KR20020013378A - 난내 투여용 ｉｂｄｖ 균주 - Google Patents

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에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크
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Abstract

본 발명은 신규한 전염성 점액낭병 바이러스인 균주 689를 제공하는데, 이 균주는 난내(in ovo) 투여용 백신 후보물로서 적합하며, 영국, 윌트샤인, 샐리스베리에 소재하는 유럽 세포 배양물 수집소(European Collection of Cell Cultures)에 V00012609로 기탁되어 있다.

Description

난내 투여용 ＩＢＤＶ 균주{IBDV STRAIN FOR IN OVO ADMINISTRATION}
본 발명은 전염성 점액낭병 바이러스(Infectious Bursal Disease Virus; IBDV) 균주의 바이러스, 전염성 점액낭병(IBD)에 대한 백신, 상기 바이러스의 제조 방법, 백신 제조 방법 및 백신을 제조하기 위한 상기 바이러스의 용도에 관한 것이다.
버나비리대(birnaviridae) 과의 한 구성원인 전염성 점액낭병 바이러스(IBDV)는 많은 가금류 생산 지역에서 풍토병을 일으킨다. IBDV에는 혈청형 1과 혈청형 2의 2가지 혈청형이 존재한다. 이 2가지 혈청형은 바이러스 중화(VN) 시험으로 구별할 수 있다. 더욱이, 혈청형 1의 하위형이 분리되어 왔다. 이들 소위 혈청형 1의 "변종" 바이러스는 교차 중화 시험[참조: P.D. Lukert 및 Y.M. Saif, Disease of Poultry, 9판, Wolfe Publishing Ltd., Ch. 28, 648-663 (1991)], 모노클로날 항체 패널[참조: Snyder, D.B. 등, Arch. Virol. 127, 89-101 (1992)] 또는 RT-PCT[참조: Jackwood, D. J. Proceedings of the International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 155-161 (1994)]에 의해 동정할 수 있다. IBDV의 이들 혈청형 1의 하위형중 일부의예로는 전형적인 균주, 변이주-E, GLS, RS593 및 DS326 균주를 들 수 있으며, 이들은 문헌[참조: Van Loon 등, Proceedings of the International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 179-187 (1994)]에 기재되어 있다.
IBDV는 굼보로병(Gumboro disease)이라고도 하는 전염성 점액낭병(IBD)을 유발시키는데, 이 질병은 림프양 조직을 가진 병아리에서 유발되는 급성이며, 전염성이 높은 질병인데, 상기 림프양 조직은 파브리시우스낭의 세포에 대한 선택적 지향성을 가진 상기 바이러스의 1차 표적이다. 감수성 조류의 이환률은 높으며, 빠른 체중 감소와 중간 정도의 사망률을 동반한다. 상기 질병으로부터 회복된 병아리는 면역 결핍증을 나타낼 수 있는데, 그 이유는 상기 병아리의 방어 기작에 필수적인 파브리시우스낭이 파괴되었기 때문이다. 상기 IBDV는 3주 보다 어린 병아리에서 심한 면역억제를 유발시키며, 생후 3 개월까지 점액낭 병변을 유도한다.
상기 질병은 다년간 약독화된 생 IBDV 백신으로 초회항원자극한 병아리에게 불활성화된 백신을 투여하여 종축 가축무리에서 높은 농도의 항체를 유도함으로써 예방할 수 있었다. 이는 IBD에 의해 초래되는 경제적 손실을 최소화하였다. 백신접종한 종축으로부터 유도된 병아리의 모계 항체는 IBDV의 초기 감염을 예방하였으며, 면역억제와 관련된 문제점을 감소시켰다. 또한, 약독화된 생 백신은 모계 항체의 감소 이후에도 상업적인 병아리 무리에서 성공적으로 사용되어 왔다.
최근, 독성이 매우 강한 IBDV 균주가 유럽에서 사망률이 높은 질병을 유발시켰다. 현재의 백신접종 프로그램으로는 병아리들을 충분히 보호할 수 없었다.
전형적인 생 IBDV 백신은 일반적으로 수분 섭취, 에어러졸(거친 스프레이) 또는 눈 내부(안약)를 통해 부화된 병아리에게 투여하였다. 이들 부화후 투여법은 몇가지 단점을 갖고 있는데, 그중에서도 가장 중요한 것은 특히 대규모로 사육하는 경우 투여에 소요되는 노동력으로 인한 비용 문제였다.
