KR20070052273A - 코로나바이러스 감염의 치료를 위한 백신 조성물 - Google Patents

코로나바이러스 감염의 치료를 위한 백신 조성물 Download PDF

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KR20070052273A
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데이비드 에스 버트
마크 에이 레디쉬
메리 차오훙 후
죠지 에이치 로웰
데이비드 휴 죤스
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Abstract

본 발명은 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 보호성 체액성 및/또는 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있는 코로나바이러스 S 단백질 또는 N 단백질, 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 조성물은 SARS의 원인체와 같은 코로나바이러스에 의한 감염을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 또한, SARS 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스에 의해 유발되는 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는, 프로테오좀 또는 프로톨린과 같은 보조제를 포함하는 코로나바이러스 S 단백질 및 N 단백질 면역원 조성물이 제공된다.
코로나바이러스 감염, 보호성 면역반응, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 코로나바이러스 S 단백질, 코로나바이러스 N 단백질, 프로테오좀, 프로톨린

Description

코로나바이러스 감염의 치료를 위한 백신 조성물{Vaccine compositions for treating coronavirus infection}
정부 권리의 진술
본 발명은 부분적으로 허가번호 UCl AI062600-01하에 미국 국립본건원의 조사 기금으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어 특정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 일반적으로 코로나바이러스 항원의 백신 조성물, 보다 구체적으로는 적어도 하나의 코로나바이러스 항원(S 단백질, N 단백질, M 단백질 등을 포함) 및 이의 변이체를 포함하는 조성물, 및 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 보호성 면역반응을 유도하기 위한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
1979년 이래로 30가지의 새로운 사람 바이러스 질환이 출현하였으며, 특히, 대부분은 동물에서 사람으로 전염되었다. 가장 최신 사례 중 하나는 최근의 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)의 발발이다. SARS는 중국의 광동 지방에서 2002년 11월에 갑작스럽게 나타난 신생 질환이다. 단시간 동안, 상기 질환은 다른 아시아 국 가로 확산되고 잇달아서 급속도로 북미와 유럽으로 확산되었다[참조: WHO. Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS). WkIy. Epidemiol, Rec. 78: 81, 2003]. SARS의 초기 출현 9개월내에 대략 8,500건의 사례가 보고되었으며, 사망율은 약 10%였다. 임상적으로, 상기 질환은 발열, 호흡곤란, 림프구감소증, 및 미만성 폐포손상을 나타내는 폐 병변을 특징으로 한다[참조: Nicholls et al., Lancet 361 : 1773, 2003]. 몇몇 후보 인자가 상기 질환의 원인체로 제시되었지만, 조사에 의해 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스(그룹 2 코로나바이러스; SARS-CoV 또는 SCV)로 범위가 좁혀졌으며, 현재는 이 바이러스가 단독으로 또는 사람 메타뉴모바이러스와 함께 SARS의 1차적 원인으로 인정되고 있다[참조: Ksiazek et al., N. Engl J. Med. 348: 1953, 2003; Drosten et al, N. Engl. J. Med. 348: 1967, 2003; Kuiken et al., Lancet 362: 263, 2003; Fouchier et al., Nature 423: 240, 2003].
코로나바이러스는 동물 및 사람에서 질환을 유발하는 플러스(+) 쇄 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스 감염은 전신 또는 국소 감염일 수 있다. 국소 감염인 경우, 코로나바이러스는 호흡기 또는 장관의 상피 세포 또는 대식세포와 같은 오로지 적은 세포 유형만을 감염시킬 것이다.
이러한 신규 질환에 있어, 심지어 SARS의 원인체의 감염 방식을 포함하는 많은 미해결 문제들이 남아 있다. 일부 단서들이 2003년 질환 유행으로부터 수집될 수 있다: (a) 전세계 다양한 지역에서 보고된 사례 중 일부 20 내지 60%를 차지하는 병원내 확산; (b) 캐나다 토론토의 사례 중 약 50%를 차지하는 의료종사자; 및 (c) 확산은 가정내에서도 흔히 일어났다. 이러한 역학 데이타의 관련성은 심각할 수 있으며, 예를 들면, 병원 폐쇄가 필수적이라 판단되는 경우, 미국의 대부분의 병원들은 재정적 파산에 직면할 수 있고(단지 2주간의 폐쇄는 대부분의 병원을 파산하게 할 수 있다), 의료종사자 집단내의 높은 감염율은 재원을 한계에 달하게 하며 과중한 인건비가 소요될 수 있다. 2003년의 질환 유행 동안, 노동 인원은 가정에 머물렀으며, 공장, 회사, 사무실 및 기타 사업체들이 일시적으로 폐점하였다. 따라서, 장래의 유행병은 광범위한 경제적 파문을 일으킬 수 있다.
SARS 바이러스 전염에 대한 주된 위험은 명백히 비말 노출 및 밀착된 개인간 접촉에 의한 것이고, 따라서, SARS 바이러스 전염을 감소시키기 위한 전략은 기타 호흡기 전염을 제한하기 위해 사용되는, 즉, 직접적 접촉을 감소시키고 비말 노출에 대비한 방어책을 사용하는 전략과 유사하거나 흡사하다. 그러나, 항온처리 기간이 2 내지 10일 동안 지속되고 비-특이적 초기 증상은 인플루엔자와 같은 다른 호흡기 감염의 증상과 유사하기 때문에, SARS 확산에 대한 가장 큰 위험은 아직 확인되지 않은 사례이다.
따라서, 사람에서 발견되는 감염(예: SARS를 야기하는 감염)과 같은 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 대안적 예방 전략 또는 치료법이 요구된다. 예를 들면, 보호성 면역반응을 유도할 수 있는, 코로나바이러스 감염에 대한 백신 조성물을 확인하고 개발할 필요가 있다. 또한, 감염 부위에 직접적으로 또는 근접하여 전달하여 치료 유효성을 최대화할 수 있는 백신 제제가 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며 다른 관련 이익을 제공한다.
발명의 요지
요약하면, 본 발명은 SARS 코로나바이러스 감염과 같은 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 당해 조성물은 예를 들면, 본원에서 기술하는 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및 프로테오좀(Proteosome) 또는 프로톨린(ProtollinTM)과 같은 보조제를 포함하는 것으로 피험체 또는 숙주에서 보호성 면역반응을 유도할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 보조제; (b) 약제학적으로 허용되는 부형제; 및 (c) 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 80% 동일하다. 특정한 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하며, 특정한 구체적 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 다른 양태에서, 부형제는 리포좀이다. 다른 특정 양태에서, 보조제는 백반, 프로인트 보조제, 프로테오좀 또는 프로톨린이다. 하나의 양태에서, 적어도 2개의 S 단백질 면역원이 투여된다. 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단 백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 하나의 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이다. 특정 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스로부터 선택된 적어도 하나 또는 적어도 2개의 코로나바이러스에 의해 유발된다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 상기 사람 코로나바이러스는 SARS-CoV이다. 다른 양태에서, 조성물은 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여되며, 특정 양태에서, 조성물은 비강 투여된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 유도된 면역반응은 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (b) 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하며, 특정한 구체적 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 하나의 양태에서, 적어도 2개의 S 단백질 면역원이 투여된다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 하나의 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이다. 특정 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 하나의 양태에서, 당해 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 S 단백질 면역원에 프레임(frame)내에서 융합되어 융합 단백질을 형성한다.
또 다른 양태에서, (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; 및 (b) 다가 융합 코로나바이러스 면역원 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 프로테오좀 또는 프로톨린 및 다가 융합 코로나바이러스 면역원 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하여, 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제 공된다.
또한, (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (b) 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하여, 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 특정한 구체적 양태에서 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 하나의 양태에서, 적어도 2개의 S 단백질 면역원이 투여된다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 특정 양태에서 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 하나의 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이다. 특정 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 하나의 양태에서, 당해 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 S 단백질 면역원에 프레임내에서 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 조성물이 프로톨린, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (b) 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 S 단백질 면역원은 보호성 면역반응을 유도할 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열 과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 S 단백질 면역원은 보호성 면역반응을 유도할 수 있다(즉, 보호성 면역반응을 유도하거나 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 갖는다). 특정 양태에서, 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적얻 90% 동일하거나 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 S 단백질 면역원은 보호성 면역반응을 유도할 수 있다. 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 S 단백질 면역원은 보호성 면역반응을 유도할 수 있다. 특정 양태에서, 당해 조성물은 (1) 프로테오좀 또는 프로톨린 및 (2) 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함한다. 특정 양태에서, S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 다른 양태에서, 적어도 하나의 S 단백질 면역원은 제2 아미노산에 연결되고, 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 구체적 양태에서, 제2 아미노산 서열은 히스티딘 태그이다. 본 발명은 또한 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서 열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 추가로 포함하는 상기한 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기한 조성물은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 M 단백질 면역원을 추가로 포함한다. 구체적 양태에서, M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 제AAU07933호에 제시된 서열(서열번호 39)을 포함한다.
다른 양태에서, 프로테오좀 또는 프로톨린 및 적어도 하나의 S 단백질 면역원(본원에서 기술한 바와 같음)을 포함하고, 적어도 하나의 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 S 단백질 면역원에 프레임내에서 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 S 단백질 면역원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 코로나바이러스 N 단백질 면역원에 프레임내에서 융합된다.
본 발명은 또한 (a) 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 N 단백질 면역원; 및 (b) 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, N 단백질 면역원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38에 제 시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 특정한 다른 양태에서, N 단백질 면역원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, N 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; 및 (b) 다가 융합 코로나바이러스 면역원 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 다가 융합 코로나바이러스 면역원은 적어도 2개의 S 단백질 면역원 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 다가 융합 코로나바이러스 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원로부터 선택되는 적어도 2개의 S 단백질 면역원을 포함한다. 특정한 다른 양태에서, 다가 융합 코로나바이러스 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 S 단백질 면역원 및 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 포함한다.
구체적 양태에서, 본원에서 기술하는 조성물(상기 기술한 조성물을 포함함) 중 어느 하나는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 본원에서 기술하는 조성물(상기 기술한 조성물을 포함) 중 어느 하나를 제공한다. 또한, 본원에서는 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 본원에서 기술하는 조성물(상기 기술한 조성물을 포함) 중 어느 하나의 용도가 제공된다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 하나 이상에 의해 유발되고, 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발된다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 다른 특정 양태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 본원에서 기술하는 조성물 중 어느 하나를 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법은 (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (c) 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; 및 (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 양태에서, S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 당해 방법은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함한다. 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 또 다른 특정 양태에서, S 단백질 면역원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열 포함하고, 이때 당해 S 단백질 면역원은 보호성 면역반응을 유도할 수 있다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 다른 양태에서, 당해 방법이 적어도 하나의 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 투여함을 포함하는 경우, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원이 소수성 잔기를 추가로 포함하거나, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 소수성 잔기를 추가로 포함하거나, 적어도 하나의 N 단백질 면역원과 적어도 하나의 S 단백질 면역원이 소수성 잔기를 포함하고, 이때, 상기 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 당해 방법의 다른 양태에서, 조성물은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 M 단백질 면역원을 추가로 포함한다. 구체적 양태에서, M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 제AAU07933호(서열번호 39)에 제시된 서열을 포함한다. 특정한 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 구체 적 양태에서, S 단백질 면역원은 제2 아미노산에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 구체적 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 다른 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 다른 특정 양태에서, 당해 방법이 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 경우, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 구체적 양태에서, N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 구체적 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 다른 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 또 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 하나 이상에 의해 유발되고, 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발된다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 다른 특정 양태에서 사람 코로나바이러스는 SARS-CoV이다. 당해 방법의 특정 양태에서, 조성물은 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 비강 투여된다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 프로톨린, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한 다.
또한 본 발명에 의해, 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하며, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 보조제를 추가로 포함하고, 특정 양태에서, 보조제는 백반, 프로인트 보조제, 프로테오좀 또는 프로톨린이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 M 단백질 면역원을 추가로 포함하고, 특정 양태에서, M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 AAU07933에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 당해 방버은 적어도 2개의 S 단백질 면역원을 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에 서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 특정한 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 또는 SARS 그룹 코로나바이러스에 의해 유발된다. 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발된다. 구체적 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 다른 구체적 양태에서, 사람 코로나바이러스는 SARS-CoV이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 비강 투여된다. 특정 양태에서, 면역반응은 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 유도함을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 약제학적으로 허용되는 부형제; (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 및 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (c) 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 포함하고, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 코로나바이러스 N 면역원이 코로나바 이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하여, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 특정한 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 보조제를 추가로 포함하고, 특정 양태에서, 보조제는 백반, 프로인트 보조제, 프로테오좀 또는 프로톨린이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 M 단백질 면역원을 추가로 포함하고, 특정 양 태에서, M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 AAU07933에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 당해 방법은 적어도 2개의 S 단백질 면역원을 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 특정한 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 적어도 2개의 N 단백질 면역원을 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 특정한 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 또는 SARS 그룹 코로나바이러스에 의해 유발된다. 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발된다. 구체적 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 다른 구체적 양태에서, 사람 코로나바이러스는 SARS- CoV이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 비강 투여된다. 특정 양태에서, 면역반응은 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 유도함을 포함하고, 다른 특정 양태에서, 면역반응은 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 유도함을 포함한다.
또 다른 양태에서, 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 특정한 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 소수성 잔기를 추가로 포함하고, 다른 특정 양태에서, 소수성 잔기는 소수성 폴리펩타이드 또는 지질이다. 특정 양태에서, 부형제는 리포좀이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 보조제를 추가로 포함하고, 특정 양태에서, 보조제는 백반, 프로인트 보조제, 프로테오좀 또는 프로톨린이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 M 단백질 면역원을 추가로 포함하고, 특정 양태에서, M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 AAU07933에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태 에서, 당해 방법은 적어도 2개의 N 단백질 면역원을 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 다른 특정 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열은 태그 또는 효소이고, 특정한 구체적 양태에서, 태그는 히스티딘 태그이다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 또는 SARS 그룹 코로나바이러스에 의해 유발된다. 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염은 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발된다. 구체적 양태에서, 코로나바이러스 감염은 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 다른 구체적 양태에서, 사람 코로나바이러스는 SARS-CoV이다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 면역반응은 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 유도함을 포함한다.
