JP2001511138A - 感染性滑液嚢炎ワクチン - Google Patents

感染性滑液嚢炎ワクチン

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ニワトリへの投与により、55%未満の嚢/体重比で表わされる嚢サイズの大きさの減少を生じることと、少なくとも約500のELISA抗体力価を有する家禽を防御する能力との特性の組み合わせを有する感染性滑液嚢炎ウイルスを含むことを特徴とする感染性滑液嚢炎感染に対して家禽を防御し得るワクチンおよび上記の特徴を有するウイルスに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 感染性滑液嚢炎ワクチン 本発明は、感染性滑液嚢炎感染に対して家禽を防御し得るワクチンおよびその ようなワクチンの製造に有用な新規ウイルスに関する。 感染性滑液嚢炎は、家禽を罹患させ得、感染性嚢病ウイルス(IBDV)によ って引き起こされる感染性疾患である。感染性滑液嚢炎の作因は、ビルナウイル ス(Birnaviridae)科、ビルナウイルス(Birnavirus) 属に属し、主にファブリキウス嚢に影響を及ぼす。これは嚢の萎縮を引き起こす 。野外において見出される毒性ウイルスでの感染は、一般に、正常重量の約1/ 3への嚢重量の減少を引き起こす。これは通常、嚢/体重比(BBR)として表 わされる。この疾患は、嚢のBリンパ球集団の変性および壊死を生じる。この結 果、免疫抑制が生じ得る。嚢の萎縮(およびその後の変性)の程度は、関与する 株の毒性に依存する。 血清学的に、IBDVを2つの異なる型に区別することができる:1型はニワ トリにおいて見出され、一方、2型はシチメンチョウにおいて見出される。 感染性滑液嚢炎の予防はワクチン接種に基づく。現在使用されているワクチン 株は、高毒性(ビルレント)(=中間+;例;Bursine Plus、Bu rsine 3)、中間毒性(例えば、Bursine 2、D78、LZ22 8TC)および高弱毒化軽度(=無毒性;例えば、Bursine 1)株に分 けられる。 養鶏業者が直面する問題は、家禽の群れが規則正しくワクチン接種されている 管理下で、新たにかえったニワトリが、高い母性抗体力価を有して誕生すること である。母性抗体力価はワクチンウイルスを妨害することが知られている。高毒 性、中間毒性および無毒性株は、それぞれ1:500、1:250または1:1 00未満の母性ウイルス中和抗体レベルを突破する(「Disease of Poultry」,第9版:Calnekら編;Iowa State Uni v ersity Press,1991,659頁)。母性抗体をモニターするた めにELISA系を使用すると、匹敵する結果が得られる。毒性(中間+))ワ クチンは、約500のIDDEX−ELISA力価を突破する。中間および軽度 株は、ずっと低い力価を突破して、血清応答を誘発することが見出されている。 株の毒性は、上記の嚢重量(BBR)に対する作用によって、または顕微鏡的 変化によってモニターされる。以下の表(表1)は、嚢重量に対する中間+ワク チン(Poulvac Bursa Plus,Delvax LZ228E) および毒性野外ウイルス(単離物D6948E)の毒性のレベルを示す(正常に 比較しての%BBRとして表わす)。 この比較は、中間+ワクチンが、毒性野外ウイルス程度に嚢重量に影響を及ぼ すことを示す。その結果として、高い母性抗体力価を有する若いニワトリをワク チン接種することを所望する業者は、より「ホット」な株の負の結果(重篤な気 管損傷および高死亡率のような)もまた受け入れなければならない。それゆえ、 業者は、中間ワクチンを使用する場合、>1:500の抗体力価を有するニワト リを失う。なぜなら中間ワクチンはこの力価を突破しないからである。そして毒 性ワクチンを使用する場合、養鶏場はウイルスの作用のためにニワトリを失う。 従って、より毒性が低く、同時に高い母性抗体力価を突破できるワクチンの必 要性が存在する。 驚くべきことに、この一組の特徴を有するIBDVが見出された。従って、本 発明によれば、中間毒性と、少なくとも約500のELISA抗体力価を有する 家禽を防御する能力との特性の組み合わせを有する感染性嚢病ウイルスを含むこ とを特徴とする、感染性滑液嚢炎感染に対して家禽を防御し得るワクチンが提供 される。 