SE443924B - Sett att framstella ett rabiesvaccin - Google Patents

Description

10 TS Ä0 8201768-2 2 (t.ex. LEP (lågt antal äggpassager) Flury eller HEP (högt antal ägg- passager) Flury-vaccin, som erhållits såsom beskrives nedan).

Den 29 januari 1939 dog en flicka med namnet Flury i staten Georgia i USA, varvid rabies diagnostiseradesam1dödsorsak, efter in- fektering av en rabiessmittat hund. Rabies-virus isoleradesfrån hjärnan, tårkörteln och spottkörteln hos flickan genom intracere- bral inympning i vita möss, såsom beskrives av Leach C.N. och Johnson H.N., Amer. J. Trop. Med. 1930, 20, 335. gñjärnmaterialet från mössen inympades intracerebralt i en dag gamla kycklingar och därefter utfördes 136 intracerebrala passager i kycklingar, enligt Koprowski H. och Cox H.R., J. Immunol. l9U8, 60: 533. Efter ytterligare två intracerebrala passager i kycklingar anpassades rabies-viruset till kycklingembryon genom inympning i gulsäcken. Efter 60 gulsäck-passager syntes viruset vara i det när- maste icke patogent för ett antal däggdjur och finns i denna serie- passagenivâ tillgängligt som rabiesvaccin för hundar under beteck- ningen LEP Flury vaccin. Efter ytterligare seriepassager i kyckling- embryon (upp till 170-174 passager) syntes viruset ha förlorat yt- terligare i patogenicitet så att två veckor gamla laboratoriemöss ej dog efter en intracerebral administration även om diande möss fortfarande dog. Detta vaccin finns tillgängligt under beteckningen HEP Flury vaccin (Flury-vaccin med ett högt antal äggpassager). Även om dessa LEP och HEP vacciner på ett effektivt sätt för- hindrat rabies-infektion då de används som vaccin före exponeringen, finns det behov av andra rabies-vaccin, såsom framgår av nyligen gjorda kontrollmätningar på nationell och internationell nivå.

Exempelvis utgör kontrollen av sylvatisk rabies i utvecklingsländer- na, där denna sjukdom varit endemisk under lång tid eller där den införts på senare tid, en av de svåra och ekologiskt komplicerade situationer som finns och för vilken det ej finns någon effektiv och ekonomisk kontrollmetod.

Likaså har vaccinbehandling av människor efter exponering or- sakat många problem i rabies-infekterade länder över hela världen.

Av dessa skäl har forskningen kring rabies inriktats på problemen vid vaccinering före och efter exponering och immunisering på icke- -parenteral, lämpligen oral våg.

Som resultat av forskning och försök har en ny vaccinstam ut- vecklats, som kan administreras på olika vägar, dvs som kan administ- reras parenteralt eller icke~parenteralt, och som synes ge ett fullt skydd då den administreras före eller efter en rabies-infektion. 3 8201768-2 Möjligheten att uppnå en effektiv oral administration med syf- tet att kunna åstadkomma en "oral vaccinering" av vifia djur, som är de mest betydelsefulla vektorerna och/eller källorna till rabies, utgör en fördel med föreliggande uppfinning.

Den levande vaccinstammen 675 är den mest apatogena förekom- mande rabies-vaccinstammen som hittills är känd. Den ger möjlighet till skydd efter exponering för naturligt virus (street virus), ock- så vid användning av en enda lämplig vaccindos. Det inaktiverade vaccin som framställts av denna stam 675 ger också skydd efter expo- nering, men i lägre grad. Det levande vaccinet har en mycket hög antigenicitetsgrad, som nästan är densamma som för den inaktiverade typen av vaccinet. De levande och inaktiverade vaccinen är vaccin av cellkulturtyp som är nästan fria från främmande proteiner, vilket avsevärt, även om ej fullständigt, minskar förekomsten av icke önsk- värda bireaktioner.

Den nya virusstammen isolerades på följande sätt: HEP Flury vaccinviruset fortplantades i primära eller sekun- dära SPF kycklingembryofibroblaster och identifierades också som rabies-virus med hjälp av specifik immunofluorescens av de infekte- rade fibroblasten, genom ett musskyddstest genom intraperitoneal vaccinering följd av administration av ett standarderisat rabies- -testvirus (rabies challenge virus, CVS) och genom seroneutralise- ringstest in vitro med känt positivt serum (International Babies Reference Serum).