배(embryo) 백신으로서 백신의 이용(소위 난내 백신)은 이미 제안되어 왔다[참조: Sharma 등; Avian disease 29, 1155-1169 (1985)].
원칙적으로, 배 백신접종(난내 백신접종)은 특정 질병에 대한 초기 저항성 및 다중 주입 헤드가 장착된 반자동 기계를 이용하여 각각의 난 내로 균일한 양의 백신을 투여할 수 있다는 점에서 이롭다.
일반적으로, 조류의 부화후 백신접종을 위한 전통적인 백신은 난내 투여를 위해서는 사용할 수 없다. 후기 배는 부화된 병아리에게는 안전하게 사용할 수 있는 이들 백신 바이러스를 포함하는 조사된 대부분의 바이러스 감염에 대한 감수성이 매우 높다. 실시예 1로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 부화된 병아리에서 눈내로 투여, 거친 스프레이에 의한 투여 및 수분 섭취에 의한 투여를 수행하기 위해 시판되는 IBDV 백신은 난내 투여를 위해서는 적합하지 않다.
난내 투여용 IBDV 백신은 소위 "복합 백신"으로 이용되었다. 이 백신은 생 IBD 바이러스와 생 바이러스의 병원성을 감소시키기 위한 바이러스 중화 인자(VNF)를 함유하는 병아리 혈청의 혼합물로 구성된다[참조: Whifill 등; Proceedings of XIX World's Poultry Congress, Amsterdam, The Netherlands, 453-455 (1992)]. 다른 IBDV 복합 백신은 등록상표 Bursaplex(엠브렉스, 인크.) 및 등록상표Bursamune(포트 도쥐)로 시판되고 있다.
상기 시판되는 복합 백신은, 단독으로 사용하는 경우 및 바이러스 중화 인자를 함유하는 혈청과 혼합하지 않은 경우, 백신접종된 난의 부화율을 감소시키는 독성이 매우 높은 병원성 IBDV 균주(소위 핫 균주)를 이용한다는 단점이 있다. 그러나, 생 IBD 균주에 이러한 병아리 혈청을 첨가하는 것은 생 IBDV 균주만을 함유하는 백신과 비교할 때 IBDV 백신의 제조 단가를 상승시키게 된다.
생 IBDV 복합 백신 및 생 IBDV 백신의 안전성 및 효능은 난내 투여후 Jungback 등[참조: Abstracts of XI International Congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest Hungary, 191ff, 1997]에 의해 시험되었다. 그 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 난내 투여후 시험한 백신은 유럽 약전에서 요구하는 효능을 충족시키지 못했는데, 그 이유는 난내 백신접종한 병아리의 10% 이상이 병원성 IBDV 균주를 이용한 2차 항원투여(challenge)후, 파브리시우스낭의 심한 균주 병변을 나타내기 때문이다.
본 발명의 목적은 백신접종된 난의 부화율에 부정적인 영향을 끼치지 않으면서, 바이러스 중화 인자를 함유하는 혈청의 부재 하에서 난내 투여할 수 있는 IBDV의 안전하고, 효능있는 저자극성 균주를 제공하는 것이며, 또한 IBD를 예방하기 위한 백신을 제조하기 위한 저렴한 제조 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 바이러스를 제공하는데, 이는 균주 689로 지정된 IBDV 균주이며,샘플이 영국 에스피4 오제이지 윌트샤인 샐리스베리에 소재하는 유럽 세포 배양물 수집소(ECACC)에 기탁번호 V00012609로 기탁되어 있다. 본 발명에 따른 IBD 바이러스 균주 689는 기존의 IBDV(백신) 균주와 구별되는데, 이는 난내 투여용으로 안전하며, 병아리에서 고체 면역 반응을 유도할 수 있다.
IBDV 균주 689의 바이러스는 기탁된 바이러스로부터 유도된 바이러스 뿐만 아니라 기탁된 바이러스로부터 유도된 후대 바이러스 및 예를 들어, 배 형성된 난 또는 세포 배양에서 예를 들어, 일련의 계대배양에 의해 획득할 수 있는 바이러스를 의미한다.
IBDV 균주 689는 IBDV의 저자극성 징후를 나타내는 필드의 병아리 파브리시우스낭으로부터 분리하였다. 파브리시우스낭은 균질화하고, 병아리 배 섬유아세포(CEF) 상에 위치시켰다. 5일 동안 항온처리한 후, 세포병원성 효과(CPE)를 시각화하고, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 이용하여 IBDV로 특정화하였다. CEP에 대해 두번째 계대배양을 수행하고, 이 물질(계대배양 레벨 2)을 실시예 3에서 사용하였다. IBDV 균주 689는 추가로 3회 플라크 정제하고, 프리 시드(pre seed)를 제조한 다음 매스터 시드(계대배양 레벨 7)를 제조하였다. 상기 매스터 시드 바이러스는 실시예 2에서 사용하였다.
