FI61626C - Foerfarande foer framstaellning av nya rabiesvirusvaccin - Google Patents

Description

Γβ1 kuulutusjulkaisu ™ ( 1) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6ΐθΖΟ ^(^5) Patentti «nyönetty 10 09 1932 Patent aeddelat ^J (51) Kv.ik.Vci.3 A 61 K 39/205* C 12 N 7/02 (21) P»t*nttlh»k*mu« — P»ttnttn»öknlng 800539 (22) HtktmlipUvi — An*6knln|tdag 22.02.80 (23) Alkuptlvi—Glttlih«ud«| 20.01.T8 (41) Tullut lulklMk·! — Blhflt offwttllf 22.02.80

Pstentti· ja rekisterihallitus Nihtivll«ip«on j. ku«l.|Uik.iM.n pvm.-

Patent- och registerstyrelsen ' Antökin Utli|d och utUkriften publkartd 31.05.82 (32)(33)(31) Pyri·»/ «uolk«jt—B«Hrd prloritM 26.01.77

Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 3258/77 (71) Gist-Brocades N.V., 1, Wateringseweg, Delft, Alankomaat-Nederländerna(NL) (72) Gosse Bijlenga, St. Didier au Mont d’Or, Ranska-Frankrike(FR) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä uusien raivotautivirusrokotteiden valmistamiseksi -Förfarande för framställning av nya rabiesvirusvaccin (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 7Ö0181+ (patentti 59812) -Avdelad frän ansökan 78018U (patent 59812) Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien aktiivisten tai inaktivoitujen raivotautirokotteiden valmistamiseksi.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja rokotteita voidaan antaa parenteraalisesti ja ei- parenterää 1 isesti. Rokotteen aktiivinen tyyppi on erittäin sopiva suun kautta annettavaksi esimerkiksi kettujen immunoimisessa. Rokotteita voidaan antaa myös muita ei-parenteraalisia teitä, kuten suolen- tai nenän-sisäisesti ruiskuttamalla, muille epidemiologisesti tärkeille villieläimille, kotieläimille ja ihmisille.

On tunnettua yrittää torjua lämminveristen eläimien raivotauti-tartuntoja ehkäisevän parenteraalisen rokotuksen avulla /esim. rokotteilla LEP (Low Egg Passage) Flury tai HEP (High Egg Passage) Flury, joita saadaan seuraavassa selostetulla tavalla/ .

2 61626

Tammikuun 29. p:nä 1939 Flury-niminen tyttö kuoli Georgian valtiossa USA:ssa, kuolinsyyn ollessa diagnoosin mukaan raivotauti, jonka tartunnan tyttö oli saanut raivotautisesta koirasta. Raivotautivirus eristettiin tytön aivoista, kyynelrau-hasesta ja sylkirauhasesta ja siirrostettiin intracerebraali-sesti valkoisiin hiiriin, kuten on selostettu kirjoituksessa:

Leach C.N. & Johnson H.N., Amer. J. Trop. Med. 1940, £0: 335.

Hiiristä saatua aivokudosta siirrostettiin intracerebraalisesti yhden päivän vanhoihin kananpoikiin, ja sen jälkeen suoritettiin 136 intracerebraalista siirrostusta kananpoikiin kirjoituksen Koprowski H. & Cox H.R., J. Immunol. 1948, 60: 533 mukaan. Edelleen kahden intracerebraalisesti kananpoikiin suoritetun siirrostuksen jälkeen raivotautivirus siirrettiin kanan-poika-alkioihin keltuaispussiin tehdyn siirrostuksen avulla.

60 keltuaispussisiirrostuksen jälkeen virus osoittautui olevan tautia synnyttämätön useitten nisäkkäitten suhteen, ja virusta on saatavissa tällä siirtoistutustasolla raivotauti-rokotteena koiria varten nimellä LEP Flury-rokote. Kun edelleen suoritettiin siirtoistutuksia kananpoika-alkioihin (aina 170-174 siirrostukseen saakka), virus osoitti menettäneen paljon enemmän patogeenisuuttaan, niin että kaksi viikkoa vanhat labo-ratoriohiiret eivät kuolleet viruksen intracerebraalisen siirrostuksen jälkeen, vaikka imeväiset hiiret kuolivat. Tätä rokotetta on saatavissa nimellä Hep Flury-rokote.

Vaikka nämä LEP- ja HEP-rokotteet ovat olleet tehokkaita raivo-tautitartunnan ehkäisyssä käytettäessä niitä rokotteina ennen altistusta, muunlaisten raivotautirokotteiden tarvetta on olemassa, kuten on osoitettu viimeaikaisilla uusilla kontrollitoi-menpiteillä kansallisella ja kansainvälisellä tasolla. Esimerkiksi sylvaattisen raivotaudin hallinta kehittyneissä maissa, joissa tämä tauti on esiintynyt jo pitkän aikaa tai joihin se on äskettäin saapunut, on eräs vaikeista ja ekologisesti monimutkaisista ongelmista, joita varten mitään tehokasta ja taloudellista menetelmää ei ole käytettävissä.

Myös infektion jälkeinen ihmisten rokotus on aiheuttanut useita ongelmia raivotaudin saastuttamissa maissa kautta maailman.

