JPS5877822A - 新規な恐水病ウイルスおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な動水病ウィルス株、そのウィルス株の単
−法に関する。

Ｉ！に詳しくは、本発明は新規なウィルス株（以下、／
に４７ｊ株と呼ぶ）、及びインビトロの細胞病理学的効
果に対する特殊なｌラーク選別とそれＫｍ＜ｊクローン
精製による新規なウィルス株の単離法に関する。このも
のの生型のワクチンは経口投与に極めて適している。経
口投与は、例えば狐の免疫化（以下にこれをＩ経口接種
１という）に望會しい、腸管からの投与又は噴−による
鼻内投与などの経口及びその他の非腸管外投与を、その
他の流行病学的に重要な人、野生動物及び家畜に対して
行うこともまた本発明の一特徴を構成する。

ワタテｙ（例えば以下のようにして得られるＬ区Ｐフツ
リ　９タチｙ　（Ｌ　Ｅ　Ｐ　（Ｌｏｗ　ＥｇｇＰａｓ
＠ａｇｅ　）　Ｆｌｕｒｙ　ｖａｃｃｉｎｅ　）”又は
ＨＥＰ７ラリワタテノ（ＨＥ　Ｐ　（ＨＩｇｈ　Ｅｇｇ
Ｐａｓｓａｇｅ　）　Ｆｌｕｒｙｖｓｃｌｎ・〕）の予
予約な腸管外投与によって、温＆　　ム 血−物の動水病つィルス感桑を倶滅し…ることが知られ
ている。

ｌり３２年１月２９日にブラリ（Ｆｌｕｒｙ　）という
−少女が米国ジ１−ノア州で死亡したが、その診断によ
る死因は動水病罹患犬による感染後の動水病であった。

少女の脳、涙腺及び唾５１１ｍからの抽出物を、文献（
Ｃ，Ｎ、Ｌｅａｃｈ　ａｎｄ　Ｈ−Ｎｌｌ　Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ：Ａｍ＊ｒ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、、　２０　
、　ｊ　３　ｊ　（／りｔＡＯ）〕に記載されているよ
うに、白色マウスに脳内接種することによって動水病ウ
ィルスが単離された。

マウスからの上記の脳物質を／日令の鶏に脳内Ｉｌ！橿
し、ついで鶏の脳内継代培養を７３６代にわたり行った
（Ｈ，にＯＰｒｏｗｓｋｌ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｃｏｘ　
：Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　ｌｒ　Ｏ、３３３（／！ｉ
’弘ど）の方法による〕。鶏で更にもう２代脳内培養し
た彼にその動水病ウィルスを卵黄嚢接橿によって錫の胚
に適応させた。卵黄嚢６０継代培養後に、該ウィルスは
多数の哺乳動物に対し実質上非発病性であるように思わ
れ、かつこの一連の継代培養レベルにおいてＬＥＰフラ
リ　ワクテ／の名で大川の動水病ワクチンとして使用で
きる。鶏胚について１！に継代培養（／７０−７７参代
まで）した後には、このウィルスは−に一層その発病性
を失ってしまっており、−遍令Ｏ１！験用マウスは脳内
投与されて４死をなかつ九。しかし、哺乳中のマウス社
死亡しえ。このワクチンはＨＥＰフラリ　ワクチン（Ｈ
ｌｇｈ　１６　Ｐａｓｓａｇｅ　Ｆｌｕｒｙ　ｖａｃｃ
ｌｎｓ　）の名で入手できる。

ζｔＬ＆のＬＥＰ及びＨＥＰワクチンは予防用ワクチン
として使用されると動水病感染の防禦に有効であったが
、国内及び１ｉＩＩｌｌＩ水皐における最近の新規な管
層基準で示されているように、他の動水病ワタテｙＫ対
する需要が確実に存在する。例え゛ばこの病気が長い間
風土病となっている先進国或は低く最近この病気が流行
しはじめた先進−における舒生動物性動水病（１ｙ１ザ
ーｔｌｃ　ｒａｂｌ・−）の防除は、有効で経済的な防
除法を利用できないような困−かつ生態学的に複＃＆情
況にある。