IBDV 균주 689는 Van Loon 등에 의해 모노클로날 항체(Moab)를 이용하는 ELISA로 동정하였다[참조: Van Loon, A.A.W.M., D. Lutticken and D.B. Snyder. Rapid quantification of infectious bursal disease(IBD) challenge, field or vaccine virus strains. International symposium on infectious bursal diseaseand chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 179-187 (1994)].
실시예 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689는 시판되는 IBDV 백신 균주 노빌리스 굼보로 균주 D78(네덜란드 복스미어 소재의 인터벳 인터내쇼날)와 함께 전형적인 형태의 IBDV에 속하는데, 그 이유는 상기한 균주 둘 다는 상이한 모노클로날 항체에 대해 동일한 반응 패턴을 가지며, CPE를 유도하는 1차 CEF 상에서 복제할 수 있기 때문이다.
실시예 2 및 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689는 파브리시우스낭 내에서 심한 병변을 유발하지 않은 전형적인 독성 IBDV 및 변이주-E IBDV를 이용한 2차 항원투여에 대한 보호성 면역 반응을 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스는 생 형태 및 불활성화된 형태로 제공되는데, 생 형태가 바람직하다.
본 발명의 다른 관점은 IBD에 대한 백신에 관한 것인데, 이 백신은 상기 정의한 바와 같은 바이러스와 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
생 바이러스를 함유하는 백신은 제조할 수 있으며, 현탁액 또는 동결건조된 형태로 시판할 수 있으며, 이러한 조성물 제조에 전통적으로 사용되는 약학적 허용 담체 또는 희석제를 추가로 함유한다. 담체로는 안정제, 보존제 및 완충제를 들 수 있다. 적합한 안정제의 예로는 SPGA 탄수화물(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로즈, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코즈), 단백질(예를 들어, 건조된 우유 혈청, 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 생성물들을 들 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 알칼리 금속 인산염을 들 수 있다. 적합한 보존제의 예로는 티메로살, 메르티올레이트 및 젠타마이신을 들 수 있다. 희석제는 물, 수성 완충액(예를 들어, 완충 염수) 및 폴리올(예를 들어, 글리세롤)을 들 수 있다. 필요에 따라, 본 발명에 따른 생 백신은 보조제를 함유할 수도 있다. 보조제 활성을 보유하는 적합한 화합물 및 조성물의 예로는 후술하는 것과 동일한 것들을 들 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 불활성화된 형태의 IBDV 균주 689를 포함하는 백신이 제공된다. 불활성화된 백신의 주 잇점은 장기간 지속되는 고농도의 항체를 얻을 수 있다는 것이다. 불활성화된 IBDV 바이러스를 함유하는 백신은 예를 들어, 이 목적에 적합한 1종 이상의 상기한 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 불활성화된 백신은 보조제 활성을 보유하는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해 적합한 화합물 또는 조성물은 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 또는 산화 알루미늄, 예를 들어 광유(예, Bayol(등록상표) 또는 Marcol(등록상표)), 또는 식물성 기름, 예를 들어 비타민 E 아세테이트 및 사포닌을 주성분으로 하는 수중유 또는 유중수 에멀젼을 들 수 있다.
본 발명의 백신은 임의의 적합한 수단에 의해 조류에게 투여할 수 있다. 부화후 투여 수단의 예로는 경구 투여(예, 사료 또는 식수에 의한 투여), 비경구 투여, 예를 들어 근육내 주입 도는 안약 형태 또는 스프레이 백신접종(에어러졸)에 의해 투여할 수 있다. 불활성화된 백신은 일반적으로 비경구, 예를 들어 근육내 또는 피하 투여한다.
또한, 본 발명의 백신은 미국 특허 제4,458,630호에 기술된 바와 같이 난내투여할 수 있다. 본 발명의 백신은 난내 투여하는 것이 가장 바람직하다.