この新たなクラスのウイルスの特定の例が単離された。新たなIBDV株は、 内部的には9793株として示され、その試料はParis(France)の Institut PasteurのCollection National e de Cultures de MicroorganismesにNo. 1−1810の下、1997年1月22日に寄託されている。寄託株1−181 0はマスター種(master seed)ウイルスの形態である。 ワクチンウイルスを、種ウイルスから、適切な媒体での1回以上の継代によっ て製造する。好ましくは、全てのワクチンウイルスは、単一のストックウイルス プール(マスター種ウイルス)に由来する。必要に応じて、作業種(worki ng seed)ウイルスプールをこのマスター種から1回以上の継代によって 製造し、実際のワクチンウイルスはこの作業種から同様に1回以上の継代によっ て製造する。ワクチンは通常、製造プロセスにおいて使用されるイノシトールま たはマンニトールのような安定化剤を含有する。必要であれば、ワクチン用の希 釈剤はいずれかの生理学的溶液であり得る。 マスター種からワクチンウイルスへのこれらのそれぞれの増殖工程の間の継代 に適切な媒体は、例えば、特定病原体除去(SPF)卵、特異的抗体陰性(SA N)卵、初代ニワトリ細胞またはトリ細胞株である。 本発明によるワクチンは、好ましくは、上記の新たなIBDVクラスの生ウイ ルスを含有する。ニワトリ1羽当りの有効用量は、約102EID50〜約106E ID50、好ましくは約103EID50〜約105EID50の間で変動し得る。ワク チンを安全に1日齢のニワトリにおよび卵中で(in ovo)投与することが できる。 生IBDVに基づく本発明によるワクチンは、好ましくは、凍結乾燥形態で運 送され、使用前に水中に溶解される。 本発明によるワクチンは、好ましくは、腸内経路によって、例えば経口で(飲 料水中でもしくは個々にピペットによって)、眼鼻的にまたは噴霧によって投与 される。 IBDV9793株は、≧500の母性抗体レベル(IDDEX ELISA によって測定)を有する鳥類において抗体を誘発する能力によって、そしてホッ トなワクチンより嚢に対する損傷がずっと低いために特徴付けられる。≧500 の母性抗体レベルを有する鳥類における抗体の誘発は、通常、いわゆる「ホット 」なワクチンおよび/または毒性野外株を用いてのみ可能である。これらのホッ トなワクチンおよび野外株は、ファブリキウス嚢を大いに損傷し、Bリンパ球の 枯渇を引き起こす。IBDV9793株は、感染後の嚢のサイズを測定したとこ ろ、嚢に対する損傷がずっと低い。 従って、本発明のさらなる態様において、寄託株No.1−1810の一般的 なもしくは特定の特徴を有する9793株のウイルスを含むワクチン、または9 793株に由来するかまたは9793株から発達する(すなわち、実際の寄託株 もしくは天然から得たウイルスのいずれかに由来するかもしくはそれから発達す る)ウイルスを含むワクチンが提供される。寄託株No.1−1810の一般的 なもしくは特定の特徴を有するIBVウイルス、または9793株に由来するま たは9793株から発達する(すなわち、実際の寄託株もしくは天然から得たウ イルスのいずれかに由来するかもしくはそれから発達する)ウイルスを含むワク チンもまた提供される。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限 定するものではない。 実施例1 マスター種ウイルスの製造 9793株の母材料のバイアル2本を2.0mlの蒸留水中に再懸濁した。こ のウイルス懸濁液を、その1mlを9mlの生理食塩水中に移すことによって1 /10希釈した。混合後、これを、2mlを58mlの生理食塩水中に移すこと によって1/30希釈して、0.1ml当り約500EID50を含有する懸濁液 を得た。400個のSAN卵の胚の各々に、上記のウイルス懸濁液0.1mlを 、卵黄嚢経路を介して、23G×1”針を装着した1mlシリンジを使用して接 種した。卵を37℃でインキュベートし、24時間後に検卵した。49個の胚は 死滅し、これらは廃棄した。接種後48時間および72時間に、死滅した胚(合 計340個の卵)を卵から取り出し、脱受精能(decapitate)した。 