För fortplantning av det som utgångsmaterial använda HEP Flury vaccinet kan naturligtvis användas också andra rabies-känsliga cell- linjer och diploida cellstammar än SPF kycklingembryofibroblaster.

Genom användning av den plaque-analysmetod i kycklingembryo- fibroblaster (SPF) som beskrivits av Yoshina, K. et al, Arch. ges.

Virusforsch., 1966, lB:370 och den plaque-cellsuspensionsmetod som beskrivits av Bijlenga, G. och Joubert, L., Bull. Soc. Sci. Vét. et Mêd. Comparëe, Lyon, l97ü, 76:429, var det möjligt att isolera en pmqug som k1arg skilfie gig ifrån den som utgångsmaterial använda vi- ruspopulationen vad gäller den cytopatiska effekten på infekterade celler. Denna plaque klonades tre gånger för framställning av en homogen och ren viruspopulation.

Den ursprungligen isolerade plaquen tilldelades talet 675 och stammen efter rening betecknades rabies-vaccin stam nr 675. Ett prov av denna stam deponerades i den tjeckoslovakiska nationella samlingen av typ-kulturer vid institutet för hygien och epidemio- 8201768-2 Ä 2G H0 logi i Prag den 13 januari 1977 och finns där under beteckningen CNCTC nummer AO Ä/77.

Denna stam skiljer sig från det ursprungliga HEP Flury viru- set genom följande egenskaper: a) en mycket utpräglad cytopatisk effekt på cellkulturer in vitro, en effekt som ej åstadkommes av HEP Flury virus; b) förkortad primär viruscykel, varierande mellan 9 och ll timmar, vilket orsakar att plaque uppträder tidigare; c) mycket klara plaques, som har i genomsnitt en något större (l mm större) diameter än plaque av HEP virus; d) ökad fästförmåga till cellytan in vitro, vilket är väsent- ligt för ett lämpligt oralt vaccin; ' e) snabbare produktion av interferon in vivo efter vaccine- ring på grund av ovan angivna egenskaper. Detta är av betydelse för vaccinering efter exponering; f) högre titrar erhålles i cellkulturer; g) genom klonförening erhålles homogena viruspopulationer, vilket medför en minskad risk för eventuell återgång av virusstam- men till ursprunglig virulens, som därför i praktiken kan uteslutas; h) det är den mest apatogena rabies-stam som hittills finns tillgänglig.

De egenskaper som anges under a) - h) visar en klar distink- tion från det ursprungliga HEP Flury viruset.

Föreliggande uppfinning omfattar även artificiella mutantstam- mar som härletts från virusstammen nr 675 och som har de egenskaper hos stammen nr 675 som beskrivits ovan.

Genom ovan angivna egenskaper, speciellt g) underlättas fram- ställningen av vaccinsatser av konstant kvalitet, dvs vaccin med förbättrad likformighet kan framställas enligt uppfinningen av virus- stammen nr 675.

De vaccin som omfattas av uppfinningen har följande fördelar: (1) I likhet med det ursprungliga HEP Flury vaccinet förökas det levande vaccinet enligt uppfinningen ej efter administration och något återstående virus kan ej påvisas; (2) vaccinen orsakar en mycket snabb interferonproduktion och dessutom andra, icke kända interfererande egenskaper, till exempel cellförmedlad immunitet. En enda administrering av vaccin efter ex- perimentell infektering med ett naturligt förekommande virus kan ge fullt skydd. På grund av den mycket snabba produktionen av interfe- ron och cellförmedlad immunitet är det nu möjligt att använda vaccinen .25 Ä0 'G1 8201768-2 enligt föreliggande uppfinning för att skydda nyligen exponerade djur under rabies-utbrott. Speciellt har möjligheten att vaccinbe- handla människor efter exponering förbättrats avsevärt då vaccinen visat sig vara högeffektiva på djur efter exponering för infektion och även kan bota djur i ett mycket framskridet infektionstillstånd. (3) Icke-parenteral administration, till exempel oralt, av 'levande virusvaccin underlättar användningen därav i organiserade vaccinationskampanjer.

Det levande virusvaccin som framställts av stam 675 har föl- jande eventuella fördelar för vaccinering före exponering: A) På djur: l. Immunisering av rävar och andra epidemiologiskt 'viktiga vilda djur med hjälp av rabies-vaccinhaltiga beten.