상기 백신의 난내 투여는 난 내에 함유되어 있는 조류 배에 백신을 투여하는 것을 포함한다. 상기 백신은 문헌[참조: Sharma; Am. J. Vet. Res. 45, 1619-1623 (1984)]에 기술된 바와 같이 난의 적합한 구획(예를 들어, 요낭액, 난황낭, 양막, 기실 또는 배내)에 투여할 수 있다. 상기 백신은 껍질(기실) 막 및 난각막 하부로 투여하는 것이 바람직하다. 통상, 상기 백신은 배 형성 후기, 일반적으로 항온처리 단계의 최종 분기(15 내지 21일)에 배를 함유하는 난 내에 주입한다. 난은 항온처리 15일 내지 19일 사이에 처리하는 것이 더 바람직하며, 항온처리 18일에 처리하는 것이 가장 바람직하다.
항온처리한 난의 주입 기작은 특별히 결정적인 것은 아니나, 배 또는 배를 둘러싸고 있는 주위 막의 조직이나 기관을 부적절하게 손상시키지 않음으로써 처리로 인해 부화율이 감소하거나 감염을 일으키지 않아야 한다. 상기 백신은 껍질을 통해 화합물을 전달하는 임의의 방법으로 난에 투여할 수 있다. 그러나, 바람직한 투여 방법은 주입하는 것이다. 배의 정확한 발생 단계 및 위치에 따라, 한정된 길이의 바늘은 난의 상이한 부분에 위치될 것이다. 예를 들어, 난의 큰 단부의 껍질에 주사기가 부착된 바늘(1-1.5 inch, 약 22 게이지)로 천공하여 작은 구멍을 만들고, 내부 껍질 막 및 난황막 하부로 백신을 주입한다. 바늘을 삽입하기 이전에 껍질을 천공하거나 드릴을 이용하여 파일롯 구멍을 형성함으로써 바늘의 손상이나 무뎌짐을 예방할 수 있다. 또한, 필요에 따라 왁스 등과 같은 실질적으로 박테리아가 투과할 수 없는 밀봉 재료를 이용하는 밀봉 기구로 난을 밀봉하여 원하지 않는 박테리아의 후속 침입을 예방할 수 있다.
이어서, 백신접종된 배 형성된 난을 항온처리기로 이전하여 부화시킨다(참조: 미국 특허 제4,458,630호, WO 98/56413 및 WO 95/35121). 전체적인 배 백신접종 과정은 시판되는 등록상표 INOVOJECT와 같은 자동화된 고속 백신접종 시스템을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 장치는 미국 특허 제4,681,063호, 제4,903,635호, 제4,040,388호, 제4,469,047호 및 제4,593,646호에 개시되어 있다.
본 발명의 백신은 활성 성분으로서 유효량, 즉 독성 IBDV 바이러스에 의한 2차 항원투여에 대해 백신접종된 조류에서 면역성을 유도하는 IBDV 물질을 면역화하는 양의 IBDV 689 바이러스를 포함한다. 본 명세서에서 사용한 용어 면역성은 백신접종후, 백신접종하지 않은 군에 비해 조류 군집에서 상당히 더 높은 보호 수준을 유도하는 것을 의미한다.
투여된 접종물, 투여 위치 및 투여 방법, 종, 연령 및 검체의 상태에 따라, 바이러스 투여량 범위는 101-106TCID50(즉, 1 조직 배양물 감염 투여량(TCID) 50은 감염된 조직 배양물의 50%가 CPE를 나타내는 투여량을 의미함)이며, 바람직하게는 102-105TCID50이다.
본 발명의 다른 관점은 상기한 백신에 관한 것인데, 이 백신은 다른 조류 병원체의 배-안전 백신 균주를 추가로 포함한다.
1종 이상의 백신 균주의 연합 투여는 경제적인 면에서 이로울 수 있는데, 그이유는 난 내의 백신접종이 거의 필요하지 않기 때문이다. 또한, 난 내로 투여되는 접종물이 적을수록, 난이 오염될 가능성은 더 적어진다.
배-안전 백신 균주는 생 백신 균주를 의미하는데, 접종 18일에 SPF 난 내로 접종하는 경우, 난의 부화율이 70% 이상 바람직하게는 80% 이상되는 생 백신 균주를 의미한다.
상기 연합 백신은 마렉스병 바이러스(MDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 난드롭 증후군(EDS) 바이러스, 터키 비강기관염 바이러스(TRTV) 또는 레트로바이러스의 1종 이상의 배-안전 백신 균주를 추가로 포함한다.
본 발명의 IBDV 백신은 병아리에게 효율적으로 사용할 수 있지만, 터키, 기니 가금류 및 자고류와 같은 기타 가금류도 상기 백신으로 성공적으로 백신접종할 수 있다. 병아리는 식용 무리, 재생 무리 및 산란 무리를 포함한다.
