CN117003860A - 猫杯状病毒卵黄抗体的制备及其应用 - Google Patents

猫杯状病毒卵黄抗体的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次利用从衡阳地区分离得到猫杯状病毒FCV‑HY220313毒株，将其灭活后制备得到免疫原，对蛋鸡进行免疫制备卵黄抗体，并进一步制备得到卵黄粉、注射制剂，经试验表明，本发明的制备得到的包含抗猫杯状病毒卵黄抗体的卵黄粉对于猫杯状病毒感染具有很好的预防作用，可以避免FCV感染、减轻FCV感染症状；在相同的治疗原则下，注射本发明的卵黄抗体注射制剂能够有效地提高猫杯状病毒病的治愈率，缩短病程，使得染病猫尽快恢复健康。本发明制备得到的卵黄抗体对猫杯状病毒感染具有很好的预防和治疗功效。

Description

猫杯状病毒卵黄抗体的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猫杯状病毒卵黄抗体的制备及其应用。
背景技术
猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）属于杯状病毒科、水疱疹病毒属，是一种高度流行的家猫病原体，常与猫疱疹病毒合并感染病引起猫科动物口腔与上呼吸道疾病。FCV 在猫科动物中具有高度传染性，不仅在世界各地的猫群中广泛存在，还可以感染老虎、猞猁等野生猫科动物，对宠物猫的生命和野生猫科动物的生物多样性产生严重威胁。经典FCV 主要致猫的上呼吸道感染，主要表现为口腔粘膜、齿龈、舌表面发生糜烂和溃疡，体温轻微升高、流鼻涕和上呼吸道症状，病死率很低，但感染率很高。在猫群中，感染率可高达90% 以上。
猫杯状病毒（Feline calicivirus， FCV）为杯状病毒科疱疹病毒属的单股正链RNA 病毒，由于 RNA 依赖 RNA 聚合酶在病毒复制过程中的不稳定性，FCV 在免疫压力下极易突变产生多样性毒株。过去 50 多年，猫杯状病毒在免疫压力下随着时间推移突变出多种可引起猫不同临床特征的新毒株，从传统的引起口腔溃疡和上呼吸道症状的毒株，逐渐突变出现引起猫严重下呼吸道症状如肺炎的高致病性毒株、引起猫跛行的毒株和引起猫毒性系统性疾病的毒株等。近年来越来越多的 FCV 在中国被不断分离和报道，2018 年郭慧敏等首次报道了 VS-FCV 中国分离株，其研究结果显示FCV 在中国已经发生了明显的变异，出现了超强毒株，利用传统的 FCV疫苗并不能对抗该病毒的感染，对中国 FCV 引起的疫病防控带来了新的难题。FCV 是一种基因组易发生变异的 RNA 病毒，这种变异不仅表现在抗原性方面，而且体现在致病性增强方面。临床上疫苗预防效果并不理想，尤其是与高致病性 FCV 的交叉免疫很少，导致临床上免疫失败频发。FCV部分感染猫康复后仍会继续排毒，持续时间为30天至数年不等。有报道显示，2005年欧洲 FCV 横向流调感染率为20-40%，FCV 纵向流调结果显示感染率为30-75%。
目前FCV的防治仍以疫苗预防为主，修饰的活疫苗和灭活疫苗是可及的，但目前国内尚无商品化的疫苗，FCV 的预防主要依赖于进口猫三联疫苗。卵黄抗体（IgY）是鸡卵黄中的一种免疫球蛋白，属γ球蛋白，其分子结构由二硫键连接的2条相同的重链（分子量约66kDa）和2条相同的轻链（分子量约25 kDa）组成。IgY技术在动物促生长、疾病诊断、预防和治疗中有广泛应用。诸多报道称IgY在疾病诊断、预防和治疗方面发挥着重要作用，其具有稳定性好、特异性高和灵敏度高、安全无毒、无残留、不产生抗药性、能增强机体免疫力等优点，且可作为注射剂、口服剂或饲料添加剂用于疾病的预防和治疗。例如专利CN2022104072056即报道了一种猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途，可以用于预防和辅助治疗猫瘟、猫鼻支和猫传染性鼻结炎。然而，关于猫杯状病毒卵黄抗体的相关研究并不多见，且国内尚无相关产品上市，因此，积极开展FCV卵黄抗体的研究，对于FCV感染的预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了丰富猫杯状病毒感染的相关预防和治疗手段，本发明旨在提供一种猫杯状病毒卵黄抗体及其制备方法与应用。
