CS244931B2

CS244931B2 - Preparation method of vaccine against markov disease

Info

Publication number: CS244931B2
Application number: CS288883A
Authority: CS
Inventors: Ionel-Victor Patrascu
Original assignee: Centr De Cercet Si Bioprepar P
Priority date: 1982-04-22
Filing date: 1983-04-22
Publication date: 1986-08-14
Also published as: DD209738A5; RO80570B1; RO80570A3

Description

Způsob přípravy vakcíny proti Markově chorobě jednovrstevnou kultivací zdravých kuřecích embryonálních specificky nepatogenních buněk naočkovaných vakcinálním krocaním herpes virem, po dosáhnutí 80' % cytopatogenního efektu charakteristického pro vakcionální virus, se uvolňuje virus z izolovaných buněk působením ultrazvuku, přičemž se při přípravě použije roztok obsahující ' sacharózu, fosfáty, glutamát draselný a hovězí albuminovou frakci V, spočívající v tom, že se jako vakcinální virus použije krocaní herpes virus kmen FC-126 klon 1 RPCPSA — Voluntari, Bukurešť č. Illb prostý mykoplasmy, přičemž se tkáňová kultivace viru provádí na rollerech nebo v suspenzi dextranových mikronosičů.Method of preparing a vaccine against Mark's disease by single-layer cultivation of healthy chicken embryonic specifically non-pathogenic cells inoculated with a vaccinated herpes virus turkey, after achieving an 80% cytopathogenic effect characteristic of a vaccine virus, releases the virus from isolated cells by ultrasound using a sucrose containing solution. , phosphates, potassium glutamate and bovine albumin fraction V, comprising the use of the turkey herpes virus strain FC-126 clone 1 RPCPSA - Voluntari, Bucharest No. Illb free of mycoplasma as vaccine virus, wherein the tissue culture of the virus is performed on roller or in a suspension of dextran microcarriers.

Vynález se týká způsobu přípravy vakcíny proti Markově chorobě za použití kmene krocaního herpes viru.The invention relates to a method of preparing a vaccine against Mark's disease using a strain of turkey herpes virus.

Známá metoda přípravy této vakcíny ze specificky nepatogenních (SPF) embryonálních tkáňových kultur o koncentraci 2 x x ' 10⁶ buněk/ml, nasazených do speciálních skleněných lahví nebo lahví z plastické hmoty, udržovaných ve statickém systému, spočívá v měnění živného média v různých intervalech za účelem vyvolání cytopatogenního efektu nebo v infikování kultur vakcinálním virem. Krocaní herpes virus (HVT) se pak extrahuje z buněčné suspenze do- SPGA ochranného roztoku obsahujícího sacharózu, 'fosfáty, glutamát draselný a hovězí albuminovou frakci V. Virus se pak uvolní působením ultrazvuku při maximálním biologickém limitu po- dobu 1 minuty, 5minutové přestávce a lminutovém chlazení, po kterém se buňky prosté herpes viru rychle zmrazí při teplotě —80 °C a udržují se při této- teplotě až do stanovení koncentrace viru v ml. Podle tohoto postupu se pak provede rychlé rozmražení, redistribuce ultrazvukem po dobu 10 sekund, ředění odpovídajícího množství na hodnotu 1 000 dávek/láhev a lyofilizace produktu. Uvedený postup má však následující nevýhody: statický systém tkáňových kultur vyžaduje přídavné operace, velké objemy uložené v termostatech, velký počet lahví pro tkáňové kultury, několik změn živných médií ve fázi množení, působením ultrazvuku se uvolňuje nedostatečný počet infekčních vakcinálních částic.Known methods for preparing the vaccine of specifically non-pathogenic free (SPF) of embryonic cell cultures at a concentration of 2 xx '10 ⁶ cells / ml, seeded in special glass bottles or plastic bottles, held in a static system is by changing the nutrient medium at different intervals to induce a cytopathogenic effect or to infect cultures with a vaccine virus. The turkey herpes virus (HVT) is then extracted from the cell suspension into a SPGA protective solution containing sucrose, phosphates, potassium glutamate and bovine albumin fraction V. The virus is then released by sonication at a maximum biological limit for 1 minute, 5 minutes and One minute of cooling, after which the herpes virus-free cells are frozen rapidly at -80 ° C and maintained at this temperature until the virus concentration in ml is determined. Rapid thawing, ultrasonic redistribution for 10 seconds, dilution of the appropriate amount to 1000 doses / bottle and lyophilization of the product are then performed. However, this process has the following disadvantages: a static tissue culture system requires additional operations, large volumes stored in thermostats, a large number of tissue culture flasks, several changes in nutrient media in the multiplication phase, and ultrasound releases an insufficient number of infectious vaccine particles.