Näistä^ syistä raivotaudin tutkimus on suunnattu ongelmiin, 3 61 626 jotka koskeva infektion jälkeistä ja sitä edeltävää rokotusta sekä immunointia ei-parenteraalista tietä, sopivimmin suun kautta.

Tutkimuksen ja kokeitten tuloksena on kehitetty uusi rokote, jota voidaan antaa erilaisilla tavoilla, ts. jota voidaan antaa paren-teraalisesti tai ei-parenteraalisesti, ja jonka on todettu aikaansaavan täyden suojauksen annettuna joko ennen raivotautitartuntaa tai sen jälkeen. Keksinnön mukaisessa menetelmässä rokotteet pa-renteraalista ja ei-parenteraalista antamista varten valmistetaan kasvattamalla in vitro raivotautiviruskantaa sinänsä tunnetulla tavalla solusysteemeissä, jotka ovat peräisin linnuista tai nisäkkäistä, ja pakastamalla saatu solususpensio lämpötilassa -70°C tai alempana ja/tai ultraäänikäsittelemällä solususpensiota solujen särkemiseksi ja viruksen vapauttamiseksi, ja sen jälkeen poistamalla solut ja solujätteet suodatuksen tai sentrifugoinnin avulla steriileissä olosuhteissa, sekä lopuksi mahdollisesti inaktivoimalla viljelysnesteissä oleva virus tunnettuja menetelmiä käyttäen ja valmistamalla rokote tunnettuja menetelmiä käyttäen, ja keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että menetelmässä käytetään uutta raivotautiviruskantaa n:o 675, joka ondeponoitu Prahan hygienian ja kulkutautiopin laitoksen kokoelmaan "Czechoslovak National Collection of Type Cultures" numerolla CNC TC AO 4/77.

Mahdollisuus antaa ainetta suun kautta, "oraalinen rokotus", villieläimille, jotka ovat tärkeimpiä raivotautitartunnan levittäjiä ja/tai tämän taudin lähteitä, on katsottava tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun rokotteen tunnusomaiseksi piirteeksi.

Aktiivisella rokotteeksi soveltuvalla viruskannalla 675 on vähiten tauteja synnyttäviä ominaisuuksia kaikista tähän saakka tunnetuista raivotautirokoteviruksista. Se mahdollistaa suojauksen virustartunnalta infektion jälkeen käytettäessä jopa vain yhtä riittävän suurta rokoteannosta. Viruskannasta 675 valmistettu inaktivoitu rokote suojaa myös infektion jälkeen, mutta vähemmässä 4 61626 määrässä. Aktiivinen rokote omaa erittäin suuressa määrin antigeeni-ominaisuuksia ja inaktivoitu rokotetyyppi melkein yhtä paljon.

Sekä aktiivinen että inaktivoitu rokote ovat soluviljelmästä saatavia rokotteita, jotka ovat melkein täysin vapaat vieraista proteiineista, mikä on omiaan ainakin olennaisesti vähentämään ei-toivottujen sivuvaikutusten määrää, elleiipoistamaan niitä kokonaan. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä raivotautiviruskanta 675 valmistetaan kasvattamalla HEP Flury-virusta ja eristämällä jäljempänä esitetyt ominaisuudet omaava plakki. Valmistusmenetelmä on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 780184.

Alkuaan eristetylle plakille annettiin numero 675 ja puhdistuksen jälkeen saadulle kannalle merkintä: raivotautirokotekanta n:o 675. Näyte tästä kannasta talletettiin 1977-01-13 Prahan hygienian ja kulkutautiopin laitoksen kokoelmaan "Czechoslovak National Collection of Type Cultures", jossa se rekisteröitiin numerolla CNC TC AO 4/77.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty kanta eroaa alkuperäisestä HEP Flury-viruksesta seuraavien ominaisuuksien suhteen: a) Erittäin selvä sytopaattinen vaikutus soluviljelmiin koeputkessa, joka eroaa voimakkuudeltaan HEP Flury-viruksen aiheuttamasta sytopaattisesta vaikutuksesta.

b) Lyhentynyt primaarinen lisääntymissykli, joka vaihtelee välillä 9-11 tuntia (HEP kannalle 12-16 tuntia), aiheuttaen plakkien nopeamman ilmaantumisen, ns. häiriövaikutuksen puuttuminen, johtuen viruskannan puhtaudesta (kloonaus), siten ei viruskanta 675 sisällä ns. Dl partikkeleita (defective interfering particles).

c) Plakkien alueella ei esiinny eläviä soluja, kun taas HEP-viruksen aiheuttamissa plakeissa on aina joitakin eläviä 5 61 626 soluja. Tämän vuoksi viruskannan 675 plakit ovat hyvin kirkkaat (läpinäkyvät) ja HEP-viruksen plakit sameat. Morfologi-sesti viruskannan 675 plakit ovat isompia ja yleensä keskenään enemmän yhtenäisen muotoiset kuin HEP-viruksen plakit.

d) Parempi kiinnityskyky solujen pintaan koeputkessa, mikä ominaisuus on olennainen riittävää suun kautta tapahtuvaa rokotusta varten. In vitro tutkimuksissa on havaittu, että viruskannan 675 suhteen ei voitu huomata eroja soluihin kiinnittymisessä käytettäessä DEAE-dekstraania. HEP-viruksen kohdalla taas huomattiin selvästi, että useammat solut infektoituivat viruksella käytettäessä DEAE-dekstraania. Tämä ilmiö voidaan selittää sillä, että viruskanta 675 on puhtaampi, mutta sen pinnassa saattaa myös olla pieniä eroja HEP-virukseen verrattuna.