一种猫杯状病毒卵黄抗体，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体是采用灭活的猫杯状病毒HY220313株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述猫杯状病毒HY220313株的微生物保藏编号为CCTCC NO:V202287；分类命名：猫杯状病毒；保藏时间是2022年10月11日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址：武汉市武汉大学。
所述猫杯状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）FCV-HY220313灭活抗原的制备；
（2）蛋鸡的免疫：将产蛋高峰期的蛋鸡按照1 mL/羽免疫剂量，鸡胸部两侧肌肉注射，每侧0.5 mL，每只鸡免疫三次，首次免疫和二次免疫隔三周，第二次和第三次免疫间隔隔一个月；
（3）卵黄抗体中和效价的测定：收集免疫后的鸡蛋，经蛋清蛋黄分离后，采用间接ELISA法测定蛋黄中FCV的抗体效价，具体结果如下：在首次免疫后7天，卵黄的抗体效价≥1:256，在三免后一个月左右，卵黄中抗体达到最高水平，卵黄的抗体效价≥1:2048。
所述FCV-HY220313灭活抗原的制备包括如下步骤：
步骤a. 培养猫肾传代细胞F81，生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；
步骤b. 取含量为1×105TCID50/ml 的猫杯状病毒FCV-HY220313株按2%的体积百分比接种到步骤a制备得到的生长状态良好的F81单层细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；
步骤c. 接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为FCV-HY220313株病毒培养液；
步骤d. 将FCV-HY220313株病毒培养液稀释至病毒含量为2×108.00TCID50/ml，加入终浓度为0.002mol/L 的BEI，30℃下灭活24h后，加入终浓度为0.002mol/L 的硫代硫酸钠中和BEI，得到灭活的疫苗原液；
步骤e. 将猫杯状病毒FCV-HY220313株疫苗原液和MONTANIDETM ISA 201VG佐剂按照体积比为1:1混合，在无菌环境中搅拌均匀，在乳化机内乳化5min，分装于透明玻璃瓶内，即制得所述灭活抗原。
本发明还请求保护所述猫杯状病毒卵黄抗体在制备用于治疗或预防猫杯状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述药物为卵黄粉或猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂。
本发明还请求保护一种猫杯状病毒卵黄抗体制剂，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体制剂是卵黄粉，所述卵黄粉的制备方法是：选取权利要求2中间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，分离卵清与卵黄，收集卵黄进行均质，加入等质量的麦芽糊精，而后在45-50℃下进行低温烘干至含水量≤10%，经粉碎即制备得到卵黄粉。
本发明还请求保护一种猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂的制备方法包括如下步骤：
（1）分离卵黄：选取权利要求2中间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，用酒精棉擦拭鸡蛋外壳，将外壳清理干净；将卵黄分离至烧杯中，烧杯编号；用玻璃棒搅拌卵黄，量取10 mL置于贴好标签的烧杯中并称重，做好记录；
（2）稀释：10mL卵黄与灭菌PBS缓冲液 pH7.4 1:2（V/V）混合，确保充分混匀，并转移到离心管中；
（3）第一次沉淀：加入3.5%（W/V）的PEG-6000，充分混匀搅拌，37 ℃水浴加热15-30min，充分溶解后取出静置，室温作用1 h；
（4）离心：12000 r/min，4 ℃，30min离心，出现分层，由上而下为黄色脂肪层、清亮层和半固体层；
（5）过滤：倒出上清液，快速型滤纸过滤，收集滤液并记录其体积，同时弃去沉淀物；
（6）第二次沉淀：根据滤液体积，加8.5%（W/V）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30 min，充分溶解；
（7）离心：12000 r/min，4 ℃，30min离心；