Předkládaný vynález eliminuje výše uvedené nedostatky použitím SPF kuřecích embrynoálních primárních buněčných kultur, nasazených na rollery nebo dextranové mikronosiče, které se infikují po vytvoření 80% jednovrstevné tkáňové kultury HVT kmenem FC-126, klon 1, Illb, ze sbírky Center for Research and Bi-oproducts for Poultry and Smáli Animals, Voluntari-Bukurešť, pak -se -shromáždí v SPGA roztoku, který obsahuje sacharózu, fosfáty, glutamát draselný a hovězí albuminovou frakci V, třikrát se zpracuje ultrazvukem po dobu 1 minuty v dvouminutových intervalech a odstředěním se získá určité -množství vakcíny. Vzniklý sediment se pak resuspenduje v roztoku SFGA, opět se podrobí působení ultrazvuku výše uvedeným způsobem, odstředěním -se získá další podíl vakcíny. Spojené podíly se uchovají při teplotě —100 °C až do -stanovení obsahu viru, pak se rychle rozmrazí, ředí roztokem SPGA a provede se lyofilizace.The present invention eliminates the above drawbacks by using SPF chicken embryonic primary cell cultures, seeded on rollers or dextran microcarriers, which are infected after the formation of 80% of a single-layer tissue culture of HVT by strain FC-126, clone 1, Illb from the Center for Research and Bi- then it is collected in an SPGA solution containing sucrose, phosphates, potassium glutamate and bovine albumin fraction V, sonicated three times for 1 minute at 2 minute intervals and centrifuged to give some - amount of vaccine. The resulting sediment is then resuspended in SFGA solution, sonicated as above, and centrifuged to give an additional portion of the vaccine. The pooled aliquots are stored at -100 ° C until virus content is determined, then thawed rapidly, diluted with SPGA, and lyophilized.

Následující příklad je příkladem přípravy vakcíny proti Markově chorobě za použití kmene krocaního herpes viru podle vynálezu.The following example exemplifies the preparation of a vaccine against Mark's disease using the turkey herpes virus strain of the invention.

Příklad provedeníExemplary embodiment

Připraví se SPF kuřecí embrynoální primární buněčné kultury na rollerech nebo dextranových mikronosičích. Po 20 až 24 hodinách, kdy se -vytvoří asi 80% jednovrstevné tkáňové kultury, se zamění živné médium čerstvým médiem obsahujícím inokulum, tj. vakcinální virové buňky sdruženého typu.SPF chicken embryo primary cell cultures are prepared on roller or dextran microcarriers. After about 20 to 24 hours, when about 80% of the monolayer tissue culture is formed, the nutrient medium is exchanged with fresh medium containing the inoculum, i.e., vaccinated viral cells of the associated type.

Tkáňové kultury se udržují ve fermentačním tanku nebo v rolleru za průběžné kontroly, bez změny živného média až cytopatogenní efekt charakterizovaný infekcí krocaního herpes viru vykazuje 80 % jednovrstevné tkáňové monokultury.Tissue cultures are maintained in a fermentation tank or roller under continuous control, without altering the nutrient medium until the cytopathogenic effect characterized by infection of the turkey herpes virus shows 80% of the monolayer tissue monoculture.

Infikované buňky se oddělí obvyklou trypsinizační metodou a odstředí se při +4 ^CC a 1 200 ot/min.Infected cells were harvested by the usual trypsinization method and centrifuged at +4 ^° C and 1200 rpm.

Odstředivé buňky lze resuspendovat v médiu pro vymražení buněk sdruženého typu a vymrazit na —196 °C (při ochlazování 1 až 2 °Ο za minutu), nebo je lze resuspendovat ve speciálním roztoku obsahujícím sacharózu, fosfáty, glutamát draselný, hovězí albuminovou frakci V (SPGA). Virus se pak uvolní z buněk působením ultrazvuku opakovaným třikrát po dobu jedné minuty s -dvouminutovými intervaly při teplotě +4° Celsia. Suspenze -se pak odstředí při +4 °C a 1 .200 ot/min a supernatant představující první podíl vakcíny se oddělí za sterilních podmínek. Sediment -se opět -suspenduje v SPGA a podrobí stejnému zpracování ultrazvukem. Takto při druhém zpracování ultrazvukem získaná -suspenze představuje druhý podíl vakcíny a přidá se -k první dávce.The centrifugal cells can be resuspended in the cell-type freezing medium and frozen at -196 ° C (cooling 1 to 2 ° Ο per minute) or resuspended in a special solution containing sucrose, phosphates, potassium glutamate, bovine albumin fraction V ( SPGA). The virus is then released from the cells by sonication repeated three times for one minute with 2 minute intervals at + 4 ° C. The suspension is then centrifuged at +4 ° C and 1200 rpm and the supernatant representing the first portion of the vaccine is collected under sterile conditions. The sediment is resuspended in SPGA and subjected to the same ultrasonic treatment. Thus, in a second ultrasonic treatment, the suspension obtained represents a second portion of the vaccine and is added to the first dose.

