KR20020013361A

KR20020013361A - 저 병원성의 닭 빈혈증 바이러스

Info

Publication number: KR20020013361A
Application number: KR1020010009780A
Authority: KR
Inventors: 쉬리어카를라크리스티나; 야그트헨리커스요하네스마리아
Original assignee: 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크; 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2002-02-20
Also published as: CA2337618C; PL202168B1; DK1132466T3; CA2337618A1; BR0100695A; EP1132466B1; US20040156868A1; PL346195A1; KR100755811B1; US6723324B2; HUP0100908A3; MXPA01002167A; ES2252143T3; ZA200101583B; NZ510130A; US7090981B2; AU2326201A; ATE310078T1; HU225801B1; EP1132466A1

Abstract

본 발명은 닭 빈혈증 바이러스(CAV)의 신규 항원형을 제공한다. 본 발명의 CAV는 야외의 칠면조로부터 분리가능하며, 닭에 대한 독성은 상당히 감소되어 있다. 이러한 특성으로 인하여 이들 바이러스는 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대해 가금류를 보호하는 생백신 제조에 특히 적합하다.

Description

저 병원성의 닭 빈혈증 바이러스{CHICKEN ANAEMIA VIRUSES OF LOW PATHOGENICITY}

본 발명은 닭 빈혈증 바이러스(CAV), CAV를 포함하는 백신 및 CAV 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

닭 빈혈증 바이러스(CAV)는 조류 감염성 빈혈, 빈혈증 피부염 증후군 또는 블루-윙(blue-wing) 질병으로서 알려진 질병의 원인제이며, Yuasa 등이 1979년에 처음 보고하였다(Avian Diseases 23, 366-385, 1979).

자연 발생적 CAV가 유도하는 질병은 어린 병아리에게서 가장 빈번하게 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이 질병은 급성이며, 첫 징후는 일반적으로 10∼14일령에 발생한다. 이 임상적 질병의 특징은, 사망율이 일반적으로 약 5∼10%, 최대 60%로 급격히 증가하는 것이다. 최대 사망율은 질병 개시 5∼6일내에 발생한다. 추가의 임상적 증후로는 우울증 및 식욕 부진이 있다. 또한, 심각한 빈혈, 전신 출혈, 파부리시우스의 흉선 및 낭의 위축증 및 황색 골수는 영향을 받은 닭에서 발견된다(McNulty, Avian Pathol. 20. 187-203, 1991).

CAV는 닭에서 수평 및 수직으로 전염된다. 전에 바이러스에 노출된 적이 없는 알을 낳는 종축(種畜;breeder)이 감염되면, CAV는 자손에서 수직 전달된다. 종축에게서 발견되는 임상적 증후는 없으며, 달걀 생산, 부화력 또는 수정율에 대한 명백한 영향은 없다. 수직 감염된 자손 병아리는 부화시에는 정상으로 보이지만, 10∼14일령에 사망율이 증가하고 전형적인 질병(빈혈증 피부염 증후군)을 형성한다. 수평 전염은 수직으로 감염된 닭, 오염된 매개물, 가옥 등과 접촉시 발생한다. CAV에 대해 모계 유도된 항체가 없음을 의미하는 어린 감수성 닭으로의 수평 전염은 2주 후에 임상 질병을 초래할 수 있다.

어버이 무리가 알을 낳기 전에 CAV에 대한 항체를 형성하도록 하여 빈혈증 피부병 증후군을 제어할 수 있다. 알을 낳기 전의 CAV에 대한 고 레벨의 항체는 알을 낳는 중에 수직 전염되는 것을 예방하고, 모계 유도된 항체를 보유한 자손을 제공하여, 부화 후 처음 몇주 동안은 수평 감염에 대해 보호된다.

따라서, 알을 낳기 전에 모든 조류를 CAV 백신으로 예방접종하는 것이 중요하다.

CAV에 대한 모계 항체는 일반적으로 약 3주령이 되면 사라진다. 이 때, 수평 감염이 발생할 수 있다. 이들 감염은 보통 무증상이지만, 이러한 무증상 감염은 육계의 성장 감소로 인한 상당한 경제적 손실과 연관되어 있다(McNulty 등, Avian Diseases 35. 263-268, 1991). 무증상 질병은 부화 직후, 바람직하게는 1일령에 닭에게 예방접종하여 예방할 수 있다.

CAV 감염과 관련된 임상 질병 및 무증상 질병에 대한 효과적인 보호를 유도하는 안전한 백신이 필요한 것은 명백하다. 어린 감수성 닭의 무리에게 백신 바이러스가 만연될 확률이 실제 문제로서 존재하기 때문에, 어버이 가축 예방접종용 CAV 생백신은 병원성이 낮은 CAV가 주성분이어야 한다. 또한, 어린 닭이 CAV 감염에 매우 감수성이기 때문에, 어린 닭에게 직접 투여하는 생백신은 어린 병아리에게 부작용이 없는 저 병원성의 CAV 분리물을 이용해야 한다.

그러나, 지금까지 분리된 모든 자연 발생적 CAV는 어린 병아리에게는 병원성이다(McNulty, Avian Pathology 20, 187-203, 1991; Noteborn and Koch, Avian Pathology 24, 11-31, 1995; McNulty, British Poultry Science 38, 7-13, 1997).

또한, 세포 배양물 중 시험관내 계대배양에 의한 CAV 분리물의 감독(減毒)화는 모호한 결과를 초래한다. Bulow 및 Fuchs(J.Vet.Med. B 33, 568-573, 1986)는 MDCC-MSB1 세포에서의 12회 계대배양 후에 Cux-1 분리물의 병원성이 감소되며, 이는 100∼112회의 추가 계대배양 후에 더 감소된다고 보고하였다. 그러나, Yuasa(Nut. Inst. Anim. Health Quarterly 23. 13-20, 1983) 및 Goryo 등(Avian Pathology 16, 149-163, 1987)은 CAV 분리물을 19회 및 40회 세포 배양물 계대 배양한 경우 감독의 증후가 없음을 발견하였다. Todd 등(Avian Pathology 24. 171-187, 1995)은 MDCC-MSB1 세포에서의 계대 배양(173회)으로 Cux-1 분리물이 감독됨을 입증하였으나, 이러한 감독화가 안정하지 않으며 독성이 복귀됨이 증명되었다.