본 발명의 다른 관점은 상기한 바와 같은 제조 방법에 관한 것인데, 이 방법은 바이러스를 적합한 기재 상에서 배양하고, 상기 기재로부터 수확하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 689 균주의 IBD 바이러스는 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 얻을 수 있다.
간략히 설명하면, 감수성 기재를 IBDV 균주 689로 접종하고, IBDV 함유 물질을 수확한후, 상기 바이러스가 원하는 역가로 복제될 때까지 번식시킨다. IBDV 바이러스의 복제를 지지할 수 있는 모든 기재를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 이의 예로는 배 형성된 병아리 난, 1차 (조류) 세포 배양물(예, 배 섬유아세포(CEF) 또는 병아리 신장 세포(CK)), 또는 포유동물 세포주(예, VERO 세포주 또는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포주)를 들 수 있다.
IBDV 균주 689는 1차 병아리 배 섬유아세포(CEF)에서 번식시키는 것이 바람직하다.
더 구체적으로, 1차 병아리 배 섬유아세포(CEF)는 최종 농도 2 x 106/㎖로 제조할 수 있다. 세포는 5% 태아 송아지 혈청을 함유하는 이글 최소 필수 배지내에서 배양한다. 이 세포 현탁액 15 ㎖에 플라크(정제된 클론, 1 ㎖에 용해시킴)로부터 얻은 IBDV 균주 689 0.1 ㎖를 첨가할 수 있다. 37℃의 고습 항원처리기 내에서 접종하고 3 내지 6일이 경과한 후, 상기 바이러스를 수확할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 IBD로부터 조류를 보호하는 난내 투여용 백신을 제조하는데 사용하는 본 발명에 따른 백신의 용도에 관한 것이다.
실시예 1: 난내 투여를 위한 시판되는 IBDV 백신 균주의 효능 및 안전성
본 연구에서, 인터벳 인터내쇼날 BV(네덜란드 복스미어 소재)에서 시판되는 IBDV 백신 균주인 노빌리스 굼보로 균주 D78(노빌리스 D78) 및 노빌리스 굼보로 균주 PBG98(노빌리스 PBG98)의 난내 투여를 위한 효능 및 안전성을 조사하였다.
재료 및 방법
시판되는 백신은 난 1개당 상이한 투여량으로 항온처리 18일째에 투여하였다. 조사한 변수는 전형적인 독성 IBDV 균주 F52/70을 이용한 2차 항원투여후의 부화율, 파브리시우스낭 병변 수치 및 생존율이었다.
부화율은 상대적인 부화율(처리하지 않은 난의 부화율과 비교한 시험 IBDV균주의 부화율)을 계산하여 조사하였다. 파브리시우스낭 병변 수치(낭 내에서의 림프구 분해성 결손)는 HE 염색된 점액낭의 현미경 검사후 조사하였다: 0(병변 없음), 1(0-20% 결손), 2(20-40% 결손), 3(40-60% 결손), 4(60-80% 결손) 및 (심한 병변, 80-100% 결손).
결과
결과는 하기 표 1에 요약하였다.
노빌리스 PBG98은 >90%의 보호성 투여량 수준에서 부화율에 부정적인 영향을 끼쳤다.
생후 15일째에, 5, 6 또는 7 log10 TCID50/난의 투여량으로 주입한 난의 평균 점액낭 병변 수치는 각각 0, 0, 0 이었다.
노빌리스 D78은 점액낭 병변에 대해 부정적인 영향을 끼쳤다. 생후 15일째에, 노빌리스 D78 4.3, 5.3 또는 6.3 log10 TCID50/난의 투여량으로 백신접종한 동물의 평균 점액낭 병변 수치는 각각 3.4, 4.7 및 5.0 이었다. 이들 결과로부터 확인할 수 있는 것은 IBDV 균주인 노빌리스 D78은 난내 투여후 파브리시우스낭내에서 심한(완전한 림프구분해성 결손) 병변을 유도할 수 있었다.
시판되는 백신 노빌리스 D78 및 노빌리스 PBG98을 이용한 난내 실험의 개요
SPF 조류 NDA+조류
균주 투여량(TCID50/난) 부화율(%)* 2차 항원투여후 생존율(%) 투여량(TCID50/난) 부화율(%)
D78 4.3 96 100 필드 100
5.3 98 100
6.3 95 100
PBG98 2 98 50 필드 102
3 90 ND
4 90 100
5 77 100
6 82 100
7 51 100
PBS 98 50 100
- 100 20
* - 상대적인 부화율
PBS - 인산염 완충 염수
결론
시판되는 IBDV 백신 균주인 노빌리스 굼보로 균주 PBG98 및 노빌리스 굼보로 균주 D78은 난내 투여를 위해서는 적합하지 않았다. 노빌리스 D78은 난내 투여후 파브리시우스낭 내에서 심한 병변을 유도하였으며, 노빌리스 PBG98은 >90%의 보호성 투여량 수준에서 부화율에 대한 부정적인 영향을 끼쳤다.