본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하는 방법에 의해 생산된 다수의 분리된 항체를 또한 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 (a) 약제학적으로 허용되는 부형제; (b) 서 열번호 4 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 및 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (c) 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 포함하고, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 코로나바이러스 N 면역원이 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하는 방법에 의해 생산된 다수의 분리된 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하는 방법에 의해 생산된 다수의 분리된 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 (b) 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함 하는 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 당해 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 (b) 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 코로나바이러스의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 하기 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하여 보다 명백해질 것이다. 또한, 본 출원에서 언급되고/되거나 출원 데이타 쉬트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 공보, 미국 특허원, 외국 특허, 외국 특허원 및 비-특허 공보는 이들의 전문이 본원에서 참조로 인용된다.
도 1은 전체길이 S 단백질(STM) 및 S 단백질 변이체(STM-del)의 개략도를 도시한 것이다. 당해 도식의 최상단은 S 단백질의 전방, 중간 및 후방 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 빗금친 박스는 트랜스막(TM) 도메인을 나타 낸다.
도 2는 단독의 STM-del 단백질(STM-del 단백질, 비강내) 또는 프로톨린TM 보조제 부가된 STM-del 단백질(STM-del 단백질+ 프로톨린TM, 비강내)의 다양한 양을 투여한 마우스에서의 혈청(IgG) 용량 반응을 도시한 것이다.
도 3A는 프로톨린TM 보조제 부가된 STM-del 단백질 또는 단독의 STM-del 단백질로 비강내 면역화된 마우스, 백반 보조제 부가된 STM-del 단백질로 근육내 면역화된 마우스 및 PBS만이 투여된 마우스에서의 혈청 IgG의 역가를 예시한 것이다. 도 3B는 프로톨린 보조제가 부가된 STM-del 단백질 또는 단독의 STM-del 단백질로 비강내(i.n.) 면역화된 마우스, 백반 보조제가 부가된 STM-del 단백질로 근육내 면역화된 마우스 및 PBS만이 투여된 마우스로부터의 폐 IgA의 역가를 도시한 것이다.
도 4A 내지 4F는 SARS 코로나바이러스 균주 Tor2의 S 단백질의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열 (서열번호 2)을 나타낸 것이다.
도 5A 내지 5B는 SARS 코로나바이러스 균주 어바니(Urbani)의 N 단백질의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27) 및 아미노산 서열(서열번호 28)을 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 농도의 프로톨린과 배합된 10㎍ SARS S-단백질(전체길이) 또는 STM-del 단백질(트랜스막 결실됨(ΔTM 결실됨))을 비강내로 투여한 마우스(마취된 또는 마취되지 않은 마우스)의 혈청 IgG 역가를 예시한 것이다. 추가의 마우스 그 룹에게 AlhydrogelR에 흡착된 10㎍ SARS S-단백질(F.L. 근육내) 또는 10㎍ STM-del 단백질(Del, 근육내)의 근육내 주사제를 투여하였다.
도 7은 도 6의 간단한 설명에서 기술한 바와 같이 면역화된 마우스로부터의폐 세척액(lavage) 및 비강 세척제(wash) 중의 IgA 역가를 나타낸 것이다.
도 8은 전체길이 S-단백질 및 프로톨린(S(FL) + 프로톨린TM); 전체길이 S-단백질 및 AlhydrogelR(S(FL) + 백반); 및 단독의 PBS로 면역화된 마우스의 시험관내 재자극된 비장세포로부터의 사이토킨 방출을 예시한 것이다.
앞서 설명한 바와 같이, 본원에서는 코로나바이러스에 의해 유발된 감염에 대해 보호성인 면역반응을 유도할 수 있는, 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원, 적어도 하나의 N 단백질 면역원, 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 N 단백질 면역원, 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물이 기술된다. 또한, 본원에서는 이들 S 및 N 단백질 면역원을 제조하고 사용하여 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 기술된다. 본 발명의 코로나바이러스 항원(항원)은 중화 항체 반응 및/또는 세포-매개성 면역을 포함하는 면역반응을 유도할 수 있는, 적어도 하나의 코로나바이러스 바이러스-암호화된 폴리펩타이드, 예를 들면, 코로나바이러스 바이러스 S 단백질 면역원 또는 N 단백질 면역원, 또는 이들의 변이체 및 단편을 포함한다. 코로나바이러스 항원(면역원)은 재조합에 의해 또는 합성에 의해 제조된 적어도 하나의 코로나바이러스 폴리펩타이드를 포함할 수 있거나, 코로나바이러스 바이러스 입자로부터 또는 코로나바이러스-감염된 숙주 세포로부터 분리된 적어도 하나의 코로나바이러스 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 코로나바이러스 S 및 N 단백질 면역원, 이들의 단편, 유도체 및 변이체 뿐만 아니라, 대표적 조성물 및 치료학적 용도는 하기에서 보다 상세히 논의된다.
특정 양태에서, 보조제 부가된 코로나바이러스 바이러스 S 또는 N 단백질 면역원, 이의 단편, 유도체 또는 변이체가 제공된다. 예를 들면, 코로나바이러스 바이러스 S 또는 N 단백질 면역원은 프로테오좀 또는 프로톨린TM과 배합되거나 혼합될 수 있다. 프로테오좀(프로쥬번트(Projuvant)로도 언급됨) 배합물 또는 혼합물은 그램-음성 세균으로부터 수득된 외막 단백질로 이루어진다. 대안으로서, 프로테오좀은 외인성 또는 내인성 지질당류과 배합될 수 있다(즉, OMP:LPS, 프로톨린으로도 언급됨). 따라서, 이러한 면역원성 조성물(백신 조성물 또는 제제)는, 프로테오좀 기술에 기초한 보조제가 관심대상의 하나 이상의 면역원(또는 항원)(예를 들면, 코로나바이러스 바이러스 S 또는 N 단백질 면역원, 및 이의 단편, 유도체 또는 변이체, 또는 기타 면역원)과 함께 "부하(loaded)"된 경우에 선척 면역반응, 증진된 혈청학적 및 점막 반응 및 특이적 면역반응을 유도하는 것을 촉진할 수 있다는 점에서 기타 보다 전형적인 보조제 부가된 백신보다 유리하다.
본원에서 사용되는 "프로테오좀 또는 프로쥬번트"는 세균 또는 바이러스 항원과 같은 면역원용 담체 또는 보조제로서 유용한, 나이세리아(Neisseria) 종과 같은 그램 음성 세균으로부터의 외막 단백질(OMP, 포린으로도 공지되어 있음)의 제제[참조: Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; 미국 특허 제5,726,292호; 미국 특허 제4,707,543호]를 언급한다. 프로테오좀은 소수성이며 사람에서 사용하기에 안전하고 크기가 특정 바이러스에 필적한다. 프로테오좀은 약 20nm 내지 약 800nm의 소포 또는 소포-유사 OMP 클러스터로 자가조립(autoassemble)되는 능력 및 단백질 항원(Ag), 특히 소수성 잔기를 갖는 항원에 비공유적으로 혼입, 배위, 결합(정전기적 또는 소수성 결합) 또는 그 밖에 협력하는 능력을 갖고 있다. 하나 이상의 OMP의 다중-분자 구조 또는 용융 구형 OMP 조성물을 포함하는, 소포 또는 소포 유사 형태의 외막 단백질 성분을 생성시키는 임의의 제조방법이 프로테오좀의 정의내에 포함된다. 프로테오좀은 예를 들면, 당해 분야에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,726,292호 또는 제5,985,284호]. 본원에서 제시하는 방법에 따라 제조된 프로테오좀은 OMP 포린을 제조하는데 사용된 세균(예: 나이세리아 종)으로부터 기원한 내인성 지질다당류 또는 지질올리고당류(각각, LPS 또는 LOS)를 또한 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 전체 OMP 제제의 2% 미만일 수 있다.
본원에서 사용되는 "지질당류"는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 또는 플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides)와 같은 그램-음성 세균 또는 기타 그램-음성 세균(알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 시트로박터(Citrobacter), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 에를리카(Ehrlicha), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드네렐라(Gardnerella), 헤모필루스(Hemophillus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 모락셀라(Moraxella), 모르가넬라(Morganella), 나이세리아, 파스퇴렐라(Pasteurella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 기타 플레시오모나스(Plesiomonas), 포르피로모나스(Porphyromonas)(포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis)를 포함), 프레보텔라(Prevotella), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케치아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 기타 쉬겔라, 스필리룸(Spirillum), 베일로넬라(Veillonella), 비브리오(Vibrio) 또는 예르시니아(Yersinia) 종을 포함)으로부터 유래된 천연(분리되었거나 천연 구조를 갖도록 합성에 의해 제조된) 또는 변형된 지질다당류 또는 지질올리고당류(총칭하여 "LPS"로 언급됨)를 지칭한다. LPS는 해독(解毒)된 형태(즉, 지질 A 코어가 제거된)일 수 있거나 해독되지 않은 형태일 수 있다. 예를 들면, 피. 깅기발리스 LPS와 같이 다수의 지질 A 종을 함유한 LPS를 본원에서 기술하는 조성물에서 사용할 수 있다[참조: Darveau et al., Infect. Immun. 72:5041-51 (2004)]. 본 명세서에서, 지질당류는 해독될 필요는 없으며, 바람직하게는 해독되지 않는다. 지질당류는 예를 들면, 미국 특허 공보 제2003/0044425호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
본원에서 사용되는 "프로테오좀:LPS 또는 프로톨린 또는 IVX 또는 IVX-908"은 한 종류 이상의 지질당류와 본원에서 기술한 바와 같이 혼합되어(예를 들면, 외부 부가에 의해) OMP-LPS 조성물(면역자극성 조성물로서 작용할 수 있음)을 제공하는 프로쥬번트의 제제를 지칭한다. 따라서, OMP-LPS 보조제는 (1) 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)와 같은 그램-음성 세균으로부터 제조된 프로테오좀(즉, 프로쥬번트)의 외막 단백질 제제 및 (2) 하나 이상의 지질다당류의 제제를 포함하는, 프로톨린의 기본 성분 중 2가지로 이루어질 수 있다. 지질당류는 내인성(즉, 천연적으로 OMP 프로테오좀 제제 중에 함유되어 있음)일 수 있고, 외부에서 제조된(즉, OMP 제제와 상이한 배양물 또는 미생물로부터 제조된) 지질당류로부터의 OMP 제제와 혼합 또는 배합될 수 있다. 이러한 외부에서 부가된 LPS는 OMP 제제가 제조되어진 동일한 그램-음성 세균으로부터 또는 상이한 그램-음성 세균으로부터 제조될 수 있다. 프로톨린은 또한, 임의로 지질, 당지질, 당단백질, 소분자 등 및 이들의 배합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 프로톨린 미국 특허 공보 제2003/0044425호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
프로쥬번트는 일반적으로 천연 발생, 변형된 또는 보충적 소수성 잔기(또한 "풋(foot)" 또는 "앵커(anchor)"로서도 언급됨)를 지니는 항원과 함께 사용된다. 프로톨린(외부에서 부가된 LPS를 함유함)는 소수성 풋 도메인을 함유하지 않고 천연에서 주로 친수성일 수 있는 항원과 함께 사용될 수 있다. 프로톨린(외부에서 부가된 LPS를 함유함)은 소수성 풋을 함유한 항원, 소수성 풋이 결여된 항원, 또는 소수성 부분 또는 풋을 갖거나 갖지 않는 항원들의 배합물과 혼합되거나 배합될 수 있다.
본원에서 사용되는 면역원성 조성물은 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포) 또는 이들의 배합물일 수 있는 적응(특이적) 면역반응을 초회감작, 강화, 활성화, 유도, 자극, 증대, 부스팅, 증폭 또는 증진시킬 수 있는, 임의의 하나 이상의 화합물 또는 제제 또는 면역원을 지칭한다. 바람직하게는, 적응 면역반응은 보호성으로서, 바이러스의 중화(바이러스 감염성의 감소 또는 제거)를 포함할 수 있다. 면역원의 대표적 예는 미생물 항원(예를 들면, 적어도 하나의 코로나바이러스 항원)이다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는 한 언급된 범위내에 있는 임의의 정수 값 및 경우에 따라 이의 분수(예를 들면, 정수의 1/10 및 1/100 등)를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "필수적으로 이루어진"은 ±15%를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나("a" 또는 "an")와 같은 부정관사는 하나 및 다수의 명사 또는 명사구를 의미(즉, 열거된 요소 또는 성분들 중 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"를 의미)하는 것으로 이해된다. 선택사항(예를 들면, "또는")의 사용은 대안의 어느 하나, 둘다 또는 임의의 배합물을 의미하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 기술하는 서열, 구조 및 치환체로의 각종 조합으로부터 유도된, 개개의 화합물 또는 화합물의 그룹은 각각의 화합물 또는 화합물의 그룹이 개별적으로 제시되는 경우와 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시됨이 이해되어야 한다. 따라서, 특정 서열, 구조 또는 치환체의 선택은 본 발명의 범주내에 있다.
코로나바이러스 면역원
코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 유용한 본원에서 기술하는 조성물은 면역원성 코로나바이러스 폴리펩타이드, 예를 들면, S 단백질, 이의 단편 및 변이체을 포함하고, 또한, 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예: 소수성 아미노산 서열 또는 히스티딘 태그 또는 비-S 단백질 코로나바이러스 폴리펩타이드 또는 이의 단편) 또는 다른 변형(예: 글리코실화)에 대한 코로나바이러스 면역원의 융합을 포함한다. 특정 양태에서, 면역원성 S 폴리펩타이드는 코로나바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는(예를 들면, 중화 항체의 생산을 유도하고/하거나 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있는) 에피토프를 갖는 S 단백질의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 본원에서 기술한 바와 같은 면역원성 폴리펩타이드는 선형 형태로 배열되거나, 배합되거나, 융합될 수 있고, 각각의 면역원은 반복될 수 있거나 반복될 수 없고, 이때 반복은 1회 또는 수회 일어날 수 있고 면역원성 S 또는 기타 코로나바이러스 폴리펩타이드 면역원의 선형 서열에 대해 N-말단, C-말단 또는 내부에 위치할 수 있다. 또한, 다수의 상이한 코로나바이러스 면역원성 폴리펩타이드(예를 들면, 다른 S 단백질, N 단백질, M 단백질 또는 다른 코로나바이러스 폴리펩타이드, 및 이들의 변이체 또는 단편)를 선별하고 칵테일 조성물로 혼합 또는 배합하여, 유해한 또는 그밖의 원치않는 부수적 면역반응 또는 부작용 없이 보호성 면역반응을 유도하는데 사용하기 위한 다가 백신을 제공할 수 있다. 본원에서는 또한 융합 단백직을 포함하는 합성 또는 재조합 다가 코로나바이러스 폴리펩타이드 면역원의 제조방법이 제공된다. 예를 들면, S 단백질 면역원-암호화 핵산 발현 작제물을 함유하는 숙주 세포를 배양하여 재조합 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체(예를 들면, 결실 돌연변이체 또는 C-말단 트랜스막 도메인이 결여된 S 폴리펩타이드 단편)를 제조할 수 있다. 또한, S 단백질 면역원 또는 이의 변이체, 또는 폴리펩타이드의 배합물(융합 단백질을 포함)을 사용하여, 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하거나 면역반응을 유도하는 방법이 의도된다.