（8）溶解：弃去上清液，沉淀物加10 mL 灭菌PBS缓冲液（pH7.4）溶解，确保沉淀完全悬浮、分散、溶解；
（9）第三次沉淀：加12%（W/V）（1.2 g）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30 min，充分溶解；
（10）离心：12000 r/min，4 ℃，30min离心；
（11）冷冻干燥：弃去上清液，沉淀物加入灭菌生理盐水进行溶解和稀释，保证注射制剂的FCV中和抗体效价≥1:6400；
（12）分装：将上述溶解溶液分装至适宜的安培瓶中，即制备得到卵黄抗体注射制剂。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明首次利用从衡阳地区分离得到猫杯状病毒FCV-HY220313毒株，将其灭活后制备得到免疫原，对蛋鸡进行免疫制备卵黄抗体，经检测，首免后14天的鸡蛋中，卵黄抗体的中和效价≥1:128；二免后14天的鸡蛋中，卵黄抗体的中和效价≥1:256；在三免后一个月左右的鸡蛋中，中和抗体效价≥1:512。可见，本发明制备得到的卵黄抗体具有很高的中和抗体效价，因而，可以用于FCV感染的预防和治疗。
其次，本发明将制备得到的免疫鸡蛋进一步制备得到卵黄粉、注射制剂，经试验表明，本发明的制备得到的包含抗猫杯状病毒卵黄抗体的卵黄粉对于猫杯状病毒感染具有很好的预防作用，可以避免FCV感染、减轻FCV感染症状；在相同的治疗原则下，注射本发明的卵黄抗体注射制剂能够有效地提高猫杯状病毒病的治愈率，缩短病程，使得染病猫尽快恢复健康。本发明制备得到的卵黄抗体对猫杯状病毒感染具有很好的预防和治疗功效。
附图说明
图1：FCV-HY220313毒株的分离培养，其中图A为未接毒F81细胞；图B为接毒F81细胞，标尺为200 μm。
图2：FCV-HY220313毒株的免疫过氧化物酶染色鉴定，其中图A为未接毒F81细胞；图B为接种HY220313毒株F81细胞，标尺为50μm。
图3：IPMA检测FCV-HY220313毒株在F81中的增殖动态，其中A-F依次为病毒感染后4h、6h、8h、10h、12h和24h；G为未接毒健康细胞48h对照，标尺为50μm。
图4：卵黄抗体抗体效价测定的结果。
具体实施方式
实施例1：猫杯状病毒HY220313毒株的分离与保藏
1.1 病料的采集和处理
在衡阳某宠物医院收集患胃肠炎的病猫粪便200 μL、于灭菌的1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，混匀，于-20℃和37℃反复冻融3次，震荡15s，3 000 r/min离心2 min，取上清，样品编号为HY220313，于-20 ℃保存备用。
1.2毒株的分离培养与传代培养
猫肾细胞F81由南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室传代保存。
使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养传代，接种25cm2密闭培养瓶、待细胞密度达到90%左右时，将1.1中HY220313样品，用0.22μm滤器无菌过滤，滤过液按照1:25的体积比例接种细胞，37℃、5% CO2培养。设正常细胞对照。每24 h观察细胞病变(CPE)，90%以上细胞病变时，反复冻融3次，收获病毒。
如图1所示，未接种病毒对照细胞生长正常（图1A），接种病料的F81细胞出现典型的FCV细胞病变——细胞出现圆缩、聚堆、脱落、产生葡萄串样的细胞病变（图1B）。连续接种培养3代，表现出稳定的特征一致的CPE。
1.3毒株的血清学鉴定
采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）方法进行鉴定。将F81细胞接种96孔板、待细胞长成90%左右的汇合度时，更换为无血清的DMEM高糖培养基，将1.2中培养的F4代病毒按1:10的体积比将病毒液接种细胞，轻轻振荡混匀，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养12h，设立不解毒细胞作为对照。PBS洗涤2次，加入33%的丙酮-PBS，固定30 min，弃掉固定液，充分干燥、加入100 μL 1:50倍稀释的鼠抗FCV单克隆抗体（郑州爱科生物科技有限公司赠送），37℃ 1 h。PBS洗涤3次。加入100 μL 1:2 000倍稀释的酶标二抗HRP-羊抗鼠IgG，37 ℃1 h，PBS洗涤3次，加入100 μL AEC底物显色液，37 ℃ 15 min。弃掉反应液，ddH2O洗1次，显微镜观察结果。
