wie z.B. durch die Verteilung von gegebenenfalls gefrorenen Fleischbällen, in denen Impfstoff enthalten ist, durch Flugzeuge;

4. der v/irksame Schutz von Haustieren nach einer stattgefundenen Infektion in Ländern, in denen eine derartige Impfprozedur gestattet ist und in Ländern, in denen Tiere, die vor der Infektion bereits einmal immunisiert worden sind, nicht getötet werden müssen.

B) im Menschen

1. Furcht vor der oralen Impfung gibt es so gut wie nicht. Die Furcht vor der Injektion ist in vielen Ländern

ein entscheidender Faktor für die Ablehnung der Impfung durch den Patienten;

2. die orale Verabreichung verursacht keine lokalen Reaktionen oder Irritationen, ein entscheidender Wachteil der zur Zeit im Handel befindlichen Impfstoffe;

3. die einfache Verabreichung gestattet die gleichzeitige Impfung großer Populationen durch medizinisch nicht (besonders) geschultes Personal (wie z.B. bei der Polio-Impfung).

In diesem Zusammenhang ist auch sehr wichtig, daß nachweislich eine einzige Applikation ausreicht, um einen wirksamen Impfschutz zu induzieren.

Der neue Impfstoff kann mit den gebräuchlichen Methoden her-

gestellt werden, wie z.B. in Zellkulturen, Einschaltung der üblichen und vorgeschriebenen Kontrollen auf bakterielle und virale Kontaminationen und Beachtung der bekannten Grundsätze und der internationalen Standard-Anforderungen.

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Der erfindungsgemäße neue Impfstoff wird bevorzugt durch die Vermehrung des Tollwutvirus Stamm 675 in primären oder sekundären Hühnerembryofibroblasten-Kulturen von 10-tägigen spf-Hühnerembryonen hergestellt. Es können allerdings auch andere ZeIlsysteme, die für das Tollvrutvirus empfänglich sind, verwendet werden, wie Zellen von verschiedenen Vögeln oder Säugetieren, vorzugsweise der Babyhamsternieren-Zellstamm BHK-21 (21 Passagen als Monolayerkultur) bzw. BHK-21 13S (13 Passagen als Suspensionskultur}. In BHK-KuItüren hergestelltes Virus eignet sich allerdings nur für Impfstoffe, die in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Suspensionskulturen haben den großen Vorteil, daß für die Herstellung des Virusmaterials Fermenter mit einer großen Kapazität verwendet werden können, was die Produktion erleichtert.

Der Impfstoff kann aber auch in Zellen, die auf Mikroträgern zur Vermehrung gebracht wurden, hergestellt werden (Tropfen-Zellkultur-System). So haben z.B. Dextran-Tropfen bzw.-Perlen, die vor und/oder während der Zellvermehrung mit makromolekularen Anionen behandelt werden, eine positive Ladungsdichte, die günstig für die Vermehrung von Zellen an ihrer Oberfläche ist. Auf diese Art und Weise werden Suspensionen mit Zellen und Perlen, die gerührt werden, mit dem Virusmaterial beimpft. Nach der VirusVermehrung wird der Rührvorgang beendet, wodurch die Perlen sich am Boden absetzen und die Virusernte von der Suspension abgetrennt werden kann.

In einer speziellen Methode werden für die Herstellung des Impfstoffes die Hühnerembryofibroblasten-Kulturen mit dem Tollwutvirus Stamm 675 mit einer Multiplizität der Infektion von O,O2 bis 1 PBE/Zelle infiziert,

wobei eine Adsorptionszeit von mindestens 1 Stunde bevorzugt wird (Adsorptionsmethode). Nach der Entfernung des nicht adsorbierten Virusmaterials wird den Zellkulturen Erhaltungsmedium zugesetzt. Dieses Besteht bevorzugt aus Eagle's Basalmedium (BME) in Earle¹scher Salzlösung mit einem

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j NACHeEREiCHTJ ¹ - -*- :

