SE444453B - Sett att isolera en ny stam av rabiesvirus - Google Patents

Description

en 15_ 50 55 1ßno7s1«2 2 Den 29 januari 1939 dog en flicka med namnet Flury i staten Georgia i USA, varvid rabies diagnostiseradessmndödsorsak, efter in- fektering av en rabiessmittat hund, Rabies-virus isoleradesfrân hjärnan, tårkörteln och spottkörteln hos flickan genom intracere- bral inympning i vita möss, såsom beskrivas av Leach C.N. och Johnson mm., Amer. J. frropnaed. 19140, 20, 555. i Hjärnmaterialet från mössen inympades intracerebralt i en dag gamla kycklingar och därefter utfördes lšóvintracerebrala passager i kycklingar, enligt Koprowski H. och Cox H.R., J- Immunol. l9ü8, 60i 533. Efter ytterligare två intracerebrala passager i kycklingar. anpassades rabies-viruset till kycklingembryon genom inympning i gulsäcken. Efter 60 gulsäck-passager syntes virnset vara i det när- maste icke patogent för ett antal däggdjnr och finns i denna serie- pasaagenivå tillgängligt som rabiesvaccin för hundar under beteck- ningen LEP Flury vaccin. Efter ytterligare seriepassager i kyckling- embryon (upp till 170-l7ü passager) syntes viruset ha förlorat yt- terligare i patogenicitet så att två veckor gamla laboratoriemöss ej dog efter en intracerebral administration även om diande möss fortfarande dog. Detta vaccin finns tillgängligt under beteckningen HEP Flury vaccin (Flury-vaccin med ett högt antal äggoassager). ' Även om dessa LEP och HEP vacciner på ett effektivt sätt för- hindrat rabies-infektion då de används som vaccin före exponeringen, finns det behov av andra rabies-vaccin, såsom framgår av nyligen gjorda kontrollmätningar på nationell och internationell nivå.

Exempelvis utgör kontrollen av sylvatisk rabies i utvecklingsländer- na, där denna sjukdom varit endemisk under lång tid eller där den införts på senare tid, en av de svåra och ekologiskt komplicerade situationer som finns och för vilken det ej finns någon effektiv och ekonomisk kontrollmetod. * »Likaså har vaccinbehandling av människor efter ekponering or- sakat många problem i rabies-infekterade länder över hela världen.

Av dessa skäl har forskningen kring rabies inriktats på problemen vid vaccinering före och efter exponering och immunisering på icke- -parenteral, lämpligen oral väg.

Som resultat av forskning och försök har en ny vaccinstam ut- vecklats, som kan administreras på olika vägar, dvs som kan administ- reras parenteralt eller icke-parenteralt, och som synes ge ett fullt skydd då den administreras före eller efter en rabies-infektion. l5 BO NO 3 i i t 7sou7s1-2 § Möjligheten att uppnå en effektiv oral administration med syf- tet att kunna åstadkomma en "oral vaccinering" av vina djur, som är de mest betydelsefulla vektorerna och/eller källorna till rabies, utgör en fördel med föreliggande uppfinning. _ Den levande vaccinstammen 675 är den mest apatogena förekom-. _ mande rabies-vaccinstammen som hittills är känd. Den ger möjlighet till skydd efter exponering för naturligt virus (street virus), ock- så vid användning av en enda lämplig vaccindos. Det inaktiverade vaccin som framställts av denna stam 675 ger också skydd efter expo- nering, men i lägre grad. Det levande vaccinet har en mycket hög antigenicitetsgrad, som nästan är densamma som för den inaktiverade typen av vaccinet. De levande och inaktiverade vaccinen är vaccin av cellkulturtyp som är nästan fria från främmande proteiner, vilket avsevärt, även om ej fullständigt, minskar förekomsten av icke önsk- värda bireaktioner. I i A 7 _ _ Den nya virusstammen isolerades på följande sätt: 'HEP-Flury vaccínviruset fortplantades i primära eller sekun- dära SPF kycklingembryofibroblaster och identifierades också som rabies-virns med hjälp av specifik immunofluorescens av de infekte- rade fibroblasten, genom ett musskyddstest genom intraperitoneal vaccinering följd av administration_av-ett standarderisat rabies- -testvirus (rabies challenge virus, CVS) och genom seroneutralise- ringstest in vitro med känt positivt serum (International Rabies Reference Serum)§ _ “ _ ' _ ”För fortplantning av det som utgångsmaterial använda HEP Flury vaccinet kan naturligtvis användas också andra rabies-känsliga cell- linjer och diploida cellstammar än SPF kycklingembryofibroblaster.