e) Interferonin nopeampi muodostuminen (noin 60 minuuttia) elimistössä rokotuksen jälkeen johtuen yllämainituista ominaisuuksista. Tämä ominaisuus on tärkeä infektion jälkeistä rokotusta varten.

f) Soluviljelmissä saadaan suurempia pitoisuuksia.

g) Kloonauksella saadaan homogeenisia viruskantoja, jonka seurauksena on pienempi vaara, että viruslaji mahdollisesti palautuu alkuperäiseen patogenisuuteensa, mikä palautuminen käytännöllisesti katsoen ei tapahdu. Tutkittaessa viruskantaa 675 nuorilla (4 viikkoa) hiirillä todettiin, ettei viruksen patogenisuus kasvanut kymmenen perättäisen intracerebraali-sen siirrostuksen jälkeen, kun taas HEP-viruksen kohdalla oli huomattavissa patogenisuuden kasvua jo yhden siirfostuk-sen jälkeen (ks. H.F. Clark, Science, 199 (1978), s. 1072 ja H. Koprowski, Bull. W.H.O., 10 (1954), s. 709). Tämä viruskannan 675 "stabiliteetti" on hyvin tärkeä ominaisuus kun sitä käytetään syöttinä luonnonvaraisten eläinten immunisointi seksi. Tällöin ei saisi esiintyä rokotteen patogenisuuden kasvua · h) Tällä raivotautiviruskannalla on vähiten tauteja synnyttäviä ominaisuuksia toistaiseksi saatavissa olevista kannoista. Tutkimuksissa (Staatliches Veterinär Untersuchungsamt, 6 61 626

Frankfurt am Main) on todettu, että HEP-rokote on patogeeninen hiirille. Kärpän ja ruskean rotan aivoissa voitiin todeta HEP-viruksen replikaatiota. Uusi viruskanta 675 ei osoittanut patogeenisuutta yllä mainittujen eläinlajien kohdalla eikä myöskään lukuisten muiden tutkittujen eläinlajien kohdalla.

On huomattava, että edellä kohdissa a-h esitetyt ominaisuudet osoittavat selvää eroavaisuutta alkuperäisestä HEP Flury-viruksesta.

Yllä mainittujen ominaisuuksien, erikoisesti ominaisuuden (g) ansiosta vakinaisen laadun omaavien rokote-erien valmistus helpottuu, ts. parannetun koostumuksen omaavia rokotteita voidaan valmistaa keksinnön mukaan viruskannasta n:o 675.

Kuten alkuperäinen HEP Flury-rokote keksinnön mukaisen aktiivisen virusrokotteen virus 675 ei lisäänny rokotuksen jälkeen eikä viruksia voida myöskään osoittaa rokotuksen jälkeen.

Tästä uudesta viruksesta keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut rokotteet aiheuttavat hyvin nopean interferonin muodostuksen sekä lisäksi muita tuntemattomia ehkäiseviä ominaisuuksia, esim. solujen välittämän immuniteetin. Niinpä yksi rokotus edellä mainitulla rokotteella patogeenisellä raivotautiviruksella suoritetun infektoinnin jälkeen voi aikaansaada täyden suojan. Interferonin erittäin nopean muodostumisen ja solujen välittämän immuniteetin johdosta keksinnön mukaisten rokotteiden käyttö äskettäin infektoituneiden eläimien suojaukseen raivotautiepidemian aikana on nyt mahdollista. Erikoisesti mahdollisuus ihmisten rokottamiseen infektoitumisen jälkeen on huomattavasti parantunut, koska rokotteet ovat osoittautuneet olevan erittäin tehokkaita eläimissä tartunnan jälkeen, ja koska ne voivat jopa parantaa eläimiä niiden ollessa hyvin pitkälle kehittyneessä infektoidussa tilassa. Aktiivisen virusrokotteen ei-parenteraalinen, esim. suun kautta tapahtuva anto helpottaa sen käyttöä organisoidussa rokotus-kampanjassa.

7 61626

Viruskannasta 675 valmistetulla aktiivisella virusrokotteella on seu-raavat mahdolliset edut infektiota edeltävässä rokotuksessa.

A) Eläimissä: 1. Kettujen ja muiden epidemiologisesti tärkeiden eläimien immunointi on mahdollista raivotautirokotetta sisältävien syöttien avulla.

2. Muiden eläinten, esimerkiksi kulkukoirien rokotus suun kautta maissa, joissa niiden tappaminen on kielletty uskonnollisista ja/tai lainsäädännöllisistä syistä.

3. Suurimittainen aktiivinen virusrokotteen anto syöttien avulla, niin että rokotuskampanjaa voidaan huomattavasti yksinkertaistaa. Esimerkiksi virusrokotetta sisältävien syöttien jakelu lentokoneesta.

4. Kotieläinten tehokas suojaus infektion jälkeen käytettäväksi maissa, joissa tällaiset rokotusmenetelmät on laillistettu, tai maissa, joissa eläimet voidaan pitää elossa infektion jälkeen edellyttäen, että ne on jo immunoitu.