Zusatz von Antibiotika (ζ. B. 100 ι. E.- Penicillin und 100 7~ Streptomycin) sowie 0,2 bis 0,5 % Albumin. Es muß unbedingt darauf geachtet werden, daß der pH-Wert des Erhaltungsmediums bei 8,0 bis 8,2 liegt. Die virusinfizierten Zellen werden 3 bis 10 Tage bei 32 bis 39°C bebrütet. Anschließend wird das virushaltige Medium bei -70°C oder bei tieferen Temperaturen eingefroren, um die Zellen zu zerstören und damit zellge"bundenes Virus freizusetzen; dies erhöht den Titer. Unter sterilen Bedingungen werden danach die Zellen und der Zelldetritus mittels Filtration oder Zentrifugation entfernt. Das Filtrat bzw. der Überstand wird anschließend bei -70⁰C gelagert. Entsprechende Proben werden zuvor für die Titration mit Hilfe der Plaquemethode entnommen. Es können natürlich auch andere Methoden zum Aufschluß der Zellen verwendet werden, z.B. eine Ultraschallbe-

15 handlung.

Eine Alternativmethode ist die Vermehrung des Virus in BHK-21 ^S-Suspensionskulturen. Hierfür werden die Zellen in Suspension z. B. in Spinner-Flaschen mit entsprechenden ">■ Rühreinrichtungen gezüchtet. Das Anzuchtmedium enthält geringe Mengen (7 - 15 %) Tryptosephosphat-Bouillon, inaktiviertes*..^:Kälberserum (7 - 15 %) und Antibiotika (z.^.. 100 I. E. Penicillin und 100 y Streptomycin). Es wird so lange gezüchtet, "bis eine Zelldichte von etwa 2x10 Zellen/ml erreicht ist. Um ein Absinken oder Klumpen der Zellen zu vermeiden, wird die Suspension ständig bewegt. Sodann werden die Zellen abzentrifugiert und unter Bewegen mit dem Tollwutvirus Stamm 675 mit einer Multiplizität der.-Infek^ tion von 0,01 bis 1 PBE/Zelle 30 bis 60 Minuten infiziert. .,«

Nach der Infektion werden die Zellen wieder z. B. in Spinner-Flaschen gegeben. BHK-21 Erhaltungsmedium wird zugefügt. Dieses enthält eine kleine Menge Rinderserumalbumin Fraktion V und z.B. 0,1-0,4 Gew. -% Antibiotika (z. B. Kanamycin oder Neomycin in einer Menge von 50 - 300<?2 Der ph-Wert wird auf 7,5 bis 8,Oeingestellt. Während der Bebrütung wird die Temperatur auf 32 bis 35° C, bevorzugt auf 33 C,

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^Γ .13 _ ■ ' ""

eingestellt. Jeden Tag werden kleine Proben entnommen und mit Hilfe der Immunfluoreszenz untersucht. Zwischen dem 2. und 3. Tag p.inf. sind zwischen 80 % und 100 % der Zellen infiziert und zeigen eine für das Tollwutvirus typische Fluoreszenz im Cytoplasma. Dies ergibt am 4. Ms 6. Tag

p.inf. eine Virusernte mit einem Infektiositätstiter von 10 bis 10⁹ PBE/ml. Für die Virusernte wird die Flüssigkeit gesammelt und bei -70⁰C eingefroren.

Nach Entfernung der Zellen und des Zelldetritus wird eine kleine Probe mit Hilfe der Plaquemethode titriert. Wenn ein ausreichender Titer erreicht wurde (10''^ bis 10 '·> PBE/ml oder höher), werden die Zellen und der Zelldetritus von der Virusernte mittels Filtration oder Zentrifugation unter ste-

15 rilen Bedingungen entfernt.

Nach der Zugabe eines geeigneten Stabilisators kann die Flüssigkeit in Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet werden.

Die Erfindung betrifft aber auch inaktivierten Tollwut-Impfstoff, vor allem zum Gebrauch in der Humanmedizin. Für den inaktivierten Impfstoff wird die erhaltene Flüssigkeit des Lebendimpfstoffs nach bekannten Methoden bzw. modifizierten Methoden inaktiviert, z.B. durch Zugabe von .. ß-Propriolacton, wäßrige Formaldehydlösung oder Acetylethylenimin oder durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht.

Der erfindungsgemäße Tollwut-Impfstoff, welcher mit dem Virusstamm der Erfindung hergestellt wird, kann einen oder mehrere übliche Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer und/oder Adjuvantien enthalten.