실시예 2: 독성 IBDV 변이주-E 균주를 이용하는 난내 투여 및 2차 항원투여후 IBDV 689 균주의 효능 및 안전성
상이한 백신의 효과는 생후 14일째에 델라웨어 변이주-E 균주로부터 얻은 2차 항원투여에 대한 혈청학적 반응 및 저항성을 측정함으로써 분석하였다.
재료 및 방법
조사한 백신은 IBDV 균주 689 및 시판되는 전형적인 IBDV 백신 노빌리스 굼보로 균주 D78(노빌리스 D78)이었다. IBDV 균주 689 105.3TCID50/난을 난내 투여에 의해 적용하였다. 노빌리스 D78 103.5TCID50/난을 난내 투여에 의해 적용하였다.
1군당 3마리 동물의 파브리시우스낭 내에서의 IBDV의 존재 및 파브리스우스낭 내의 미소 병변을 조사하였으며, 점액낭 병변 수치는 백신접종후 3일 및 17일과 2차 항원투여후 3일 및 10일에 상기한 바와 같이 측정하였다.
효능: 생후 14일째에 독성 IBDV 균주인 변이주-E로부터 얻은 2차 항원투여에 대해 얻은 보호를 측정하였다. IBDV에 대한 혈청학적 반응은 백신접종후 14 일째에 비루스 중화(VN) 시험으로 측정하였다. 전형적인 IBDV 균주는 VN-IBD-바이러스로서 사용하였다.
결과
파브리시우스낭 병변: 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689 투여량은 백신접종후 단지 가벼운 병변을 유도하였다. 노빌리스 D78로 백신접종한 12 마리 동물중 4 마리(33%)에서, 2차 항원투여후 10 일째에 완전한 림프구분해성 결손이 관찰되었다. 개개의 데이타로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 백신 둘 다로 백신접종한 동물은 2차 항원투여에 대해 완전한 보호를 나타냈다.
평균 점액낭 병변 수치
백신접종후 일자 2차 항원투여후 일자
바이러스 3 17 3 10
IBDV 균주 689 1.7 1.7 1.0C 0.6
노빌리스 D78 4.3 3.7 1.72C 2.8
백신접종하지 않은 대조군 5.0A
C = 만성 병변; A = 급성 병변
IBDV에 대한 혈청학적 반응 : 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689 및 노빌리스 D78은 전형적인 IBDV에 대해 양호한 수준의 항체를 유도하였다.
백신접종후 17일의 혈청학적 반응
전형적인 VN 바이러스
바이러스
IBDV 균주 689 7.1±2.2
노빌리스 D78 6.8±2.4
백신접종하지 않은대조군 <1.0±0.0
VN-역가는 희석율의 log2 값으로 나타냈다. 백신접종후 3일 및 17일과 2차 항원투여후 3일에 ELISA 시스템을 이용한 파브리시우스낭 내에서의 IBDV 항원의 검출: 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689는 백신접종후 3 일째에 3 마리 병아리중 2 마리 병아리에서 검출할 수 있었다. 백신접종후 17 일째에는 바이러스 항원은 검출할 수 없었다. 2차 항원투여후 3 일째에 바이러스를 검출할 수 없었다는 것은 상기 동물들이 2차 항원투여에 대해 보호되었음을 시사하는 것이다. 노빌리스 D78 바이러스는 백신접종후 3 일째에 모든 동물로부터 분리할 수 있었다.
파브리시우스낭에서 IBDV의 존재
백신접종후 일자 2차 항원투여후 일자
바이러스 3 17 3 보호율(%)*
IBDV 균주 689 2/3 0/3 0/3 100
노빌리스 D78 3/3 0/3 0/3 100
백신접종하지 않음 대조용 6/6 0
* 조사한 총 동물수당 존재하는 바이러스 항원을 보유하는 양성 동물의 수
결론
IBDV 균주 689는 난내 투여후 자극이 매우 적었다. 대조적으로, 시판되는 노빌리스 굼보로 D78 균주의 난내 투여후, 몇몇 조류는 적은 투여량(3.5 log10/난)을 적용하는 경우에도 완전한 림프구분해성 결손을 나타냈다. IBDV 균주 689는 독성 IBDV 변이주-E 바이러스를 이용하는 2차 항원투여에 대해 혈청학적 반응 및 완전한 보호를 유도할 수 있었다.