P 2. Oral vaccinering av husdjur, till exempel kringdrivande hundar, i sådana länder där en avlivning av dessa ej är möjlig av religiösa och/eller juridiska skäl. 3. Administration av levande virusvaccin i stor skala med hjälp av beten, så att vaccineringskampanjer kan förenklas avsevärt.

Exempelvis fördelning av eventuellt djupfrysta köttbullar som inne- håller virusvaccinet med hjälp av flygplan. 4. Effektivt skydd av husdjuren efter exponering, för an- vändning i länder där sådana vaccinationsförfaranden är tillåtna och i länder där djuren kan omhändertas efter exponering under för- utsättning att de redan blivit immuniserade.

§) På människor: l. Fruktan för en oral vaccinering är försumbar. Fruktan för en ympning är en mycket betydelsefull faktor i flera länder och orsakar en minskning av antalet patienter som kommer tillbaka för det erforderliga antalet ympningar. 2. Administration per os orsakar ej lokala reaktioner eller irritationer, vilket är en verklig olägenhet med nuvarande i handeln tillgängliga, tidigare kända vacciner. 3. Lätt administration i stor skala och med hjälp av icke medicinskt utbildad personal blir möjlig (jämför oral poliomyelit- vaccinering).

I detta sammanhang måste det faktum att en enda administrering av vaccinet visat sig vara tillräcklig anses vara betydelsefullt.

De nya vaccinen framställes enligt brukliga förfaranden, dvs i cellkulturer in vitro, under användning av vanliga och föreskrivna kontroller för att eliminera kontaminering med bakterier och/eller Ä0 8201768-2 6 virus, enligt väl kända principer och internationella standardkrav.

De nya vaccinerna enligt föreliggande uppfinning framställes lämpligen genom odling av rabies-viruset i monoskikt av primära el- ler sekundära kycklingembryofibroblaster härledda från SPF 10 dagar gamla kycklingembryon. Andra cellsystem som är tillräckligt mottag- liga för rabies-infektion kan emellertid också användas, såsom andra celler som härrör från fåglar eller däggdjur, till exempel Baby Hamster Kidney 21 (21 passager) för monoskiktodling eller BHK-21 13 S (13 passager av suspensionsodling) för suspenderad odling, men i detta fall endast för djurvaccin. Det suspenderade cellkultursyste- met har den stora fördelen att möjliggöra produktion av virusvaccin i fermentatorer av stor kapacitet vilket underlättar produktionen.

' Vaccinen kan också framställas i celler odlade på mikrobärare (kulcellkultursystem). Exempelvis kan polydextrankulor, behandlade med makromolekulära anjoner före och/eller under cellväxten användas som har en lämplig positiv laddningsdensitet för celltillväxt på ytan. På detta sätt kan en omrörd suspension av celler och kulor i ett flytande medium ympas med önskat virus och då viruset fortplan- tats sänkes kulorna till botten av reaktorn och separeras från vi- russuspensionen.

Vid en specifik metod för framställning av vaccin infekteras kycklingembryofibroblaster med rabies-ympvirusstammen nr 675 med en infektionsmultíplicitet av 0,02 till l pfu/cell, varvid en infek- tionsperiod av minst l timme föredras. Då det virus som ej fäst av- lägsnats tillsättes ett underhållsmedium, som lämpligen utgöres av Basal Medium Eagle (BM) i Earle's saltlösning, vartill sättes lämp- liga'mängder antibiotika (t.ex. 100 IU penicillin och 100 pg strep- tomycín) och 0,2-0,5 Z albumin. Man måste tillse att underhållsme- diets pH hâlles vid 8,0 till 8,2. De virusinfekterade cellerna inku- beras vid 32-39°C i 3-10 dygn och mediet fryses därefter vid -70°C eller lägre så att cellerna sönderdelas och viruset frigöres (en ök- ning av titern). Celler och celldelar avlägsnas genom filtrering el- ler centrifugering under sterila betingelser. Filtratet eller den överstâende vätskan förvaras vid -70°C och prov tas för titrering enligt den plaque-metod in vitro som hänvisas till ovan. Andra me-'I toder kan också användas för att sönderdela cellerna efter inkube- ringen, till exempel kan cellsuspensionen utsättas för vibrering med ultraljud. g Enligt en altermniv specifik framställningsmetod odlas BHK-21 133 celler i suspension, till exempel i en centrifugkolv med häng- Ä0 1 0 8201768-2 stång, under användning av BHK-21 medium för centrifugeringsodling vartill sättes små mängder tryptosfosfatbuljong (7-15 1), inaktive- rat kalvserum (7-15 1) och antibiotika (t.ex. 100 IU penicillin och 100 ng streptomycin). Cellerna odlas tills en mängd av 2 x 106 cel- ler/ml uppnås, varvid cellerna omröres tillräckligt för att hållas i suspension och ej klumpa samman.