人の罹患後ワクテン治療もまた、世界の動水病感ｌ１１
１ｗ１鴎において多数の問題を童み出した。以上の緒憚
由から、゛動水病の研究は非腸管外、好適には経口ルー
）Ｋよる罹患後及び罹患前の接種及び免疫化の問題に向
けられてきた。

本発明における研究及び実験の結果、新規なワクチン株
が開発された。この株は種々のルートで投与することが
できる。即ち、これは腸管外又は非腸管外投与すること
ができ、また動水病感染の前後いずれにおいても投与さ
れると、完全な動水病防禦を果すように思われる。

動水病め最も重要な媒介動物及び（又は）感染源である
野生−物の０経口＊ｍ”を行う目的で有効な経口投与を
行う可能性は、本発明の有利な特徴として評価されよう
。

生きたＡ６１ｈ７ｊワクチン株はこれまでに知られ一友
最も非発病性の現存動水刺ワクチン株である〇これはた
だ１回の適正量の７クチンを用いるだけで屋外でウィル
ス感染をうけた後−の動水病防禦の可能性を与える。こ
の１１６６７６株から製造される不活化ワクチンもまた
罹患後に動水病を防禦するがその程度は低い。この生ワ
クチンは極めて高度の抗原性をもち、それは不活化型の
ワクチンとほとんど勢しｉ抗原性をもつ。この生ワクチ
ン或は不活化ワクチンはほとんど完全に真檜タン・譬り
ｔ含まない細胞培養聾ワクテ／であり、完全ではないと
しても好ましからぬ副作用の程度を実質的に減少させる
。

この新規なウィルス株は次のよう圧して単離された： 上記ＨＥＰフツリ　ワクチンのウィルスを一次又は二次
３ＰＦ鶏胚纏維芽綱胞内で増殖させた。

これらの感染され九纏維芽細胞に特異的な免疫けい光（
ｔｍｍｕｎｏず１ｕｏｒ＠ｓｃ＊ｎｃ＊　）　法を用い
ることによ桑厘属内螢種にもとづくマウス防禦テストと
、それに続く標皐化動水病対抗りイルス（ＣＶＳ）の投
与とＫより、および既知の陽性血清（ｌｉｉｉｌｌｉ恐
水病標準血動水を用−たインビトロの血清中和テス）　
（ｓ＊ｒｏｎ＠ｕｔｒａｌｌｚａｔｌｏｎ　ｔ＠＠ｔ　
）　Ｋよって動水病ウィルスと同定された。

最初ＫＷ用されるＨＥＰフラリ　ワタテンの増殖のため
に他の動水病感染性細胞系及び二倍体−−八 胞系をも　ＳＰＦ鶏胚纏維芽細胞の代りに使用し得るこ
とは理解されるであろう。

ＨＥＰフラリ　ワクテ／は世界中で使用されてお９、そ
のいずれを使用することも可能である。

に、ｖｏ＠ｈＩｎａ等〔＾ｒｃｈ、　ｇａｓ、　Ｖｌｒ
ｕｓｔｏｒｓｃｈ、、／　ｔ　。

３７０Ｃ／り６６）〕による鶏胚４Ｉ維４ｊ細胞（ＳＰ
Ｆ）におけるプラーク　検屍法及び０．８１７１＠ｎｇ
ａ　ａｎｄ　　Ｌ、　ＪＯｕｂ＠ｒｔ　（Ｂｕｌ　＋、
ｓｏｐ、　Ｓｃｌ　、　Ｖ≦ｔ。

・ｔＭ≦ｄ、　Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ、　　ＬｙＯｎ、ム
亙μｍり（／り７≠）ＩＫよる！ラーキ／グ細胞懸濁法
を用い、感染細ＩＩ！に対するａ胞病理学的効果におい
て、最初のウィルス集団とは明らかに異なるプラークを
単一しうる。このプラークを均一かつ純粋なウィルス集
団を得るために３回りＱ−ニンダした。