B. Ihmisissä: 1. "Oraalinen rokotus" on potilaan kannalta kivuton. Hyvin useassa maassa pelätään rokotusta mikä aiheuttaa sen, että useat potilaat eivät palaa ottamaan vaadittua määrää rokotuksia.

2. Suun kautta tapahtuva rokotus ei aiheuta paikallisia reaktioita tai ärsytyksiä, jotka muodostavat tosiasiallisen haitan nykyisin kaupallisesti saatavissa olevia aikaisempia rokotteita käytettäessä.

3. Helppo laajamittainen rokotus lääketieteellisesti kouluttamattoman henkilökunnan suorittamana on tullut mahdolliseksi (vertaa suun kautta tapahtuvaa poliomyelitis-rokotusta).

Tässä yhteydessä se tosiasia, että yksi ainoa rokotus on osoittautunut riittäväksi, on katsottava tärkeäksi seikaksi.

‘ ‘ rt 61626

Uusia rokotteita valmistetaan tavallisilla menetelmillä, ts. in vitro suoritettujen soluviljelyjen avulla, käyttäen tavanmukaisia ja säädettyjä valvontatoimenpiteitä bakteeri- ja/tai viruskontaminaatioiden eliminoimiseksi tunnettujen periaatteiden ja kansainvälisten standardivaatimusten mukaisesti.

Tämän keksinnön mukaisia uusia rokotteita valmistetaan sopi-vimmin kasvattamalla raivotautivirusta 675 primaarisissa tai sekundaarisissa kananpoika-alkion fibroblasteissa yksisolu-kerroksissa, jotka ovat peräisin 10 päivää vanhoista kanan-poika-alkioista (SPF). Kuitenkin voidaan käyttää myös muita solusysteemejä, jotka riittävän herkästi saavat raivotauti-tartunnan, kuten muita linnuista peräisin olevia soluja tai nisäkässoluja, esim. Baby Hamster Kidney 21 (21 siirtoa) yk-sikerrosviljelmiä varten tai BHK-21 13S (13 suspensioviljel-mäsiirtoa) suspendoitua viljelyä varten, mutta tässä tapauksessa vain eläinrokotteita varten. Suspendoidulla soluvilje-lysysteemillä on se suuri etu, että se tekee mahdolliseksi virusrokotteiden valmistuksen suuren tilavuuden omaavissa fermentoreissa, mikä helpottaa tuotantoa.

Rokotteita voidaan myös valmistaa mikrokantajilla kasvatetuissa soluissa (helmi-soluviljelysysteemi). Esimerkiksi voidaan käyttää polydekstraanihelmiä, joita on käsitelty suuri-molekyylisillä anioneilla ennen solujen kasvatusta ja/tai sen aikana, ja joiden pinnassa on riittävä varaustiheys solujen kasvua varten. Tällä tavalla haluttu virus voidaan istuttaa sekoituksen alaisena olevaan nestenmäiseen väliaineeseen, joka sisältää soluja ja helmiä ja viruksen lisääntymisen jälkeen helmien annetaan laskeutua pohjaan ja erota virussuspensiosta.

Kasvatettaessa raivotautivirusta 675 kananpoika-alkion fibroblastissa nämä infektoidaan raivotautiviruskannalla n:o 675, jonka m.o.i. on sopivasti (luku, joka ilmaisee montako virusta in-fektoi kunkin solun eli infektiokyky) on 0,02-1 pfu/solu (plaque forming unit, ilmaisee virusten kyvyn muodostaa plakkeja), in-fektioajan ollessa sopivimmin vähintään 1 tunnin pituinen. Kiinnitty-mättömän viruksen poistamisen jälkeen lisätään elatusainetta, jonka sopivimmin muodostaa Basal Medium Eagle (BME)Earle'n suolaliuoksessa, johon on lisätty sopivat määrät antibiootteja 9 61 626 (esim. 100 IU penisilliiniä ja 100 mikrogrammaa streptomysiiniä) sekä 0,2-0,5 % albumiinia. On huolehdittava siitä, että ela-tusaineen pH pidetään arvossa 8,0-8,2. Viruksella infektoituja soluja inkuboidaan lämpötilassa 32-39°C 3-10 vuorokautta, minkä jälkeen elatusaine pakastetaan -70°C:ssa tai alemmassa lämpötilassa solujen särkemiseksi ja viruksen vapauttamiseksi (lisäten pitoisuutta). Solut ja solujätteet poistetaan suodattamalla tai linkoamalla steriileissä olosuhteissa. Suodos tai linkoamisessa jäänyt neste säilytetään lämpötilassa -70°C, ja näytteitä otetaan titrausta varten käyttäen edellä mainittua in vitro suoritettavaa plakinmuodostusmenetelmää.

Myös muita menetelmiä voidaan käyttää solujen särkemiseen inkuboinnin jälkeen, esim. saattamalla solususpensio ultraäänivärähtelyn alaiseksi.