Efter nedcentrifugering av cellerna med hjälp av en centri- fug sker infektering med rabies-ympvirusstam 675 med en infektions- multiplicitet mellan 0,01 och l pfu/cell i 30-60 minuter under kons- tant'omröring.

Efter infekteringen suspenderas cellerna ånyo i centrifugkol- ven och underhållsmedium som utgöres av BHK-21 centrifugkulturmedium vartill satts små mängder serumalbuminfraktion V från nötkreatur, till exempel 0,1-0,4 viktprocent, och antibiotika (t.ex. kanamyqin eller neomycin i en mängd av t.ex. 50-300 pg), varvid pH inställes mellan 7,5 och 8,0. Under infekteringen hâlles temperaturen vid 32-35°C, lämpligen vid 33°C, och varje dag avlägsnas ett litet prov ur centrifugkolven för undersökning med hjälp av immunofluorescens- teknik. Mellan 2-3 dagar efter infekteringen uppvisar 80 till 100 Z av cellerna i dessa prov en specifik immunofluorescens för rabies- inklusionskroppar i cytoplasman, motsvarande en titer av 108 till 109 pfu/ml vid skörd U-6 dygn efter infekteringen. Vid skördningen avlägsnas vätskan från kolven och förvaras frusen vid -70°C.

' Ett litet prov titreras efter det att celler och celldelar avlägsnats genom plaque-titreringsmetoden. Om en godtagbar titer erhölls (mellan 1o7*5 een 1o8=5 pfu/ml eller högre) eviägenee ee1- ler och celldelar från skörden genom filtrering eller centrifugering under sterila betingelser.

Efter tillsats av en lämplig stabilisator är vätskan färdig för till exempel fördelning i flaskor för lyofilisering av slutpro- dukten.

Det bör märkas att även avdödade (inaktiverade) rabies-vacci- ner, lämpligen för humant bruk, också omfattas av uppfinningen.

Dessa avdödade rabies-vaccin kan framställas genom inaktive- ring av viruset i de framställda odlingsvätskorna enligt kända för- faranden eller modifieringar därav, till exempelvgenom tillsats av ß-prdpiolakton, formalin eller acetyletylenimin, eller genom ultra- violett bestrålning.

Det bör märkas att rabies-vaccin, som härrör från virusstam- men enligt föreliggande uppfinning kan innehålla en eller flera H0 8201768-2 8 lämpliga stabílisatorer, konserveringsmedel, buffrande salter och hjälpmedel.

Med uttrycket intestinal administration som användes i beskriv- ning och krav avses administration av vaccin i en form som frigör viruset enligt föreliggande uppfinning i tarmarna.

Uppfinningen äskådliggöres närmare genom följande exempel.

Monoskikt av primära eller sekundära SPF-kycklingembryo- fibroblaster som odlats 1 stationära eller rullande flaskor infekte- ras med rabies-ympvirusstammen 675 med en infektionsmultiplicitet Exempel l. '(m.o.i.) av 0,02 till l pfu/cell. Lägre virusmängder kan också an- vändas men inkubationsperioden förlänges då. En infektionsperiod av minst 1 timme erfordras för att ympviruset skall fästa till cellerna.

Därefter avlägsnas återstående virus som ej fäst och underhållsme- dium tillsättes, bestående av Basal Medium Eagle (BME) i Earle's saltlösning vartill satts lämpliga mängder antibiotika och 0,2 Z albumin av den relevanta art vartill vaccinet skall användas, var- vid noggrant tillses att denslutliga blandningen av underhållsmediet har ett pH av 8,2.