ワクチ々株がその元のプイルレ／スに復帰する可能性は
、殆ど排他的にワクチン株の不純さく逆選別をもたらす
）に上るものであるから、株４７ｊの前記の如き効果的
な精製は実際上儂帰の危険性を＃除した。ｔた、この株
１，７３Ｆｉ入手し得るものりうちでＩｋ４非発病性の
動水病ウィルス株であるＯ 初めて単離されたプラークはＡｔ、７６と番号付けられ
、精製後の株は動水病ワクチン株／％１．７６とされた
。この株の試料はｌり７７年１り／３日に７’ラバの寄
託機ｍｌ　（Ｃｚ＠ｃｈｏｓｌｏｖａｋ　Ｎａｔｌｏｎ
ａｌＣｏｌｌ＠ｃｔｌｏｎ　　ｏｆ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅｏｆ　Ｈｙｇｌ＊ｎ＠＠ｎｄ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ
ｏｇｙ　）　Ｋ寄託され、そこで寄託番号ＣＮＣＴＣ４
＾０≠／７７として記録されている。

この株は、以下の特性により、初めのＨＥＰ７２リ　ウ
ィルスと区別しうるニー （ａ）　　インビトロにおける極めて一導な細胞病理学
的効果（培養細胞に対すｂ款死車、ｅｐＥ　）；　明ら
かＫＨＥＰ７９９株の効果とは異っており１かり／コ〜
コ参時間早く作用する。

（ｂ）　　短縮された一次ウイルスすイクル；り〜ｌ／
時間の範囲で変化する。一方ＨＥＰｙｌｕ株の場合には
／−〜／ｊ時間である。極めて急速なプラークの形成を
引き起こす。

（−極めて明瞭なプラーク。このプラークはＸＦ−均し
てＨＩＰウィルスのプラークよりも幾分大きな径（／　
ｍ　）を有する。このプラークの領域では生細胞１は全
くないが、ＨＥＰノラリ株の場合には常にいくらかの生
細胞が４淫する。

（−インビトロでのａｍ表面に対する高い付着能力。こ
れは適正な経口ワクチンにとって必須の要件である。

（・）　インピーでの遮かなインターフェロン生産性＜
ｍ種後約６０分）および高い達成可能なインターフェロ
ン力価。この性質は罹患後の接種に対して重要な要件で
ある。

（ｆ）　　ｊｌｌ胞培養において、高いウィルス力価を
与える。

これ６１１１４１！（ａ−ず）は本発明の株、４７　ｊ
　カ元のＨＥＰ７ラリ　ウィルスとは明らかに異ること
を示すものであることを理解することができよう。

本発明がその範囲内に、ウィルス７１６４７３株から誘
導され、かつ上述ｔｙｙｓ４７１株の＃特性を有する人
工変異株をも包含するものであることが理解されよう。

既に述べたように、本発明によればクローン稽１ｉＫよ
って均質なウィルス集団が得られることから、一定の品
質をもつワクテンパッチの製造が容易化される。即ち、
改善されえ稠度のワクチンを、本発１１に従ってウィル
ス腐６７！株から製造しうる。

本発明のもう一つの特徴をなすワクチンは次の諸利点を
示す： （１）　　元のＨ筐Ｐフツリ　ワタチンにおけると同様
に本発明による生ウィルス　ワクチン社投与後に増殖せ
ず、残留ウィルスは検出され得ない。

（２）　このワタテｙ鉱極めて迅速なインターフェロｙ
生童性と、その他の付随的な未知の阻止能、例えばｊｌ
Ｉ鳳愉免歳性とを惹起する。天然ウィルスによる実験的
感染後に、ワクチンを一腹投与するだけで売食を防禦を
達成しうろ。極めて迅速なイ／ターアエａン生童性と細
胞性免疫性に基−て、動水病の流行中ＫＩＩ患したばか
りの動物ム の防禦のために、本発明のワクチンを利用することが命
中可能である。特に、人の罹ｌｌ後のワクチン治療の可
能性が着しく改善されたが、それ紘このワクチンが感染
後の動物に対し著しく有効であり、その感染の著しく進
んだ段階にある動物を治癒させることすら可能であるか
らである。