배경으로서 이론으로 국한됨이 없이, 코로나바이러스는 18개 이상의 바이러스성 단백질(예를 들면, 비-구조적 단백질(NSP) 1-13, 구조적 단백질 E, M, N, S, 및 RNA-의존적 RNA 폴리머라제)을 암호화하는 포지티브-센스, 비분절 일본쇄 RNA 게놈을 갖고 있다. 코로나바이러스는 3개의 주요 표면 당단백질(S, E 및 M으로 지정됨)을 갖고 있으며, 일부 코로나바이러스는 SARS 바이러스에서 발견되지 않는 헤마글루티닌 에스테라제(HE)로 지칭되는 또 다른 표면 당단백질을 갖고 있다. 또한, N(뉴클레오캡시드) 단백질은 일반적으로 게놈과 관련된 염기성 인단백질로서 항원성으로 보고된 바 있다[참조: Holmes and Lai, Fields Virology, Chapter 34, 1996)]이다. 코로나바이러스의 주요 항원인 S(스파이크(spike)) 단백질은 2개의 도메인, 즉 수용체 결합에 관여하는 것으로 사료되는 S1 및 바이러스와 표적 세포 간의 막 융합을 매개하는 S2를 갖고 있다[참조: Holmes and Lai, 1996, supra].
S(스파이크) 단백질은 수용체 결합과 바이러스 감염성을 매개할 수 있는 비공유 결합된 동종삼량체(올리고머)를 형성할 수 있다. S 단백질의 동종삼량체는 수용체 결합 도메인의 정확한 천연 입체형태를 제시하고 중화 항체 반응을 유도하기 위해 필수적인 것으로 사료된다. 또한, S 단백질의 세포내 프로세싱은 중요한 전사후 올리고당류와 관련된다. N-글리칸 모티프 분석으로 예상되는 전사후 올리고당류 변형(글리코실화)은 S 단백질이 이러한 변형을 위해 23개 정도의 많은 부위를 갖고 있음을 나타낸다. 또한, C-말단 시스테인 잔기도 단백질 폴딩(folding) 및 천연(기능적) S 단백질 입체형태의 보존에 참여할 수 있다. 일부 코로나바이러스(예: 그룹 II 및 III 바이러스의 일부 균주)의 S 단백질은 당해 S 단백질의 중심 근처에서 골지체내 트립신-유사 프로테아에 의해 또는 세포 외부에 위치한 효소에 의해 N-말단 S1 및 C-말단 S2 폴리펩타이드를 함유한 연결된 폴리펩타이드로 단백분해성 프로세싱될 수 있다. 코로나바이러스의 II형 그룹 및 그룹 I 바이러스의 일부 구성원들도 또한 프로세싱될 수 있다. 코로나바이러스로서 SARS-관련 바이러스 병원체의 특성화와 달리, 코로나바이러스는 혈청학적 및 유전적 특성에 기초하여 세 그룹으로 분류되며, 이들 그룹은 당해 분야 및 본원에서 그룹 I, 그룹 II 및 그룹 III으로도 지칭되는 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3로 지칭된다[참조: Holmes et al., Fields Virology, supra; Stadler et al., Nat. Rev. Microbiol. 209-18 (2003); Holmes, J Clin. Invest. 111 :1605-609 (2003)]. 현재, 코로나바이러스는 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 SARS-CoV(SARS-관련 코로나바이러스)로 세분된다[참조: Stadler et al., supra; Holmes, J Clin. Invest., supra].
예시적 SARS-CoV S 단백질은 12개 아미노산 시그날 서열, 아미노산 12번 내지 672번의 S1 도메인(서열번호 20 참조) 및 아미노산 673번 내지 1192번의 S2 도메인(서열번호 22 참조)의 1,255개의 아미노산(예를 들면, 서열번호 2 및 도 4 참조)을 갖는다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 에피토프(즉, 면역원인)를 갖고 중화(예: IgA 또는 IgG 항체) 또는 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있는 코로나바이러스 S 또는 N 폴리펩타이드 및 이의 변이체가, 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물에 포함된다. 또한, 본원에서는 글리코실화되지 않고 중화 면역반응을 유도할 수 있는 S 단백질 면역원(하나 이상의 면역원성 에피토프를 함유함)을 확인하는 방법이 제공된다. 하나의 양태에서, S 단백질 면역원은 전체길이 S 단백질의 부분 또는 단편이다. 예를 들면, 서열번호 2의 417번 내지 560번 위치의 아미노산을 포함하는 S 단백질 면역원의 부분은 N-글리칸 치환 부위를 함유하지 않고 소수성 영역이다. 이러한 영역은 또한 세포 수용체 결합에 관여하는 것으로 사료되는 S1 도메인의 영역에 상응한다. 따라서, 서열번호 2의 417번 내지 560번 위치의 아미노산 서열을 포함하는 단편 또는 이의 부분(예를 들면, 서열번호 12 및 서열번호 14)은 면역원성일 수 있고 이러한 서열내의 적어도 하나의 에피토프에 대해 특이적인 면역반응은 표적 세포내로의 코로나바이러스의 진입을 방지할 수 있다. 또한, 글리코실화 부위를 함유하지 않는 이러한 S 단백질의 면역원성 단편은, 당해 단편이 포유동물 세포에서와 동일한 방식으로 단백질을 글리코실화시킬 수 없는 세균과 같은 세포에서 만들어지고 생산될 수 있다는 이점을 제공한다. 고양이 전염성복막염바이러스(feline infectious peritonitis virus; FIPV)로부터의 백시니아 바이러스 발현된 S-단백질은 바이러스 감염의 항체-유도성 증진(ADE)과 연루되었다[참조; Vennema et al., Adv. Exp. Med. Biol. 276:217 (1990); Klepfer et al., Adv. Exp. Med. Biol. 380:235 (1995)]. 따라서, 당해 분야의 이러한 기술내용의 견지에서, 본원에서 기술하는 바와 같이 숙주에서 면역반응을 유도하고 이에 따라 백신으로서의 이점을 제공하는 S 단백질 면역원의 능력은 예측될 수 없다.
본원에서 기술하는 바와 같이, S 단백질 면역원은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도하는, 각각 전체길이 S 단백질 또는 야생형 S 단백질 내에 함유된 적어도 하나의 에피토프를 보유하거나 갖는 S 단백질의 단편 또는 S 단백질 변이체(본원에서 기술한 바와 같은 전체길이 S 단백질의 변이체 또는 S 단편일 수 있음)를 포함한다. S 단백질 단편 또는 S 단백질 변이체는 전체길이 또는 야생형(천연) S 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성 또는 기능(예를 들면, 수용체 결합 또는 세포 융합 활성)을 갖거나, S 단백질-특이적 생물학적 활성 또는 기능을 갖는다. 예를 들면, S 단백질 변이체는 면역반응을 유도하는(예를 들면, 야생형 또는 전체길이 S 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는) 에피토프를 함유할 수 있거나 S 단백질 수용체 결합 활성을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, S-단백질 단편은 서열번호 2의 1번 내지 1200번 위치에 제시된 아미노산 서열(서열번호 4)을 포함하는 절두된(truncated) S-단백질이다. 결실된 S-단백질의 부분은 트랜스막 영역이고, 나머지 단편은 본원에서 STM-del 또는 ΔTM S-단백질로 언급된다. 특정한 다른 양태에서, 예시적 S 단백질 단편은 서열번호 2의 12번 내지 254번 위치(서열번호 6); 또는 서열번호 2의 255번 내지 834번 위치(서열번호 8); 또는 서열번호 2의 835번 내지 1255번 위치(서열번호 10); 또는 서열번호 2의 12번 내지 672번 위치(서열번호 20; S1 도메인); 또는 서열번호 2의 673번 내지 1195번 위치(서열번호 22; S2 도메인)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 다른 양태에서, S 폴리펩타이드 단편은 서열번호 2의 300번 내지 550번 위치(서열번호 12); 또는 서열번호 2의 380번 내지 580번 위치(서열번호 14); 또는 서열번호 2의 380번 내지 480번 위치(서열번호 16); 또는 서열번호 2의 481번 내지 580번 위치(서열번호 18); 또는 서열번호 2의 673번 내지 960번 위치(서열번호 24); 또는 서열번호 2의 961번 내지 1200번 위치(서열번호 26)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. S 단백질 면역원성 단편은 또한 S 단백질의 상기한 아미노산 단편의 보다 작은 부분 또는 단편을 포함한다. 면역반응을 자극하거나, 유발하거나, 유도하는 에피토프를 포함하는 S 단백질 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 중 어느 하나의 8개 아미노산 내지 150개 아미노산 사이의 임의의 수 범위의 연속적 아미노산(예를 들면, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50개 등의 아미노산)을 포함한다.
관련 양태에서, 코로나바이러스 S 폴리펩타이드 변이체는 서열번호 2에 제시한 전체길이 S 단백질의 아미노산 서열(SARS-CoV Tor2 균주 유래; 서열번호 1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열이다)과 적어도 50% 내지 100% 아미노산 동일성(즉, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성)을 갖거나, 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26에 제시한 S 단백질 단편과 50% 내지 100%의 아미노산 동일성(즉, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성)을 갖는다. 이러한 S 폴리펩타이드 변이체 및 단편은 하나 이상의 S 단백질-특이적 생물학적 활성 또는 기능, 예를 들면, (1) SARS-CoV와 같은 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응, 예를 들면, 중화 반응 및/또는 항체 매개성 면역반응을 유도하는 능력(즉, S 폴리펩타이드 변이체는 보호성 면역반응을 유발하거나 유도하는 에피토프를 함유한다); (2) 수용체 결합을 통해 바이러스 감염을 매개하는 능력; 및 (3) 비리온과 숙주 세포 사이의 막 융합을 매개하는 능력을 보유한다.
전체길이 SARS 코로나바이러스 S(스파이크) 폴리펩타이드 서열의 추가 예가 본원에서 제공되며 당해 분야에서 이용가능하다. 예를 들면, SARS 코로나바이러스 프랑크푸르트 1 균주의 전체길이 S 단백질은 서열번호 45에 제공되며, 이는 서열번호 44에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. SARS 코로나바이러스 TW5 균주의 전체길이 S 단백질은 서열번호 47에 제공되며, 이는 서열번호 46에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. SARS 코로나바이러스 GDO3TOO13 균주의 전체길이 S 단백질은 서열번호 49에 제공되며, 이는 서열번호 48에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. SARS 코로나바이러스 BJOl 균주의 전체길이 S 단백질은 서열번호 51에 제공되며, 이는 서열번호 50에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 양태에서, 이들 전체길이 S 폴리펩타이드 중 어느 하나의 단편(예를 들면, 트랜스막 도메인이 결실된 절두된 S 단백질) 및 변이체를 코로나바이러스, 특히 SARS 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다.
다른 양태에서, N 단백질의 단편, 또는 전체길이 N 단백질의 단편의 변이체 또는 전체길이 N 단백질의 변이체는 (1) 예를 들면, SARS-CoV와 같은 코로나바이러스에 대한 체액성 반응(즉, 야생형 또는 전체길이 N 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는) 및/또는 세포 매개성 면역반응일 수 있는 면역반응을 유도하는 능력(즉, N 폴리펩타이드 변이체는 면역반응을 유발하거나 유도하는 에피토프를 함유한다); (2) RNA와 같은 핵산에 결합하는 능력; 및 (3) 코로나바이러스의 발병을 촉진하는 능력[참조: Chen et al. Clin. Chem. 50:988-95 (2004) (핵 국소화 시그날과 관련된 모티프를 함유하는 N 단백질 내에 위치하는 아노산 서열을 기술함)]과 같은 적어도 하나의 N 단백질 관련 생물학적 활성 또는 기능을 보유하거나 갖는 면역원을 포함한다.
또한, 본원에서는 하나 이상의 N 단백질 관련 생물학적 활성(예를 들면, 핵산 결합 활성 또는 N 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 능력)을 갖는 기타 N 단백질 및 이의 변이체가 기술된다. 특정 양태에서, 예시적 N 단백질 면역원 단편 및 이의 변이체는 서열번호 28의 1-211번 위치(서열번호 30); 또는 서열번호 28의 212-422번 위치(서열번호 32); 또는 서열번호 28의 100-300번 위치(서열번호 34)의 아미노산을 갖는 단편을 포함한다. 다른 양태에서, N 폴리펩타이드 단편은 서열번호 28의 50-250번 위치(서열번호 36); 또는 서열번호 28의 150-400번 위치(서열번호 38)의 아미노산을 포함한다. N 단백질 면역원성 단편은 또한 N 단백질의 상기한 아미노산 단편의 보다 작은 부분 또는 단편을 포함한다. 면역반응을 자극하거나 유도하는 에피토프를 포함하는 N 단백질 단편은 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 및 38 중 어느 하나의 8개 아미노산 내지 150개 아미노산 사이의 임의의 수 범위의 연속적 아미노산(예를 들면, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50개 등의 아미노산)을 포함한다.
N 폴리펩타이드의 변이체 또는 전체길이 N 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 및 38 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는다. 본원에서 기술하는 바와 같이, N 폴리펩타이드 변이체는 적어도 하나의 N 단백질-특이적 활성, 예를 들면, SARS-CoV와 같은 코로나바이러스에 대한 보호성 체액성 또는 세포 매개성 면역반응을 유도하는 능력 또는 하나 이상의 기타 N 단백질 관련 생물학적 활성, 예를 들면, 핵산 결합 활성을 보유한다. 관련 양태에서, 코로나바이러스 N 폴리펩타이드는 서열번호 28에 제시한 전체길이 N 단백질의 아미노산 서열(SARS-CoV 어바니 균주 유래, 도 5 참조: 서열번호 28의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제시하는 서열번호 27 참조)과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는다.