유럽 특허 출원 제0533294호는 발육란에서 계대배양하여 감독시킨 CAV 분리물을 개시하고 있다. 이들 분리물은 1일령 병아리에게는 일부 잔류 독성을 나타내어, 1주령 미만의 어린 병아리를 예방접종하는데는 특히 적합하지 않다. 또한, 이들 감독형 CAV 분리물은 닭의 배아에서 병변을 유도하여, 이들 백신 바이러스는 난(卵)내 예방접종에 덜 적합하다.

닭은 CAV의 천연 숙주로 보인다. CAV는 영국산 칠면조 및 오리 혈청 조사에서는 발견되지 않았으며, CAV를 접종한 1일령 칠면조 새끼는 빈혈증의 임상적 증후를 나타내지 않았으며 바이러스에 대한 항체를 형성하지 않았다(McNulty 등, Avian Pathology 17, 315-324, 1988 및 McNulty, Avian Pathology 20. 187-203, 1991). 최근에는 Farkas 등(Avian Pathology 27, 316-320, 1998)은 CAV 항체가 닭 이외의 종(즉, 메추라기)에서 검출됨을 보고하였다.

본 발명의 제1 목적은 CAV 생백신의 제조용, 예컨대 육계 예방접종에 사용되는 것이 유리할 수 있는 병원성이 적은 추가의 CAV를 제공하는 것이다.

본 발명의 제2 목적은 CAV에 가장 감수성인 조류를, 예컨대 난에서 예방접종 또는 1일령 조류를 예방접종하는데 사용할 수 있는 병원성이 적은 CAV, 특히 비병원성 CAV를 제공하는 것이다.

이들 목적은 닭 빈혈증 바이러스(CAV)를 제공하여 달성할 수 있음을 발견하였는데, 이 바이러스는 하이브리도마 세포주가 분비하는 모노클론 항체 R2를 포함하는 기준 시료로 중화시키며, 이 시료는 2000년 2월 3일에 영국 살리스버리에 소재하는 유럽 동물 배양 세포 수집소(ECACC)에 수탁 번호 00020304로 기탁되어 있다.

놀랍게도, 병원성이 적은 CAV의 자연 발생적 균주가 존재하는 것이 발견되었다. 본 발명에 따른 CAV는, 흉선 위축증, 약한 골수 및/또는 빈혈증을 유도하는 바이러스의 능력으로 측정되는 바와 같이, 지금까지의 자연 발생적 CAV 균주와 비교하여 1일령 병아리에서 상당히 감소된 병원성을 나타낸다(표 2). 또한 예상밖으로, 이들 CAV는 야외에서 감염된 칠면조로부터 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 CAV는 감염된 닭에서 분리된 공지된 CAV 균주와 칠면조에서 분리된 일부 다른 CAV 균주를 항원적으로 구별할 수 있다.

모노클론 항체(Moab)는 감염제의 특성을 확인하고, 동일하거나 유사한 미생물의 상이한 분리물 간의 항원성 유사성 및 차이점을 결정하는데 유용하다. 표 1에서, 본 발명에 따른 CAV는 병원성 특성을 보유한 공지된 닭에서 분리된 균주 또는 기타 칠면조에서 분리된 균주에서 관찰되는 것과는 상이한 모노클론 항체와의 반응 패턴을 보유함이 확인된다.

특히 본 발명에 따른 CAV 균주는, 모노클론 항체 R2에 의해 중화되지 않는 닭으로부터 분리된 공지된 CAV 균주와는 대조적으로, 모노클론 항체 R2를 포함하는 시료로 중화되는 바이러스이다.

CAV 균주가 모노클론 항체 R2를 포함하는 시료로 중화되는 지를 검사하기 위해서, 먼저 2000년 1월 26일 영국 살리스버리에 소재하는 유럽 동물 세포 배양 수집소(ECACC)에 기탁된 CAV 균주 319에 대한 모노클론 항체 R2 시료의 중화 항체 역가를, 하기 실시예 1에 개시된 바와 같이 바이러스 중화 시험으로 확정한다. 항체 역가에 따라서, 모노클론 항체 R2 기준 시료는 모노클론 항체 R2 시료의 희석 또는 농축으로 제조하여 실시예 1에 개시된 바와 같은 바이러스 중화 시험에서 50 ㎕의CAV 균주 319 당 300∼1000 TCID₅₀에 대해 검사한 경우 50 ㎕는 항체 역가가 16(log₂)이다.

CAV 균주는, 특히 Moab R2 기준 시료에 의한 바이러스 중화 시험에서 중화된 경우 본 발명에 속하는 것으로 간주한다. 이는 바이러스 중화 시험에서 CAV 균주 50 ㎕ 당 300∼1000 TCID₅₀에 대해 검사한 경우 Moab R2 기준 시료의 항체 역가는 50 ㎕ 당 5(log₂)이상임을 의미한다.

특히, 본 발명은 Moab R2 기준 시료의 고 희석액으로 중화되는 CAV 균주를 제공한다. Moab R2 기준 시료의 고 희석액으로 중화되는 CAV 균주는 닭에 대한 병원성이 낮다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, CAV 균주에 대한 Moab R2 기준 시료의 항체 역가가, CAV 균주 50 ㎕ 당 300∼1000 TCID₅₀에 대해 검사한 경우, 50 ㎕ 당 10(log₂) 이상, 더욱 바람직하게는 50 ㎕ 당 12(log₂) 이상, 심지어 50 ㎕ 당 14(log₂) 이상, 특히 50 ㎕ 당 16(log₂) 이상인 것이 특징인 CAV 균주가 제공된다.

모노클론 항체 R2 기준 시료의 고 희석액에 의해 중화된 CAV 균주는 어린 병아리 및 어린 배아에게는 본질적으로 비병원성이다. 따라서, 이러한 CAV 균주는 닭 배아 또는 1일령 병아리와 같이 CAV 감염에 가장 감수성인 닭에게 투여할 CAV 생백신에 사용하는 것이 특히 적절하다.