（２）　こつ生ウイルスワクチンの非腸管外、例えば経
口ルー）Ｋよる投与はその組織化された接種の施行くお
けろ使用を容易にする。

／に４７１株から製造式れる生ウィルス　ワクチンは罹
患前の接種に対して考え得る以下の如き利点をもつ； ＾　動物において ／、　動水病ワクチン含有の食餌による狐及びその他の
流行病学的に重要な野生動物の免疫化。

ユ　家畜の屠殺が宗教的及び（又は）立法的理由で禁止
されている諸国における家畜、例えば舒犬に対する経口
的接種。

ま　予防＊ａｇ＋施行が著しく単純化門れうるような食
餌による、生ウィルス　ワクテ／の大規模投与。例えば
飛行機によるウィルス　ワクテ／を含有する、場合によ
っては凍結された電−トーールの撒布。

仏　予肪接種が規定されている諸国、及び動物が既に免
疫化されている場合には罹廊壁にも飼い続けることがで
きるような諸国において使用するえめの、罹患後の家畜
の有効な動水−防禦。

−）　人におｉで ｆ　経口接種の恐怖はＩＩＡＷ４されうる。接種の恐怖
はいくつかの国々におｉては極めて重要な因子でＴｏ６
、この恐怖の九めに１所足回数の接種に応じる患者の数
が減少する。

１　経口投与社、現在市販されている、先行技ＩＩＫよ
るワクチンに関する実際上の欠点となってｉる、局部反
応又は刺激を与えない、３、大規模で、医療的に慣れて
ｉない人々による容易な投与が可能になる〔経口ポリオ
＊Ｓ＊（ｏｒａｌ　　ｐｏｌｌｏｍｙｅｌｉｔｊｓ　　
ｖａｃｃｅｎａｔｌｏｎ　　）　参照〕。

これに関して、このワクナノの／ｌｐＪたけの投与で十
分であると思われる事実は重要なものと評価されよう。

この新規なワクチンは通常の操作即ちイノビトロの細胞
培養により製造され、又、周知の原理及び国際的標準要
件に従って＃８＃及び（又は）ウィルスの夾雑を避ける
ために規定された通常の制御法を適用して製造される。

本発明の新規なワクチンは、好適には動水病ウィルスを
５ＰＦＩＯ日令の鶏胚に由来する７次又はλ成鶏胚線維
芽細胞の単一層内で生育させることによって製造される
。しかしながら、動水病感染に十分感受性のある他のｍ
１糸（鳥に由来する他の細胞及び哺乳動物の細胞、例え
ば単一層培養用の幼ハムスター腎、２／（λｌ継代）或
は懸濁鳩養用の８Ｈに一、２／　　／ｊｓ（懸濁１４．
１１１１３代）のよりなもの）も１（川口うるが、この
場合には動物用ワクチ／に対してのみ使用し得る。この
懸濁細胞培養系は、生産を容易にする大容量の発酵槽内
におけるウィルスワクチンの生産を可能にするという大
暑な利点を持つ。

更にこのワタテ／は櫂クロ担体（ビーズ細胞培養系）上
で生育する細脂内でも製造しうる。例えば、Ｉａ―生青
前及び（又は）生育中に巨大分子アニオノで処理され九
−リブキストランビーＪｅは、その表両に細胞生育の丸
めに十分な正電荷密度を有するので使用することができ
る。このようにして、畝状媒体中で攪拌され九細胞とビ
ーズとの懸濁物に所定のウィルスを接種し、ウィルスの
接種後にそのビーズを反応槽の底に沈降させ、ウィルス
の懸濁物から分離する。