전체길이 SARS 코로나바이러스 N(뉴클레오캡시드) 폴리펩타이드 서열의 추가 예는 본원에서 제공되며 당해 분야에서 이용가능하다. 예를 들면, SARS 코로나바이러스 HB 균주의 전체길이 N 단백질은 서열번호 55에 제공되며, 이는 서열번호 54 에 제시한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
2가지 이상의 코로나바이러스 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 및 이의 변이체의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BLAST, tBLAST, pBLAST, 또는 MegAlign와 같은 임의의 표준 소프트웨어를 사용하여 비교할 수 있다. 다른 것들에는 DNASTARR(Madison, Wisconsin)에 의해 생산되는 Lasergene 생물정보학 컴퓨터화 세트에 제공된 소프트웨어 프로그램이 포함된다. ALIGN 또는 BLAST와 같은 알고리듬에 관한 설명은 예를 들면, 문헌[참조: Altschul, J. MoL Biol. 219:555-565, 1991; 또는 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:10915-10919, 1992]에서 찾아볼 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트에서 이용할 수 있다. 최적의 정렬을 결정하여 다수의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다[참조: Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); and Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd edition, Academic Press, Inc., 1998].
본원에서 사용되는 바와 같이, "동일성 퍼센트" 또는 "동일성%"은 컴퓨터 실행 알고리듬을 전형적으로 데폴트 파라메터로 사용하여 대상 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이들의 변이체 서열 전체를 시험 서열과 비교함으로써 얻어진 백분율 값이다. 본원에서 기술하는 변이체 폴리펩타이드 및 면역원은 점 돌연변이, 프레임이동(frameshift) 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 부가, 결실 등과 같은 각종 돌연변이 중 하나 이상을 포함하도록 제조할 수 있거나, 변이체는 글리코실화, 알킬화 등을 포함하는 특정한 화학적 치환에 의한 변형과 같은 변형의 결과일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 두 펩타이드 또는 폴리펩타이드 간의 유사성은 일반적으로 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환과 비교하여 측정한다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 본원에서 기술하는 S 또는 N 단백질 면역원, 이의 단편 및 변이체는 체액성 반응 및/또는 세포 매개성 면역반응일 수 있는 면역반응, 바람직하게는 보호성 면역반응을 유도하거나 유발하는 에피토프를 함유한다. 보호성 면역반응은 다음 중 하나 이상에 의해 나타날 수 있다: 코로나바이러스에 의한 숙주 감염을 예방함; 감염을 변경하거나 제한함; 감염으로부터 숙주의 회복을 보조하거나, 개선시키거나, 증진시키거나, 자극함; 및 후속적 코로나바이러스 감염을 예방하거나 제한할 수 있는 면역학적 기억을 생성시킴. 체액성 반응은 감염성을 중화시키고, 바이러스 및/또는 감염된 세포를 용해시키고, 숙주 세포에 의한 바이러스의 제거를 촉진(예를 들면, 포식작용(phagocytosis)를 촉진)시키고/시키거나 바이러스의 항원성 물질의 제거를 촉진하는 항체의 생산을 포함할 수 있다. 체액성 반응은 또한 특이적 점막 IgA 반응을 유도하거나 유발함을 포함하는 점막 반응을 포함할 수 있다.
본원에서 기술하는 코로나바이러스 폴리펩타이드, 단편 또는 변이체에 의한 피험체 또는 숙주(사람 또는 사람이 아닌 동물)에서의 면역반응의 유도는, 본원에서 기술하고 당해 분야에서 통상적으로 실시되는 방법으로 결정되고 특성화될 수 있다. 이들 방법에는 동물 면역화 연구(예를 들면, 토끼, 마우스, 담비, 사향 고양이, 아프리카 녹색 원숭이 또는 붉은털원숭이를 이용함)과 같은 생체내 검정, 및 웨스턴 면역블롯 분석, ELISA, 면역침전법, 방사선면역검정 등을 포함하는, 항체의 검출 및 분석을 위한 면역화학방법과 같은 다수의 시험관내 검정 중 어느 하나 및 이들의 조합이 포함된다. 예시로서, 동물 모델은 특정 모델에 적절한 종결점에 의해 측정될 수 있는, 동물에서 보호성인 면역반응을 유도하고 유발하는 코로나바이러스 항원의 능력을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 붉은털원숭이에서 SARS를 연구하기 위한 동물 모델의 예는 문헌[참조: Kuiken et al., Lancet 362:263-70 (2003)]에 기재되어 있다. 고양이 및 담비 동물 모델 또한 SARS를 연구하는데 유용할 수 있다[참조: Martina et al., Nature 425:915 (2003)].
면역반응을 분석하고 특성화하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 기술에는 S 또는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체가 면역반응, 특히 중화 면역반응을 유도할 수 있는지를 평가하기 위한 중화 검정(예를 들면, 플라크 감소 검정 또는 세포병변 효과(CPE)를 측정하는 검정 또는 당해 분야에 숙련가에 의해 실시되는 임의의 다른 중화 검정)가 포함된다[참조: Schmidt et al., Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 6n ed., American Public Health Association (Washington 1989); Marra et al., Science 300:1399-404 (2003); Guo et al., Virology 324:251-56 (2004)]. 간략하게 언급하면, 동물을 피하, 복강내, 비강내, 정맥내 또는 본원에서 기술되고 당해 분야의 숙련가에 의해 실시되는 다른 적절한 투여법에 의해 S 또는 N 단백질 면역원, 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원 또는 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 조성물, 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원과 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 칵테일 조성물로 면역화시킨다. 혈청을 면역화된 동물로부터 수거하고 혈청 중에 존재하는 항체가 세포 배양물 단층의 코로나바이러스 감염을 억제하는 능력에 대해 시험한다(예를 들면, 감염은, 코로나바이러스로부터 유도된 단층내 플라크(즉, "구멍")의 수에 의해(플라크 감소 검정) 또는 CPE 검정에서 세포병변 효과를 현미경으로 측정함으로써 측정할 수 있다). 또한, 유도된 또는 유발된(즉, 면역화 전의 면역반응과 비교하여 변화되거나 변경된) 면역반응은 본원에서 기술하는 당업자에게 공지된 방법에 따라서 본원에서 기술하는 하나 이상의 S 또는 N 단백질 면역원으로 면역화된 후에 코로나바이러스로 시험감염(challenge)된 동물에서의 사이토킨 발현 패턴을 측정하여 확인하고 특성화할 수 있다. 예를 들면, 특이적 사이토킨 수준은, 리보뉴클레아제 보호 검정(RPA)을 사용하여, S 또는 N 단백질 면역원으로 면역화하고 후속적으로 코로나바이러스로 시험감염시킨 후에 1형 또는 2형 반응이 우세한지를 측정함으로써 측정할 수 있다. 또 다른 예시적 검정에는 OptEIA 키트(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 하나 이상의 사이토킨의 수준을 측정하는 ELISA가 있다.
생물학적 활성을 보유하는 코로나바이러스 폴리펩타이드 및 이의 변이체(예: S 단백질 변이체 또는 N 단백질 변이체)를 검출 및 특성화하는데 유용한 시험관내 검정에는 예를 들면, 코로나바이러스 폴리펩타이드 및 변이체의 존재를 확인하고/하거나 코로나바이러스 폴리펩타이드 및 변이체의 기능(생물학적 활성)을 측정하는데 사용될 수 있는 경쟁적 ELISA 기술 또는 경쟁적 수용체 결합 기술이 포함된다. 코로나바이러스 항원(예를 들면, 생리학적 부형제 및/또는 프로테오좀-기반 조성물 중에 배합(혼합, 혼화 또는 제형화)될 수 있는 적어도 하나의 S 단백질 면역원, 하나의 N 단백질 면역원, 또는 각각의 S 및 N 단백질 면역원 중 적어도 하나)은 천연의 코로나바이러스 폴리펩타이드에 존재하는 에피토프의 제시에 의존적인 중화 항체 반응을 야기(중화 항체 반응의 생성을 유발하거나 유도함)할 수 있다. 입체적(conformational) 또는 서열적(sequential) 에피토프의 존재는 예를 들면, 모노클로날 항체의 사용을 포함할 수 있는 단백질 결합 검정 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 공지된 항체의 사용 또는 리간드(예: 코로나바이러스 단백질, S 또는 N 단백질 또는 이의 단편) 또는 수용체의 사용을 포함할 수 있는 경쟁적 결합 검정 포맷으로 결정할 수 있다.
본원에서 천연 폴리펩타이드(또는 단백질)는 조립된 바이러스에서 또는 바이러스의 조립 동안에 발견되는 천연의 입체형태의 코로나바이러스 단백질을 지칭하며, 즉 단백질은 적응된 천연 국소 구조(topographical structure)를 갖고 있다. 또한, 천연의 입체형태는 재조합적으로 발현된 코로나바이러스 폴리펩타이드에 의해 채택될 수 있다. 체액성 반응, 즉 항체 반응을 유도하는 에피토프(본원 및 당해 분야에서 항원 결정인자로도 언급됨)는 입체적 에피토프일 수 있고, 따라서 천연의 코로나바이러스 단백질에서 발견되는 바와 같다. 대안으로, 에피토프 또는 항원 결정인자는 서열적 에피토프일 수 있고, 즉 에피토프는 본원에서 기술하는 코로나바이러스 단백질 서열 중 하나 이상의 연속적 아미노산을 포함한다. 체액성 면역반응은 입체형태적 또는 서열적 에피토프에 의해 또는 에피토프들의 배합물에 의해 유도될 수 있다. T 세포 인식을 포함하는 세포 매개성은 1차 및 2차 구조만을 보유한(즉, 서열적 에피토프) 프로세싱된 코로나바이러스 단백질 단편(또는 단편)의 제시에 의존적일 수 있다.
이들 및 당해 분야에 공지된 다른 검정 및 방법은 코로나바이러스에 대한 보호성 체액성 또는 세포 매개성 면역반응을 유도하는 적어도 하나의 에피토프를 갖는 S 또는 N 단백질 면역원 및 이의 변이체를 확인하고 특성화하는데 사용될 수 있다. 다양한 검정에서 수득된 결과의 통계학적 유의성은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 실시되는 방법에 따라서 계산되고 이해될 수 있다.
코로나바이러스 S 또는 N 단백질 면역원(전체길이 단백질, 이의 변이체, 단편 및 융합 단백질) 뿐만 아니라, 이러한 면역원을 암호화하는 상응하는 핵산은 분리된 형태로 제공되고, 특정 양태에서, 균질해질 때까지 정제된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된"이란 용어는 핵산 또는 폴리펩타이드가 이의 본래 또는 천연 환경으로부터 제거되었음을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물 또는 세포내에 존재하는 천연 발생 핵산 분자 또는 당해 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 분리된 것이 아니며, 이 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 천연계에 있는 동일한 또는 모든 공존하는 물질로부터 분리되어진 경우에 분리된 것이다. 핵산 분자는, 예를 들면 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 핵산 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 천연 환경의 일부가 아니라면 여전히 분리된 것일 수 있다.
코로나바이러스 S 또는 N 단백질 면역원(및 상응하는 면역원성 에피토프) 및 이의 단편 및 변이체는 합성에 의해 또는 재조합에 의해 제조될 수 있다. 코로나바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 에피토프를 함유하는 코로나바이러스 단백질 단편은 자동화 공정에 의한 합성을 포함하는 표준 화학 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 면역원성 펩타이드는 커플링제로서 HATU를 이용한 표준 고체상 Fmoc 보호 전략에 기초하여 합성된다. 면역원성 펩타이드를, 측쇄 작용 그룹을 또한 탈보호시키는 적절한 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 사용하여 고체상 수지로부터 절단한다. 조 면역원성 펩타이드를 분취용 역상 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 기타 정제 방법, 분배 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 전기영동 또는 이온-교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다. tBoc 보호 전략, 상이한 커플링 시약의 사용 등과 같은 당해 분야에 공지된 다른 합성 기술을 사용하여 유사한 면역원성 펩타이드를 제조할 수 있다. 또한, D-아미노산 또는 L-아미노산 및 이들의 배합물을 포함하는 임의의 천연 발생 아미노산 또는 이의 유도체를 사용할 수 있다. 특정 양태에서, 합성 S 단백질 면역원은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양태에서, 본 발명의 합성 N 단백질 면역원은 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 가질 것이다.
본원에서 기술하는 바와 같이, S 또는 N 단백질 면역원은 재조합체일 수 있으며, 이때 목적하는 S 또는 N 단백질 면역원은 핵산 발현 작제물 내의 발현 조절 서열(예: 프로모터)에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드로부터 개별적으로 또는 함께 발현된다. 특정 양태에서, 재조합 S 단백질 항원은 서열번호 2와 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 것이다. 또 다른 양태에서, 재조합 S 단백질 면역원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 다른 양태에서, 재조합 S 단백질 면역원 및 이의 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 상기한 아미노산 서열들 각각에 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 서열을 포함할 수 있는 서열번호 2의 단편일 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 재조합 N 단백질 면역원 및 이의 변이체는 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 변이체이거나, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38의 아미노산 서열 또는 상기한 아미노산 서열들 각각에 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 서열을 포함할 수 있는 서열번호 28의 단편을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드, 핵산, 또는 핵산 분자는 임의의 일본쇄 또는 이본쇄 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 중 어느 하나를 언급한다. 폴리뉴클레오타이드는 생물학적 공급원으로부터 분리될 수 있고/있거나 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭 및 생성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 단편은 임의의 연결, 절단, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성에 의해 PCR 생성물 또는 분리된 폴리뉴클레오타이드로부터 수득될 수 있다. 핵산은 천연 발생 뉴클레오타이드(예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드), 천연 발생 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들면, 천연 발생 뉴클레오타이드의 α-에난티오머 형태) 또는 둘다의 배합물인 단량체로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 당 잔기 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 잔기 내의 변형을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들면, 하나 이상의 하이드록실 그룹의 할로겐, 알킬 그룹, 아민 및 아지도 그룹으로의 치환을 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 또한, 전체 당 잔기가 아자-당 및 카복실 당 유사체와 같이 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조로 치환될 수 있다. 염기 잔기의 변형의 예에는 알킬화 푸린 및 피리미딘, 아실화 푸린 또는 피리미딘, 또는 다른 익히 공지된 헤테로사이클릭 치환체가 포함된다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결물의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로세놀레이트, 포스포로디세놀레이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등이 포함된다. "핵산"이란 용어는 폴리아미드 골격에 결합된 천연 발생 또는 변형된 핵산을 포함하는 "펩타이드 핵산"을 또한 포함한다.