본 발명에 따른 가장 바람직한 균주는 CAV 균주 319이며, 이 시료는 수탁 번호 00012608로 ECACC에 기탁되어 있다. 비병원성의 관점에서, 이 균주는 어린 병아리 또는 닭의 배아를 면역화시키는 백신 성분으로서 특히 적합하다.

본 발명에 따른 신규 CAV 균주를 확인하면 CAV에 의한 감염으로부터 생기는 질병 증상에 대하여 가금류, 특히 어린 병아리를 효과적으로 보호할 수 있는 병원성이 낮은 CAV 생백신을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서는, 전술한 바와 같이 살아있는 형태로 존재하는 CAV 균주가 제공된다.

물론, 본 발명은 불활성화된 형태로 존재하는 CAV 균주를 제공한다. 불활성화된 CAV 균주는 종축 예방접종에 특히 적합한 불활성화된 백신의 기제로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 CAV는 야외에서 칠면조로부터 분리할 수 있다. 간단히 요약하면, 칠면조 무리로부터 수거한 칠면조 혈청의 혈청학적 조사를 수행하여 표준 바이러스 중화 시험에서 CAV를 중화시킬 수 있는 혈청 시료를 확인할 수 있다. 이러한 조사의 예는 Farkas 등(1998, 상기 문헌 참조)에 요약되어 있다. 이어서, 실시예 1에 개시된 바와 같이, CAV를 칠면조의 기관으로부터 분리할 수 있다. 마지막으로, 본 발명에 따른 CAV는 모노클론 항체 R2와의 반응을 검사하여 확인할 수 있다.

필요에 따라, 상기 특성 규명된 병원성이 적은 CAV는, 생성 바이러스가 발육란에서 고 역가로 증식하도록 발육란에서 이들 CAV를 계대 배양하여 발육란에 적용할 수 있다. 유럽 특허 출원 제0533294호에는 CAV를 배아 병변으로 도입하는 능력이 성장 잇점과 관련되어 있음을 개시하고 있으며, 추가로 이러한 바이러스를 얻을 수 있는 방법을 설명하고 있다. 따라서, 본 발명은 닭 배아에서 병변을 도입하는특성을 추가로 보유하는 전술한 유형의 CAV를 제공한다. 이러한 CAV는 17일 이상의 배아의 난내 예방접종 또는 1일령 이상의 병아리의 부화후 예방접종에 적합하다.

추가의 측면에서 본 발명은, 본 발명의 CAV와 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하고, CAV 감염으로부터 생긴 임상적 및 무증상의 질병 상태에 대한 가금류의 보호에 유용한 백신을 제공한다.

본 발명에 따른 CAV는 생바이러스 또는 불활성화된 바이러스로서 백신내로 혼입할 수 있다. 그러나, 본 발명의 CAV는 병원성이 적어서 CAV 생백신에 도입하는데 특히 적절하다.

본 발명에 따른 백신은, 예컨대 시판용 CAV 백신에 통상적으로 사용되는 바와 같은 종래의 방법으로 제조할 수 있다. 수의학 백신 조성물의 제법은 "Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin(편저: Mayr, A. 등, Verlag Paul Parey, 독일 베를린 및 함브루크, 1984) 및 "Vaccines for Veterinary Applications"(편저:Peters, A.R. 등, Butterworth-Heinemann Ltd., 1993)에 개시되어 있다.

간단히 요약하면, 적절한 기질을 본 발명에 따른 생 CAV와 함께 접종하고, 바이러스가 소정의 감염 역가 또는 항원양의 내용물로 복제될 때까지 증식시킨 다음, CAV를 함유하는 재료를 수거하여 예방 활성을 보유한 약학 조성물로 제형화한다.

상기 CAV의 복제를 지지할 수 있는 모든 기질을 사용하여 본 발명에 따른 백신을 생산할 수 있다. 적절한 기질로는 생체내 백신 생성을 위한 세포 배양물, 예컨대 MDCC-MSB1 세포, 닭 배아 및 병아리 등이 있다.

세포 배양물에서 생성하기 위해서, 바이러스는 일반적으로 세포 접종 후 3∼10일 동안 증식시키고, 그 후 세포 배양물 상청액을 수거하고, 필요에 따라 여과 또는 원심분리하여 세포 파편을 제거한다.

대안적으로, 본 발명에 따른 CAV는 닭의 발육란에서 증식시킨 다음, 유럽 특허 출원 0533294호에 개시된 바와 같은 일반적인 방법으로 CAV 재료를 수거할 수 있다.

생 CAV를 함유하는 본 발명의 백신을 제조하고, (냉동) 현탁액의 형태 또는 동결건조형으로 시판할 수 있다. 백신은 이러한 조성물에 통상적으로 사용되는 약학적 허용 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다. 담체로는 안정화제, 보존제 및 완충제 등이 있다. 적절한 안정제로는, 예컨대 SPGA, 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로즈, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코스), 단백질(건조 유청, 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 산물이 있다. 적절한 완충제로는, 예컨대 알칼리 금속 포스페이트 등이 있다. 적절한 보존제로는 티메로살, 머티올레이트 및 젠타마이신 등이 있다. 희석제로는 물, 수성 완충제(예, 완충 염수), 알코올 및 폴리올(예, 글리세롤) 등이 있다.

필요에 따라, 본 발명에 따른 생백신은 보조제를 포함할 수 있다. 보조제 활성을 보유한 적절한 화합물 및 조성물의 예는 불활성화된 백신의 제조에 대해 하기 설명하는 것과 같다.

본 발명의 생백신을 예컨대 근육내 주사, 피하 주사 등의 주사로 투여할 수 있지만, 생백신은 가금류 예방접종에 통상적으로 사용되는 저렴한 대량 적용 기법으로 투여하는 것이 바람직하다. 이들 기법은 음료수 및 분무 예방 접종 등을 포함한다.

생백신을 투여하는 또 다른 방법으로는 난내 투여, 점안제 투여 및 부리 침지 투여 등이 있다.

본 발명은 마지막 4분기 항온 처리 기간동안 난내 투여하는 경우 실질적으로 비병원성인 CAV를 제공하기 때문에, 본 발명에 따른 백신의 특히 유리한 투여 경로는 난내 투여이다.