Genom användning av den plaque-analysmetod i kyoklingembryo- fibroblaster (SPF) som beskrivits av Yoshina, K. et al, Arch, ges. _ Virusforsch., l966, l8:37O och den plaque-cellsuspensionsmetod som beskrivits av Bijlenga, G. och Joubert, L., Bull. Soc. Soi. Vet. et Mëd. Comparêe, Lyon, 1974, 76:ü29, var det möjligt att isolera en nknua som klartc skilde sig ruspopulationen vad gäller den cytopatiska effekten på infekterade ifrån den som utgångsmaterial använda vi- celler. Denna plaque klonades tre gånger för framställning av en homogen och ren viruspopulation. A Den ursprungligen isolerade plaquen tilldelades talet 675 och stammen efter rening betecknades rabies-vaccin stam nr 675. Ett, prov av denna stam deponerades i den tjeckoslovakiska.nationella samlingen av typ-kulturer vid institutet “för hygien och epidemio- ”780Û781-2 logi i Prag den 13 januari 1977 och finns där under beteckningen CNCTC nummer Ao u/77. _ _ i Denna stam skiljer sig från det ursprungliga HEP Flury viru-_ set genom_följande egenskaper: V ' _ 7 ' a) en mycket utpräglad cytopatisk effekt.på cellkulturer in vitro, en effekt som ej åstadkommes av HEP Flury virus; _ b) förkortad primär viruscykel, varierande mellan 9 och ll timmar, vilket orsakar att plaque uppträder tidigare; _ c) mycket klara plaques, som har i genomsnitt en något större (l mm större) diameter än plaque av HEP virus; _ ip V d) ökad fastförmåga till eeiiytan in»vicfo, vilket är väsent- ligt för ett lämpligt oralt vaccin; _ I I e) snabbare produktion av interferon in vivo efter vaccine- ring på grund av ovan angivna egenskaper}-Detta_är av betydelse för vaccinering efter exponering; A f) högre titrar erhålles i cellkulturer; g) genom klonförening erhålles homogena viruspopulationer, vilket medför en minskad risk för eventuell återgång av virusstam-_ men till ursprunglig virulens, som därför i praktiken kan uteslutas; h) det är den mest apatogenairabies~stam som hittills finns tillgänglig. _ A I i i _ A A De egenskaper som anges under a) -'h) visar en klar distink- tion från det ursprungliga HE? Flury viruset.' i _ Föreliggande uppfinning omfattar även isolering av artifi- ciella mutantstammar som härletts från virusstammen nr 675 och som har de egenskaper hos stammen nr 675 som beskrivits ovan.

»Genom ovan angivna egenskaper, speciellt g) underlättas fram-_ ställningen av vaccinsatser av konstant kvalitet, dvs vaccin med förbättrad likformighet kan framställas enligt uppfinningen av virus- stammen nr 675. I _ _ De vaccin som omfattas av uppfinningen har följande fördelar: (1) I likhet med det ursprungliga-HE? Flury vaccinet förökas det levande vaccinet enligt uppfinningen ej efter administration och något återstående virus kan ej påvisas; V (2) vaccinen orsakar en mycket snabb interferonproduktion och dessutom andra, icke kända interfererande egenskaper, till exempel cellförmedlad immunitet, En enda administrering av vaccin efter ex- perimentell infektering med ett naturligt förekommande virus kan ge fullt skydd. På grund av den mycket snabba produktionen av interfe- ron och cellförmedlad immunitet är det nu möjligt att använda vaccinen KD HO 7800781-2: enligt föreliggande uppfinning för att skydda nyligen exponerade djur under rabies-utbrott. Speciellt har möjligheten att vaccinbe- handla människor efter exponering förbättrats avsevärt då vaccinen visat sig vara högeffektiva på djur efter exponering för infektion» och även kan bota djur i ett_mycket framskridet infektionstillstånd. (3) Icke-parenteral administration, till exempel oralt, av levande virusvaccin underlättar användningen därav i organiserade vaccinationskampanjer. i . i ,V Det levande virusvaccin som framställts av stam 675 har föl~ _ jande eventuella fördelar för vaccinering före exponering: A> .tårar _ l. Immunisering av rävar och andra.epidemiologisktW viktiga vilda djur med hjälp av rabies-vaccinhaltiga beten. v I 2. Oral vaccinering av husdjur, till exempel kringdrivandem hundar, i sådana länder där en avlivning av dessa ej är möjlig av religiösa och/eller juridiska skäl. p _, 3. Administration av levande virusvaccin i stor skala med hjälp av beten, så att vaccineringskampanjer kan förenklas avsevart.