それらを約50個の胚の群にプールした。各群を、小さなオートクレーブ可能な 軸を装着したYstralブレンダーを使用して別々にホモジナイズした。各ホ モジネートをビーカー上の2層のガーゼを通して注ぎ、各々の濾液を別々のDu ranボトルに移した。濾液の容量の約1/3に等価な容量の、イノシトールお よびマンニトールを含有する安定化剤を、各々に添加した。2または3mlの試 料を、各ボトルから、それぞれ力価測定または無菌性試験用に採取した。ボトル および試料を凍結し、さらなる処理まで−70℃で貯蔵した。無菌ボトルを融解 し、プールし、マグネチックスターラーを使用して十分に混合した。全量で49 6mlのマスター種懸濁液を、1バイアル当り0.5mlでバイアル中に充填し 、Edwards Lyomaster 4000中に入れ、凍結乾燥した。バ イアルを真空下でゴム栓を用いて閉め、アルミニウムカプセルを用いて密封した 。 実施例2 作業種の製造 9793株のマスター種ウイルスのバイアル1本を1.0mlの蒸留水中に再 懸濁した。これを、その0.2mlを1.8mlの生理食塩水中に移すことによ って1/10希釈した。混合後、これを、1mlを199mlの生理食塩水中に 移すことによって1/200希釈して、0.1ml当り約104EID50を含有 する懸濁液を得た。650個のSAN卵の胚の各々に、上記のウイルス懸濁液0 .1mlを、卵黄嚢経路を介して、23G×1”針を装着した1mlシリンジを 使用して接種した。卵を37℃でインキュベートし、24時間後および48時間 後に検卵した。24時間後に12個の胚は死滅し、48時間後に11個の胚が死 滅した。これらは全て廃棄した。接種後72時間に、残りの卵から胚を取り出し 、 脱受精能した。それらを約60個の胚の10の群にプールした。各群を、小さな オートクレーブ可能な軸を装着したYstralブレンダーを使用して別々にホ モジナイズした。各ホモジネートをビーカー上の2層のガーゼを通して注ぎ、各 々の濾液を別々のDuranボトルに移した。濾液の容量の約1/3に等価な容 量の、イノシトールおよびマンニトールを含有する安定化剤を、各々に添加した 。各々の最終容量は50mlと60mlとの間であった。1mlを各Duran ボトルから取り出し、プールした。混合後、これを1mlアリコートでNunc Cryotube中に分注し、これらを後の力価測定用に−70℃で貯蔵した 。さらなる1mlアリコートを各Duranボトルから取り出し、5%血液寒天 プレート上に個々にプレーティングして、無菌性についてチェックした。Dur anボトルは全て、必要とされるまで−70℃で貯蔵した。14日後にいずれの プレート上でも増殖ななく、それゆえ、10個全てのアリコートを作業種に含め た。 作業種の凍結乾燥および試験 各々の作業種のアリコートを融解し、プールし、フォロアを使用してマグネチ ックスターラーで十分に混合した。420本のバイアルに各々1mlのウイルス 懸濁液を充填した。バイアルをModulyo凍結乾燥機中に入れた。凍結乾燥 を14時間実施し、その後バイアルを密封し、クリーンルームから取り出した。 クリンプトップ(crimp top)を各バイアルに付し、それらを全て真空 についてEdward spark testerを使用して試験した。 ワクチンの製造 ワクチン材料自体を、作業種から上記で略述した方法に従って製造した。安定 化剤(イノシトール、マンニトール)をワクチン材料に添加した。 実施例3 ワクチンの安全性 実施例1に従って製造したワクチンの安全性を、以下に説明する2つの方法に 従って1日齢のニワトリをワクチン接種した後に試験した。嚢/体重比 嚢サイズを以下の式: による嚢/体重比(BBR)として表す。嚢の損傷評価 顕微鏡検査によって見られる損傷を以下のように判断する: 重量測定後、取り出した嚢を、PHC,Doorn,The Netherl andにおける顕微鏡検査用に、4%ホルマリン中で固定した。結果を表2に要 約するように評価した。 コントロール以外、各々30羽の群を、噴霧によって9793ワクチンでワク チン接種した。ワクチン接種の3週間後、各群の鳥類の半分を屠殺し、BBRを 測定した。ワクチン接種の3週間後、各群の残りの半分の鳥類にチャレンジした 。このチャレンジを、高毒性野外株(D6948E、Deventer,The NetherlandのAnimal Health Instituteから 入手した)を使用して実施した。