일반적으로, 백신은 배 형성의 후기 단계, 일반적으로 항온처리 기간의 최종 4분기(15∼21일), 바람직하게는 항온 처리기의 18일째에 발육란에 주사한다.

항온처리된 알의 주사 메카니즘은 특별히 중요하지 않지만, 배아 조직 및 기관을 심하게 손상시키지 않아야 한다. 예를 들어, 난각의 거대 말단에서 주사기에 부착된 바늘(1∼1½인치, 약 22 게이지)로 작은 구멍을 관통시키고, 백신을 내부 난각막 및 융모요막 아래로 주사한다. 이어서, 예방접종된 발육란을 항온기로 옮겨 부화시킨다(미국 특허 제4,458,630호, 제5,427,791호, WO 98/56413 및 WO 95/35121호). 바람직하게는, 전체 배아 예방접종 과정은 자동화된 예방접종 시스템, 예컨대 시판용 Inovoject(등록상표)를 사용하여 수행한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 불활성화된 형태의 CAV를 포함하는 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 백신을 제공한다. 불활성화된 백신의 잇점은 장기간 동안 상승된 레벨의 보호성 항체를 얻을 수 있다는 것이다. 이 특성으로 인하여 이러한 불활성화된 백신은 특히 종축 예방 접종에 적합하다. 본 발명에 따른 불활성화된 CAV 백신은 당업자들에게 공지된 일반적인 방법으로 제조할 수 있다(예컨대 유럽 특허 출원 0533294호에 개시됨).

불활성화된 CAV를 함유하는 백신은, 예컨대 이러한 목적에 적합한 1종 이상의 전술한 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 불활성화된 백신은 보조제 활성을 보유한 1종 이상의 화합물을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 용도로 적절한 화합물 또는 조성물로는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 산화알루미늄, 예컨대 Bayol F(등록상표) 또는 Marcol 52(등록상표)와 같은 광유, 또는 비타민 E 아세테이트과 같은 식물성유를 주성분으로 하는 수중유 또는 유중수 에멀젼, 및 사포닌 등이 있다.

불활성화된 백신은 일반적으로 비경구, 예컨대 근육내 또는 피하 투여된다.

본 발명에 따른 백신은 독성 바이러스에 의한 항원 투여에 대해 활성 성분으로서 상기 정의한 CAV의 유효량, 즉 예방접종된 조류 또는 그 자손에서 면역성을 유도하는 CAV 재료를 면역화시키는 양을 포함한다. 면역성은 예방접종되지 않은 그룹과 비교하여 예방접종 후에 조류군에서 상당히 높은 레벨의 보호를 유도하는 것으로 정의한다.

통상적으로 본 발명에 따른 생백신은 조류 1마리당 10²∼10⁹TCID₅₀, 바람직하게는 10²∼10⁶TCID₅₀으로 투여할 수 있으며, 불활성화된 백신은 조류 1마리당 10⁴∼10¹⁰TCID₅₀의 항원성 등가물을 포함할 수 있다.

본 발명의 CAV 백신은 닭에서 효과적으로 사용할 수 있지만, 칠면조 및 메추라기와 같은 기타 가금류를 이 백신으로 성공적으로 예방접종할 수 있다. 닭은 육계, 번식용 닭 및 알을 낳는 닭을 포함한다.

CAV 감염으로부터 생긴 임상 질병 및 무증상 질병 상태는 주로 어린 닭, 특히 육계에서 보고되고 있기 때문에, 본 발명은 바람직하게는 CAV로 유도된 질병 증상으로부터 육계를 보호하는데 사용하는 백신을 제공한다.

본 발명의 생백신 또는 불활성화된 백신을 수용하는 동물의 연령은 현재 알려진 CAV 백신을 수용하는 동물의 연령과 동일할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CAV는 병원성이 적어서 어린 조류, 즉 2주령 미만의 조류, 특히 1일령의 조류나, 또는 심지어 항온처리 기간의 최종 4분기에서 난내 경로를 통해 배아에 CAV 백신을 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 생백신을 1일령 이상의 어린 조류(예, 육계)에게 직접 예방접종하여 CAV의 수평 감염으로부터 생기는 무증상 질병을 예방할 수 있다. 육계 종축와 같은 어버이 가축의 예방접종은, 본 발명의 생백신 또는 불활성 백신으로, 또는 생백신과 불활성 백신의 조합을 포함하는 프로토콜로 수행할 수 있다. 이러한 유형의 면역화 프로그램의 잇점은 어린 조류에게 수직 전달되는 모계에서 유도된 항체에 의해 1일령 자손의 즉각적인 보호가 제공된다는 것이다. 통상적인 종축 예방 접종 프로그램으로는 생백신을 사용하여 6주령 이상의 종축을 예방접종하는 프로그램, 또는 불활성화된 백신을 사용하여 14∼18 주령의 종축을 예방접종하는 프로그램이 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 CAV 외에 가금류에 감염성인 기타 병원제의 1종이상의 백신 성분을 포함하는 조합 백신을 제공한다.

조합 백신은 Mareks 질병 바이러스(MDV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV), 감염성 활액낭 질병 바이러스(IBDV), 가금 아데노바이러스(FAV), EDS 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스(TRTV), 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV) 및 레오바이러스의 1종 이상의 (불활성화된) 백신 균주를 포함한다.

특히, 본 발명은 본 발명에 따른 CAV와 MDV 백신 균주, 예컨대 HVT를 포함하는 조합 생백신을 제공한다. 이 조합 백신은 난내 예방접종하는데 사용할 수 있어 유리하다.

실시예

실시예 1

병원성이 적은 CAV 균주의 분리 및 시험관내 동정

A.

CAV 균주는 하기 절차에 따라서 상이한 칠면조 유래의 기관으로부터 분리하였다:

기관을 균질화하고, 15분 동안 3000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 MDCC-MSB1 세포에 첨가한 다음, 현탁액을 +37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 2∼3일 후에 세포를 현미경으로 검사한 다음 2차배양하였다. CAV에 대해 특징적인 세포 변성 효과(CPE)가 발생할 때까지 이 절차를 반복하였다. CAV에 대해 특징적인 CPE가 존재하는 경우, 현탁액을 3000 g에서 15분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 수거하고 -70℃에서 보관하였다. 후속 계대배양을 동일한 절차에 따라서 진행하였다.