, Die Beispiele erläutern die Erfindung. 35

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¹ Beispieli

Monolayer von primären oder sekundären Hühnerembryofibroblastenkultüren, hergestellt von spf-Hühnerembryos, werden als stationäre oder Rollerkulturen mit dem Tollwut-Saatvirus Stamm 675» das eine Multiplizität der Infektion von 0,02 bis 1 PBE/ Zelle besitzt, beimpft. Wenn geringere Virusmengen für die Beimpfung verwendet werden, verlängert sich die Adsorptionszeit. Das Saatvirus muß mindestens 1 Stunde adsorbiert v/erden. Nach Beendigung der Adsorptionszeit wird das nicht adsorbierte Virusmaterial entfernt und die Zellkultur mit Erhaltungsmedium beschickt. Dieses besteht aus Eagle's Basalmedium (BME) in Earle¹scher Salzlösung mit einem entsprechenden Antibiotikazusatz und 0,2 % Albumin der Species, für die der Impfstoff verwendet werden soll. Der pH-Wert des Erhaltungs-

¹⁵ mediums wird auf 8,2 eingestellt.

Bei einer Bebrütung bei 33° bis 35°C über 4 bis 8 Tage entsteht ein ausgeprägter cpS (cytopathischer Effekt). Das virushaltige Medium wird danach bei -70⁰C eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Zellen und der Zelldetritus mittels Zentrifugation mit 1000 g oder durch Filtration durch ein Membranfilter (Porengröße: 5 Mikron) unter sterilen Kautelen entfernt. Die Flüssigkeit (Überstand bzw. Filtrat) wird bei -70⁰C gelagert. Für die Titration im Plaquetest nach Bijlenga und Joubert, a.a.O., werden entsprechende Proben entnommen.

Für Impfstoffe, die für postinfektionelle Impfungen verwendet

werden sollen, muß der Virustiter 10 PBE/ml betragen. Für prophylaktisch verwendete Impfstoffe genügen auch Virustiter von bis zu 10' PBE/ml.

Die Herstellung der Impfstoffchargen wird durch die üblichen Wirksamkeitsteste (NIH- und Habel-Test) kontrolliert. Chargen, die für postinfektionelle Impfungen verwendet werden sollen, werden einem zusätzlichen Viirksamkeitstest nach der Methode

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-15 - ■ - ^Π

von G. Bijlenga, Symposium on Advances in RaMes Research» Atlanta, Georgia, V.St.A., 7. Ms 9· September 1976, S. 14, unterzogen.

In diesem neuen Wirksamkeitstest wird lokales Straßenvirus 4 ¥ochen alten Mäusen intramuskulär appliziert. Innerhalb von 24 Stunden erhalten die infizierten Tiere einmal 0,5 ml Impfstoff intraperitoneal. Alle geimpften Mäuse sollten überleben, während von den infizierten Kontrollmäusen innerhalb der Testperiode, von 3 Wochen ungefähr 50 % sterben sollten.

Entsprechend den international anerkannten Mindestanforderungen werden die entsprechenden Kontrollen auf die Abwesenheit von bakteriellen und viralen Kontaminationen sowie die bei der Impfstoffproduktion üblichen Kontrollen für primäre oder sekundäre Zellen bzw. Zellinien durchgeführt.

Beispiel 2
BHK-21 i3S-Zellen werden als Suspensionskultur in Spinner-Flaschen gezüchtet. Als Medium dient das übliche BHK-21 Medium mit einem Zusatz von 10 % Tryptosephosphat-Bouillon, 10 % inaktiviertem Kälberserum und Antibiotika (100 I.E.Penicillin, 100y Streptomycin). Die Zellen werden unter ständigem Rühren, um sie in der Suspension zu halten und um ein Verklumpen zu vermeiden, so lange bebrütet, bis eine Zelldichte von 2 χ 10 Zellen/ml erreicht ist.

Die Zellen werden dann mit 80 g abzentrifugiert und 45 Minuten mit Tollwut-Saatvirus Stamm 675 beimpft und bewegt. Das Saatvirus hat eine Multiplizität der Infektion von 0,01 bis 1 PBE/Zelle. Nach der Infektion werden die Zellen wieder in die Spinner- \ Flaschen gegeben und es wird Erhaltungsmedium zugefügt. Dieses besteht aus BHK-21 Spinner-Kulturmedium mit einem Zusatz von 0,2 % Rinderserumalbumin Fraktion V und entsprechenden Antibiotika (z.B. Kanamycin oder Neomycin). Der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt.