このワタチン製造のための特殊な方法においては、鶏胚
纏維芽ＩＩＡ膓を、σＯ−〜ｌρｆｕ／細胞なる感−多
重度の動水病ウイルスム４７ｊ株で感染させｈが、感染
期間は最低１時間であることが好まし−、ζこで感染多
重度とは培地中の細胞当た襲の生存ウィルス粒子数であ
り、１ｓ１１１に当たりのｌラータ形成単位（ｐｌａｇ
ｕｅ−ずｏｒｍＩＱ　−ｕｎｉｔｓ　。

１１　）で表わ畜れる。■付着しなかったウィルスを除
去した後に、好適には適量の抗生物質（例：１００ｅυ
ペニシリン及び／　００　ｐｇストレグトマイシ／）と
０．２〜ｏ、ｒ＠のアルジミンとが添加された、［ａｒ
ｌｓ’ｓ　塩　溶液中のＢａ５ｍ１　Ｍ＠ｄｉｕｍ証−
１・（ＢＭりからなる維持培地を添加する。

仁の維持培地のｐｌをｆ、　０−　ｆ、　、２　Ｋ保つ
ように注意すべきである。フィルス感染細胞を３２〜３
９℃で３〜ＩＯ日間恒温保持し、そこで細胞を破壊して
ウィルスを遊離させる（力価が増す）ために、その培地
を一７０℃以下に凍結する。細胞及び細膓破片を滅菌状
態でｒ過又は遠心分１ｌＩＩＫよって除＜、Ｆ液又は上
澄液を一７０℃で保存し、試料を上述のインビトａｘ　
　プラーキング法によって力価測定するためＫＩｌ取す
る。恒温保持後に細胞を破壊するために他の方法、例え
ば細胞懸濁液を超音波振動Ｋかける方法を使用しうろこ
とが理解されよう。

他の特別の製造法によれば、８Ｈに一２／／ｊｓ細胞を
懸濁液中で生育させる。例えばスピネルフラスコ中に棒
を吊し、少量のトリノトース　ホスフェート　ブ’　Ｘ
　（ｔｒｙｐｔｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅＭｏｔｈ　
）　（７〜／　７１　）、不活化仔牛血清（７〜／１％
＞及び抗生物質（例えば／　００１Ｕ　ｆ）−１−７リ
ン及び／　ｏ　ｏ　ｐｇのストレグトマイクン）が添加
されたスピネル培養層ＢＨＫ−２／培地を用いて生育さ
せる。細胞を、約２×ｌＯ６細胞／−のレベルに達する
まで生育させ、その間それらを懸濁状態に保ち、互いに
凝集するのを防止するために十分にＪｌｌｌｍｌを攪拌
する。

遠心分ｌＩＩ！によってそれらの細胞を回転沈降させ、
動水病つィルス属１．７１株による０、０７〜／　ｐｆ
ｕ／細胞なる感染多重度での感染を、定速攪拌の下で３
０ヤルＯ分間行う。

感染後、少量の牛血清アルデｉノ　フックシ璽／ＶＣ例
えば０．　／　−０，１７重量−）及び抗生物質（例え
ばｊＯ〜ＪＯＯｐｌｉＧカナマイシン又はネすマイｙｙ
）が−纏され九・Ｈに一コｌスピネル培地からなる維持
培地を含むスピネルフラスコ中に鋏細胞を再度懸濁させ
、−を７ｊ〜ｔ、　０４Ｃ調整する。感染中に、温度を
３λ〜ＪｊＣ１好ましくはｊＪｃＫｌｌ）％１１日該エ
ビネル　フラスコから、少量の試料を取出して、免疫け
い光法による検査に供する。感染後−〜３日の間に、こ
れら試料中の細胞のｔｏ〜ｉｏｏ＠が該細胞質中の動水
病細―封入体に対して４Ｉ異的な免疫けい光を示すが、
これは感染後参〜４日の収穫時には、ｌｏ８〜／　ｄ’
　ｐｆｕ　／−の力価ＫＮｍするものとなる。収穫時に
１液を７ツスコから取出し、−７０℃で凍結保存する。