CAV 닭의 분리물을 상기 절차에 따라서 MDCC-MSB1 세포에서 복제하였다.

본 발명에 따른 CAV 균주의 추가의 군은 미지의 원인으로 쇠약해진 칠면조로부터 유사한 방식으로 분리하였다. 태어난 칠면조를 희생시켜, 간을 분리하였다. 실험실에서, 동부피의 RPMI 640 배지를 첨가한 다음, 울트라 투락스(ultraturax)를 사용하여 50% 간 균질물을 제조하였다. 10분 동안 4000 g에서 원심분리한 후에, 15 ㎛ 필터를 통해 상청액을 수거하였다. 이 상청액은, 바이러스 재용해시 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

바이러스 재용해 시도를 위해서, 1 ㎖ 당 3 ×10⁵MDCC-MSB1 세포를 함유하는 RPMI1640 배지(5% FCS) 30 ㎖에 간 상청액 각 0.2 ㎖를 첨가하였다. 2 또는 3일 동안 +37℃에서(5% CO₂) 항온처리한 후에, CAV에 특징적인 CPE의 존재(투명한 세포질을 보유한 거대 팽윤 세포)에 대해 MDCC-MSB1 세포를 현미경으로 검사하였다. CAV에 대해 특징적인 CPE가 없는 것으로 밝혀지면, MDCC-MSB1 세포 현탁액 5 ㎖를 새로운 RPMI 1640 배지(5% FCS) 25 ㎖에 첨가하여 세포를 2차 배양하였다. 이어서, 세포 현탁액을 +37℃에서(5% CO₂) 2 또는 3일 동안 다시 항온처리하였다.

MDCC-MSB1 세포 현탁액을 최대 10회, 또는 CAV에 대해 특징적인 CPE가 관찰될 때까지 2차 배양하였다.

CAV에 대해 특징적인 CPE가 관찰되는 경우, 세포-바이러스 현탁액을 수거하고 4000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수거하고 후에 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

B

후속 실험에서, CAV에 대해 유도되는 모노클론 항체 R2, 양성 및 음성 폴리클론 닭 혈청을 사용하여, 바이러스 중화 시험에 의해 본 발명에 따른 CAV 균주를 (기지의) 닭 CAV 균주 및 기타 칠면조 균주와 구별할 수 있는 지를 검사하였다.

재료 및 방법

CAV 균주

CAV 닭 균주 26P4(야생형 및 감독형): EP 특허 출원 제0533294호

CAV 닭 균주 Gifu(야생형 및 감독형): EP 특허 출원 제0533294호

CAV 닭 균주 앙스트롬: Angstrom 등, Avian Path. 17, 23-32, 1988

CAV 닭 균주 Cux: von Bulow 등, Zentralbl. Veterinarmed. 30, 742-750, 1983

CAV 닭 균주 클론-1: Lamichane 등, Avian Dis. 35, 515-522, 1991

CAV 닭 균주: 홀랜드 분리물, 기준 균주

CAV 칠면조 균주 18938, SP6198, 18933, 17382, 319, 3571, 3533, 3527, 3570, 3572, 18012, 18936, 18010 및 18941

CAV에 대해 유도된 항체

Moab R2

양성 CAV 혈청

음성 CAV 혈청

바이러스 중화 시험

최소한 1:16 희석액으로 출발하여, 조직 배양 배지(RPMI 1640 + 5% FCS)중 미량역가 평판에서 Moab 기준 시료의 일련의 2배 희석액을 만들어 각 희석액 50 ㎕를 얻었다(양성 및 음성 기준 혈청은 동일한 희석액을 사용하여 포함시킴). 이어서, 동부피의 CAV 현탁액을 각 Moab R2 희석액에 첨가하였다.

중화 시험에서 동시에 CAV 감염 역가를 모니터하기 위해서, CAV 작용 희석액을 적정하였다. 따라서, 각 CAV 작용 희석액의 일련의 10배 희석액(10^-1내지 10^-4)을 미량역가 평판 외부의 튜브에서 제조하였다. 그 다음, 각 희석액 50 ㎕를 12배로 하여 미량역가판에 옮겼다. 동일한 미량역가판의 또 다른 12웰을 조직 배양 배지 100 ㎕로 충전하여 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 조직 배양 배지 50 ㎕를 바이러스 희석액에 첨가하였다. 바이러스-Moab 혼합물 및 적정 바이러스 혼합물을 밤새 4℃에서 항온배양하였다. 그 다음, 6 ×10⁵세포를 함유하는 MDCC-MSB1 세포 현탁액 100 ㎕를 바이러스-Moab 혼합물과 바이러스 희석액 및 적정 대조군에 첨가하였다. 그 후 미량역가 평판을 항온기로 옮겼다(+37℃, 5% CO₂).

2∼3일 동안 +37℃에서 항온배양한 후에, CAV에 대해 특징적인 세포변성 효과(CPE)의 존재에 대해 적정에 포함된 세포를 검사하였다. 적정 결과 50 ㎕ 당 CAV 300∼1000 TCID₅₀미만이 존재하는 것으로 밝혀지면, 중화 시험 및 적정에 포함된 세포를 2차 배양하고, +37℃에서 2∼3일 동안 다시 항온배양하였다. 적정시 CAV 역가가 50 ㎕ 당 300∼1000 TCID₅₀이 얻어질 때까지 세포의 항온배양 및 2차 배양 절차를 수행하였다. CAV 역가는 Reed 및 Muench의 방법(The American Journal of Hygiene, 27, 493-497, 1937)에 개시된 바와 같이 계산하였다.

CAV에 대해 특징적인 CPE의 존재 여부에 대해 바이러스-Moab 혼합물에 첨가된 세포를 검사하여 항체 역가를 측정하였다. 항체 역가(log₂)는, CAV 균주가 완전히 중화되는, 즉 CAV에 대해 특징적인 CPE가 관찰되지 않는 Moab R2 기준 시료의 최대 희석율의 역수로서 표현한다. Moab R2 기준 시료의 항체 역가가 <5 (log₂)인 경우, 특정 CAV 균주는 Moab R2에 의해 중화되지 않는 것으로 간주한다.