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Γ ₁₆ fNIACH_QERElCHTj1

Die Bebrütungstemperatur liegt bei 33°C. Jeden ;Tag werden aus den Spinner-Flaschen kleine Proben entnommen und mit Hilfe der Immunfluoreszenz untersucht. 2 bis 3 Tage p.inf. sollten 30 bis 100 % der Zellen eine für das Tollwutvirus typisehe Fluoreszenz im Cytoplasma zeigen. Dies entspricht einem

Q Q

Infektiositätstiter von 10 bis i0^y PBE/ml, wenn die Kulturen am 4. bis 6. Tag p.inf. geerntet werden. Für die Virusernte wird die Flüssigkeit entnommen und bei -70⁰C eingefroren. Eine kleine Probe wird entnommen, von Zellen und Zelldetritus befreit und im Plaquetest titriert. Wenn ein ausreichender Titer erreicht wurde (1O⁷'⁵ bis 10⁸'⁵ PBE/ml und höher), wird die gesamte Virusernte, wie zuvor schon beschrieben, von Zellen und Zelldetritus befreit und kann dann nach der Zugabe von geeigneten Stabilisatoren in Ampullen abgefüllt und ge-

15 friergetrocknet werden.

Um höhere Titer zu erzielen, benutzt man in einer Alternativmethode entweder stationäre Monolayer-Kulturen oder Monolayer in Roller-Kulturen für die Infektion. 2 bis 8 Stunden nach der Infektion werden die Zellen abtrypsiniert und in Suspensionskulturen verbracht, die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Es muß dabei besonders darauf geachtet werden, daß sich die Zellen nicht verklumpen. Auf diese Weise können mehr als 2x10 Zellen/ml verwendet werden, wodurch in Abhängigkeit von der Zellzahl, die in die Suspensionskultur gegeben wurde, höhere Titer erreicht werden.

Beispiel3

Um die Verwendungsmöglichkeit und die Wirksamkeit des vermehrungsfähigen und des inaktivierten Tollwut-Impfstoffes "der ... ■ Erfindung zu zeigen, sind einige Beispiele von prophylaktischen und postinfektionellen Impfversuchen im folgenden zusammengestellt:

A) Orale Impfung von Füchsen mit dem Tollwut-Lebendimpfstoff (Stamm 675, Infektiositätstiter: 2 χ 10 PBE/ml, Impfdosis: 2 ml/Fuchs )

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OO CaJ

Tabelle I

	Nr. des Fuchses	Alter (11.8.75)	Serumtiter' 11.9. 7.10. 21.11.	7,0 1,6 2,4	8,2 1,4 3,2	Belastungs- > infektion ^xx' 23.12.75
oral geimpfte Füchse	84 86 88	5 Monate 6 Monate 6 Monate	4,0 2,0			geschützt geschützt geschützt
nicht ge impfte Kontroll füchse	83 85 92	6 Monate 6 Monate 6 Monate		Tod 15. Tag ρ.inf. Tod 17.Tag p.inf. Tod 18. Tag p.inf.

χ) Eine I.E. (Internationale Einheit) entspricht einer Serumverdünnung von
1:300, die eine 50prozentige Plaquereduktion hervorruft.

xx) eine sehr hohe Dosis von challenge-Virus (aus der Speicheldrüse eines natürlich
infizierten Fuchses). Für die Bestimmung des Schutzwertes des Impfstoffs wurde
eine Dosis von 1 391 610 MLD₅₀ verwendet.

2BÖ324Ö

Das Experiment beweist die Wirksamkeit der oralen Impfung von jungen Füchsen. Durch serologische Untersuchung konnten ein Antikörperanstieg und relativ hohe Serumtiter nachgewiesen werden. Hehr als 5 Monate nach der Impfung waren die Füchse noch voll geschützt, während alle 3 Kontrollfüchse nach einer sehr kurzen Inkubationszeit starben, was auf die außerordentlich hohe challenge-Dosis zurückzuführen ist (intramuskulär in das rechte Hinterbein). Die gebräuchliche challenge-Dosis ist für Füchse 3000

B) Ergebnisse von serologischen Untersuchungen nach der Impfung mit dem inaktivierten Stamm