試料から細胞及び細胞片を除去した後、少量の鍍試料を
！ラークカ価副定法によって力価測定する。許容される
力価（１０７°５〜１０８・５ρｆｕ　／−以上）Ｋ、
遺したら、滅菌状態でｒ過又は癌心分離することによっ
て前記細胞及び細胞片を収穫物から除く。

適正な安定化剤を添加した後、該液体は例えば最終製品
の凍結乾燥のためのバイアル中に分配しうるむとＫなる
。

好適には入用の、死菌（不活化）動水病ワタテｙも本発
明の範囲内に包含されることが理解されよう。

これらの死菌動水病ワクチンは、調製され友培養筐中の
ウィルスを、既知の操作又はその便法、例えば／−ｆ曹
ビオラクＦノ、ホルマりン、或はアセテルエチレンイン
ンの添加により或は紫外線照射によって不活化すること
により製造することがで自る。

本発明のウィルス株から誘導される動水病ワクテｙは一
種以上の適正な安定化剤、防腐剤、緩衡剤塩類及び補助
剤を含有しうろことが理解されよう。

本明細書及び特許請求の範囲の記載にお−で使用される
腸内投与という用語は本発明の動水病ワクテｙを腸内に
放出し得る形状で投与することを意味する。

本発明は次の諸例によって例示されろ。

例１ ■定され丸、又はローラ　−トル中で育生されえ１次又
はλ次ＩＦＦ帰胚纏維芽頴胞の単一層を、（０，０２〜
／ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍ、ｏ、１．）を有する
動水病ウィルス４４７１株で感染させる。

少量のウィルスを使用することもできるが、その場合に
社恒温保持時間を延長する。種ウィルスを細胞に付着さ
せるためＫは、少くとも１時間の感染時間が必要である
。次に、残留する付着しなかったウィルスを除き、適正
量の抗生物質と０．２−のワクチン使用の対象となる関
連種のアルブ電／とを添加したＥａｒｌｅ’ｓ塩溶液中
のＢａ５ａｌ　Ｍ＠ｄｉｕｍ【・１・（ＢＭＥ）からな
る維持培地を添加する。

その際に、維持培地の最終混合物のｐ［Ｉがり、２とな
るように注意する。

前記ウィルス感染細胞を３３〜３ｊ℃にて≠〜を日間恒
温保持すると細胞病理学的効果（ＣＰ　Ｅ）が高まる。

次いでその培地を一７０℃で凍結する。

次に、生成物を解凍した後、１ｏｏｏｐで遠心分離する
か又はメンプラン　フィルター（孔径ｊｉりｌ２））で
滅菌条件下でｒ過して、細胞及び細胞片を除く。上澄液
又はｆ液を一７０℃で保存し、上述のインビトロプラー
キング法（ｓｌＪｌｅｎｇａ及びＪ＠ｕｂ＠ｒｔ　）で
力価１１ｊＭするために試料を採取する。

罹患後の効果的な接種に用いるワクチン・ヤツテの許容
力価社／　０８ｐｆｕ　／−である。罹患前の接種に対
しては、／　０’　ｐｆｕ／−の最少力価でも許容され
る。

上述のワｙｔ−：ｙパッチの製造は通常の力価試験（Ｎ
ＩＮ及びｏａｂ・１テスト）で制御されるが、罹患ＩＫ
使用されるパッチについては更にＧ、　８１　ｊｌ＊ｎ
ｇａ　（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ
　１ｎ１１１ａｂｌｅｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ｓ　
　＾ｔｌａｎｔａ　　、　　Ｇ＠ｏｒｇｌａ、　　ＬＪ
、Ｓ、　＾、。

ｌり７を年２月７〜２日第７≠頁）による追加の新規な
力価試験が必要とされる。

ヒの新規な力価試験において局在屋外ウィルス（１ｏｃ
ａｌ　５ｔｒｅｅｔ　ｖｉｒｕｓ　）を弘週令−ｌウス
の筋肉内（１，ｍ、　）に投与し、続いてコ≠時間以内
に０．１−ワクチンをｌ１１腹膜内Ｋｌ！種する。接種
された全てのマウスは生き残る筈であるが対照マウスの
＃ｌｚｏ　ｓは３週間の試験期間の終了前に死ぬ筈であ
る。