추가로, 분리된 핵산 분자는 분리된 단편의 형태의 핵산 분자 또는 이의 공급원 세포(해당되는 경우 정상적으로 내부에 존재하는 염색체를 포함) 또는 실질적으로 순수한 형태의 바이러스로부터 분리된 거대 핵산 작제물의 성분으로서의 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드 또는 핵산)를 언급한다. 예를 들면, 코로나바이러스 입자 또는 코로나바이러스로 감염되거나 이를 보유하는 숙주 세포로부터 분리된, 코로나바이러스 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 다른 예에는 화학적으로 합성된 핵산 분자가 있다. 핵산 분자는 DNA, cDNA, RNA, 뉴클레오타이드 유사체 또는 이들의 일부 배합물을 포함하는 광범위한 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
하나의 양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 2와 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원을 암호화하는 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 코로나바이러스에 대한 체액성 반응(예를 들면, 점막 IgA 및/또는 전신의 IgG 또는 IgM 또는 IgA의 유도 및 생산) 및/또는 세포 매개성 면역반응을 포함하는 보호성 면역반응을 유도하는 항원성 에피토프를 갖는다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 S 단백질 면역원을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 , 서열번호 24 및 서열번호 26로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는, 서열번호 2의 S 단백질 면역원 단편을 암호화한다. 다른 양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 28 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 N 단백질 면역원을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는 서열번호 28의 N 단백질 면역원 단편을 암호화한다.
또한 본원에서는 코로나바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 벡터 및 작제물, 특히 본원에서 제시하는 코로나바이러스 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체 및 조절성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 발현 작제물(재조합 발현 작제물로도 지칭됨)이 제공된다. 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하거나 코로나바이러스 감염에 대한 면역반응을 유도하는 방법에서 사용될 수 있는 숙주 세포를 이러한 벡터 또는 작제물을 포함하도록 유전자 조작할 수 있다. 코로나바이러스 폴리펩타이드 및 이의 단편 또는 변이체는 포유동물 세포, 효모, 세균 또는 기타 세포(예: 곤충 세포) 내에서 프로모터 서열을 포함하는 적절한 발혀 제어 서열의 제어하에 발현될 수 있다. 세포 비함유 해독 시스템을 또한 사용하여 RNA를 포함하는 핵산 및 발현 작제물을 사용하여 이러한 코로나바이러스 단백질을 생산할 수 있다. 원핵세포 및 진핵세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 사용되며, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989) and Third Edition (2001)]에 기재되어 있으며, 본원에서 기술하는 바와 같은 플라스미드, 코스미스, 셔틀 벡터, 바이러스 벡터 및 염색체성 복제 기원을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 핵산 발현 작제물은 서열번호 2와 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터와 같은 발현 제어 서열을 포함하고, 이때 상기 S 단백질 면역원은 SARS 코로나바이러스 감염과 같은 코로나바이러스 감염에 대한 체액성 반응(예를 들면, 중화 항체를 포함함) 및/또는 세포 매개성 면역반응을 유도하는 적어도 하나의 에피토프를 갖는다. 특정 양태에서, 핵산 발현 작제물은 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 핵산 발현 작제물은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 , 서열번호 24 및 서열번호 26로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 2의 단편인 적어도 하나의 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터 서열과 같은 발현 제어 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 핵산 발현 작제물은 적어도 하나의 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체, 또는 N 단백질 면역원의 단편 또는 이의 변이체이고 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터와 같은 발현 제어 서열을 포함한다. 관련 양태에서, 핵산 발현 작제물은 코로나바이러스 감염, 예를 들면, SARS 코로나바이러스 감염에 대한 체액성 반응(예를 들면, 중화 항체를 포함함) 및/또는 세포 매개성 면역반응을 유도하는 에피토프를 갖는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터와 같은 발현 제어 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 코로나바이러스 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 본원에서 제시하는 서열과 상이할 수 있다. 코로나바이러스 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상동체 또는 균주 변이체 또는 기타 변이체를 암호화하는 서열을 포함한다. 변이체는 천연 다형태로부터 발생할 수 있거나 재조합 방법(예를 들면, 특정 숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화를 수득하기 위해 또는 아미노산 돌연변이를 도입하기 위해) 또는 화학석 합성에 의해 합성될 수 있으며, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 등에 의해 야생형 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 코로나바이러스 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 변이체는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 보존적 치환의 예에는 하나의 지방족 아미노산의 다른 아미노산, 예를 들면, Ile, Val, Leu, 또는 Ala으로의 치환 또는 하나의 극성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 예를 들면, Lys와 Arg, Glu와 Asp 또는 Gln와 Asn 간의 치환이 포함된다. 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 또한 아미노산 잔기가 염기성 측쇄(예; 라이신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산); 비하전된 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닐, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지된 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예: 티로신, 페닐알라닐, 트립토판)를 갖는 아미노산을 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환되는 것이다. 분류되기가 보다 어려운 것으로 고려되는 프롤린은 지방족 측쇄(예: Leu, Val, Ile 및 Ala)를 갖는 아미노산과 특성을 공유한다. 특정 양태에서, 글루타민의 글루탐산으로 치환 또는 아스파라긴의 아스파르트산으로 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 고려될 수 있다.
본원에서 기술하는 코로나바이러스 면역원 서열 내의 아미노산의 보존적 및 유사한 치환은 본원에서 기술하고 당해 분야에서 실시되며 유사한 물리적 특성 및 기능적 또는 생물학적 활성, 예를 들면, 체액성 반응을 포함할 수 있는 면역반응을 유발하거나 유도하는 능력을 보유하는(즉, 야생형(또는 비변이체) 면역원에 결합하고 이에 특이적으로 결합하는 항체와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나 야생형 또는 비변이체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체에 결합하는 항체를 유도하는) 변이체를 제공하는 방법에 따라서 용이하게 제조할 수 있다. S 단백질 면역원 또는 이의 변이체 바람직하게는 세포 수용체에 결합하는 능력 및 감염성을 매개하는 능력을 보유한다. N 단백질 면역원 및 이의 변이체는, 예를 들면, 핵산에 복합체화되거나 이에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 변이체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 내지 100% 또는 90% 또는 95% 초과의 동일성을 갖거나, 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 S 단백질 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 특정한 다른 변이체는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 내지 100% 또는 90% 또는 95% 초과의 동일성을 갖거나, 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 S 단백질 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 또한 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 모든 축퇴 핵산 분자를 포함하다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 모든 축퇴 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 기술하는 바와 같이, S 단백질 면역원의 변이체는 체액성(점막 IgA 반응을 포함) 및/또는 또는 세포 매개성 면역반응을 포함할 수 있는 보호성 면역반응을 유도하거나 유발하는 능력을 갖는 바와 같이 적어도 하나의 생물학적 또는 기능적 활성을 보유한다. 또한, 본원에서 코로나바이러스 S 폴리펩타이드 변이체는 중화 항체인(즉, 바이러스 감염성을 중화시키는) S 단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력; S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력; 바이러스 감염을 중화하는 능력을 갖는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력; 세포 매개성 반응을 유도하거나 유발하는 능력; 및/또는 S 단백질 세포 수용체에 결합하는 능력과 같은 천연 또는 야생형 S 단백질의 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 또한 가질 수 있다. 본원에서 기술하는 바와 같이, N 단백질 면역원 변이체는 체액성(점막 IgA 반응을 포함) 및/또는 또는 세포 매개성 면역반응을 포함할 수 있는 보호성 면역반응을 유도하거나 유발하는 능력을 갖는 바와 같이 하나 이상의 생물학적 또는 기능적 활성을 보유한다. 또한, 본원에서 코로나바이러스 N 폴리펩타이드 변이체는 보호성 항체, 예를 들면, 중화 항체인 N 단백질 특이적 항체에 결합하는 능력, N 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력; 면역반응(체액성 및/또는 세포 매개성 면역반응)을 유도하거나 유발하는 능력 또는 코로나바이러스 게놈 RNA와 같은 핵산 분자에 결합하는 능력과 같은 천연 N 단백질의 활성과 실질적으로 유사한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 핵산 분자 변이체는 보존적 아미노산 치환을 갖는 S 또는 N 폴리펩타이드 유도체 또는 변이체를 암호하여 코로나바이러스 폴리펩타이드 변이체는 적어도 하나의 코로나바이러스 균주에 특이적인 항체를 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프(각각, 야생형 S 또는 N 폴리펩타이드 유래)를 보유하고/하거나 각각 S 또는 N 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하게 된다.
특정 양태에서, 핵산 서열은 코로나바이러스 S 또는 N 단백질 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하도록 변형될 수 있으며, 이때 당해 핵산 서열의 특정 코돈을 특정 숙주에 의해 선호되는 코돈으로 변화시켜 발현 수준을 증진시킬 수 있다[참조: Haas et al., Curr. Biol. 6:315, 1996; Yang et si., Nucleic Acids Res. 24:4592, 1996]. 예를 들면, 면역원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 특정 코돈을 펩타이드의 1차 서열을 변화시키지 않고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 개선된 발현을 위해 최적화시킬 수 있다. 예시로서 제한됨이 없이, AGG/AGA의 아르기닌(Arg) 코돈은 CGT/CGC의 Arg로 변경될 수 있다. 유사하게, AGG/AGA Arg 코돈은 CGT/CGC 코돈으로 변경될 수 있다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 코돈은 세균, 진균, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포를 포함하여 하이브리드 폴리펩타이드가 발현될 특정 숙주에 대해 최적화될 수 있다. 추가로, 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈도 마찬가지로 변화시킬 수 있으며, 특정 숙주에 가장 적합할 수 있다면 상이한 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 코돈을 동시에 변경시킬 수 있다(예: 아르기닌, 글리신, 류신 및 세린에 대한 코돈이 모두 최적화될 수 있고, 이들의 임의의 조합이 가능하다). 대안으로, 코돈 최적화는 보존적 아미노산 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합과 같은 주요 아미노산 서열내의 하나 이상의 변화를 일으킬 수 있다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 각각, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 S 단백질 면역원을 암호화하는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 또는 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함한다. 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 암호화하는 변이체 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 또는 25에 제시한 뉴클레오타이드 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 각각 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질 면역원을 암호화하거나, 본원에서 기술하는 바와 같은 S 단백질 변이체 면역원을 암호화할 수 있다(S 단백질 변이체 면역원은 중화 항체인(즉 바이러스 감염성을 중화시키는) S 단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력, S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력, 바이러스 감염을 중화하는 능력을 갖는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력, 세포 매개성 반응을 유도하거나 유발하는 능력 및/또는 S 단백질 세포 수용체에 결합하는 능력과 같은 하나 이상의 생물학적 또는 기능적 활성을 보유한다). 따라서, 특정 양태에서, 분리된 핵산(또는 폴리뉴클레오타이드)은, 변이체 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26의 코로나바이러스 S 단백질 폴리펩타이드에 함유된 하나 이상의 S 단백질 에피토프에 특이적 항체를 유도하는 능력 및 유사한 구조를 갖는 천연 또는 비-천연 코로나바이러스 S 폴리펩타이드를 암호화하기 때문에, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 또는 25과 실질적으로 유사한 이들 서열의 변이체를 포함한다.
또한 본원에서는 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 암호화하는 분리된 핵산이 기술되며, 이들 뉴클레오타이드 서열의 예는 각각 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 및 38에 제시하 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 27, 29, 31, 33, 35 및 37로 제시된다. 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 암호화하는 변이체 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 27, 29, 31, 33, 35 및 37에 제시한 뉴클레오타이드 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질 면역원을 암호화할 수 있거나 본원에서 제시한 바와 같은(하나 이상의 생물학적 또는 기능적 활성, 예를 들면, 보호성 항체, 예를 들면, 중화 항체인 N 단백질 특이적 항체에 결합하는 능력; N 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하거나 유발하는 능력; 면역반응(체액성 및/또는 세포 매개성 면역반응)을 유도하거나 유발하는 능력; 또는 코로나바이러스 게놈 RNA와 같은 핵산 분자에 결합하는 능력을 보유하는) 코로나바이러스 N 단백질 면역원을 암호화할 수 있다. 하나 이상의 분리된 핵산에 대한 언급은, 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38의 코로나바이러스 N 단백질-유래의 폴리펩타이드에 함유된 적어도 하나의 N 단백질 에피토프에 대한 특이적 항체를 유도하는 능력 및 유사한 구조를 갖는 천연 또는 비-천연 코로나바이러스 N 폴리펩타이드를 암호화한다는 점에서 실질적으로 유사한 이들 서열의 변이체를 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 분리된 핵산(또는 폴리뉴클레오타이드)는 변이체 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38의 코로나바이러스 N 단백질 폴리펩타이드에 함유된 하나 이상의 N 단백질 에피토프에 대한 특이적 항체를 유도하는 능력 및 유사한 구조를 갖는 천연 또는 비-천연 코로나바이러스 N 폴리펩타이드를 암호화한다는 점에서 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38와 실질적으로 유사한 이들 서열의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열은 (a) 당해 뉴클레오타이드 서열이 코로나바이러스 S 또는 N 단백질 유전자의 암호화 영역[예를 들면, 본원에서 제공되고 당해 분야에 공지된(예를 들면, GenBank 및 기타 서열 데이타베이스에서 발견할 수 있는) 뉴클레오타이드 서열; SARS 코로나바이러스의 균주와 같은 코로나바이러스의 상이한 균주로부터 유래된 서열; 또는 이러한 서열의 부분을 포함함]으로부터 유래되고 면역반응(체액성 또는 세포 매개성 면역반응), 바람직하게는 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 실질적으로 동일한 능력을 갖는 S 또는 N 단백질 에피토프을 함유하는 경우; (b) 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열이 중간 또는 높은 엄중성 조건하에 S 또는 N 단백질 면역원을 암호화하는 본원에서 기술하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드할 수 있는 경우; 및/또는 (c) 뉴클레오타이드 서열이 축퇴성(즉, 서열이 상이한 코돈 서열을 포함하지만 동일한 아미노산을 암호화하는)인 경우; 또는 (d) 서열이 (a), (b) 또는 (c)에 기술한 서열 중 어느 하나의 상보체인 경우 코로나바이러스 S 단백질 또는 N 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 두 뉴클레오타이드 서열은 실질적으로 상보적인 핵산 서열들 간에 안정한 하이브리드가 형성되는 경우 명시된 엄중성의 조건하에 "하이브리드화"한다고 언급된다. 하이브리드화의 엄중성은 하이브리드가 어닐링되고(annealed) 세척되는 환경 또는 조건의 설명으로서, 전형적으로 이온 강도 및 온도를 포함한다. 하이브리드화에 영향을 줄 수 있는 다른 요인에는 프로브 크기 및 하이브리드가 형서되도록 하는 시간이 포함된다. 예를 들면, "높은", "중간" 및 "낮은" 엄중성 조건은 다음의 예시적 조건 또는 이와 동등한 조건을 포함한다: 높은 엄중성은 약 65℃에서 0.1 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS이다; 중간 엄중성은 약 50℃에서 0.2 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS이다; 낮은 엄중성은 약 42℃에서 1.0 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "높은 엄중성 조건"이란 용어는 하나 이상의 서열들이, 하이브리드화 뉴클레오타이드 서열들이 오직 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일성을 보유하는 경우에만 하이브리드된 상태를 유지함을 의미한다. 적합한 중간 엄중성 조건은, 예를 들면, 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)에서의 사전 세척; 50℃ 내지 70℃, 5X SSC에서 1 내지 16시간 동안 하이브리드화한 다음, 22 내지 65℃에서 20 내지 40분 동안 0.05 내지 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 중 하나 이상으로 각각 1회 또는 2회 세척함을 포함한다. 부가적 엄중성을 위해, 조건은 50 내지 60℃에서 15분 동안 0.1 X SSC 및 0.1% SDS로 세척함을 포함할 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 하이브리드화 엄중성의 변화는 사전하이브리드화, 하이브리드화 및 세척 단계를 위해 사용된 시간, 온도 및/또는 용액의 농도를 변경하여 달성할 수 있다. 또한, 하이브리드화에 대한 조건은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서, 예를 들면, 포름아미드를 하이브리드화 용액에 부가하고 부수적으로 하이브리드화 시간을 감소시켜 변경할 수 있다.