결과

VN 시험에서 측정된 Log₂항체 역가

	R2	CAV 양성 혈청	CAV 음성 혈청
닭 균주
CAV 26P4(야생형)CAV 26P4(감독형)CAF Gifu(야생형)CAV Gifu(감독형)CAV Cux-1CAV 앙스트롬CAV 클론-1CAV 홀랜드 분리물	<4<4<4<4<4<4<4<4	1313131313121311	<4<4<4<4<4<4<4<4
칠면조 균주
CAV SP6198	<4	12	<4
CAV 319,CAV 18938CAV 18933CAV 17382CAV 3571CAV 3533CAV 3527,CAV 3570,CAV 3572,CAV 18012,CAV 18936,CAV 18010CAV 18941	1616147161616161616161616	11121010111212121212121212	<4<4<4<4<4<4<4<4<4<4<4<4<4

결론

바이러스 중화 시험 결과, 닭에 대해 병원성이 적은 CAV 칠면조 균주의 그룹은 감독형 및 병원성 CAV 닭 분리물과 병원성 칠면조 분리물과 구별할 수 있음이 밝혀졌다(표 1). Moab R2는 칠면조로부터 분리된 저 병원성 CAV 균주만을 중화시키지만, 병원성 칠면조 분리물과 임의의 공지된 닭 균주를 중화시키지 않는다. 병원성 실험 결과는 실시예 2에 제시되어 있다.

실시예 2

저 병원성 CAV 균주의 생체내 특성 규명

A

본 실험에서, SPF 닭에서 병원성에 대해 CAV 분리물을 평가하였다. CAV 분리물의 병원성은 흉선 및 골수의 거시적 검사와 헤마토크리트(haematocrit)(Ht) 값의 측정으로 결정하였다.

실험적 고안

1일령 SPF 닭에게 CAV 분리물 중 하나를 10^6.0TCID₅₀로 근육내 접종하였다. 1군의 닭에게는 접종하지 않음으로써 대조군으로서 사용하였다. 14일령에서, 각 군으로부터 여러 마리의 닭을 제거하였다. Ht 값 측정을 위해 혈액 시료를 수거하였다. 흉선 및 골수를 거시적으로 검사하였다. 남은 닭을 4주령이 될 때까지 유지하였다. 실험 개시 전과 4주령에 혈액 시료를 수거하였다.

전술한 바와 같이 바이러스 중화 시험으로 CAV 항체의 존재/부재에 대해 혈청을 검사하였다.

접종에 사용되는 제제의 실제 감염도 역가는, 표준 절차에 따라 MDCC-MSB1 세포에 대한 적정으로 측정하였다. 바이러스-세포 현탁액은 2∼3일 마다 최대 10회 2차 배양하였다. 이어서, CAV에 대해 특징적인 CPE의 존재에 대해 세포를 거시적 검사하여 종말점 역가를 측정하였다. 역가는 Reed 및 Muench의 방법에 따라 계산하였다(1937년, 상기 문헌 참조).

결과

거시적 검사 및 헤마토크리트 검사 결과는 표 2에 요약되어 있다.

혈청학 결과는 표 3에 요약되어 있다. CAV 항체는 1일령의 10 부화쌍으로부터 유도된 혈청에서는 검출되지 않았다. 또한, CAV 항체는 4주령 대조 닭으로부터 유도된 혈청에서도 검출되지 않았다.

거시적 검사 및 Ht 측정의 결과

접종	투여된 실제 감염도 역가(log₁₀TCID₅₀)	흉선 위축이 있는 닭(%)	약한 골수를 갖는 닭(%)	빈혈이 있는 닭(%)(Ht<27%)
닭 균주
CAV 클론-1CAV Gifu	6.05.8	79%100%	50%100%	21%67%
칠면조 균주
CAV SP6198	4.9	100%	93%	20%
CAV 18938CAV 18933CAV 17382CAV 319	4.95.36.66.1	40%0%53%13%	0%0%27%0%	0%0%7%0%

혈청학 검사 결과

접종	4주령에서 평균 log₂CAV 항체 역가
CAV 클론-1CAV Gifu	n.d.12.0(±0.0)
CAV SP6198CAV 18938CAV SP6198CAV 18933CAV 17382CAV 319	9.9(±1.7)10.3(±1.6)9.9(±1.7)10.8(±1.3)10.2(±1.5)11.4(±1.0)
()=표준 편차n.d.=수행하지 않음

결론

이 실험에서 얻은 결과로부터, 본 발명의 CAV 균주는 닭 또는 기타 칠면조 종으로부터 유도된 CAV 균주와 비교하여 닭에 대해 감소된 병원성을 나타냄이 확인된다.

B

본 실험에서는, 칠면조로부터 분리된 CAV 균주가 CAV에 대해 특징적인 배아 병변을 유도하는 지를 검사하였다. 유럽 특허 출원 제0533294호는 닭에 대해 감소된 독성을 나타내는 감독형 CAV를 개시하고 있다. 이러한 유리한 특성은 발육란에서 병변을 유도하는 종래 바이러스의 특성과 관련이 있다.

실험 고안

난황낭 경로를 통해서 30개의 수정된 SPF 알에게 각 CAV 균주 0.2 ㎖를 접종하였다. 접종 부피는 감염도 역가 10^6.0TCID₅₀를 포함하였다. 양성 대조군으로서, 30개의 수정된 SPF 알에게, 배아 병변을 유도하는 것으로 알려진 CAV 균주인 감독된 CAV 26P4 균주를 접종하였다. 접종하지 않은 30개의 수정된 SPF 알은 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, +37℃의 알 항온기에서 알을 항온배양하였다. 배 형성된지 7일 후에, 매일 알을 초에 비추어 살펴 보았다. 배 형성된 지 최대 10일에 발생하는 배아 사멸은 CAV에 의해 유발된 것이 아닌 것으로 간주하였고, 따라서 이 알들은 버렸다. 배 형성 11일 후에 발생하는 배아 사멸은 CAV가 유발하는 것으로 간주하여, 배아를 수거하여 CAV가 유도한 병변의 존재에 대해 거시적으로 검사하였다. 배 형성 17일째에, 모든 남아있는 배아를 수거하고, CAV가 유도하는 병변의 존재에 대해 거시적으로 검사하였다.