このワタテｙ　パッチの考えられるｌａ曹及びウィルス
夾雑に対する滅菌試験のための通常の制御法と、ワタテ
ｙ製造に用いられる１次又は２次−脂及び細胞系（ｃｅ
ｌｌ　Ｉｌｎ・Ｓ）に対する操作法とはｌ−的に確立さ
れた最少要件に従って行われる。

例コ ８ＮＫ−２／　　／Ｊｓ細胞を、棒を吊し九−・Ｈｅ・
スピネル　フラスコ中の懸濁液中で生育させるが、その
際にスピネル培養用ＢＨに一コ／培地を用い、該培地に
は抗生物質（１００１Ｕのぺｘシリン及び１１００ｐの
ストレグトマイクン）の存在下に、１０９１＋トリノト
ース　ホス７エートブロスとｌＯ嚢不活化仔牛血清とを
添加する。

コＸ　／　０’　細胞／−のレベルに達するまで細胞を
生育させ、その間それらが懸濁状１１ＭＫ保たれ、かつ
亙いに凝集しないように１十分に細胞を攪拌する。

遠心分−によって１１００ｒｐで細胞を回転沈降させ、
０，０／〜／ｐｆｕ／ｍ胞の感染多重度で動水病つィル
ス／％Ａ７ｊ株による感染を、定速攪拌下で参！分間行
う、感染後、０．２％の牛血清アルノ電ンフラクク曹／
Ｖが適量の鈴拝されうる抗生物質（即ちカナマイク／又
はネオマイシン）と共に―纏された＠−に一２７スピネ
ル培地からなる一持培地を含有するスピネルフラスコに
細胞を再度騙濁させ、同時［ｐＢを７ｔｒＫ調整する。

感染中に温度を３３℃に保ち、そのスピネル　フラスコ
から毎日少量の試料を、免疫けい光性によって検査する
えめに取出す。感染後２〜３日間で、これらの賦科中の
Ｊｌｌｍｌの１０〜１００慢が細胞質中の動水病ｓｔｉ
ｍ射入体に対して特異的な免疫けい光を示す筈であって
、これは結果として感染後弘〜を日の収穣時において１
０”〜１０”ｐずＵ／−という十分な力価を保証する。

収穫時に１前記７９スコから筐体をとヤ出し、該筐体を
一７０℃に凍結して保存する。この収穫物の少量試料を
別に保存してお自、細胞及び細胞片を除去し九後Ｋ、グ
クーク力個１ＩＩｌ定法で力価測定を行う。力価が許容
されうる値（１０９・“〜／　０”・’　ｐｆｕ　／−
又はそれ以上）である鳩舎には、上述の方法によって該
収穫物からｍ鳳及び細胞片を除き、適正な安定化剤を加
えて、液体を最＃ｌｌ１ｌ晶の凍結乾燥用バイアル中に
分配する。

艶に−そう高い力価を得るために、固定完全業一層又は
ローラ培養メトル中の該率一層を感染させることＫよる
別法を使用しうる。感染後２〜を時間の関に１細胞は抗
トリノシ／性が破壊されて上述の懸濁培養Ｋかけられる
。細１＠凝集が生じないように注意すべきである。この
ようにして、コＸ１０’ｌｌ胞／−以上を使用すること
が可能であり、前記懸濁培養Ｋかけられる感染細胞の数
に応じてよ抄高い力価の収換物が得られる。