如图2所示，采用免疫过氧化物酶染色法检测分离培养HY220313样品，结果显示，未接种病毒细胞无着色（图2A），病毒感染细胞经染色后细胞质呈棕红色，细胞核无着色（图2B）表明分离获得的HY220313毒株为FCV毒株，将分离培养的病毒命名为FCV-HY220313毒株。
1.4 FCV-HY220313毒株的体外增殖动态实验
将细胞以适当密度接种8个35 mm培养皿中，以接种后24 h长满90%左右为宜。所有培养皿更换为无血清DMEM培养基，1.5 mL/皿，将FCV-HY220313毒株F4代，按106.2个TCID50/皿的剂量，即每个皿加入1μL病毒，接种7个35 mm培养皿，留1皿作为未接种病毒对照。在37℃、5% CO2条件下培养。分别于接毒后第4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h（共6个时间点）收集样品。每皿用PBS 2 mL洗涤3次（视细胞脱落情况处理），用电吹风吹干（用温热风、皿边缘出现白色圈为宜）。每皿加入1.5 mL 33%丙酮-PBS（33 mL丙酮加入到67 mL灭菌的PBS溶液，混匀即可），室温放置30min固定。弃固定液，用电吹风吹干（皿边缘出现白色圈为宜）。加入鼠抗FCV单克隆抗体，轻轻摇匀，于37℃孵育1 h。每皿注入2 mL PBS，室温静置30 sec，移液器吸出洗液，重复2次。每皿注入稀释好的HRP标记的羊抗鼠二抗1.5 mL轻轻摇匀，于37℃孵育1 h。PBS洗涤3次，加入1.5 mLAEC底物显色液，于37℃ 孵育避光30 min。移液器吸出反应液，每皿注入1.5 mL蒸馏水润洗一次，移液器吸出液体，再加入1.5mL蒸馏水，在显微镜下观察各孔显色情况，拍照记录结果。
如图3所示，IPMA检测结果显示，感染后4h（4 hpi）细胞中出现极少阳性细胞（箭头所指），且染色很浅。6 hpi -10 hpi可见到阳性细胞越来越多、染色越来也深、且细胞膜的染色相对胞质更深；感染后第12 h检出大量阳性细胞，且抗原出现弥散，说明细胞膜在崩解，感染后第24 h细胞绝大多数细胞已经脱落、少部分贴壁细胞胞质呈棕红色、尤其是胞膜着色相对较深、胞核无着色。未接毒的细胞在培养48 h后生长状态良好，无着色。
有关猫杯状病毒FCV-HY220313毒株的分子生物学鉴定等资料，已经在发明专利申请“CN 2023107169842一种猫杯状病毒毒株及其应用”中详细记载，基于其中的分子生物学鉴定可知FCV-HY220313毒株与HZ2063、DL39、BJ-112和BJ-281等中国分离毒株亲缘关系最近、同属于ClusterⅢ。基于其中的动物回归试验可知，本发明的猫杯状病毒FCV-HY220313株具有较强的致病性，甚至致死性。
1.5 保藏
经分离鉴定，获得了猫杯状病毒FCV-HY220313株，其微生物保藏编号为CCTCC NO:V202287；分类命名：猫杯状病毒；保藏时间是2022年10月11日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址：武汉市武汉大学。
实施例2：FCV-HY220313灭活抗原的制备及检验
2.1 病毒的增殖
步骤a. 培养猫肾传代细胞F81，生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基。
步骤b. 取含量为1×105TCID50/ml 的猫杯状病毒FCV-HY220313株按2%的体积百分比接种到步骤a制备得到的生长状态良好的F81单层细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；
步骤c. 接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为FCV-HY220313株病毒培养液；
2.2 病毒的灭活
步骤d. 将FCV-HY220313株病毒培养液稀释至病毒含量为2×108.00TCID50/ml，加入终浓度为0.002mol/L 的BEI，30℃下灭活24h后，加入终浓度为0.002mol/L 的硫代硫酸钠中和BEI，得到灭活的疫苗原液；
2.3 灭活抗原的配制
步骤e. 将猫杯状病毒FCV-HY220313株疫苗原液和MONTANIDETM ISA 201VG佐剂按照体积比为1:1混合，在无菌环境中搅拌均匀，在乳化机内乳化5min，分装于透明玻璃瓶内，即制得所述灭活抗原。