Inkubering vid 33 till 35°c 1 H till 8 dygn av de virusinfex- terade cellerna medför en utpräglad CPE (cytopatisk effekt) och me- diet fryses därefter vid -70°C. Celler och celldelar avlägsnas där- efter, efter upptining av produkten genom centrifugering vid 1000 g eller genom filtrering genom ett membranfilter (porstorlek 5 pm) under sterila betingelser. vätskan, antingen överstående vätska el- ler filtrat, förvaras vid -70°C och prov tas för titrering enligt den plaque-metod in vitro som angivits ovan (Bijlinga och Joubert).

Godtagbara titrar för vacoinsatser som skall användas för ef- fektiv vaccinering efter exponering är 108 pfu/ml. För vaccinering före exponering kan en minsta titer upp till 107 pfu/ml fortfarande godtas. i Framställningen av vaccinsatser som beskrivits ovan kontrolle- ras genom brukliga test av styrkan (NIH och Habel-test) och de sat- ser som skall användas för behandling efter exponering utsättes för ytterligare en ny test av styrkan, enligt Bijlenga, G., Symposium on Advances in Babies Research, Atlanta, Georgia, USA, 7-9 september 1967, sid. 14. Vid detta nya test av styrkan administreras lokalt naturligt förekommande virus intramuskulärt (i.m.) till 4 veckor gamla möss, varefter 0,5 ml vaccin ympas intraperitonealt en gång inom 24 timmar. Samtliga vaccinerade möss bör överleva, under det att cirka 50 % av kontrolldjuren bör dö före slutet av undersöknings-.J E H0 7 8201768-2 perioden på 3 veckor. Vidare utföres också brukliga sterilitetskon- troller med avseende på eventuell bakteriell eller viruskontamine- ring av vaccinsatserna, samt förfaranden för kontroll av primära el- ler sekundära celler och cellinjer som användes för framställning av vaccinerna enligt internationellt fastställda minimikrav.

Exempel 2. fugkolv med hängstång under användning av BHK-21 medium för centri- fugkultur vartill satts 10 1 tryptosfosfatbuljong och 10 1 inakti- verat kalvserum i närvaro av antibiotika (100 IU penicillin och 100 pg streptomycin). Cellerna odlas tills en mängd av 2 x 10 celler/ml uppnås, under det att cellerna omröres tillräckligt för att hållas suspenderade och för undvikande av hopklumpning.

Efter nedcentrifugering av cellerna vid 800 varv/min i en cen- trifug infekteras med rabies-ympvirusstam 675 med en infektionsmul- tiplicitet mellan 0,01 och l pfü/cell under H5 minuter under kons- tant omröring. Efter infekteringen suspenderas cellerna ånyo i cen- BHK-2l l3S celler odlas i suspension i en Belloo centri- trifugkolven och underhållsmedium som utgöres av BHK-21 centrifug- kulturmedium vartill satts 0,2 5 serumalbuminfraktion V från nötkrea- tur tillsammans med lämpliga mängder godtagbara antibiotika (dvs kanamycin eller neomycin), varvid pH inställes på 7,8.Under infekte- ringën hålles temperaturen vid 33°C ochwarje dag uttages ett litet prov ur centrifugkolven som undersökes med hjälp av immunofluores- censteknik. Mellan två ochtre dagar efter infekteringen bör 80 till 100 X av cellerna i dessa prov uppvisa en specifik immunofluorescens för rabies-inklusionskroppar i cytoplasman, vilket i sin tur garan- terar en lämplig titer av 10 till 109 pfu/ml vid skörd Ä till 6 dygn efter infekteringen. Vid skörden avlägsnas vätskan ur kolven och förvaras frusen vid -70°C. Ett litet prov av skörden hâlles åt- skilt för titrering efter det att celler och celldelar avlägsnats enligt plaque-titreringsmetoden. Om titern är godtagbar (mellan l07°5 och 10 'S pfu/ml eller högre) avlägsnas cellerna och cellde- larna från skörden såsom angivits ovan och vätskan är efter tillsats av lämplig stabilisator klar att fördela i flaskor för lyofilisering av slutprodukten.

” En alternativ metod, för att erhålla ändå högre titrar, kan användas genom infektering av antingen stationära fullständiga mono- skikt eller sådana monoskíkt i rullande flaskkulturer. Mellan två och 8 timmar efter infekteringen trypsiniseras cellerna och placeras i suspensionskultur såsom beskrivits ovan. Man bör tillse att någon sammanklumpning av cellerna ej sker. På detta sätt kan mer än 8201768-2 /0 e x lu celler/ml utnyttgas vilket ger högre titrar i skörden, bero- ende på antalet infekterade celler som överföres till suspensions- kultur.