Suspenze virů se zmrazí na —100 °C v lahvích stejné velikosti a v nádobách z plastické hmoty. Vzorky oddělené v nádobkách z plastické hmoty -se rozmrazí a provedou se bakteriologická, biologická a mytologická stanovení a rovněž kvantitativní stanovení -vakcinálního viru.Virus suspensions are frozen to -100 ° C in bottles of the same size and in plastic containers. The samples separated in the plastic containers are thawed and bacteriological, biological and mythological determinations as well as quantitative determination of the vaccine virus are performed.

Po- stanovení koncentrace viru v ml se suspenze virů rozmrazí, zředí SPGA a lyofilizuje. Každá láhev musí podle výrobního protokolu obsahovat 250, 500 nebo 1000 vaitoinálních- dávek a každá vakcinální dávka 1 200 jednotek tvorby povlaku, dále jen PFU.To determine the virus concentration in ml, the virus suspension is thawed, diluted with SPGA, and lyophilized. According to the manufacturing protocol, each bottle must contain 250, 500 or 1000 vaitoinal doses and each vaccine dose of 1200 coating units, hereinafter referred to as PFU.

Tato lyofilizovaná vakcína se uchovává až do použití při teplotě +4 °C.This lyophilized vaccine is stored at +4 ° C until use.

Srovnání vakcíny vyrobené podle původního postupu a postupu podle vynálezu (varianta I a II):Comparison of the vaccine produced according to the original procedure and the process according to the invention (variants I and II):

Vakcína Vaccine Celkem ml Total ml PFU/ml PFU / ml Vakcinální dávka po lyofilizaci Vaccine dose after lyophilization 1. vakcína varianta I 1. vaccine variant I 100 100 ALIGN! 5 x 10⁶ 5 x 10 ⁶ 66,000* 66,000 * 2. vakcína varianta II 2nd vaccine variant II 80,000 80,000 působení ultrazvuku effect of ultrasound na buněčný sediment for cell sediment — supernatant - supernatant 100 100 ALIGN! 5 x 10® 5 x 10® — buněčný sediment - cell sediment 20 20 May 4,5 x 10® 4.5 x 10®

*vakcinální dávka obsahuje 1 200 PFU* the vaccine dose contains 1200 PFU

Médium pro buněčné kultury je médium TC 199 prosté purinu, pyrinrdinu a nukleotidu a s přídavkem fosfátu tryptasy, hydrogenuhličitanu sodného, antibiotik a fetálního séra.The cell culture medium is TC 199 medium free of purine, pyridine and nucleotide and with the addition of tryptase phosphate, sodium bicarbonate, antibiotics and fetal serum.

Vakcinální virus je krocaní herpes virus kmen FC-126 klon 1 prostý mykoplasmy, registrovaný pod číslem Illb klon 1 v rejstříku Center for Research and Bioproducts fcr Poultry and Smáli Animals, Voluntari-Bukurešť. Krocaní herpes virus FC-126 je nepatogenní pro kuřata, klon 1 je prostý mykoplasmy a vyvolává v totálních nebo renálních kuřecích embryonálních fibroblastech cha rakteristický cytopatogenní efekt. Kuřata vakcinovaná HVT kmenem FE-126 jsou odolná к následné infekci patogenním virem Markovy choroby a nevznikají tumory.The vaccine virus is a turkey herpes virus strain FC-126 clone 1 free of mycoplasma, registered under the number Illb clone 1 in the register of Poultry and Smal Animals, Voluntari-Bucharest. The turkey herpes virus FC-126 is non-pathogenic to chickens, clone 1 is free of mycoplasma and produces a characteristic cytopathogenic effect in total or renal chicken embryonic fibroblasts. The chickens vaccinated with the HV-strain FE-126 are resistant to subsequent infection with the pathogenic virus of Mark's disease and do not develop tumors.

Předkládaný vynález má následující výhody:The present invention has the following advantages:

— příprava vakcíny nevyžaduje zvláštní metodiku, výroba je kontinuální, poloautomatizovaná, — suspenze virových částic je po zpracování ultrazvukem homogenní, — lze připravit jak lyofilizované, tak zmrazené formy vakcín.- preparation of the vaccine does not require special methodology, production is continuous, semi-automated, - suspension of virus particles is homogeneous after ultrasound treatment, - both freeze-dried and frozen forms of vaccines can be prepared.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Method of preparing a vaccine against Mark's disease by single-layer cultivation of healthy chicken embryonic specifically non-pathogenic cells inoculated with a vaccinated herpes virus turkey, after reaching 80% of the cytopathogenic effect characteristic of a vaccine virus, releases the virus from isolated cells by ultrasound using a solution containing sucrose, phosphates, potassium glutamate and bovine albumin fraction V, characterized in that the vaccine virus used is a turkey herpes virus strain FC-126 clone 1 RPCPSA - Voluntari, Bucharest # 111b free of mycoplasma, the tissue culture of the virus being carried out on rollers in a suspension of dextran microcarriers.