Exempelvis fördelning av eventuellt djupfrysta köttbullar som inne- håller virusvaccinet med hjä1p.av flygplan. Ä. Effektivt skydd av husdjuren efter exponering, för an- _ vändning i länder där sådana vaccinationsförfaranden är tillåtna A och i länder där_djuren kan omhändertas efter exponering under för-e utsättning att de redan blivit immuniserade, å) På människor: _ _ 7 1; Fruktan för en oral vaccinering är försumbar. Frukten' för en ympning är en mycket betydelsefull faktor i flera länder och orsakar en minskning av antalet patienter som kommer tillbaka för det erforderliga antalet ympningar. _ 2. Administration per os orsakar ej lokala reaktioner eller irritationer, vilket är en verklig olägenhet med nuvarande i handeln tillgängliga, tidigare kända vacciner. 3. Lätt administration i stor skala och med-hjälp av icke medicinskt utbildad personal blir möjlig (jämför oral poliomyelit- vaccinering). 4 _ _ I detta sammanhang måste det faktum att en enda administrering av vaccinet visat sig vara tillräcklig anses vara betydelsefullt.i De nya vaccinen framställes enligt brukliga förfaranden, dvsi i cellkulturer in vitro, under användning av vanliga och föreskrivna kontroller för att eliminera kontaminering med bakterier och/eller _ ___. -_._.._.._,_-..._._., ,.. ..._ .. ..._.»...~_.._~._........_...~__._-.._..._...._,fi._._.s_._ .

HO 7so@7s1-2 6A virus, enligt väl kända principer och internationella standardkrav.

I De nya vaccinerna enligt föreliggande uppfinning framställes lämpligen genom odling av rabies-viruset i monoskikt av primära el- ler sekundära kycklíngembryofibroblaster härledda från SPF 10-daaar gamla kycklingembryon. Andra cellsystem som är tillräckligt mottag- liga för rabies-infektion kan emellertid också användas, såsom andra celler som härrör från fåglar eller däggdjur, till exempel Baby , Hamster Kidney 21 (21 passager) för monoskiktodling eller BHK-21 13 S (13 passager av suspensionsodling) för suspenderad odling, men i detta fall endast för djurvaccin, Det suspenderade cellkultursyste- met har den stora fördelen att möjliggöra produktion av virusvaccin i fermentatorer av stor kapacitet vilket underlättar produktionen.