결과

배아 사멸은 표 4에 제시되어 있다.

접종	접종된알의 갯수	배 형성된 후의 일수
	접종된알의 갯수	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
CAV 319	30	13	1	-	1	-	-	-	1	-	-	-
CAV 18933	30	15	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-
CAV 18938	30	15	-	-	1	-	-	-	1	-	-	-
CAV 26P4감독형	30	11	-	-	1	-	-	-	3	1	-	2
대조군비접종	30	3	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-

거시적 검사

CAV 균주 319

배 형성 14일째에 죽은 배아는 CAV에 대해 특징적인 병변을 나타내지 않았다. 14개의 생존한 17일령 배아의 거시적 검사 결과 CAV에 대해 특징적인 병변은 관찰되지 않았다.

CAV 균주 18933

14개의 생존한 17일령 배아의 거시적 검사 결과 CAV에 대해 특징적인 병변은 관찰되지 않았다.

CAV 균주 18938

배 형성 14일째에 죽은 배아는 CAV에 대해 특징적인 병변을 나타내지 않았다. 13개의 생존한 17일령 배아의 거시적 검사 결과 CAV에 대해 특징적인 병변은관찰되지 않았다.

CAV 균주 26P4(감독형)

배 형성 14일, 15일 및 17일째에 죽은 배아는 모두 CAV에 대해 특징적인 병변을 나타내었다. 12개의 생존한 17일령 배아의 거시적 검사 결과, 6개의 배아에서 CAV에 대해 특징적인 병변이 관찰되었다.

결론

본 실험으로부터, 칠면조로부터 분리된 자연 발생적 CAV 균주는 배아 병변을 유도하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 3

난내 예방접종

실험 고안

60개의 18일령 SFP 발육란에, 시판용 CAV 백신인 Nobilis 균주 P4(등록상표)(EP 0533294호), CAV 균주 319 또는 SPF 발육란에서 얻은 배아 균질물 0.2 ㎖를 난내 접종하였다. 1개의 알에 대해 계산된 감염도 역가가 10^3.0TCID₅₀가 되도록 접종하였다. 접종 후에, 알을 부화기로 옮기고, 부화 후에 닭을 음압 분리기에 두었다.

7일, 14일 및 21일령에, 매회 5마리의 닭을 각 군으로부터 분리하였다. 혈액 시료를 헤마토크리트 값의 측정을 위해 수거하였다. 이어서, 부검을 위해 닭을 희생시켰다. 부검시, 흉선 및 골수를 거시적으로 검사하였다.

6주령 및 8주령에, 각 군에서 여러 마리의 닭으로부터 혈액 시료를 수거하고, CAV 항체의 존재/부재에 대해 혈청을 검사하였다.

부화 후 8주 동안, 질병 또는 사망의 임상정 증후의 발생에 대해 닭을 매일 관찰하였다.

재료 및 방법

바이러스 적정

접종된 실제 감염도 역가는 전술한 바와 같이 표준 절차에 따라서 MDCC-MSB1 세포에서 적정하여 결정하였다.

헤마토크리트 측정

말초 혈액 시료를 헤파린 처리된 미량-헤마토크리트(Ht) 모세관에서 2중으로 수거하였다. 10분 동안 15000 g에서 원심분리한 후에, 헤마토크리트 값을 측정하였다. 이어서, 각 닭에 대한 평균 Ht 값을 계산하였다. 27% 미만의 값을 가진 닭은 빈혈이라고 간주하였다.

거시적 검사

거시적 검사시, 흉선 위축 및 골수 약화된, 영향을 받은 동물의 비율을 측정하였다.

질병의 임상적 증후 관찰

실험을 통해서, 질병 또는 사망의 임상적 증후의 발생에 대해 매일 모든 닭을 관찰하였다.

혈청학

고상 결합 CAV 항원, CAV 특이적 비오티닐화된 모노클론 항체 및 아비딘에 커플링된 HRP와 효소 결합형 면역 흡착 분석(ELISA)을 사용하여 CAV 항체의 부재/존재에 대해 혈청 시료를 검사하였다. 항체 역가(log₂)는 비오티닐화된 모노클론 항체가 최대로 결합하지 않는 최대 혈청 희석율의 역수였다. 역가가 <5(log₂)인 혈청 시료는 CAV 항체에 대해 음성으로 간주된다.

난내 접종

18일령 SPF 발육란의 무딘 쪽 말단을 요오드 용액으로 닦아 표면을 소독하였다. 이어서, 소위 말하는 난 드릴을 사용하여 난각에 구멍을 만들었다. 그 다음 Discardit 1.0 ㎖ 주사기와 Microlance 오렌지 0.6 ×25 바늘을 사용하여 바이러스 희석액을 알에 접종하였다. 부화기로 알에 옮기기 전에, 구멍을 파라핀으로 밀봉하였다.

결과

감염도 적정

접종물에서 발견되는 실제 감염도 역가는 하기에 목록화되어 있다.

CAV 백신 Nobilis 균주 P4 : 알 1개당 10^1.9TCIP₅₀

CAV 균주 319 : 알 1개당 10^2.9TCIP₅₀

거시적 검사 결과

거시적 검사에서 얻은 평균 득점은 표 5에 제시되어 있다.

CAV 백신 Nobilis 균주 P4

7일령 및 21일령에 흉선의 변화는 관찰되지 않았다. 14일령에, 3마리의 닭에게서 약간의 흉선 위축이 나타나고, 2마리의 닭에게서 중간 정도의 흉선 위축이 나타났다. 7일령, 14일령 및 21일령에, 골수 변화는 관찰되지 않았다.

CAV 균주 319

7일령, 14일령 및 21일령에, 흉선 및 골수의 변화는 관찰되지 않았다.