특정 양태에서, 코로나바이러스 폴리펩타이드-암호화 핵산 분자에 대한 하이브리드화를 유지하는 핵산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26에 제시한 S 단백질 또는 단편의 적어도 하나의 에피토프를 보유하거나 서열번호 28, 30, 32, 34, 36 또는 38에 제시한 N 단백질 또는 단편의적어도 하나의 에피토프를 보유하는 폴리펩타이드를 암호화하고, 이때 적어도 하나의 에피토프는 각각 천연 또는 야생형 S 또는 N 단백질과 실질적으로 동일한, 면역반응(체액성 및/또는 세포 매개성 면역반응), 바람직하게는 보호성 면역반응을 유도하는 능력을 갖는다. 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 또는 25 중 어느 하나 또는 서열번호 27, 29, 31, 33, 35 및 37 중 어느 하나에 제시한 뉴클레오타이드 서열에 대한 하이브리드화를 유지하는 핵산에 의해 암호화되는 S 또는 단백질은 또한 본원에서 기술하는 S 또는 N 단백질 각각의 임의의 다른 기능적 또는 생물학적 활성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
본원에서 기술하는 단백질은 본원에서 기술하고 당해 분야에서 실시되는 광범위한 기술을 사용하여 작제 또는 생산할 수 있다. 코로나바이러스 폴리펩타이드의 생산방법은 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 숙주 세포에서의 발현을 포함한다. 하나의 양태에서, S 또는 N 단백질 면역원(코로나바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응을 유도하는 적어도 하나의 에피토프를 가짐)의 생산 방법은 코로나바이러스 폴리펩타이드, 예를 들면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 중 어느 하나에 제시한 코로나바이러스 폴리펩타이드(또는 본원에서 기술하는 바와 같은 이의 변이체 또는 단편) 또는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36, 또는 38 중 어느 하나에 제시한 코로나바이러스 폴리펩타이드(또는 본원에서 기술하는 바와 같은 이의 변이체 또는 단편)를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터와 같은 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 핵산 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 각각 S 또는 N 면역원의 발현을 위해 충분한 조건하에 충분한 시간 동안 배양함을 포함한다. 이들 발현 벡터 또는 목적하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 작제물은 바람직하게는 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 적절한 조절 요소의 선별은 선택된 숙주 세포에 의존하며 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 조절 요소의 예로는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 전사 터미네이터, 및 해독 개시 시그날을 포함하는 리보좀 결합 서열이 포함된다. 임의로, 벡터는 폴리아데닐화 서열, 하나 이상의 제한 부위 뿐만 아니라, 하나 이상의 선택성 마커, 예를 들면, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 또는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 마커를 포함할 수 있다. 또한, 선택된 숙주 세포 및 사용되는 벡터에 따라서, 복제 기점, 추가의 핵산 제한 부위, 인핸서, 전사 유도성을 부여하는 서열 및 선택성 마커와 같은 기타 유전 요소를 본원에서 기술하는 벡터내로 혼입시킬 수 있다.
세균성 발현 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 작용하는 프로모터, 하나 이상의 선택성 표현형 마커 및 세균의 복제 오리진을 포함한다. 특정 양태에서, 본원에서 기술하는 핵산 발현 작제물은 lac, tac, trc, ara, trp, λ 파아지, T7 파아지 및 T5 파아지 프로모터일 수 있거나 미국 특허 공보 제2003/0143685호에 기술된 바와 같은 T5 파아지 프로모터/lac 오퍼레이터 발현 제어 서열(플라스미드 pT5)일 수 있는 유도성 프로모터를 갖는다. 상기 발현 제어 서열은 관심대상의 단백질이 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 하기에 충분한 임의의 서열을 지칭하며, 하나 이상의 프로모터 서열, 인핸서 서열, 오퍼레이터 서열(예: lacO) 등을 포함한다. 특정 양태에서, 코로나바이러스 폴리펩타이드-암호화 핵산(예: S 또는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산)은 플라스미드 pT5와 같은 플라스미드내로 혼입되고, 숙주 세포는 세균, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
다른 대표적 프로모터에는 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토즈 프로모터 시스템[참조: Chang et al., Nature 275:615, 1978], T7 RNA 폴리머라제 프로모터[참조: Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990], 람다 프로모터[참조: Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990], trp 프로모터[참조: Nichols and Yanofsky, Meth. in En∑ymology 101 : 155, 1983] 및 tac 프로모터[참조: Russell et al., Gene 20:231, 1982]가 포함된다. 추가의 프로모터에는 T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파아지 람다의 PR 및 PL 프로모터, 이. 콜라이의 recA, 히트 쇼크(heat shock), lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA 및 lacZ 프로모터, 비. 서브틸리스의 프로모터, 바실러스(Bacillus)의 박테리오파아지의 프로모터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파아지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터가 포함된다. 원핵세포 프로모터는 글릭 등[참조: Glick, J. bid. Microbiol. 1:211, 1987, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)] 및 아우수벨(Ausubel) 등(1995)에 의해 검토되었다. 대표적 선택성 마커에는 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자와 같은 각종 항생제 내성 마커가 포함된다. 숙주 세포를 형질전환시키기에 적합한 많은 플라스미드는 당해 분야에 공지되어 있으며, 특히 pBR322[참조: Bolivar et al., Gene 2:95, 1977], pUC 플라스미드 pUC18, pUC19, pUC118, pUC119[참조: Messing, Meth. in Enzymology 101 :20-77, 1983 and Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982] 및 pNH8A, pNH16a, pNH18a 및 Bluescript M13[참조: Stratagene, La Jolla, California]를 포함한다.
특정 양태에서, S 및 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체는 소형 세포에서 또는 동일한 발현 벡터로부터 또는 하이브리드 융합 폴리펩타이드로서 동일한 발현 벡터로부터 발현된다. 또한, 제한 부위가 양 측면에 있는 돌연변이 서열을 함유하여 천연 서열의 단편에 연결될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 돌연변이를 특정 위치에 도입시킬 수 있다. 연결 후, 수득된 재작제된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유도체 또는 변이체를 암호화한다.
대안으로서, 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위 특이적(또는 절편 특이적) 돌연변이유발 공정을 사용하여 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 상기 제시한 변경의 예시적 제조방법은 왈더(Walder)등[참조: Gene 42:133, 1986)]; 바우어(Bauer) 등[참조: Gene 37:73, 1985]; 크레이크(Craik)[참조: BioTechniques, January 1985, 12-19]; 스미스(Smith) 등[참조: Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981]; 및 삼브룩(Sambrook) 등(상기 참조)에 의해 개시되었다. 목적하는 결실 부위에 인접한 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 단백질의 결실 또는 절두 유도체(예: 가용성 세포외 부분)를 또한 작제할 수 있다. 제한 후, 돌출부로 채워지고 DNA가 재연결될 수 있다. 상기 제시한 변경의 예시적 제조방법은 삼브룩 등[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]에 의해 개시되었다.
핵산 분자 내에서 이루어지는 돌연변이는 바람직하게는 암호화 서열의 판독 프레임(reading frame)을 보존한다. 또는, 돌연변이는 전사된 경우 mRNA의 해독에 악영향을 미칠 수 있는 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조에 하이브리드화할 수 있는 상보적 영역을 생성시키지 않는 것이 바람직할 수 있다. 돌연변이 부위가 미리 결정되지 않을 수 있으나, 특히 돌연변이의 성질이 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서 돌연변이의 최적화 특성을 선별하기 위해, 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈에서 실시하고 발현된 돌연변이체를 생물학적 특성의 획득, 손실 또는 보유에 대해 스크리닝할 수 있다. 대안으로서, 제한 부위가 양 측면에 있는 돌연변이 서열을 함유하여 천연 서열의 단편에 연결될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 돌여변이를 특정 위치에 도입시킬 수 있다. 연결 후, 수득된 재작제된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유도체 또는 변이체를 암호화한다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발[참조: Drinkwater and Klinedinst, Proc. Natl. Acad. ScL USA 83:3402-3406, 1986]; 강제 뉴클레오타이드 오혼입(misincorporation)[참조: Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990]; 또는 무작위적으로 돌연변이된 올리고뉴클레오타이드의 사용[참조: Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989]과 같은 기술을 사용하여 작제할 수 있다.
본원에서 기술하는 코로나바이러스 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 클로닝된 폴리뉴클레오타이드 서열은, 예를 들면, 리포좀-매개 형질감염, 인산칼슘 매개 형질감염[참조: Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973], 전기천공[참조: Neumann et al., EMBO J. 1 :841 -845, 1982] 또는 DEAE-덱스트란 매개 형질감염[참조: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987]; 레트로바이러스, 아데노바이러스성 및 원형질체 융합 매개 형질감염[참조: Sambrook et al., supra]에 의해 배양된 포유동물 세포내로 도입시킬 수 있다. 클로닝된 DNA를 함유하는 벡터로 안정하게 형질감염된 세포를 확인하기 위해, 일반적으로 선택성 마커를 관심대상의 폴리뉴클레오타이드와 함께 세포내로 도입시킨다. 배양된 포유동물 세포에서 사용하기에 바람직한 선택성 마커로는 네오마이신, 하이그로카이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 선택성 마커는 증폭가능한 선택성 마커일 수 있다. 바람직한 증폭가능한 선택성 마커는 DHFR 유전자 및 네오마이신 내성 유전자이다. 선택성 마커는 문헌[참조: Thilly, Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Massachusetts]에 검토되어 있다..
다가 백신
본원에서 기술하는 폴리뉴클레오타이드 및 숙주 세포는 예를 들면, 다가 백신으로서 사용될 수 있고 적어도 하나의 S 단백질 면역원 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원, 즉 다수의 상이한 S 단백질 면역원들의 혼합물 또는 배합물을 포함하는 다가 면역원을 제조하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 다가 백신은 적어도 하나의 N 단백질 면역원 또는 적어도 하나의 N 단백질 면역원, 즉 다수의 상이한 N 단백질 면역원들의 혼합물 또는 배합물을 포함한다. 대안으로서, 다가 백신은 적어도 하나의 S 단백질 면역원과 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원의 배합물 및/또는 다른 코로나바이러스 항원, 예를 들면 M 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 다가 백신은 다가 하이브리드 백신이며 몇가지 방식으로 연결되어 있는, 예를 들면, 프레임내에서 융합 단백질로서 융합되어 있는 2개 이상 또는 다수의 상기한 면역원들을 포함한다. 또한, 면역원 융합 단백질은 융합 단백질내에 1회 이상 반복된 하나 이상의 면역원을 가질 수 있고(이로써 하나 이상의 면역원은 융합 단백질 내의 적어도 2곳의 위치에 함유된다), 이러한 반복은 선별된 다가 면역원 폴리펩타이드의 아미노- 또는 카복시 말단에서 또는 다가 융합 단백질 내부에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 이러한 다가 하이브리드 코로나바이러스 항원(다가 융합 단백질)은 (1) 본원에서 기술하는 하나 이상의 S 단백질 면역원 또는 S 단백질의 폴리펩타이드 단편(예를 들면 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26 및 이의 변이체 단편); (2) 본원에서 기술하는 하나 이상의 N 단백질 면역원 또는 N 단백질의 폴리펩타이드 단편(예를 들면, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38, 이의 변이체 및 단편); 또는 (3) 하나 이상의 S 단백질 면역원(또는 이의 단편) 및 하나 이상의 N 단백질 면역원(또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 적어도 2개의 코로나바이러스 S 단백질 면역원 또는 적어도 2개의 코로나바이러스 N 단백질 면역원이 각각 다수의 S 단백질 면역원 또는 N 단백질 면역원으로 고려된다. 다른 양태에서, 다가 하이브리드 코로나바이러스 면역원은 프로테오좀 또는 프로톨린과 같은 보조제 또는 백반, 프로인트 보조제, 또는 Ribi 보조제(제조원: Corixa Corporation, Seattle, WA)과 같은 보조제와 배합된다.