Vaccinen kan också framställas i celler odlade på mikrobärare (kulcellkultursystem). Exempelvis.kan polydextrankulor, behandlade med makromolekulära anjoner före och/eller under cellväxten användas som har en lämplig positiv laddningsdensitet för celltillväxt på ytan. På detta sätt kan en omrörd suspension av celler och kulor i ett flytande medium ympas med önskat virus och då viruset fortplan- tats sänkes kulorna till botten av-reaktorn och separeras från vi- russuspensionen. _ ' _ Vid en specifik metod för framställning av vaccin infekteras kycklingembryofibroblaster med rabies-ympvirusstammen nr 675 med en infektionsmultiplicitet av 0,02 till l pfu/cell, varvid en infek- tionsperiod av minst l timme föredras. Då det virus som ej fäst av- lägsnats tillsättes ett underhållsmedium, som lämpligen utgöres av Basal Medium Eagle (BME) i Earle's saltlösning, vartill sättes lämp- liga'mängder antibiotika (t.ex. 100 IU penicillin och 100 pg strep-_ tomycin) och 0,2-0,5 % albumin. Man måste tillse att underhållsme- diets pH.hålles vid 8,0 till 8,2. De virusinfekterade cellerna inku-« beras vid 32-3900 i 3-lO dygn och mediet fryses därefter vid -7000 eller lägre så att cellerna sönderdelas och viruset frigöres (en ök- ning av títern). Celler och celldelar avlägsnas genom filtrering el- ler centrifugering under sterila betingelser. Filtratet eller den överstående vätskan förvaras vid -70°C och prov tas för titrering enligt den plaque-metod in vitro som hänvisas till ovan. Andra me- toder kan också användas för att sönderdela cellerna_efter inkube- ringen, till exempel kan cellsuspensionen utsättas för vibrering med ultraljud. A Enligt en altenæniv specifik framställningsmetod odlas BHK-21 138 celler i suspension, till exempel i en centrifugkolv med häng- , 50 H0 v evsoovzn-lz» «stång, under användning av BHK-21 medium för centrifugeringsodling vartill sättas små mängder tryptosfosfatbuljong (7fl5-%),,inaktive-_ rat kaivserum (7-15 z) och antibiotika (sex. 100 :U peniciilinkoch 100 ng streptomycin). Cellerna odlas tills en mängd av'2 x 106 cel- 'ler/ml uppnås, varvid cellerna omröres tillräckligt för att hållas i suspension och ej klumpa samman.

Efter nedcentrifugering av cellerna med hjälp av en centri- fug sker infektering med rabíes~ympvirusstam 675 med en infektione- multiplioitet mellan 0,01 och l-pfu/cell i 30~60 minuter under kons- tant omröring. V . H _ .Efter-infekteringen suspenderas cellerna ånyo i centrifugkol- ven och underhållsmedium som utgöres av BHK-21 centrifugkulturmedíum 'vartill satts små mängder serumalbumínfraktion V från nötkreatur, till exempel 0,1-0,U viktprocent, och antibiotika (t.ek. kanamycin eller neomycin i en mängd av t.ex} 50-300 pg), varvid pH inställes mellan 7,5 och 8,0. Under infekteringen hålles temperaturen vid 32~35°C, lämpligen vid 5300, och varje dag avlägsnas ett litet prov ur centrifugkolven för undersökning med hjälp av immunofluorescens- teknik. Mellan 2-3 dagar efter infekteringen uppvisar 80 till l00'% av cellerna i dessa prov en specifik immunofluorescens för rahies- inklusionskroppar i cytoplasman, motsvarande en titer.av 108 till lO9 pfu/ml vid skörd N46 dygn efter infekteringen. Vid skördningen avlägsnas vätskan från kolven och förvaras frusen vid -7000. 0 ' Ett litet prov titreras efter det att celler och celldelar avlägsnats genom plaque-titreringsmetoden} Om en godtagbar titer erhölls (mellan l07'5 och l08'5_pfu/ml eller högre) avlägsnas cel- ler och celldelar från skörden genom filtrering eller centrifugering under sterila betingelser.' ' I Efter tillsats av en lämplig stabilisator är vätskan färdig för till exempel fördelning i flaskor för lyofilisering av slutpro~ dukten. l ' V Det bör märkas att även avdödade (inaktiverade) rabies-vacci~ ner, lämpligen för humant bruk,-också omfattas av uppfinningen.

Dessa avdödade rabies~vaocin kan framställas genom inaktive- ring av viruset i de framställda odlingsvätskorna enligt kända för- faranden eller modifieringar därav, till exempel genom tillsats av -propiolakton, formalin eller acetyletylenimin, eller genom ultra- violett bestrålning, A Det bör märkas att rabies-vaccin, som härrör från virusstam~ men enligt föreliggande uppfinning kan innehålla en eller flera H0 78007814 i 8 i lämpliga stabilisatorer, konserveringsmedel, buffrande salter och, hjälpmedel, _ ' I _ n _ Med uttrycket intestinal administration som användes i beskriv- ning och krav avses administration av vaccin i en form som frigör, viruset enligt föreliggande uppfinning i_tarmarna, _ I .