实施例3：卵黄抗体的制备
3.1 蛋鸡的免疫
将产蛋高峰期的蛋鸡按照1 mL/羽免疫剂量，鸡胸部两侧肌肉注射，每侧0.5 mL，每只鸡免疫三次，首次免疫和二次免疫隔三周，第二次和第三次免疫间隔隔一个月。
3.2卵黄抗体抗体效价的测定
收集免疫后的鸡蛋，经蛋清蛋黄分离后，采用间接ELISA法测定蛋黄中FCV的抗体效价，具体结果如图4所示，其中：在首次免疫后7天，卵黄的抗体效价≥1:256，在三免后一个月左右，卵黄中抗体达到最高水平，卵黄的抗体效价≥1:2048。可见，本发明的灭活疫苗能够刺激蛋鸡产生较高水平的IgY。
3.3 卵黄抗体中和活性的测定
在96孔板上培养猫肾传代细胞F81，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基。取稀释后的FCV-HY220313株培养液（稀释至病毒滴度为106TCID50/ml）与等体积的卵黄液样品混匀，常温下作用1h，加入到培养好的96孔板F81细胞中（每孔100μL混合液），37℃吸附1h，换维持液100μL，72h后倒置显微镜下观察结果。采用终点稀释法计算卵黄抗体对FCV-HY220313株的中和抗体效价，经检测，首免后14天的鸡蛋中，卵黄抗体的中和效价≥1:128；二免后14天的鸡蛋中，卵黄抗体的中和效价≥1:256；在三免后一个月左右的鸡蛋中，中和抗体效价≥1:512。可见，本发明制备得到的卵黄抗体具有很高的中和抗体效价，因而，可以用于FCV感染的预防和治疗。
实施例4：卵黄抗体制剂的制备
4.1 卵黄粉的制备
选取间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，分离卵清与卵黄，收集卵黄进行均质，加入等质量的麦芽糊精，而后在45-50℃下进行低温烘干至含水量≤10%，经粉碎即制备得到卵黄粉。
4.2 卵黄抗体注射制剂的制备
（1）分离卵黄：选取间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，用酒精棉擦拭鸡蛋外壳，将外壳清理干净；将卵黄分离至烧杯中，烧杯编号；用玻璃棒搅拌卵黄，量取10 mL置于贴好标签的烧杯中并称重，做好记录（卵黄质量=烧杯与卵黄总质量-烧杯质量）。
（2）稀释：10mL卵黄与灭菌PBS缓冲液（pH7.4）1:2（V/V）混合，确保充分混匀，并转移到离心管中。
（3）第一次沉淀：加入3.5%（W/V）的PEG-6000（称取误差范围0.01），充分混匀搅拌，37 ℃水浴加热15-30 min，充分溶解后取出静置，室温作用1 h（越长越好，可过夜静置；静置期间，溶液会出现分层现象。）。
（4）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心，出现分层，由上而下为黄色脂肪层、清亮层（IgY）和半固体层。
（5）过滤：倒出上清液，快速型滤纸过滤，收集滤液并记录其体积，同时弃去沉淀物。
（6）第二次沉淀：根据滤液体积，加8.5%（W/V）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30 min，充分溶解。
（7）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心。
（8）溶解：弃去上清液，沉淀物加10 mL 灭菌PBS缓冲液（pH7.4）溶解，确保沉淀完全悬浮、分散、溶解。
（9）第三次沉淀：加12%（W/V）（1.2 g）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30 min，充分溶解。
（10）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心。
（11）冷冻干燥：弃去上清液，沉淀物加入灭菌生理盐水进行溶解和稀释，保证注射制剂的FCV中和抗体效价≥1:6400。
（12）分装：将上述溶解溶液分装至适宜的安培瓶中，即制备得到卵黄抗体注射制剂。
实施例5：卵黄抗体在预防和治疗猫杯状病毒感染中的应用
5.1 卵黄粉在预防猫杯状病毒感染中的应用