또한, 이러한 다가 하이브리드 코로나바이러스 면역원 백신 조성물은 상이한 코로나바이러스 항원 그룹, 예를 들면, 그룹 1(예: 전염성 위장염 바이러스, TGEV; 사람 호흡기 코로나바이러스, HcoV-229E); 그룹 2(예: 마우스 간염 바이러스, MHV); 그룹 3 바이러스(예: 조류 IBV); 및 SARS 그룹(예: SARS-CoV 균주 Tor2(참조: GenBank 수탁번호 AY274119); 어바니(참조: GenBank 수탁번호 AY278741); 프랑크푸르트 1(참조: GenBank 수탁번호 AY291315), TW5 (참조: GenBank 수탁번호 AY502928); BJOl(참조: GenBank 수탁번호 AY278488); GD03T0013 (참조: GenBank 수탁번호 AY525636) 등); 또는 이들의 배합물(또는 예를 들면 사람을 감염시키는 것으로 확인된 임의의 다른 코로나바이러스 그룹)로부터의 면역원성 에피토프를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 동일하거나 상이한 코로나바이러스 항원은 BamHl, ClaI, EcoRI, HindIII, KpnI, NcoI, NheI, PmlI, PstI, SalI, XhoI 등 중 어느 하나일 수 있는 제한 효소 제한 부위인 핵산 서열에 의해 암호화되는 2개 이상의 아미노산에 의해 연결될 수 있다. 본원에서 기술한 바와 같이 합성된 부가적 아미노산 링커가 또한 부가될 수 있다. 바람직하게는, 부가적 아미노산은 사람 단백질의 5개의 아미노산 신장부(stretch) 내 서열에서 어떠한 동일성도 생성하지 않는다. 또한, 하이브리드 코로나바이러스 면역원 폴리펩타이드는 하나 이상의 부가적 카복시-말단 아미노산을 추가로 포함할 수 있으며, 부가적 아미노산은 D-아미노산 또는 L-아미노산이다. 시스테인, 히스티딘, 류신 및 글루탐산과 같은 20개의 천연 발생 아미노산 중 어느 하나 또는 이의 유도체를 부가할 수 있다. 예를 들면, 융합 폴리펩타이드의 카복시 말단에 하나 이상의 시스테인의 부가는 지질, 캐리어 단백질, 태그, 효소 등과 같은 다른 성분의 부착 또는 연결에 유용할 수 있다.
특정 양태에서, 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및/또는 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 제2 아미노산 서열에 연결되고, 특정 구체저 양태에서, S 단백질 면역원 및/또는 코로나바이러스 N 단백질 면역원은 프레임내에서 제2 아미노산 서열과 융합된다. 제2 아미노산 서열은 캐리어 단백질(예를 들면, 당해 분야에서 항원의 증가된 또는 개선된 면역원성을 촉진하는 것으로 이해되는 단백질 및 폴리펩타이드), 태그(예를 들면, 히스티딘 태그) 또는 효소를 포함할 수 있다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 코로나바이러스 면역원 융합 단백질은 예를 들면, 하이브리드 폴리펩타이드 융합 단백질의 검출, 분리 또는 정제를 가능하게 하는 부가적 기능적 또는 비-기능적 비-코로나바이러스 폴리펩타이드 서열에 융합된 S 또는 N 단백질 면역원, 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 부가적 기능적 폴리펩타이드 서열은 특정 양태에서 단백질-단백질 친화성(예: 수용체-리간드), 금속 친화성 또는 전하 친화성 방법에 의해 융합 단백질이 검출, 분리 및/또는 정제될 수 있게 하는 태그 서열일 수 있다. 특정 양태에서, 하이브리드 폴리펩타이드 융합 단백질은 하이브리드 코로나바이러스 폴리펩타이드가 부가적 폴리펩타이드 서열로부터 분리될 수 있도록 하는 프로테아제 인식 서열을 포함하는 서열을 갖는 융합 단백질의 특이적 프로테아제 절단에 의해 검출될 수 있다. 또한, 아미노- 또는 카복시 말단에 위치할 수 있는 부가적 아미노산, 캐리어 단백질, 소수성 부분(예: 지질) 또는 태그 서열을 포함하는 하이브리드 폴리펩타이드를 합성에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 재조합 코로나바이러스 항원은 알칼리성 포스파타제, 티오레독신, β-갈락토시다제, 헥사히스티딘(6xHis), FLAGR 에피토프 태그(DYKDDDDK, 서열번호 40) 또는 GST 등 중 어느 하나일 수 있는 태그에 프레임내에서 융합된다.
특정 양태에서, 하이브리드 코로나바이러스 폴리펩타이드 융합 단백질에 융합된 태그는 하이브리드 코로나바이러스 폴리펩타이드 융합 단백질의 친화성 검출 및 분리를 용이하게 하며, 예를 들면, 폴리-His 또는 미국 특허 제5,011,912호 및 문헌[참조: Hopp et al., 1988 Bio/Technology 6:1204]에 정의된 항원성 펩타이드 에피토프 또는 XPRESSTM 에피토프 태그(DLYDDDDK, 서열번호 41; Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 티오레독신을 포함할 수 있다. 친화성 서열은 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있다. 예를 들면, pBAD/His(Invitrogen) 또는 pQE-30(제조원: Qiagen, Valencia, CA) 벡터는, 니켈 친화성 컬럼을 사용하여 성숙한 단백질 융합체를 특정 숙주, 예를 들면, 세균으로부터 정제하기 위한 폴리히스티딘 태그를 제공할 수 있다. 대안으로, 친화성 서열은 코로나바이러스의 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 (예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여) 재조합적으로 제조하는데 사용되는 플라이머내로 합성에 의해 부가되거나 조작될 수 있다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 코로나바이러스 항원은 티오레독신에 융합되고, 당해 코로나바이러스 면역원-티오레독신 융합 단백질은 재조합 핵산 서열에 의해 암호화된다.
치료학적 제형 및 사용방법
특정 양태에서, 코로나바이러스에 대한 면역반응을 유도하거나 유발하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 코로나바이러스 면역원을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 피험체에게 S 단백질 면역원, 이의 단편 또는 변이체, S 면역원 융합 단백질 또는 다가 면역원, 또는 이러한 면역원들의 혼합물을 본원에서 기술하는 바와 같은 코로나바이러스에 특이적인 항체를 유도하기에 충분한 용량으로 투여함으로써 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 방법은 피험체에게 N 단백질 면역원, 이의 단편 또는 이의 변이체, N 면역원 융합 단백질 또는 다가 면역원, 또는 이러한 면역원들의 혼합물을 코로나바이러스에 특이적인 항체를 유도하기에 충분한 용량으로 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법은 피험체에게 적어도 하나의 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 N 단백질 면역원(또는 S 또는 N 단백질 면역원의 변이체 또는 단편); 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원 및 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 융합 단백질 또는 다가 면역원; 또는 이러한 면역원들의 혼합물 또는 칵테일을 투여함을 포함한다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 코로나바이러스 단백질 항원(면역원)은 코로나바이러스 감염을 앓고 있거나 코로나바이러스 감염의 발생 위험에 쳐한 피험체 또는 숙주에게 투여된다. 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질(예: S 단백질 면역원 및/또는 N 단백질 면역원)의 투여는 바람직하게는 보호성 면역반응을 유도하거나 자극한다. 본원에서 기술하는 바와 같은 보호성 면역반응은 체액성 반응을 포함할 수 있으며, 즉 피험체에 대한 코로나바이러스 단백질(면역화)의 투여는 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 자극 또는 유도한다. 체액성 반응의 자극 또는 유도는 바람직하게는 코로나바이러스 감염성을 중화시키는 중화 항체인 항체의 생산을 포함한다. 체액성 반응은 또한 코로나바이러스에 특이적인 점막 IgA 항체의 생산을 포함하고 피험체 또는 숙주의 혈청에서 검출될 수 있는 IgM, IgG 및 IgA를 포함하는 다양한 면역글로불린 부류 중 어느 하나의 생산을 포함할 수 있는 점막 면역반응을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질 면역원의 투여는, T 세포의 자극, 면역 세포에 의해 생산되는 사이토킨과 같은 면역자극성 분자의 생산 및 특이적 코로나바이러스 단백질 면역원에 대한 반응으로서 특이적 T 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 포함하는 세포 매개성 반응을 또한 유도할 수 있다.
하나의 양태에서, 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역원성 조성물로서 유용한 조성물은 본원에서 기술하는 바와 같은 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 코로나바이러스 항원(면역원)(다가 백신 및 다가 하이브리드 융합 단백질을 포함) 및 프로톨린 또는 프로테오좀 보조제[참조: 미국 특허 제5,726,292호 및 제5,985,284호 및 미국 특허 공보 제2001/0053368호 및 제2003/0044425호]를 함유한다. 당해 분야에서 이해되고 있는 바와 같이, 보조제는 면역원의 면역원성을 증진시킬 수 있고(즉, 면역자극원으로서 작용한다), 많은 항원은 보조제와 배합 또는 혼화 또는 혼합되지 않는다면 면역원성이 불량하다. 약독화된 생 바이러스, 치사 바이러스, 분할 항원(split antigen) 제제, 서브유닛 항원, 재조합 또는 합성 바이러스 항원 및 이들의 배합물과 같은 각종 공급원을 항원 공급원으로 사용할 수 있다. 서브유닛, 재조합 또는 합성 백신의 효능을 최대화하기 위해, 항원을 강력한 면역자극제 또는 보조제와 배합할 수 있다. 기타 예시적 보조제로는 백반(수산화알루미늄, REHYDRAGELR; 인산알루미늄; 비로좀(virosome); 지질 A 함유 및 비함유 리포좀; Detox(Ribi/Corixa); MF59; 또는 기타 유성 및 수성 에멀젼 유형 보조제, 예를 들면, 나노에멀젼[참조: 미국 특허 제No. 5,716,637호] 또는 서브마이크론 에멀젼[참조: 미국 특허 제5,961,970호]; 및 프로인트 완전 및 불완전 보조제가 포함된다.
프로테오좀-기반 보조제(즉, 프로톨린 또는 프로테오좀)은 본원에서 기술하는 다양한 코로나바이러스 항원(면역원) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 백신 조성물 또는 제형에서 사용될 수 있다. 프로테오좀은 전형적으로는 나이세리아 종으로부터 유래되나 다른 그램-음성 세균으로부터 유래될 수 있는 외막 단백질(OMP)[참조: Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; 미국 특허 제5,726,292호; 미국 특허 제4,707,543호]로 이루어진다. 프로테오좀은 20 내지 800nm의 소포 또는 소포-유사 OMP 클러스터로 자가 조립하고 항원, 특히 소수성 잔기를 갖는 항원에 비공유적으로 혼입, 조화, 결합 또는 그 밖에 협력하는 능력을 갖는다. 프로테오좀은 소수성이며 사람에서 사용하기에 안전하고 크기가 특정 바이러스에 필적한다. 배경으로서 이론으로 국한시키고자 함이 아니라, 프로테오좀을 단백질과 같은 항원과 혼합하는 것은 항원과 프로테오좀 간의 비공유 결합 또는 배위를 포함하는 조성물을 제공하며, 이러한 결합 또는 배위는 예를 들면 투석에 의해 가용화 세제가 선택적으로 제거되거나 농도가 감소되는 경우에 형성된다. 프로테오좀은 미국 특허원 제2001/0053368호 및 제2003/0044425호에 기술되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다.
하나 이상의 OMP의 다중-분자 구조 또는 용융 구형 OMP 조성물을 포함하는, 소포 또는 소포 유사 형태의 외막 단백질 성분을 생성시키는 임의의 제조방법이 "프로테오좀"의 정의내에 포함된다. 하나의 양태에서, 프로테오좀은 나이세리 종, 보다 바람직하게는 나이세리아 메닝기티디스로부터 유래된다. 특정한 다른 양태에서, 프로테오좀은 보조제 및 항원 전달 조성물일 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 코로나바이러스 항원 및 보조제를 포함하며, 당해 보조제는 프로쥬번트 또는 프로톨린을 포함한다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 코로나바이러스 항원은 코로나바이러스로 감염된 세포인 바이러스 입자 또는 재조합 공급원으로부터 분리될 수 있고/있거나, 예를 들면, (세제) 분할 항원을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 면역원성 조성물은 지질당류와 같은 제2 면역자극제를 추가로 포함한다. 즉, 당해 보조제는 부가적 면역자극제를 포함하도록 제조할 수 있다. 예를 들면, 프로쥬번트를 지질당류와 혼합하여 OMP-LPS 보조제를 제공할 수 있다. 따라서, OMP-LPS (프로톨린) 보조제는 2가지 성분으로 이루어질 수 있다. 나이세리아 메닝기티디스와 같은 그램-음성 세균으로부터 제조된 프로테오좀(즉, 프로쥬번트)의 제1 성분은 외막 단백질 제제를 포함하고, 제2 성분은 지질당류의 제제를 포함한다. 지질당류는 미국 특허원 제2001/0053368 및 제2003/0044425호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 또한, 제2 성분은 지질, 당지질, 당단백질, 소분자 등 및 이들의 배합물을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.
본원에서 기술하는 바와 같이, OMP-LPS 보조제의 두 성분들은 성분들 간의 상호작용을 최적화하여 면역원성 조성물의 제조시 사용하기 위한 성분들의 안정한 결합 및 제형화를 야기하는 특정한 초기 비로 배합(혼합 또는 제형화)될 수 있다. 공정은 일반적으로 선택된 세제 용액(예: EmpigenR BB, TritonR X-IOO 또는 Mega- 10) 중에서 성분들을 혼합한 다음, 투석 또는 정용여과/한외여과 방법에 의해 세제의 양을 미리 정해진 바람직한 농도로 감소시키면서 OMP와 LPS 성분의 복합체 형성을 일으킴을 포함한다. 또한, 두 성분들의 혼합, 공침전 또는 동결건조를 사용하여 적절하고 안정한 결합, 조성물 또는 제형을 제조할 수 있다. 하나의 양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 하나의 코로나바이러스 항원 및 보조제를 포함하고, 당해 보조제는 프로쥬번트(즉, 프로테오좀) 및 지질당류를 포함한다.
특정 양태에서, 전체 프로테오좀 단백질의 백분율로서의 최종 지질당류 함량(기준 중량)은 약 1% 내지 약 500%의 범위, 보다 바람직하게 약 10% 내지 약 200%의 범위 또는 약 30% 내지 약 150%의 범위이다. 다른 양태는 프로테오좀이 나이세리아 메닝기티디스로부터 제조되고 지질당류가 쉬겔라 플렉스네리 또는 플레시오모나스 쉬겔로이데스로부터 제조되고 최종 지질당류 함량이 전체 프로테오좀 단백질의 50중량% 내지 150중량%인 면역자극성 조성물이다. 다른 양태에서, 프로테오좀은 내인성 지질올리고당류(LOS) 함량이 전체 OMP의 약 0.5% 내지 약 5% 범위가 되도록 제조한다. 다른 양태에서, 프로테오좀은 전체 OMP의 약 12% 내지 약 25% 범위의 내인성 지질당류 및 또 다른 양태에서 내인성 지질당류는 전체 OMP의 약 15% 내지 약 20%이다. 본 발명은 또한 임의의 그램-음성 세균 종 유래의 지질당류를 함유한 조성물을 제공하며, 당해 지질당류는 프로테오좀의 공급원인 동일한 그램-음성 세균 종 또는 상이한 세균 종으로부터 유래할 수 있다.