Uppfinningen åskådliggöres närmare genom följande exempel.Ä ëšempel-l. Monoskíkt av primära eller sekundära SPF-kycklingembryo- fíbroblaster som odlats i stationära eller rullande flaskor infekte- . ras med rabies~ympvirusstammen 675 med en infektionsmultiplicitet (m.o.i.) av 0,02 till l pfu/cell. Lägre virusmängder kan också an- 'vändas men inkubationsperioden förlängas då. En infektionsperiod av minst 1 timme erfordras för att ympvirnset skall fästa till cellerna.

Därefter avlägsnas återstående virus som ej fäst och underhållsme- 0 dium tillsättes, bestående av Basal Medium Eagle (BME) i Earle's saltlösning vartill satts lämpliga mängder antibiotika och 0,2 % albumin av den relevanta art vartill vaccinet skall användas, vare vid noggrant tillses att denslutliga blandningen av underhållsmediet har ett pH av 8,2. " V _ V Inkubering vid 35 till BSQC i H till 8 dygn av de virnsinfek- terade cellerna medför en utpräglad CPÉ (cytopatisk effekt) och me- diet fryses därefter vid -7000. Celler och celldelar avlägsnas där- efter, efter upptining av produkten genom centrifugering vid l000 g eller genom filtrering genom ett membranfilter (porstorlek 5 pm) under sterila betingelser. Vätskan, antingen överstående vätska el- ler filtret, förvaras vid ~70°C och prov tas för titrering enligt den plaque-metod in vitro som angivits ovan (Bijlinga och Joubert). _ Godtagbara titrar för vaccinsatser som skall användas för ef- fektiv vaccinering efter exponering är 108 pfu/ml. För vaccinering före exponering kan en minsta titer upp till l07 pfu/ml fortfarande ~ godtas. ' 4 Framställningen av vaccinsatser som beskrivits ovan kontrolle- ras genom brukliga test av styrkan (NIH och Habel-test) och de sat- ser som skall användas för behandling efter exponering utsättas för ytterligare en ny test av styrkan, enligt Bijlenga, G., Symposium on Advances in Rabies Research, Atlanta, Georgia, USA, 7-9 september 1967, sid. 14. Vid detta nya test av styrkan administreras lokalt naturligt förekommande virus intramuskulärt (í.m.) till U veckor gamla möss, varefter 0,5 ml vaccin ympas intraperitonealt en gång inom 2N timmar. Samtliga vaccinerade möss bör överleva, under det att cirka 50 % av kontrolldjuren bör dö före slutet av undersöknings~' BO H0 9 7soo7s1-“2ui -v perioden på 5 veckor. Vidare utföres också brukliga sterilitetskon- troller med avseende på eventuell bakteriell eller viruskontamine- ring av vaccinsatserna, samt förfaranden för kontroll av primära el- ler sekundära celler och cellinjer som användes för framställning av vaccinerna enligt internationellt fastställda minimikrav..