选择8-10周龄的健康易感猫（FCV中和抗体效价≤1:4）10只，随机分为两组，均采用同样的猫粮、在同样的环境条件下进行饲喂，其中组1为试验组，每日口服由“4.1卵黄粉的制备”中方法制备得到的包含抗猫杯状病毒卵黄抗体的卵黄粉，1g/kg体重，连续服用5天；组2为对照组，每日口服由普通鸡蛋制备得到的卵黄粉（分离卵清与卵黄，收集卵黄进行均质，加入等质量的麦芽糊精，而后在45-50℃下进行低温烘干至含水量≤10%，经粉碎即制备得到），剂量也为1g/kg体重，连续服用5天。而后采用猫杯状病毒FCV-HY220313株进行攻毒，每只猫滴鼻攻毒（稀释至病毒滴度为106TCID50/ml）0.5ml。连续14天观察并记录猫的状态，发病标准为：出现发热、精神低迷、眼或鼻子出现粘液或者脓性分泌物、结膜炎、鼻子分泌物增多且FCV检测呈现阳性、口腔溃疡等FCV感染症状，甚至死亡。
结果显示，对照组组2的猫发病率100%，出现明显的发热、眼或鼻子出现粘液或者脓性分泌物、鼻子分泌物增多且FCV检测呈现阳性、口腔溃疡等FCV感染症状等FCV症状，其中3只试验猫在试验过程中死亡，死亡率高达60%。
试验过程中，试验组1的猫全部存活，存活率达到100%，其中仅有1只猫出现了发病症状，表现为发热、精神低迷、眼角分泌物增加，但是并且持续时间较短，在出现症状后3天左右即自愈。
由此可见，本发明的制备得到的包含抗猫杯状病毒卵黄抗体的卵黄粉对于猫杯状病毒感染具有很好的预防作用，可以避免FCV感染、减轻FCV感染症状。
5.2 卵黄抗体注射制剂在治疗猫杯状病毒感染中的应用
选择8-10周龄的健康易感猫（FCV中和抗体效价≤1:4）10只，采用猫杯状病毒FCV-HY220313株进行攻毒，每只猫滴鼻攻毒（稀释至病毒滴度为108TCID50/ml）1ml，待其发病后，随机分为两组，其中组1卵黄抗体注射制剂治疗组，每只猫皮下注射1mL卵黄抗体注射制剂，同时根据症状进行退烧、消炎、抗病毒等辅助治疗（采用利巴韦林、干扰素、盐酸多西环素片、氯霉素滴眼液、阿莫西林克拉维酸钾、复合B族维生素片等药物进行对症治疗）；组2为对照组，根据症状进行退烧、消炎、抗病毒等治疗（采用利巴韦林、干扰素、盐酸多西环素片、氯霉素滴眼液、阿莫西林克拉维酸钾、复合B族维生素片等药物进行对症治疗），其中根据症状所进行的治疗由同一宠物医生进行诊治，在治疗过程中未告知其分组情况。试验时间共持续10天，观察10天内发病猫的治愈情况。对于10天后未痊愈的猫，继续进行治疗，直至其病症基本消除，对于试验过程中死亡的动物，进行无害化处理。结果显示，组1的10天内的治愈率为100%；组2的10天内的治愈率为60%，死亡率为20%。具体结果记录如下：
组1：治疗第3天，3只猫发烧、精神萎靡、口鼻分泌物增多、眼睛发炎的症状明显改善；第6天，除有1只猫仍存在口鼻分泌物较多的症状外，其他猫基本恢复正常；第8天，所有猫的临床症状基本消失，表明猫杯状病毒病基本治愈，治愈率为100%。
组2：治疗第3天， 3只猫仍发烧且精神萎靡、眼角发炎，2只猫发烧、精神萎靡、口鼻分泌物增多、眼睛发炎的症状有所改善；第5天，1只猫死亡；第6天，2只猫仍存在精神萎靡、口鼻分泌物增多的情况，剩下的2只猫基本恢复正常；第10天，3只猫的症状基本消失，但仍有1只存在口鼻分泌物增多的情况，表明传统治疗方法在10天内，猫杯状病毒病的治愈率为60%，死亡率为20%。剩下的1只发病猫经过额外的5天治疗，恢复了健康。
基于以上试验可知，在相同的治疗原则下，注射本发明的卵黄抗体注射制剂能够有效地提高猫杯状病毒病的治愈率，缩短病程，使得染病猫尽快恢复健康。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种猫杯状病毒卵黄抗体，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体是采用灭活的猫杯状病毒HY220313株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述猫杯状病毒HY220313株的微生物保藏编号为CCTCC NO:V202287；分类命名：猫杯状病毒；保藏时间是2022年10月11日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址：武汉市武汉大学。
2.根据权利要求1所述的猫杯状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）FCV-HY220313灭活抗原的制备；
（2）蛋鸡的免疫：将产蛋高峰期的蛋鸡按照1 mL/羽免疫剂量，鸡胸部两侧肌肉注射，每侧0.5 mL，每只鸡免疫三次，首次免疫和二次免疫隔三周，第二次和第三次免疫间隔隔一个月；
（3）卵黄抗体中和效价的测定：收集免疫后的鸡蛋，经蛋清蛋黄分离后，采用间接ELISA法测定蛋黄中FCV的抗体效价，具体结果如下：在首次免疫后7天，卵黄的抗体效价≥1:256，在三免后一个月左右，卵黄中抗体达到最高水平，卵黄的抗体效价≥1:2048。