チャレンジの10〜12日後、これらの鳥類を 同様に屠殺し、BBRを測定した。選択した数の群から、チャレンジの前後の両 方で、嚢を顕微鏡で検査し、損傷評価を決定した。結果 BBR BBR測定の結果を表3に要約する。これらの結果は、ワクチン接種後のコン トロールに比較しての%BBRは平均で約60であることを示す。従って、ワク チンウイルスによる嚢に対する損傷は非常に軽度であると結論することができる 。さらに、ワクチン接種した鳥類の嚢に対するチャレンジウイルスの作用は存在 しないことが明らかであり、一方、コントロールの鳥類において嚢に対するかな りの損傷が顕著である。コントロールの鳥類からのこれらの後者のデータは、実 際、野外ウイルスおよび毒性ワクチン株について以前に示されたデータを確認す る。 *非ワクチン接種コントロール。顕微鏡検査 顕微鏡的に可視の嚢に対する損傷を表4に要約する。ワクチン接種後の損傷評 価は非常に低く、ワクチンのために許容されるレベルにあり、一方、非常に高い 評価が、チャレンジ後の非ワクチン接種鳥類において見出される。ワクチン接種 した鳥類の嚢は、再び、チャレンジウイルスによって影響されないことが示され た。 *非ワクチン接種コントロール。 実施例4 ワクチン接種後の血清応答 これらの研究を、実施例3に使用した鳥類を用いて実施した。鳥類の血液試料 を約5または6日齢で採取した。2〜5日後の個々の力価を、Kouwenho venの式(B.KouwenhovenおよびJ.van den Bosc h;Proceedings of 19th World’s Poultr y Congres,1992,465−468頁)に従って算出した。次いで 、鳥類を異なる力価群に分割し、ワクチン接種した。3または4週間の間に、血 液試料を採取して、セロコンバージョンを検査した。結果 これらの研究の結果を表5に要約する。これらのデータは、本発明によるワク チンの高い効力を確認する。高レベルの母性抗体は、ワクチン接種を妨害しない 。Kouwenhoven(前出)は、中間+株が突破することができる約50 0のELISA力価を与える。本発明によるワクチンは、より高レベルの母性抗 体 を容易に突破して、セロコンバージョンを誘発する。 *非ワクチン接種コントロール;「ND」は測定せずを意味する。 実施例5 上記のKouwenhovenの式を使用してワクチン接種日を算出するため に、血液試料を1日齢のニワトリから採取した。 死亡率に対する9793株の作用を測定するために、2つの試験AおよびBを 設定した。試験Aについては、血液試料を、1日齢、14(9793株でのワク チン接種日)、21、28および35日目に採取した。試験Bについては、血液 試料を、1日齢、11(9793株でのワクチン接種日)、21、28および3 5日目に採取した。 両方の実験において、一方の群をIBD用にワクチン接種し、他方の群をコン トロールとした。各群は1,500羽のニワトリからなった。 全てのニワトリを、ニューカッスル病(ND)および伝染性気管支炎(IB) に対して、ワクチン接種日にワクチン接種した。使用したワクチンはPoulv ac NDW(ニューカッスル病ワクチン)およびPoulvac IB Pr imer(H120株およびD274株を含有する伝染性気管支炎ワクチン)で あった。ワクチン接種を粗噴霧によって実施した。血清学をNDおよびIBにつ いてはHI試験によって、IBDについてはIDEXX ELISAによって実 施した。最後に、死亡率をモニターした。血清学についてのデータを表6Aおよ び6Bに示す(試験97−62Aおよび97−62B)。 死亡率は以下のとおりであった: 試験A: IBDワクチン接種(群1) =7% 非ワクチン接種コントロール(群2)=6.4% 試験B: IBDワクチン接種(群2) =2.8% 非ワクチン接種コントロール(群1)=5.1% 試験Bは、IBD9793が、>500の母性抗体を突破することを示す。試 験Aにおいて、母性抗体はワクチン接種日に500を下回った。IBおよびND についての血清学データは、IBまたはNDに対する体液抗体応答に対するIB D9793による免疫抑制を示さない。死亡率データはまた、ワクチンが安全で あることを示す。 1:商群を用いる片側ANOVAを使用しての群間での統計学的有意差(P≦0 .05)。