	Tabelle '	II	ml	i.m.	Serumtiter
			ml	i.m.	4 Wochen
Tierart	Körper		ml	i.m.	p.vacc.
	gewicht,	Impfdosis	ml	i.m.	6,8
	k^;		ml	i.m.	6,3
' Hund 1	6,5		ml	i.m.	5,5
ρ	8	2	ml	i.m.	12,3
3	1 2	2	ml	i.m.	5,9
4	10	2	ml	S.C.	4,5.
VJl	15	2	ml	S. C.	3,a
6	14	2	ml	S.C.	20,5
7	17	2	ml	S.C.	4,5
8	17		ml	S.C.	8,5
: Kuh 1	200		ml	S.C.	15,5
2	400	5	ml	S.C.	4,8
3	300	5	ml	S.C.	7,6
! 4	500	5			8,9
VJl	400	5			3,8
6	600	5	4,7
7	500	5
8	400	5
	5

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■ ■ "·

Es wurde eine einzige Impfstoff-Dosis appliziert. Die angegebenen Titer sind ausgedrückt in I.E. wie in Tabelle I.

4 Wochen nach der Impfung zeigten alle 8 Hunde und 8 Rinder einen Antikörperanstieg mit sehr hohen Titern. Der geforderte Mindesttxter ist in der Europäischen Pharmacopoe mit 0,2 I.E./ml festgelegt.

C)₁ Schutzrate von Labormäusen nach einer Infektion mit Straßenvirus (vom Fuchs stammend)

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[O

cn

Ol

cn

Tabelle III

Art des j

1. Std.

Intervalle

1/10

i zwischen der Infektion

3 Tage

i

I

7/10

4 Tage

und der

Impfung

7 Tage, 8 Tage

6/10 6/10

9 Taüe"^x

Impfstoffes j
i

1 Tag ^:

2 Tage

8/10 j

5 Tage

6 Tage

■-

Lebendimpf- |
stoff 675 I

0/10^{XX :}

i

1/10 j 1/10

5/10

2/10

0/10 4/10 5/10

3/10

unverdünnt j

1/10

0/10

ίο"¹ !

4/10

ίο-² j

6/10

G
CC

ΙΟ"³ ί

8/10

00
CO
N>

10~⁴ i

6/10

7/10 j 7/10

6/10

8/10

■-■v
O

Kontrollen j

7/10

σ>
<ä>

inaktivierter
Impfstoff 675

0/10

unverdünnt

1/10

ΙΟ"¹

6/10

10-2

8/10

ΙΟ"³

6/10

ΙΟ"*

28Ü3240 _π

ο η

χ) Titer des Impfstoffes 10 P3E/ml (für den inaktivierten Impfstoff wurde der Titer vor der Inaktivierung bestimmt)
xx) Zahl der Todesfälle pro Zahl der infizierten Mäuse

5 xxx) 2 Impfungen am Tag 9 und 11.

Alle Mäuse wurden intramuskulär mit einem Tollwutvirus infiziert, das aus der Speicheldrüse eines Fuchses stammte (0,1 ml). Diese Menge reichte aus, um 60 bis 80 % der Kontrol len nach einer Inkubationszeit von 9 bis 11 Tagen zu töten.

Der Lebendimpfstoff und der inaktivierte Impfstoff wurden jeweils in einer einzigen Dosis (0,5 ml) intraperitoneal in unterschiedlichen Abständen von der Infektion, wie in Tabel-Ie III aufgeführt, verabreicht.

Der unverdünnte Lebendimpfstoff schützte die Tiere noch 6 Tage nach der Infektion. Ein derartiger Schutzeffekt ist bisher noch bei keinem der im Handel befindlichen Impfstoffe nachgewiesen worden. Dieser Schutzeffekt beweist, daß sogar noch dann, wenn das Tollwutvirus bereits das Zentralnervensystem erreicht hat, die Mäuse noch geheilt werden können.

Wird 2 mal hintereinander mit 1 Tag Intervall geimpft, ist 9 Tage nach der Infektion immer noch ein Teil der Mäuse geschützt.

Der Lebendimpfstoff sowie der inaktivierte Impfstoff können bis zu 1Ofach verdünnt werden. Mit dem verdünnten Impfstoff muß die Impfung innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion vorgenommen werden.

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Claims

Delft, Niederlande 2i". Januar 1978 " Tollwut-Impfstoff " Priorität: 26. 1. 1977, Großbritannien, Nr. 3258/77 Patentansprüche

1. Tollwut-Lebendimpfstoff oder inaktivierter Impfstoff für die parenterale und nicht-parenterale Impfung, g e k e η η zeichnet durch einen Gehalt an gegebenenfalls inaktiviertem Tollwutvirus Stamm 675» hinterlegt bei der Tschechoslovakischen Nationalen Kultursammlung, Institut für Hygiene und Epidemiologie, Prag, mit der Registriernummer CNCTC AO 4/77 oder dessen Mutanten und Varianten mit dem glei-

.25 chen reproduzierbaren signifikanten cpE sowie anderen spezifischen Charakteristika des Stammes 675.