실시예 3 : 전형적인 독성 IBDV 균주를 이용한 난내 투여 및 2차 항원투여후의 IBDV 689 균주의 효능 및 안전성
IBDV 균주 689의 효능은 부화후 14 일째에 전형적인 독성 IBDV 균주 F52/70을 투여함으로써 얻은 2차 항원투여에 대한 혈청학적 반응 및 저항성을 측정함으로써 평가하였다.
재료 및 방법
난은 각각 35개의 난으로 이루어지는 4개의 군으로 나눴다. 항온처리하고 18 일째에, 3개의 군은 난 1개당 상이한 투여량으로 IBDV 균주 689를 이용하여 백신접종하였다. 희석제만을 주입한 군은 음성 대조용으로 이용하였다.
부화후 1 일째에, 1개의 군당 5 마리 병아리의 파브리시우스낭에 대해 병변과 바이러스 항원의 존재에 대해 조사하였다.
부화후 14 일째에, 모든 동물의 혈청학적 반응을 조사하였으며, 파브리시우스낭은 병변 및 바이러스 항원의 존재에 대해 조사하였다. 혈청학적 반응의 조사에 있어서, 전형적인 IBDV 균주는 바이러스 중화-IBDV-바이러스로서 사용하였다.
모든 동물은 부화후 14 일째에 전형적인 독성 IBDV 균주 F52/70을 안약으로 투여하여 2차 항원투여하였다.
2차 항원투여후 3일째에, 1개의 군당 5 마리 병아리의 파브리시우스낭에 대해 병변과 바이러스 항원의 존재에 대해 조사하였다. 2차 항원투여후 10 일째에, 남아있는 모든 동물의 파브리시우스낭은 미소 병변에 대해 조사하였다. 상대적인 부화율을 조사하였다.
결과
부화율: <1.3, 2.4 또는 4.7 log10 TCID50/난으로 백신접종한 난의 상대적인 부화율(감염되지 않은 난에 대한 부화율)은 각각 116%, 93% 및 89% 였다. 난내 투여는 부화율에 대한 부정적인 효과는 없었다.
파브리시우스낭의 병변: 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689는 백신접종후 단지 가벼운 병변만을 유도하였다. 이는 IBDV 균주 689의 저자극 특성을 나타내는 것이다. 개개의 데이타로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 백신접종된 동물은 완전히 보호되었다.
백신접종후 3일 및 14일 및 항원투여후 3일 및 10일의 파브리시우스낭의 평균 점액낭 병변 수치
IBDV 균주 689 백신접종후 일자 2차 항원투여후 일자
투여량(log10TCID50/난) 3 17 3 10
<1.3 0 1.0 1.0C 0.8
2.4 0.8 1.6 0.8 1.0
4.7 2.2 1.4 1.8C 2.0
백신접종하지 않은 대조군 0 0 5.0A 5.0
C = 만성 병변; A = 급성 병변
IBDV에 대한 혈청학적 반응 : 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신접종하고 17일이 경과한 후, 모든 백신접종된 동물은 평균 7.3 내지 8.7 log2/군이었으며, 이는 전형적인 IBDV에 대해 양호한 혈청학적 반응이었다.
백신접종후 17일이 경과한후의 혈청학적 반응
IBDV 균주 689 전형적인 VN 바이러스
투여량(log10 TCID50/난)
<1.3 7.3±2.1
2.4 8.7±1.4
4.7 8.2±1.7
백신접종하지 않은 대조군 <4.0±0.0
VN-역가는 희석율의 log2 값으로 나타냈다.
ELISA 시스템을 이용하는 파브리시우스낭 내에서 IBDV 항원의 검출은 백신접종후 3일과 17일에, 2차 항원투여후 3일에 수행하였다.
표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신접종후 3일에 백신 바이러스는 각각 2.4 또는 4.7 log10 TCID50/난의 투여량으로 백신접종한 5마리의 조류중 2마리의 조류 및 5마리의 조류중 4 마리의 조류로부터 분리할 수 있었다. <1.3 log10 TCID50/난의 투여량으로 백신접종한 동물에서 백신 바이러스는 검출되지 않았다. 2차 항원투여직전에는 백신접종한 어떤 동물에서도 백신 바이러스는 검출되지 않았다.