3.根据权利要求2所述的猫杯状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述FCV-HY220313灭活抗原的制备包括如下步骤：
步骤a. 培养猫肾传代细胞F81，生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；
步骤b. 取含量为1×105TCID50/ml 的猫杯状病毒FCV-HY220313株按2%的体积百分比接种到步骤a制备得到的生长状态良好的F81单层细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；
步骤c. 接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为FCV-HY220313株病毒培养液；
步骤d. 将FCV-HY220313株病毒培养液稀释至病毒含量为2×108.00TCID50/ml，加入终浓度为0.002mol/L 的BEI，30℃下灭活24h后，加入终浓度为0.002mol/L 的硫代硫酸钠中和BEI，得到灭活的疫苗原液；
步骤e. 将猫杯状病毒FCV-HY220313株疫苗原液和MONTANIDETM ISA 201VG佐剂按照体积比为1:1混合，在无菌环境中搅拌均匀，在乳化机内乳化5min，分装于透明玻璃瓶内，即制得所述灭活抗原。
4.根据权利要求1所述的猫杯状病毒卵黄抗体在制备用于治疗或预防猫杯状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述药物为卵黄粉或猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂。
5.一种猫杯状病毒卵黄抗体制剂，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体制剂是卵黄粉，所述卵黄粉的制备方法是：选取权利要求2中间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，分离卵清与卵黄，收集卵黄进行均质，加入等质量的麦芽糊精，而后在45-50℃下进行低温烘干至含水量≤10%，经粉碎即制备得到卵黄粉。
6.一种猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂，其特征在于，所述猫杯状病毒卵黄抗体注射制剂的制备方法包括如下步骤：
（1）分离卵黄：选取权利要求2中间接ELISA抗体效价≥1:512的免疫鸡蛋，用酒精棉擦拭鸡蛋外壳，将外壳清理干净；将卵黄分离至烧杯中，烧杯编号；用玻璃棒搅拌卵黄，量取10mL置于贴好标签的烧杯中并称重，做好记录；
（2）稀释：10mL卵黄与灭菌PBS缓冲液 pH7.4 1:2（V/V）混合，确保充分混匀，并转移到离心管中；
（3）第一次沉淀：加入3.5%（W/V）的PEG-6000，充分混匀搅拌，37 ℃水浴加热15-30min，充分溶解后取出静置，室温作用1 h；
（4）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心，出现分层，由上而下为黄色脂肪层、清亮层和半固体层；
（5）过滤：倒出上清液，快速型滤纸过滤，收集滤液并记录其体积，同时弃去沉淀物；
（6）第二次沉淀：根据滤液体积，加8.5%（W/V）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30min，充分溶解；
（7）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心；
（8）溶解：弃去上清液，沉淀物加10 mL 灭菌PBS缓冲液（pH7.4）溶解，确保沉淀完全悬浮、分散、溶解；
（9）第三次沉淀：加12%（W/V）（1.2 g）PEG-6000，震荡摇匀，37 ℃水浴15-30 min，充分溶解；
（10）离心：12000 r/min，4 ℃，30 min离心；
（11）冷冻干燥：弃去上清液，沉淀物加入灭菌生理盐水进行溶解和稀释，保证注射制剂的FCV中和抗体效价≥1:6400；
（12）分装：将上述溶解溶液分装至适宜的安培瓶中，即制备得到卵黄抗体注射制剂。
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