Exemgel 3. För att åskådliggöra användningen och värdet av de le- vande och inaktiverade rabies-vaccinen enligt föreliggande uppfin- ning anges några resultat av försök med vaccinering före och efter exponering nedan: A. Oral vaccinering av rävar med levande rabies-vaccin stam 675 (2 ml/räv), varvid vaccínets titer är 2 x 108 pfu/ml Éâeâïs âiâer Serumtiter i IUX Prövningxx tifie- vacci- rings- nering (75-08-11) (75-09-11)(75-1o-o7)(75-ll-21) (75-12-23) EI' Oralt 84 5 mån. fl,o 7,0 8,2 skyddad vacci: nerade 86 6 mån. 1,3 1,6 1,4 Skyddad djur 88 6 mån. 2,0 2,Ä 3,2 Skyddad Kontrol- _ ler 83 6 mån. Död efter d (Icke 85 6 mån. Död efter vacci- 17 d nerade djur) 92 6 mån. ïâddefter x En I.U. (Internationell Enhet) = en serumspädníng av l/300, som ger en slutavläsning med 50 Z plaque-reduktion.

En mycket hög dos av detta testvirus (från spottkörtlarna hos naturligt infekterad räv), nämligen l 391 610 MLDSQ, användes för att testa skyddsvärdet hos vaccinet.

XX ' Detta försök visar effektiviteten av oral vaccinering av unga rävar. Immunitetssvaret hos rävarna visar en serumomvandling och goda titrar. Mer än fem månader efter vaccineringen har de tre rävar- na fullt skydd och samtliga tre kontrollrävar dog inom mycket korta inkuberingsperioder, vilket beror på den mycket höga dosen testvirus som inympats intramuskulärt i högra bakbenet. En vanlig testdos an- vänd på rävar är 3000 MLDSO.

H 8201768-2 B. Serologiska resultat efter vaccinering med inaktiverad stam 675 Djurart Djurets Vaccindos Serumtíter U veckor efter vikt vaccinering (kg) e Hund 1 6,5 2 ml i.m. 6,8 2 8 2 ml i.m. 6,3 3 12 2 ml i.m. 5,5 M 10 2 m1 i.m. 12,3 15 2 ml i.m. 5,9 6 14 2 m1 i.m. 4,5 7 17 2 ml i.m. 3,8 8 17 2 ml i.m. 20,5 Ko 1 200 5 ml s.c. ü,5 2 Ä00 5 ml s.c. 8,5 3 300 S ml s.c. 15,5 4 500 5 ml s.c. 4,8 H00 5 ml s.c. 7,6 6 600 5 ml s.c. 8,9 7 _500 5 ml s.c. 3,8 8 N00 5 ml s.c. ü,7 'En enda vaccininjektíon adminístrerades och de angivna titrar- na är uttryckta i I.U. som i föregående tabell.

Fyra veckor efter vaccineringen uppvisade de åtta hundarna och åtta nötboskapen samtliga en serumomvandling med mycket höga titrar.

Den minsta titer som erfordras för serumomvandlíng fastställes i den europeiska farmakopën till 0,2 I.U./ml. 8201768-2 12 C. Skydd av laboratoríemöss efter infektering med vild, levande virus (från räv) Typ av . Intervall mellan infektion och vaccination_ vaccin _ š*ä 1 h 1 d 2 d 3 d U d 5 d 6 d T d_ 8 d Levande vaccin 675 x outspätt 0/1o*“ 1/10 1/10 1/10 2/10 0/10 0/10 4/10 s/10 3/10 1o'1 1/10 1o'2 4/10 _ i ' 10. 3 1 6/10 -" Le/10 Kontrcller ;s/10 8/10 7/10 7/10 7/10 7/10 6/10 6/10 6/10 s/10 Inaktiverati vaccin I 675 x ' 5 oucspäct 50/10 1/10 5/10 '1 1/10 1o'2 6/10 1o'5 8/10 loï" 6/10 -'- R' pfu/ml (för inaktiverat vaccin bestäm- des titern före inaktivering) x Vaccinets títer lO8”2 xx Antal döda/antal ympade möss xxx Två vaccineringar (på dag 9 och ll) Samtliga möss som anges i denna tabell ympades intramuskulärt med ett rabies-virus från spottkörteln hos räv (0,1 ml lösning) som dödade 60-80 1 av kontrollerna vid en inkubatíonsperiod av 9 :ill 11 dagar. ' Den levande och den inaktiverade vaccinstammen 675 administref rades i en enda dos (0,5 ml) intraperitonealt under olika perioder 12 is2o176s-2 .efter den första infektionen som anges i tabellen.