2차 항원투여하고 3일이 지난후, 백신접종한 어떤 동물에서도 바이러스는 검출되지 않았는데, 이는 모든 동물이 2차 항원투여에 대해 보호됨을 시사하는 것이다. 대조적으로, 백신접종하지 않은 대조용 군의 모든 동물은 2차 항원투여후 3일이 경과한 후 바이러스 항원을 함유하는 것으로 확인되었다.
파브리시우스낭 내에서 IBDV의 존재
IBDV 균주 689 백신접종후 일자 2차 항원투여후 일자
투여량(log10 TCID50/난) 3 17 3 보호율(%)*
<1.3 0/5 0/5 0/5 100
2.4 2/5 0/5 0/5 100
4.7 4/5 0/5 0/5 100
백신접종하지 않은 대조군 5/5 0
* 조사한 총 수당 존재하는 바이러스 항원을 보유하는 양성 동물의 수
결론
IBDV 균주 689는 자극이 매우 적었다. IBDV-균주 689는 혈청학적 반응과 전형적인 독성 IBDV 균주 F52/70에 대한 완전한 보호를 유도할 수 있었다.
실시예 4: 바이러스 동정
모노클로날 패널 시험에 의한 IBDV 균주의 동정
재료 및 방법
미량 역가 평판에서 병아리 배 섬유아세포는 상이한 IBDV 균주로 감염하고, 37℃에서 3일 내지 5일 동안 항온처리한 후 상이한 모노클로날 항체를 이용하여 처리하였다. 상이한 IBDV 균주에 대한 모노클로날 항체의 결합은 형광 표지된 접합체(염소-항-생쥐)로 가시화하였다.
결과
표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, IBDV 균주 689 및 전형적인 시판 백신 균주 노빌리스 D78은 상이한 모노클로날 항체(Moab)에 대해 동일한 반응 패턴을 보유하였다.
상이한 Moab를 이용하는 상이한 IBDV 바이러스의 패널 패턴
바이러스/Moab B29 8 R63 BK9 67 57 B69
IBDV 균주 689 + + + - - - +
노빌리스 D78 + + + - - - +
대조용 IBDV 균주:
전형적인 균주 + + + - - - +
변이주-E + + + + + - -
GLS + + - - - + -
+ 바이러스 상에 에피토프 존재, - 바이러스 상에 에피토프 부재
병아리 배 섬유아세포(CEF) 상에서의 성장: 표 9에서 확인할 수 있는 바와같이, IBDV 균주 689 및 노빌리스 D78은 둘 다 CPE를 유도하는 CEF 상에서 복제할 수 있었다.
CEF 상에서 성장하고, 특이성 IBDV-CPE를 유도할 수 있는 능력
바이러스 CEF 성장
IBDV 균주 689 +
노빌리스 D78 +
+ = 투여량은 CEF 상에서 CPE를 유도함.
- = 투여량은 CEF 상에서 CPE를 유발시키지 않음.
결론
IBDV 균주 689는 CEF 상에서 성장하였으며, 전형적인 형태의 IBDV에 속했다.
본 발명에 따라 백신접종된 난의 부화율에 부정적인 영향을 끼치지 않으면서, 바이러스 중화 인자를 함유하는 혈청의 부재 하에서 난내 투여할 수 있는 IBDV의 안전하고, 효능있는 저자극성 균주 및 IBD를 예방하기 위한 백신을 제공할 수 있다.

Claims (8)

  1. 샘플이 영국 에스피4 오제이지 윌트샤인 샐리스베리에 소재하는 유럽 세포 배양물 수집소에 기탁번호 V00012609로 기탁된 전염성 점액낭병 바이러스 균주의 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 생 형태인 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항의 바이러스 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 전염성 점액낭병에 대한 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 백신이 유효 투여량으로 난(egg) 1개당 101-106TCID50(조직 배양물 감염성 투여량 50), 바람직하게는 102-105TCID50을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 백신이 다른 조류 병원체의 배(embryo)-안전 백신 균주를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  6. 적합한 기재 상에서 바이러스를 배양하고, 상기 기재로부터 바이러스를 수확하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항의 바이러스를 제조하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항의 바이러스와 약학적 허용 담체 또는 희석제를 혼합하는 것을 특징으로 하는 제3항 내지 제5항중 어느 한 항의 백신을 제조하는 방법.
  8. 전염성 점액낭병에 대해 조류를 보호하기 위한 난내(in ovo) 투여용 백신을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항의 바이러스의 용도.
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