例　　３ 本発明によ・る動水病生ワクチンと不活化動水病ワクチ
ンの用法と価値とを例示する九めに罹患前及び後の秦種
夷験のいくりかの結果を以下に列挙する。

〔＾〕　Ｃ水病生ワクデン／Ｉ６乙７ｊ株による狐の経
口接種（コー／狐）（ワクチンの力価はコｘ１０８ｐｆ
ｕ／ｓ（）： この実験は着い狐のｎ口接檜の有効性を示している。狐
の免疫応答は適正な血清変換 （５ｅｒｏｃｏｎｖ＠ｒｓｌｏｎ　）及び良好な力価を
示す。接種後ｊケ月以上して３匹の狐は完全に防禦され
、３匹の対照用狐は全部、極めて短い潜伏期間中に死ん
だ。このことは右後足に筋肉内接種された極めて高い用
量の対抗　ウィルスに基〈ものである。

通常使用される狐用の対抗用量は３０００　ＭＬＤ５゜
である。

（１１不活化ムｔ７ｊ株による接横後の血清学的結果： ９クテンを１回注射して投与し、示され九カ価社前表の
ようＫ　１．ｔＪ、　　で表わされている。

接種後参週間で、を匹の犬とｔ頒の牛とは全部、極めて
高ｉ力価の血清変換を示した。血清変換に必要な最低力
価は欧州薬局方（ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐ＠ａｎＰｈａｒ向
ｔｏｐ・・）によってＱ１０．Ｕ、／−と定められてい
る。

（Ｃ）　　野生の生ウィルス（狐に由来）で感染した後
の研究用マウスの鋳Ｉｌｌ： この表に示された全てのマウスは狐の唾液腺動水病つィ
ルスＣＯ，／−溶液）で筋肉内接種され、２〜Ｉ１日の
潜伏期間内に対照のｔｏ−ｔｏ−が死亡した。

生及び不活化ワクチン４Ａフフ株は、表に示された最初
の感染後の種々の期間において、腹膜内に単一用量（０
，７ｄ）で投与された。

この未希釈生ワクチンは感染６日後でも防禦し九が、こ
のことは以前罠は市販の如何なるワクチンにりいても決
して昭められなかった。この防禦成績は動水病りイルス
が中枢神経系に遣し九後ですら感染マウスが治癒されう
ろことを示している。

感染後２日で接種を開始し、７目間隔で２回接種すると
いくつかのマウスはなお防禦され友。

この生ワクチンは７０回希釈されても、感染後コ参時間
以内ならば防禦能を示しうると考えられる。

不活化ワクテｙｉｊ感染後２≠時間以内である啼にのみ
防禦し、７０倍以内であれば希釈することがで自ると考
えられる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　寄託番号ＣＮＣＴＣＡＯ≠／７７で寄託され
   ている動水病つィルス新株ム４７ｊおよび該新株４Ａ７
   ｊの再現性ある高い細胞病理学的効果および他のＩｆＩ
   ＃電の緒特性を示す突然変異株および変異株。
2. （２））　再現性ある高い細胞病理学的効果を有する、
   寄託番号ＣＮＣＴＣ＾０４４／７７で寄託されている動
   水病ウィルス新株４Ａ７ｊｆ）ＩＩ造方法にお−て、Ｈ
   砿−７ラリワクチンを一次または二次ＳＰＦ鴎胚纏繍芽
   細鳳、もしくは動水病感染性の細胞畢壜九はλ缶体細胞
   系内で増殖させ、公知のグテータ検定法およびｌテーク
   細胞懸濁法を利用して形成され九プラークを単一し、比
   だし皺！ツータは元のＨｔＰフラリ株と社恐水病感粂細
   ＠に対する細胞病理学的効果において異る、次いで得ら
   れ良前記プラークを３り＝−ン精製に掛けて均一かつ純
   粋なウィルス集団を得ることを特徴とする、上記動水病
   新株、％Ａ７ｊの製造方法。
3. （３）　　舒生食肉獣及びその他の野獣を動水病感染か
   ら保護する方法において、寄託番号ＣＮＣＴＣ＾０弘／
   ７７　として寄託されている、生き九恐水病ウィルス株
   ４４７にワクチンを経口投与しても効果の彦い場合に１
   上起動物の腸内に＃’７クチンを投与することを特徴と
   する上記方法。