Exemgel 2¿ fugkolv med hängstâng under användning av BHK-21 medium för centri-_ BHK-21 135 celler odlas i suspension i en Bellco centri~ fugkultur vartill satts 10 % tryptosfosfatbuljong och 10 % inakti- verat kalvserum i närvaro av antibiotika (l00 IU penicillin och lQ0\' ng streptomycin). Cellerna odlas tills en mängd av 2 x 106 celler/ml 'uppnås; under det att cellerna omröres tillräckligt för att hållas suspenderade och för undvikande av hopklumpning._“ A _ Efter nedcentrifugering av cellerna vid 800 varv/min i en cen- trifug infekteras med rabies-ympvirusstam 675 med en infektionsmul- itiplícítet mellan 0,01 och l pfu/cell under H5 minuter under kons- tant omröring. Efter infekteringen suspenderas cellerna ånyo i cen- trifugkolven och underhållsmedium som utgöres av BHK-21 centrifug- kulturmedium vartill satts 0,2 % serumalbuminfraktion V från nötkrea- tur tillsammans med lämpliga mängder godtagbara antibiotika (dvs kanamycin eller necmycin), varvid pH inställes nå 7,8.Under infekte- ringen hålles temperaturen vid 5300 ochxarje dag uttages ett litet prov ur centrifugkolven som undersökas med hjälp av immunofluores- censteknik¿ Mellan två ochtre dagar efter infekteringen bör 80 till l0O %Aav cellerna i dessa prov uppvisa en specifik immunofluorescens för rabies-inklusionskroppar i cytcplasman, vilket i sin tur garan- terar en lämplig titer av 10 till 109 pfu/ml vid skörd U till 6 dygn efter infekteringen. Vid skörden avlägsnas vätskan ur kolven och förvaras frusen vid -7000. Ett litet prov av skörden hålles åt- skilt för titrering efter det att celler och celldelar avlägsnats enligt plaque-titreríngsmetoden. Om titern är godtagbar (mellan 107,5 och l08'5 pfu/ml.eller högre) avlägsnas cellerna och cellde- larna från skörden såsom angivits ovan och vätskan är efter tillsats av lämplig stabilisator klar att fördela i flaskor för lyofilisering av slutprodukten. ' ' En alternativ metod, för att erhålla ändå högre titrar, kan användas genom infektering av antingen stationära fullständiga mono- skikt eller sådana monoskikt i rullande flaskkulturer. Mellan tvål och 8 timmar efter infekteringen trypsiniseras cellerna och placeras i suspensionskultur såsom beskrivits ovan. Man bör tillse att någon sammanklumpning av cellerna ej sker. På detta sätt kan mer än 7800781-2 100 2 x_106 celler/ml utnyttjas vilket ger högre titrar i skörden, bero- ende på antalet infekterade celler som överföres till suspensions- kultnr, _ ' , ' 0 Éxemoel St För att-åskådliggöra användningen och värdet av de le- vande och inaktiverade rabies-vaccínen enligt föreliggande uppfin- ning anges några resultat av försök_med vaccinering före och efter exponering nedan: I _ ' _ A. Oral vaccinering av rävar_med levande rabies-vaccin stam 675 (2 ml/räv),_varvid vaccinets titer är 2 x 108_pfu/ml I .Rävens Ålder 'iden~ vid _ serumticer i IU* Prövningxx tifief vacci- _ ¿ ' 1 rings~ nering .' _ . ' HP (75-08-ll) (75~09-ll)(75*l0*07)(75~ll-21)'(75*l2°23) Oralt su 5 mån_ -u;o 7,0- - 8,2 ; Skyddad vacci~ ' _ ' A ' ' nerade_ 86 6 mån. 1,3 1;6 v1,u' 'skyadad_ qjur 88 6 mån. 2,0 ' 2,u V _5,2A skyddad .

Kontrol- V . '_ Å ler 85 6 mån. _ - _ r Död efter * - vi 15 d (Icke 85 6 mån. ' _' Död efter vacci- . , l7Ad nerade - U V ' -' U« . 92 6 man. A ^ , Doo efter dgur) _ 6 18 d x En I.U. (Internationell Enhet) = en serumspädning av 1/300, som ger en slutavläeníng med 50 Z plaque~reduktion. xx En mycket hög dos av detta testvirus (från spottkörtlarna hos naturligt infekterad räv); nämligen 1 591 610 MLD för att testa skyddsvärdet hos vaocinet; 50, användes _ ' Detta försök visar effektiviteten av oral vaccinering av unga rävar. Immunitetssvaret hos rävarna visar en serumomvandling och goda títrar. Mer än fem månader efter vaccineringen har de tre rävar~ na fullt skydd och samtliga tre kontrollrävar dog inom mycket korta inkuberingsperíoder, vilket beror på den mycket höga dosen testvírus som inympats intramuskulärt i högra bakbenet. En vanlig testdos an- vänd på rävar är 5000 MLDBO. 11 5 57800781-2 B. Serologiska resultat effier vaccinering med inaktivevrad stam 675 ' Djurart' Djurets . Vaccíndos Serumtíter H veçkor efter' = vikt "vaccinering ' (kg) ' ' ' _ Hund l 6,5 , 2 ml i.m. 6,8 2 8 2_ml i.m. 6,3 B l2 2 ml i.m. -5,5 u 10- 52 m1 i.m.à 12,5 '_15 2 ml i.m. 5,9 _ s" .ln 2 m1 1.111. 14,5 7 el] 2 ml i.m. 3;8' 8 17 2 ml i.m. 20,5 1:0 1 zoo 5' m1 s.c.' _u-,5 2 1400 5 m1 s.c. _ 8,5, “3 3oo_ 55 m1 s.c. 151,5 U 500 5'ml s.c. 4;8_ UQO 5 ml s.c. _ 7,6 V 6 600 5 ml s,c.» 8,9 7 500 5 m1's.c« 3,8 ' 8 H00 5 ml s.c. H,7> 'En enda vaccininjektion~adminístrefades och de angivna títrar- na är utt3yckta i I.U. som i föregående tabell. Å Fyra veckor efter vaccíneringen uppvisade de åtta hundarna och åtta nötbeskapen samtliga en serumomvandlíng med mycket höga titrar.