Vaihtoehtoisen valmistusmenetelmän mukaan soluja BHK-21 13S kasvatetaan suspensiossa, esim. riippuvan tangon käsittävässä pyörityspullossa, käyttäen viljelmää varten väliainetta BHK-21, johon on lisätty pieniä määriä tryptoosifosfaatti-ravinto-liuosta (7-15 %), inaktivoitua vasikanseerumia (7-15 %) ja antibiootteja (esim. 100 IU penisilliiniä ja 100 mikrogrammaa streptomysiiniä). Soluja kasvatetaan kunnes on saavutettu li-kimain taso 2 x 10 solua/ml, samalla kun solususpensiota sekoitetaan riittävästi solujen pysyttämiseksi suspensiossa ja niiden yhteenkasautumisen välttämiseksi.

Kun solut on lingottu sentrifugin avulla, suoritetaan infek-tointi 30-60 minuutin aikana raivotautiviruskannalla 675, jonka m.o.i. on välillä 0,02-1 pfu/solu, samalla jatkuvasti sekoittaen.

Infektoinnin jälkeen solut suspendoidaan jälleen pyörityspullos-sa olevaan elatusaineeseen, jonka muodostaa viljelyväliaine BHK-21, johon on lisätty pienet määrät nautaseerumialbumiinifrak-tiota V, esim. 0,1-0,4 paino-%, sekä antibiootteja (esim. kanamysiiniä tai neomysiiniä, esim. 50-300 mikrogrammaa), säätäen samalla pH välille 7,5-8,0. Infektoinnin aikana lämpötila pidetään arvossa 32-35°C, edullisemmin arvossa 33°C, ja joka päivä pyörityspullosta otetaan pieni näyte tutkittavaksi *4 10 Ä , 6162 6 immuunifluoresenssimenetelmän avulla. 2-3 vuorokautta infektoin-nin jälkeen 80-100 % näytteen soluista osoittaa raivotauti-virukselle ominaista immuunitluoresenssia 8 9 senssia sytoplasmassa, vastaten tiitteriä 10 -10 pfu/ml 4-6 vuorokauden kuluttua infektoinnista suoritetussa talteenotta-misessa. Virusta talteenotettaessa neste poistetaan pullosta ja säilytetään pakastettuna lämpötilassa -70°C.

Solujen ja solujätteiden poiston jälkeen pieni näyte titrataan plakkititrausmenetelmällä. Jos hyväksyttävä pitoisuus (välillä 10 -10 ' pfu/ml tai suurempi) on saavutettu, solut ja solu- jätteet poistetaan tuotteesta joko suodattamalla tai linkoamalla steriileissä olosuhteissa.

Sopivan stabilointiaineen lisäämisen jälkeen neste on valmis esim. jaettavaksi pieniin lääkepulloihin lopullisen tuotteen kylmäkuivausta varten.

Myös inaktivoidut raivotautirokotteet, jotka parhaiten sopivat käyttöön ihmisissä, sisältyvät tämän keksinnön piiriin.

Näitä inaktivoituja raivotautirokotteita voidaan valmistaa inaktivoimalla virus valmistetuissa viljelynesteissä tunnetuilla menetelmillä tai niiden muunnoksilla, esim. lisäämällä beta-propiolaktonia, formaliinia tai asetyylietyleeni-imiiniä, tai ultraviolettisäteilyn avulla.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut raivotautirokotteet voivat sisältää yhden tai useamman sopivan stabilointiaineen, säilytysaineen, puskuri-suolan ja apuaineen.

Sanonnalla suolen kautta tapahtuva rokotus, tarkoitetaan "rokotteen" antamista muodossa, joka vapauttaa sen suolistossa.

Keksintöä kuvataan seuraavien esimerkkien avulla.

% 61626

Esimerkki I

Primaaristen tai sekundaaristen kananpoika-alkion fibroblastien (SPF) yksisolukerrokset, jotka solut on kasvatettu paikallaan pysyvissä tai pyörivissä pulloissa, infektoidaan raivotauti-viruskannalla 675, jonka m.o.i. on välillä 0,02-1 pfu/solu.

Pienempiä virusmääriä voidaan myös käyttää, mutta inkubointi-aika on tällöin pitempi. Ymppiviruksen kiinnittämiseen soluihin tarvitaan vähintään 1 tunnin pituinen infektioaika. Sen jälkeen kiinnittymätön virus poistetaan, ja lisätään elatus-ainetta, jonka muodostaa Basal Medium Eagle (BME) Earle'n suolaliuoksessa, johon on lisätty sopivat määrät antibiootteja sekä 0,2 % sen lajin albumiinia, johon rokotetta tullaan käyttämään, pitäen huolta siitä, että elatusaineen lopullisen seoksen pH on 8,2.

Viruksella infektoitujen solujen inkubointi lämpötilassa 33-35°C 4-8 vuorokautta aikaansaa selvän sytopaattisen (CPE) vaikutuksen, ja väliaine pakastetaan sen jälkeen lämpötilassa -70°C.

Tuotteen sulattamisen jälkeen solut ja solujätteet poistetaan linkoamalla kiihtyvyydellä 1000 g tai suodattamalla membraani-suodattimen (huokoskoko 5 mikrometriä) lävitse steriileissä olosuhteissa. Joko linkouksessa tai suodatuksessa saatu neste säilytetään lämpötilassa -70°C, ja otetaan näytteitä tiirattaessa in vitro suoritettavalla plakkimuodostusmenetelmällä Bijlenga, G., Joubert, L., Bull. Soc. Sei. V§t. et Möd. ComparSe, 1974, 76:429.