Det levande,outspädda vaccinet gav skydd fortfarande 6 dagar efter infektionen vilket aldrig tidigare har kunnat iakttas med något annat i handeln tillgängligt vaccin. Detta skydd visar att möss kan botas också då rabies-viruset nått det centrala nervsys- temet. Med två vaccineringar med en dags mellanrum och med början nio dagar efter infekteringen erhöll vissa möss fortfarande skydd.

Detta levande vaccin kan även spädas upp till tio gånger och ge skydd, dock ej längre än 2D timmar efter infekteringen.

Det inaktiverade vaccinet gav endast skydd då det tillfördes inom ZH timmar efter infektionen och kunde också spädas högst tio gånger.

Claims (5)

:c 8201768-2 r 1” Patentkrav

1. Förfarande för framställning av levande eller inakti- verade rabiesvirusvaccin för parenteral eller icke-parenteral, t ex oral eller intestinal administrering, k ä n n e t e c k - n a t därav, att de härrör från stammen av rabiesvümsnov. spec. nr 675, erhållen genom propagering av HEP Flury vaccin i primär eller sekundär SPF hönsembryofibroblaster, följt av isolering och rening av stammen, och deponerad i den tjeckoslovakiska nationella samlingen av typkulturer i Institutet för Hygien och Epidemiologi i Prag under numret CNC TC AO H/77, samt dess nutanter och varian- ter som uppvisar den reproducerbart signifikanta cytopatiska effekten och övriga specifika egenskaper hos stammen nr 675, genom odling av cellkulturer in vitro och under tillämpning av brukliga och föreskrivna åtgärder för att eliminera bakteriell och/eller viral kontaminering.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n at av att vaccinen framställes genom odling av rabies-virus icellsystem som är tillräckligt känsliga för rabies-infektion, av celler som härrör från fåglar eller däggdjur, frysning av cellsuspensionen vid -7000 eller lägre och/eller utsättande av cellsuspensionen för vibrering med ultraljud så att cellerna förstöres och viruset fri- göres, varefter celler och celldelar avlägsnas genom filtrering eller centrifugering under sterila betingelser, eventuellt följt av inaktívering av viruset i odlingsvätskan enligt i och för sig kända metoder.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av ' att kycklingembryofibroblaser infekteras med rabies-ympvírusstam nr 675, med en infektionsmultiplicitet av 0,02 till 1 pfu/cell, varvid infekteringsperioden är minst 1 timme, och ett underhålls- medium med pH 8,0 till 8,2 tillsättes efter det att virus som ej fäst avlägsnats, varefter de virusinfekterade cellerna inkuberas vid 32-3900 i 3-10 dagar, cellerna och mediet fryses vid -70°C eller lägre och efterföljande filtrering eller centrifugering un- der sterila betingelser, eventuellt följt av inaktivering av vi- ruset i odlingsvätskan på känt sätt. Å.

Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att som underhållsmedium användes basalmedíum Eagle (BME) i Earle's saltlösning, vartill lämpliga mängder antibiotika och 0,2-0,5 % albumin sättes. ”5 8201768-2

5. Förfarandeenligtkravâ, lcännetecknat av att Baby Hamster Kidney 21 (21 passager) 13 S (13 passager i suspen- sionskultur) celler, som odlats i suspension i en centrifugkolv i BHK-21 medium för centrifugkultur, vartill satts en liten mängd tryptosfosfatbuljong, inaktiverat kalvserum och antibiotika, till en mängd av cirka 2 x 10 celler/ml, infekteras med rabies-ympvirus stam 675 med en infektíonsmultiplicitet mellan 0,01 och 1 pfu/cell under omröring, varefter viruset inkuberas i suspension i under- hållsmedium vid en pH mellan 7,5 och 8,0 och vid en temperatur av 32-3500 i U-6 dygn efter infekteringen, cellerna och mediet fryses vid -7000 eller lägre och därefter filtreras eller centrifugeras under sterila betingelser, eventuellt följt av inaktivering av vi- ruset i odlingsvätskan på känt sätt.