Den minsta titer som effordras för serumomvandlíng fastställes i den europeiska farmakopên till 0,2 I.U./ml.“ 5 ' U'1 73007314 12 C, Skydd av iaboratoriemöss efter infektering med vilda levande virus (från räv) Typ av Intervall mellan infektion och vaccination vaccin >} »= - V I ä 1 n 1 a 12 d 3 a Yu d ís d (6 d I j_d “§ d y§”å åLevande - A ~ ïvaccín §675 X É i Oufiâpäft ' 1 0/IOXX 1/10 1/10 1/io 2/io o/10 o/10 Q/10 5/10 V3/ao V A gl H _ à É 10'1 1/lo É 1o"2 51/10 É 1075 6/lo . ~u 8/10 é Kontroller 6/10 8/10 7/10 7/10 7/10 7/10 6/lo 6/lo 6/lo a/10. f Inaktiverat ; vaccin ? 675 x 4 oucspatt 0/10 l/lo 5/10 * 1/10 1o"2 6/10 "3 7 8/10 "" 6/lo _ 0 . _ 1 x Vaccínets titer4l08'2 pfu/ml (för inaktiverat vaocin bestäm- des titern före-inaktivering) xx Antal döda/antal ympade möss 7, xxx Två vaccineringar (på dag 9 och ll) _ Samtliga möss som anges i denna tabell ympades íntramuskulärt med ett rabies~virus från spottkörteln hos räv (0,1 ml lösning) som dödade 60-80 % av kontrollerna vid en inkubationsperiod av 9 till ll dagar.

Den levande och den inaktiverade vacçinstammen 575 administre- rades i en enda dos (0,5 ml) intraperítonealt under olika perioder w_ 13 7800781-2 efte? den förste infektionen som anges i tabellen.~ Det levande, outspädda vaccinet gav skydd fortfarande 6Ä' dagar efter infektionen vilket aldrig tidigare har kunnat iakt- tas med något annat i handeln tillgängligt vaccin. Detta skydd visar att möss kan botas också då rabies~viruset nått det centrala nervsystemet. Med två vaccineringar med en dags mellan- rum och med början nio dagar efter ínfekteringen erhöll vissa möss fortfarande_skydd. 9 ' dDetta levande vaccin kan även spädas upp till tio gånger och A ge skydd, dock ej längre än 24 timmar efter infekteringen.

Det ínaktiverade vaccinet gav endast skydd då det tillfördes inom 24 timmar efter infektionen och kunde också spädas högst tio gånger.

Claims (1)

1. 78ÛÜ781~2 74' gatentkrav Sätt att isolera en ny stam av fabiesvirus genom odling 'av HEP Flury virus i primära eller sekundära kycklingembryofibro- blaster (SPE)~el1er i rabieskänsligaycellinjer och diploida cellstammar, k ä n n e t e c k n a t därav, att den nya vi- russtammen nr 675, deponerad i den tjeckoslovakiska nationella samlingen av typkulturer i Institutet för Hygien och Epidemio- logi i Prag unaer depositionsnumret CNCTC AO 4/77, eller mutan~ tef och varianter därav som uppvisar den reproducerbart signif fikanta cytopatiska effekten och övriga specifika kännetecken för stammen nr 675, utvínnes genom isolering av en plaque som skiljer sig från den som utgångsmaterial använda víruspopula- tionen med avseende nå sin cytopatiska effekt på de infekterade cellerna genom användning av en plaquefanalysmetod och en p1aque~ce11suspensionsmetod som båda i och för sig är kända, åtföljd av klonrening av den erhållna plaquen.