2. Impfstoff gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er das Virus in einer pharmazeutisch annehmbaren Injektions-

30 lösung enthält.

3. Impfstoff gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens einen Stabilisator, ein Konservierungsmittel, einen Puffer und/oder ein Adjuvans enthält.

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4. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 für die orale oder intestinale Applikation inkorporiert in Ködern.

5. Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Tollwutvirus Stamm 675 (CNCTC AO 4/77) in Zellkulturen von Vögeln oder Säugetieren, die empfindlich für das Tollwutvirus sind, vermehrt, zur Aufspaltung der Zellen die erhaltene virushaltige Zellsuspension bei -70⁰C -oder tiefer einfriert und/oder mit Ultraschall ■jO behandelt, die Zellen und den Zelldetritus durch Filtration oder Zentrifugation unter sterilen Kautelen entfernt und gegebenenfalls das Virusmaterial in der Zellkulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise inaktiviert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Hühnerembryofibroblastenkultüren mit dem Tollwutvirus Stamm 675 ^mit einer Multiplizität der Infektion von 0,02 bis 1 PBE/Zelle mindestens eine Stunde infiziert, nach der Entfernung von nicht adsorbiertem Virus ein Erhaltungsmedium vom pH-Wert 8,0 bis 8,2 zusetzt, die infizierten Zellen 3 bis 10 Tage bei 32 bis 39°C bebrütet, das virushaltige Zellkulturmedium bei -70⁰C oder tiefer einfriert und/oder mit Ultraschall behandelt,'die Zellen und den Zelldetritus durch Filtration oder Zentrifugation unter sterilen Kautelen entfernt .

und gegebenenfalls das Virusmaterial in der Zellkulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise inaktiviert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Erhaltungsmedium Eagle's Basalmedium in Earle¹scher Salzlösung mit einem Zusatz von Antibiotika und 0,2 bis 0,5 % Albumin verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Babyhamsternierenzellen Stamm BHK-21 13S in Suspensions-

35 kultur unter Zusatz von 7 bis 15 % Tryptose-Phosphat-Bouillon, 7 bis 15 % inaktiviertem Kälberserum und

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L ^J

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Antibiotika Ms zu einer Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml unter ständigem Bewegen vermehrt, die Zellen abzentrifugiert und die erhaltenen Zellen unter Bewegen mit dem' Tollwutvirus
Stamm 675 mit einer Multiplizitat der Infektion von 0,01 bis
1 PBE/Zelle 30 bis 60 Minuten infiziert, sodann die Zellen in
Suspensions-Kultur unter "Zusatz von Erhaltungsmedium bei einem pK-Wert von 7,5 bis ö,0 während 4 bis 6 Tagen bei 32 bis 35° C bebrütet, das virushaltige Zellkulturmedium bei -70° C oder tiefer einfriert und/oder mit Ultraschall behandelt,, die Zellen und den Zelldetritus durch Filtration oder Zentrifugation unter
sterilen Kautelen entfernt und gegebenenfalls das Virusmaterial in der Zellkulturflüssigkext in an sich bekannter Weise inaktiviert.

9. Tollwutvirus (nov.spec.) Stamm 675, hinterlegt bei der
Tschechoslovakischen Nationalen Kultursammlung, Institut für Hygiene und Epidemiologie, Prag, mit der Registriernummer
CNCTC AO 4/77, sowie dessen=Mutanten und Varianten mit dem
gleichen reproduzierbaren signifikanten cpE sowie anderen

²⁰ spezifischen Charakteristika des Stammes 675.

10. Verfahren zur Gewinnung des Tollwutvirusstammes gemäß
Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den HEP Flury
Impfstoff in primären oder sekundären spf^Hühnerembryofibroblasten oder in anderen Tollwutvirus-empfindlichen Zelllinien oder diploiden Zellstämmen vermehrt, eine Plaque isoliert, die sich vom Ausgangsvirus durch ihren cytopathisehen Effekt im Plaquetest unterscheidet, und diese Plaque über
3 Plaquepassagen klonisiert.

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