Infektoinnin jälkeen tapahtuvaa rokotusta varten vaaditaan roko- g te-eriltä tiitteriarvoa 10 pfu/ml, tehokkaan rokotuksen aikaansaamiseksi. Ennen infektiota tapahtuvaa rokotusta varten 7 voidaan tiitteriarvo 10 pfu/ml vielä hyväksyä.

Rokote-erien valmistusta edellä selostetulla tavalla valvotaan tavanmukaisilla tehokkuuskokeilla (NIH- ja Habel-koe), ja infektion jälkeiseen käsittelyyn tarkoitettuja eriä varten on lisäksi otettu käyttöön uusi tehokkuuskoe, joka on selostettu kirjoituksessa: Bijlenga, G., Symposium on Advances in Rabies Research, Atlanta, Georgia, USA, 1976-09-07-09, sivu 14.

Tässä uudessa tehokkuuskokeessa paikallista luonnonvaraista virusta injektoidaan lihaksensisäisesti (i.m.) 4 viikon ikäisiin 12 61 626 hiiriin, ja sen jälkeen suoritetaan 24 tunnin kuluessa yksi vatsaontelonsisäinen rokotus 5 ml :11a rokotetta. Kaikkien rokotettujen hiirien pitäisi jäädä eloon, kun taas 50 % kontrollihiiristä pitäisi kuolla ennen kolmen viikon testikau-den päättymistä.

Lisäksi suoritetaan tavanmukaiset valvontakokeet rokote-erien mahdollisen bakteeri- ja viruskontaminaation toteamiseksi sekä rokotteiden valmistukseen käytettävien primaaristen ja sekundaaristen solujen ja solusukupolvien tarkastukset kansainvälisesti vahvistettujen minimivaatimusten mukaisesti.

Esimerkki II

Soluja BHK-21 13S kasvatetaan suspensiossa sekoitussauvalla varustetussa pyörityspullossa, käyttäen viljelmää varten väliainetta BHK-21, johon on lisätty 10 % tryptoosifosfaatti-ravintoliuosta ja 10 % inaktivoitua vasikkaseerumia, antibioottien (100 IU penisilliiniä ja 100 mikrogrammaa streptomysiiniä) läsnäollessa. Soluja kasvatetaan kunnes on saavutettu solutihbys 2 x 10ö solua/ml, samalla kun soluja sekoitetaan riittävästi niiden pysyttämiseksi suspensiossa sekä niiden yhteenkasautumi-sen välttämiseksi.

Kun solut on lingottu sentrifugin avulla käyttäen nopeutta 800 kierrosta minuutissa, suoritetaan infektointi 45 minuutin ajan raivotautiviruskannalla 675, jonka m.o.i. on välillä 0,01-1 pfu/solu, samalla jatkuvasti sekoittaen. Infektoinnin jälkeen solut suspendoidaan jälleen pyörityspullossa olevaan elatusaineeseen, jonka muodostaa viljelyväliaine BHK-21, johon on lisätty 0,2 % nautaseerumialbumiinifraktiota V sekä sopivat määrät hyväksyt-täviä antibiootteja (esim.kanamysiiniä tai neomysiiniä), säätäen samalla pH arvoon 7,8. Infektoinnin aikana lämpötila pidetään arvossa 33°C, ja jöka päivä pyörityspullosta otetaan pieni näyte tutkittavaksi immuunifluoresenssimenetelmän avulla. 2-3 vuorokautta infektoinnin jälkeen 80-100 % näiden näytteiden soluista pitäisi osoittaa raivotautivirukselle ominaista immuunifluoresenssia sytoplasmassa, mikä varmistaa riittävän tiit-8 9 terin 10 -10 pfu/ml esiintymisen virusta talteenotettaessa 4-6 vuorokauden kuluttua infektoinnista.

i 13 61 6 2 6

Virusta talteenotettaessa neste poistetaan pullosta ja sitä säilytetään pakastettuna lämpötilassa -70°C. Solujen ja solu-jätteiden poiston jälkeen pieni näyte tuotteesta pidetään erillään titrattavaksi plakkititrausmenetelmällä. Jos tiitteri on hyväksyttävissä (välillä 10'' -10 ' pfu/ml tai suurempi), solut ja solujätteet poistetaan koko tuotteesta, kuten edellä on selostettu, ja neste on valmis sopivan stabilointiaineen lisäämisen jälkeen jaettavaksi pieniin lääkepulloihin lopullisen tuotteen kylmäkuivausta varten.

Vaihtoehtoista menetelmää, vielä suurempien tiitteriarvojen saavuttamiseksi, voidaan käyttää infektoimalla joko stationäärisiä yksisolukerroksia tai tällaisia kerroksia pyörivissä viljelypulloissa. 2-8 tuntia infektoinnin jälkeen solut trypsinoidaan ja viedään suspensioviljelmään, kuten edellä on selostettu. On huolehdittava siitä, ettei solujen kasautumista tapahdu. Tällä tavalla voidaan käyttää suurempaa pitoisuutta kuin 2 x 10 solua/ml, mikä aikaansaa suurempia tiitteriarvoja tuotteelle riippuen suspensioviljelmään vietyjen infektoitujen solujen lukumäärästä.