음성 배아 균질물

헤마토크리트 값의 측정

7일령, 14일령 및 21일령에 측정된 헤마토크리트 값은 표 6에 제시되어 있다.

측정된 모든 헤마토크리트 값은 27% 이상이었다.

혈청학

평균 CAV 항체 역가는 표 7에 제시되어 있다.

CAV 백신 Nobilis 균주 P4

6주령에, 검사한 17개의 혈청 중 15개의 혈청에서 CAV 항체가 검출되었다. 8주령에, 모든 17 마리의 닭이 CAV에 반응하였다.

CAV 균주 319

6주령에, 검사한 18개의 혈청 중 17개의 혈청에서 CAV 항체가 검출되었다. 8주령에, 모든 18 마리의 닭이 CAV에 반응하였다.

음성 배아 균질물

6주령 및 8주령에, 검사한 모든 혈청에서 CAV 항체가 검출되지 않았다.

질병의 임상적 증후에 대한 관찰

실험을 통해서, 균주 P4, 균주 319 또는 음성 배아 균질물로 접종한 닭에서는 질병 또는 사망의 임상적 증후가 관찰되지 않았다.

논의

CAV 균주 P4 또는 CAV 균주 319를 18일령 발육란을 접종한 후에, 실험을 통해서 질병 또는 사망의 임상적 징후는 관찰되지 않았다. 헤마토크리트 값의 측정으로 빈혈증이 있는 닭은 없음이 밝혀졌다.

혈청학적 검사 결과, CAV 균주 319 또는 CAV 균주 P4를 접종한 대부분의 닭은 6주령에 CAV로 혈청전환됨이 밝혀졌다.

거시적 실험 결과, CAV 균주 P4는 14일령에만 약간 내지 중간 정도의 흉선 위축을 유도함이 밝혀졌다. 그러나, CAV 균주 P4는 골수의 변화를 유도하지 않았다. 거시적 검사 결과, CAV 균주 319는 흉선 및 골수의 변화를 유도하지 않음이 추가로 밝혀졌다.

결론

이 실험 결과로부터, 18일령 SPF 발육란의 난내 접종 후에, CAV 균주 319는 감독형 CAV 백신 Nobilis 균주 P4보다 닭에 대한 병원성이 더 적다는 결론을 내릴 수 있다.

거시적 실험 결과

접종	x일령에 관찰된 병리학적 변화의 비율(%)
	골수	흉선
	7	14	21	7	14	21
CAV 백신 Nobilis 균주 P4	0%	0%	0%	0%	100%	0%
CAV 균주 319	0%	0%	0%	0%	0%	0%
음성 배아 균질물	0%	0%	0%	0%	0%	0%

헤마토크리트 값

접종	x일령에 측정된 평균 헤마토크리트 값(%)
접종	7	14	21
CAV 백신 Nobilis 균주 14	33.0(±1.0)	34.6(±2.3)	n.d.
CAV 균주 319	32.4(±1.1)	34.4(±3.4)	34.2(±1.5)
음성 배아 균질물	32.4(±1.1)	34.2(±1.6)	n.d.
n.d.= 모든 헤마토크리트 튜브가 원심 분리 과정에서 파괴되었기 때문에 측정하지 않음( )=표준 편차

혈청학 결과

접종	x주령에서의 평균 log₂CAV 항체 역가
접종	6 주령	8주령
CAV 백신 Nobilis 균주 14	6.5(±1.4)	7.8(±1.2)
CAV 균주 319	6.9(±1.8)	8.8(±2.2)
음성 배아 균질물	<4.0(±0.0)	<4.0(±0.0)
()=표준 편차

본 발명의 CAV는 병원성이 상당히 감소되어 CAV 감염으로부터 생긴 질병에대해 가금류를 보호하는 생백신의 제조에 사용할 수 있다.

Claims

하이브리도마 세포주가 분비하는 모노클론 항체 R2를 포함하는 수탁 번호 00020304로 ECACC에 기탁된 기준 시료에 의해 바이러스가 중화되는 것이 특징인 닭 빈혈증 바이러스(CAV).
제1항에 있어서, 바이러스가 살아 있는 형태로 존재하는 것이 특징인 CAV.
제1항 또는 제2항에 있어서, CAV 50 ㎕ 당 300∼1000 TCID₅₀에 대해 검사시 CAV에 대한 기준 시료의 역가가 50 ㎕ 당 10(log₂) 이상, 더욱 바람직하게는 50 ㎕ 당 12(log₂) 이상, 심지어는 50 ㎕ 당 14(log₂) 이상인 것이 특징인 CAV.
제3항에 있어서, CAV 50 ㎕ 당 300∼1000 TCID₅₀에 대해 검사시 CAV에 대한 기준 시료의 역가가 50 ㎕ 당 16(log₂) 이상인 것이 특징인 CAV.
제4항에 있어서, 수탁 번호 00012608로 ECACC에 기탁된 CAV 균주 319인 것이 특징인 CAV.
제1항 또는 제2항에 기재된 CAV와 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는, CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 가금류 보호용 백신.
제6항에 있어서, 백신이 보조제를 추가로 포함하는 것이 특징인 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 가금류 보호용 백신.
제6항에 있어서, 백신이 가금류에 대해 감염성인 기타 병원체의 1종 이상의 백신 성분을 추가로 포함하는 것이 특징인 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 가금류 보호용 백신.
a. CAV로 감수성 기질을 접종하는 단계,

b. 바이러스를 증식시키는 단계, 및

c. CAV 함유 재료를 수거하는 단계

를 포함하는 제1항 또는 제2항에 기재된 CAV의 제조 방법.
필요에 따라 CAV의 불활성화 후에 제9항에 기재된 방법으로 얻은 수거된 CAV를 약학적 허용 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함하여, CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대해 가금류를 보호하는 백신을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 백신이 난(卵)내 투여되는 것이 특징인 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 가금류 보호용 백신.
제6항에 있어서, 백신이 1일령 병아리에게 비경구 투여되는 것이 특징인 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상에 대한 가금류 보호용 백신.
제6항에 기재된 백신을 조류에게 투여하는 단계를 포함하여, 가금류에서 CAV 감염으로부터 생긴 질병 증상을 제어하는 방법.