1:商群を用いる片側ANOVAを使用しての群間での統計学的有意差(P≦0 .05)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY ,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM ,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY, CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E S,FI,GB,GE,GH,HU,ID,IL,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z W

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.ニワトリへの投与により、55%未満の嚢/体重比で表わされる嚢サイズ の減少を生じることと、少なくとも約500のELISA抗体力価を有する家禽 を防御する能力との特性の組み合わせを有する感染性滑液嚢炎ウイルスを含むこ とを特徴とする、感染性滑液嚢炎感染に対して家禽を防御し得るワクチン。 2.その試料がInstitut PasteurのCollection National de Cultures de Microorganis mesにNo.1−1810の下に寄託されている9793株のウイルスの特徴 を有する感染性滑液嚢炎ウイルスを含むワクチン。 3.感染性滑液嚢炎ウイルスが寄託株No.1−1810の特徴を有すること を特徴とする請求項1記載のワクチン。 4.感染性滑液嚢炎ウイルスが、その試料がInstitut Pasteu rのCollection National de Cultures de MicroorganismesにNo.1−1810の下に寄託されている 9793株のウイルスであることを特徴とする請求項1または2記載のワクチン 。 5.感染性滑液嚢炎ウイルスが、その試料がInstitut Pasteu rのCollection National de Cultures de MicroorganismesにNo.1−1810の下に寄託されている 9793株に由来するかまたはそれから発達するウイルスであることを特徴とす る請求項1〜3のいずれか1項記載のワクチン。 6.1用量当り102EID50〜106EID50の量のウイルスを含むことを特 徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載のワクチン。 7.1用量当り103EID50〜105EID50の量のウイルスを含むことを特 徴とする請求項6項記載のワクチン。 8.ニワトリへの投与により、55%未満の嚢/体重比で表わされる嚢サイズ の減少を生じることと、少なくとも約500のELISA抗体力価を有する家禽 を防御する能力との特性の組み合わせを特徴とする感染性滑液嚢炎ウイルス。 9.その試料がInstitut PasteurのCollection National de Cultures de Microorganis mesにNo.1−1810の下に寄託されている9793株のウイルスの特徴 を有する感染性滑液嚢炎ウイルス。 10.感染性滑液嚢炎ウイルスが寄託株No.1−1810の特徴を有するこ とを特徴とする請求項8記載の感染性滑液嚢炎ウイルス。 11.感染性滑液嚢炎ウイルスが、その試料がInstitut Paste urのCollection National de Cultures d e MicroorganismesにNo.1−1810の下に寄託されてい る9793株のウイルスであることを特徴とする請求項8または9記載の感染性 滑液嚢炎ウイルス。 12.感染性滑液嚢炎ウイルスが、その試料がInstitut Paste urのCollection National de Cultures d e MicroorganismesにNo.1−1810の下に寄託されてい る9793株に由来するかまたはそれから発達するウイルスであることを特徴と する請求項8〜10のいずれか1項記載の感染性滑液嚢炎ウイルス。
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