Farmakologinen tutkimus Tämän keksinnön mukaisten aktiivisten ja inaktiivisten raivotautirokotteiden tehokkuuden tutkimiseksi on seuraavassa esitetty eräitä tuloksia, jotka on saatu ennen infektiota ja infektion jälkeen suoritetuissa rokotuskokeissa: A: Kettujen rokotus suun kautta aktiivisella raivotautirokote-

Q

kannalla 675 (2 ml/kettu), rokotteen tiitterin ollessa 2 x 10 pfu/ml.

λ 14 61 626

Ketun Ikä ro- Seerumin tiitteri (IU*) Tartu- tunnus- kotus- Q 1Λ ... ., tus305 numero hetkellä ^ (7.10.75) (21.11.75) (23.12.75) (11.8.75)

Suun 84 5 kk. 4,0 7,0 8,2 suojattu kautta 86 6 kk. 1,3 1,6 1,4 suojattu rokote- 88 6 kk. 2,0 2,4 3,2 suojattu tut eläimet Köntrol- 83 6 kk. kuoli 15 vrk.

li- eli kuluttua rokotta- 85 6 17 vrk· kuluttua mattanat __ 92 6 kk. kuoli 18 vrk.

eläimet kuluttua *IU (kansainvälinen yksikkö) = seerumin laimennus 1/300, mikä laimennus aikaansaa 50 %:n vähenemän plakin muodostumisessa.

^^Hyvin suurta infektioviruksen (saatu luonnollisen infektion saaneen ketun sylkirauhasesta) annosta, nimittäin 1 391 610 MLD^-yksikköä, käytettiin rokotteen suojauskyvyn määrittämiseksi.

Tämä koe todistaa nuorten kettujen suun kautta tapahtuvan rokotuksen tehokkuuden. Kettujen immuniteettireaktiot osoittavat riittävää serokonversiota ja hyviä tiitteriarvoja. Enemmän kuin viisi kuukautta rokotuksen jälkeen kaikki kolme kettua oli täysin suojattuja, ja rokottamattomat kolme kettua kuolivat hyvin lyhyen itämisajan kuluessa, mikä johtui erittäin suuresta infektiovirusannoksesta, joka istutettiin lihaksensisäisesti oikeaan takajalkaan. Ketuille tavallisesti käytetty infektio-annos on 3000 MLD^Q-yksikköä.

B: Serologiset tulokset inaktivoidulla kannalla 675 joko lihak sensisäisesti tai ihonalaisesti suoritetun rokotuksen jälkeen: is 616 2 6

Eläin- Eläimen Rokote- Seerumitiitterit 4 viikkoa laji paino (kg) annos rokotuksen jälkeen

Koira 1 6,5 2 ml i.m. 6,8 28 2 ml i.m. 6,3 3 12 2 ml i.m. 5,5 4 10 2 ml i.m. 12,3 5 15 2 ml i.m. 5,9 6 14 2 ml i.m. 4,5 7 17 2 ml i.m. 3,8 8 17 2 ml i.m. 20,5

Lehmä 1 200 5 ml s.c. 4,5 2 400 5 ml s.c. 8,5 3 300 5 ml s.c. 15,5 4 500 5 ml s.c. 4,8 5 400 5 ml s.c. 7,6 6 600 5 ml s.c. 8,9 7 500 5 ml s.c. 3,8 8 400 5 ml s.c. 4,7 i.m. = lihaksensisäisesti, s.c. = ihonalaisesti

Vain yksi rokoteruiske annettiin, ja tiitteriarvot on ilmoitettu yksiköissä IU samoin kuin edellisessä taulukossa.

Neljän viikon kuluttua rokotuksesta ko. kahdeksan koiraa ja kahdeksan nautaa osoitti hyvin suuren tiitteriarvon omaavaa serokonversiota. Serokonversioon tarvittavan minimitiitterin on Euroopan Farmakopen vahvistanut arvoksi 0,2 IU/ml.

C: Laboratoriohiirien suojaus aktiivisella ja inaktivoidulla kannalla 675 vatsaontelonsisäisesti antamalla, luonnonvaraisella aktiivisella viruksella (ketusta lähtöisin olevalla) suoritetun infektoinnin jälkeen: 16 61 626

Tnfektoinnin ja rokotuksen välinen aika

Rokote- 12345678 9*** tyyppi 1 h vrk. vrk. vrk. vrk. vrk. vrk. vrk. vrk. vrk.

Aktiivinen rokote 675*

Lainventa- maton 0/10** 1/10 1/10 1/10 2/10 0/10 0/10 4/10 5/10 3/10 10_1 3/10 10"2 4/10 10~3 6/10 10"4 8/10

Kontrollit 6/10 8/10 7/10 7/10 7/10 7/10 6/10 6/10 6/10 8/10

Inaktiivinen rokote 675*

Laimentama- ton 0/10 1/10 5/10 10"1 1/10 10-2 6/10 10"3 8/10 10"4 6/10 X o o

Rokotteen tiitteri 10 ' pfu/ml, (inaktiivisen rokotteen tiit-teri määrättiin ennen inaktivointia)

XX

Kuolleitten lukumäärä/rokotettujen hiirien lukumäärä

XXX

Kaksi rokotusta (vuorokausina 9 ja 11).

Kaikkiin tässä taulukossa lueteltuihin hiiriin istutettiin lihaksensisäisesti ketun sylkirauhasesta saatua raivotautivirusta (0,1 ml liuosta), joka tappoi 60-80 % kontrollihiiristä, itämisajan ollessa 9-11 vuorokautta.

Aktiivista ja inaktivoitua rokotevirusta 675 annettiin yhtenä annoksena (0,5 ml) vatsaontelonsisäisesti eri aikoina alku-infektoinnin jälkeen, kuten taulukossa on osoitettu.

Aktiivinen laimentamaton rokote suojasi vielä 6 vuorokautta infektoinnin jälkeen, mitä ei ole koskaan aikaisemmin todettu muiden kaupallisesti saatavissa olevien rokotteiden suhteen.

17 61 626 Tämä suojaus osoittaa, että hiiret voidaan parantaa vieläpä raivotautiviruksen päästyä keskushermostoon.

Käyttäen kahta rokotusta yhden päivän välein ja aloittaen 9 vuorokautta tartutuksen jälkeen muutamat hiiristä tulivat vielä suojatuiksi.

Tätä aktiivista rokotetta voitiin myös laimentaa kymmenkertaisesti, ja se antoi suojan, mutta ei pitemmäksi aikaa kuin 24 tunniksi infektoinnin jälkeen.

Inaktivoitu rokote suojasi vain silloin, kun sitä oli annettu 24 tunnin aikana infektoinnin jälkeen, ja sitä voitiin myös laimentaa, mutta ei enempää kuin kymmenkertaisesti.

Claims (3)

61 626 18

1. Menetelmä aktiivisten ja inaktivoitujen raivotautivirusrokotteiden valmistamiseksi, jotka sopivat annettavaksi, sekä paren-teraalisesti että ei-parenteraalisesti, kasvattamalla in vitro rai-votautiviruskantaa sinänsä tunnetulla tavalla solusysteemeissä, jotka ovat peräisin linnuista tai nisäkkäistä, ja pakastamalla saatu solususpensio lämpötilassa -70°C tai alempana ja/ tai ultraäänikä-sittelemällä solususpensiota solujen särkemiseksi ja viruksen vapauttamiseksi, ja sen jälkeen poistamalla solut ja solujätteet suodatuksen tai sentrifugoinnin avulla steriileissä olosuhteissa, sekä lopuksi mahdollisesti inaktivoimalla viljelynesteissä oleva virus tunnettuja menetelmiä käyttäen ja valmistamalla rokote tunnettuja menetelmiä käyttäen, tunnet tu siitä, että menetelmässä käytetään uutta raivotautiviruskantaa n:o 675, joka on deponoitu Prahan hygienian ja kulkutautiopin laitoksen kokoelmaan "Czechoslovak National Collection of Type Cultures" numerolla CNC TC AO 4/77.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelnä, tunnettu siitä, että kananpoika-alkion fibroblasteja infektoidaan vähintään yhden tunnin ajan raivotautiviruskannalla n:o 675, jonka infektiokyky eli m.o.i. -luku on 0,02-1 pfu/solu, ja kiinnittymättömän viruksen poistamisen jälkeen lisätään pH-arvon 8,0-8,2 omaavaa elatusainetta, edullisesti Basal Medium Eagle (bME) Earle'n suolaliuoksessa, johon on lisätty sopivat määrät antibiootteja sekä 0,2-0,5 % albumiinia, ja viruksella infektoituja soluja inkuboidaan lämpötilassa 32-39°C 3-10 vuorokautta, minkä jälkeen solut ja väliaine pakastetaan lämpötilassa -70°C tai alemmassa ja poistetaan solut ja solujätteet suodattamalla tai sentrifugoimalla pakastuskäsittelyn jälkeen steriileissä olosuhteissa, sekä lopuksi vil jelynesteissä oleva virus mahdollisesti inaktivoidaan, ja valmistetaan rokote tunnettuja menetelmiä käyttäen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluja Baby Hamster Kidney 21 13 S (13 suspensiovil jelysiirtoa), jotka on kasvatettu pyörityspullossa viljelyväliaineen BHK-21 suspensiossa, johon on lisätty pieniä määriä tryptoosifosfaatti-ravin-toliuosta, inaktivoitua vasikkaseerumia ja antibiootteja, kunnes on saavutettu likimain solutiehys 2 x 10^ solua/ml, infektoidaan noin 45 minuutin ajan raivotautiviruskannalla 675, jonka m.o.i.-luku on 0,01-1 pfu/ solu,samalla sekoittaen, minkä jälkeen virusta inkuboidaan 19 61 626 BHK-21 viljelyväliaineessa, johon on lisätty 0,2 % nautaseerumi-albumiinifraktiota V sekä sopivat määrät antibiootteja, pH-arvossa 7,5-8,0 ja lämpötilassa 32-35°C 4-6 vuorokautta, ja inkuboinnin päätyttyä solut ja väliaine pakastetaan lämpötilassa -70°C tai alemmassa lämpötilassa, jota seuraa suodatus tai linkoaminen steriileissä olosuhteissa solujen ja solujätteiden poistamiseksi, minkä jälkeen viljelynesteissä oleva virus mahdollisesti inaktivoidaan, ja valmistetaan rokote tunnettuja menetelmiä käyttäen.