특정 양태에서, 면역원성 조성물 중의 프로테오좀 또는 프로톨린 대 코로나바이러스 항원 비는 1:1 초과, 2:1 초과, 3:1 초과 또는 4:1 초과이다. 다른 양태에서, 면역원성 조성물중 프로테오좀 또는 프로톨린 대 코로나바이러스 항원 비는 약 1:1, 2:1, 3:1 또는 4:1이다. 당해 비는 8:1 이상일 수 있다. 다른 양태에서, 면역원성 조성물 중의 프로테오좀 또는 프로톨린 대 코로나바이러스 항원 비는 약 1:1 내지 약 1 :500의 범위이며, 적어도 1:5, 적어도 1: 10, 적어도 1:20, 적어도 1 :50 또는 적어도 1:100, 또는 적어도 1:200이다. 1:2 내지 1:200 범위의 프로톨린: 코로나바이러스 항원 비의 이점은 프로테오좀-기반 보조제의 양이 면역반응을 유도하는 코로나바이러스 항원의 능력에 유의한 효과를 미치지 않으면 급격하게 감소될 수 있다는 점이다.
또 다른 양태에서, 조성물은 프로테오좀 또는 프로톨린과 배합된(혼합된 또는 제형화된) 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하며, 이때 상기 S 단백질 면역원은 서열번호 2와 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 아미노산 서열 또는 이의 단편 을 포함하고, S 단백질 면역원 또는 이의 단편은 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도하는 에피토프를 갖는다. 예시적 S 단백질 면역원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 2로 이루어진다. 다른 양태에서, S 단백질 면역원은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 , 서열번호 24 및 서열번호 26으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 2의 단편이다.
다른 양태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 코로나바이러스 N 단백질 면역원, 이의 단편 또는 변이체, 및 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 보조제로 이루어진다. 특정 양태에서, N 단백질 면역원은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 특정한 다른 양태에서, 조성물은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 서열을 갖는 N 단백질 면역원 변이체를 포함한다. 이러한 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 예시적 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체는, 서열번호 28의 단편이고 예를 들면, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38의 아미노산 서열, 또는 이들 서열과 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율을 포함한다) 동일한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 하나(하나 이상)의 코로나바이러스 S 면역원, 이의 단편 또는 변이체, 및 하나 이상의 (하나 이상의) 코로나바이러스 N 단백질 면역원, 이의 단편 또는 변이체, 및 프로쥬번트 또는 프로쥬번트 및 지질당류를 포함하는 보조제로 이루어진다.
대안으로, 본원에서 기술하는 임의의 S 또는 N 단백질 면역원 또는 S 단백질 면역원과 N 단백질 면역원의 배합물은 면역원성 조성물 중에서 리포좀과 배합(혼합 또는 제형화)될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 함유한 리포좀은 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 지질 또는 α-갈락토실포스포티딜글리세롤알킬아민을 추가로 포함한다. 이러한 리포좀중 지질의 부가는 보호성 면역을 증가시킴으로써 코로나바이러스 백신 조성물의 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스 폴리펩타이드 및 면역원은 공유 결합된 소수성 부분을 추가로 포함할 수 있다. 소수성 부분은, 예를 들면, 미국 특허 제5,726,292호에 개시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 지질일 수 있다. 천연 발생 코로나바이러스 S 단백질 및 서열번호 2에 제시한 서열을 갖는 재조합적으로 발현된 S 단백질은 S 단백질 면역원 단편(예를 들면, 서열번호 16 또는 18은 이에 융합된 S 단백질로부터의 소수성 트랜스막 도메인을 가질 수 있다) 또는 N 단백질 면역원(예를 들면, 서열번호 30 또는 32는 이에 융합된 S 단백질로부터의 소수성 트랜스막 도메인을 가질 수 있다)과 함께 소수성 부분으로서 작용할 수 있는 소수성 트랜스막 도메인(서열번호 2의 약 아미노산 1195번 내지 약 1240번)을 함유한다. 하나의 양태에서, 코로나바이러스 조성물(예: 백신 조성물)은 프로테오좀[참조: 미국 특허 제5,726,292호 및 제5,985,284호] 또는 프로톨린[참조: 미국 특허원 제2003/0044425호]와 배합, 혼합, 복합체화 또는 제형화된 코로나바이러스 S 단백질 또는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체를 포함하고, 이때 상기 S 또는 N 단백질 면역원은 소수성 부분 또는 풋을 추가로 포함한다. 프로테오좀과 배합되는 경우, S 또는 N 단백질 면역원은 바람직하게는 소수성 아미노산 서열 또는 지질(본원에서 사용되는 바와 같이 지질은 가용성 특성을 의미하고, 따라서 알킬, 아릴알킬, 아릴, 지방산, 글리세라이드 및 글리세릴 에테르, 인지질, 스핑고지질, 장쇄 알콜, 스테로이드, 비타민 등을 포함한다)로 이루어질 수 있는 소수성 부분을 포함한다. 하나의 양태에서, S 단백질의 소수성 부분(예: 트랜스막 도메인)은 코로나바이러스 N 단백질 면역원에 융합될 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 소수성 부분을 함유하거나 함유하지 않는 S 또는 N 단백질 면역원은 본원에서 기술한 바와 같이 태그, 캐리어 또는 효소인 제2 아미노산 서열을 추가로 함유하여 융합 단백질을 형성할 수 있다. 또 다른 양태에서, S 및 N 면역원은 면역원성 조성물 중에서 개별적 성분으로서 배합되거나, 융합되어 소수성 부분을 함유하거나 함유하지 않고 추가로 또는 대안으로 본원에서 기술하는 바와 같은 제2 아미노산 서열을 함유한 하이브리드 다가 면역원을 형성할 수 있다.
다른 양태에서, 면역원성 조성물은 (프로쥬번트 또는 프로톨린)을 포함할 수 있거나 추가로 백신 공여체의 하나 이상의 숙주 세포에 의해 생산된 특정 수용체(예: Toll-유사 수용체, TLR)와 상호작용하여 숙주 면역반응을 자극할 수 있는 성분(예: 수용체 리간드)을 포함할 수 있다. 하나의 양태에 따라서, 코로나바이러스 단백질의 면역원성 에피토프를 포함하는 조성물은 Toll-유사 수용체(TLR)와 상호작용하여 선천 면역반응을 촉진할 수 있는 폴리펩타이드 에피토프(이는 후속적 적응면역반응을 유발하거나 유발하지 않을 수 있다)를 함유할 수 있다.
선천 면역반응은 특이적 항원-의존적 또는 항체-의존적 반응이 아니고(즉, T 세포 및/또는 B 세포의 클론 확장이 관여하지 않음) 본원에서 기술하는 수많은 항원, 면역원 또는 코로나바이러스 중 어느 하나에 의해 유도될 수 있는 비특이적 보호성 면역반응이다. 본원에서 기술하는 면역자극성 조성물은 프로테오좀 및 지질당류(프로톨린)을 포함하고, 이중 하나 또는 이들 둘다는 비특이적 보호성 반응을 유도할 수 있다. 이론으로 국한됨이 없이, 본원에서 기술하는 백신 조성물 또는 제제의 하나 이상의 성분은 백신 수용자의 선천 면역반응 및/또는 적응 면역반응과 관련된 Toll-유사 수용체(TLR)와 상호작용할 수 있다. 적어도 10가지의 TLR이 기술되어 있다[참조: Takeda et. al., Annu Rev Immunology (2003) 21 :335-76]. TLR8 및 TLR1O을 제외한 특정 TLR과 상호작용하고 이어서 이를 활성화시키는 하나 이상의 리간드가 동정되었다. 나이세리아 메닝기티디스의 특정 외막 단백질 부분, 예를 들면, OMP 2(Por B로서도 지칭됨)는 TLR2와 상호작용하며, 대부분 그러나 전부는 아닌 그램 네가티브 세균의 LPS는 TLR4와 상호작용한다. 따라서, 생물학적 효과에 기여할 수 있는 본원에서 기술하는 백신 조성물 또는 제제의 한가지 활성은 TLR2 및 TLR4 중 하나 또는 이들 둘다의 활성화를 포함한다. 다른 TLR(TLR2 및 TLR4이 아닌)의 활성화가 유사한 작용을 하거나 발현된 사이토킨의 정성적 또는 정량적 프로파일을 보다 증진시킬 수 있고 숙주 Th1/Th2 면역반응과 관련될 수 있다. LPS 및 PorB 이외의 TLR 리간드를 단독으로 또는 배합하여 사용하여 TLR2 또는 TLR4를 활성화시킬 수 있다는 것도 또한 의도된다. 하나 이상의 TLR의 정성적 또는 정량적 활성화는, 수반되는 체액성 항체 반응의 존재 또는 부재하에 Th1(1형) 또는 Th2(2형) 면역반응의 상대적 자극(균형 또는 불균형 상태)을 유도하거나 영향을 줄 것으로 예상된다. TLR2 및 TLR4 이외의 TLR과 상호작용하는 리간드도 본원에서 기술하는 백신 조성물에서 사용할 수 있다. 이러한 백신 성분을 단독으로 또는 배합하여 사용함으로써, 본원에서 제시하는 바이러스 감염을 치료하거나 이로부터 보호하기에 충분한 숙주 면역반응의 발생을 일으킬 수 있다. 이러한 TLR 및 관련된 리간드 당해 분야에 공지되어 있고 하기 표 1에 제시한 것들을 포함한다.
TLR 및 리간드
TLR 계열 리간드(가능한 공급원의 예)
TLR1 가용성 인자(나이세리아 메닝기티디스) 트리-아실 지질펩타이드(세균, 마이코박테리아)
TLR2 지단백질 및 지질펩타이드 포린(나이세리아) 비정형 LPS(예:렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans) 피. 깅기발리스) 펩토디글리칸(그램-양성 세균) 리포테이코산(그램-양성 세균) HSP70(숙주) 당지질(예: 트레포늄 말토필리움(Treponema maltophilum))
TLR3 이본쇄 RNA(예: 바이러스)
TLR4 LPS(그램-음성 세균) 탁솔(식물) HSP60(숙주) HSP70(숙주) HSP60(숙주)(클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pnemoniae) 피브리노겐(숙주)
TLR5 플라겔린(세균)
TLR6 디-아실 지질펩타이드(마이코플라즈마)
TLR7 이미다조퀴놀린(합성 화합물) 록소리빈(합성 화합물) 브로피리민(합성 화합물)
TLR8 아직 동정되지 않은 리간드
TLR9 CpG DNA(세균)
TLR10 아직 동정되지 않은 리간드
언급한 TLR(표 1) 중 어느 하나 또는 이들의 배합물은 본원에서 기술하는 코로나바이러스 S 단백질 면역원, N 단백질 면역원, 또는 적어도 하나의 S 단백질 면역원과 N 단백질 면역원 둘다를 포함하는 백신 조성물에 부가된, 배합된 또는 제형화된 TLR 리간드 성분 중 어느 하나 또는 이들의 배합물에 의해 활성화될 수 있다. TLR 중 어느 하나 또는 다수의 TLR의 자극은 투여 경로(예: 비강내, 주사 등)에 적합한 농도에서 TLR 리간드 중 어느 하나 또는 다수의 TLR을 사용하여 달성할 수 있다. 따라서, 백신 조성물 또는 제제는 외부에 지질다당류 성분을 부가하거나 부가함이 없이, 항원성(면역원성) 백신 성분과 배합되거나 제형화된 재조합 리간드(융합 단백질 또는 이의 단편)를 포함하는 또는 임의의 하나 이상의 TLR 리간드(들)을 포함할 수 있다.
효과적 면역반응은 선천 면역반응과 적응 면역반응 간의 상호교통에 의존적이다. T 림프구는 이펙터 분자의 방출을 조절함으로써 적응 면역반응을 조정한다. 예를 들면, T 헬퍼(Th) 1 세포는 세포 매개성 면역의 발생에 중요한, 인터류킨-2(IL-2), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터페론 감마(IFN-γ)[참조: Mosmann et al, J. Immunol. 136: 2348, 1986; Street and Mosmann, FASEB J. 5: 171, 1991]을 생산한다. 이와 달리, Th2 세포는 IL-4, IL-13, IL-5, IL-9, IL-6 및 IL-10을 생산한다. 이러한 이펙터 분자는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 실시되는 방법에 따라서 본원에서 기술하는 임의의 코로나바이러스 항원으로 면역화된 피험체 또는 숙주로부터의 생물학적 샘플 중에서 용이하게 측정할 수 있다.
세포 매개성 면역(CMI) 반응은 면역반응이 (Th1 반응의 증가 또는 수반되는 Th1의 증가 및 Th2 반응의 감소로 인해) 우세한 Th2 반응으로부터 균형 상태의 또는 혼합 Th1 및 Th2 반응으로 또는 우세한 Th1 반응으로 이동했는지를 결정함을 포함한다. 마찬가지로, Th1 반응으로부터 균형 상태의 또는 혼합 Th1/Th2 반응 또는 증가된 또는 우세한 Th2 반응으로의 이동이 결정될 수 있다. 예를 들면, IFN-γ, IL-2 및 TNF-β과 같은 Th1 사이토킨 및 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13과 같은 2형 사이토킨의 수준은 ELISA, ELISPOT 및 유세포분석법(세포내 사이토킨을 측정하기 위해)를 포함하여 본원에서 기술하고 당해 분야에서 실시되는 방법으로 측정할 수 있다. 1형 반응은 Th1 면역의 지표인 세포독성 T 세포(CTL)과 같은 기타 CMI-관련 반응의 유도를 예측하게 해준다. 면역반응의 항원-특이적 유도 또는 자극으로부터 야기되는 면역 세포 증식 및 클론 확장은, 비장세포와 같은 림프구 또는 림프절로부터의 세포를 분리하고, 당해 세포를 항원으로 자극하고, 사이토킨 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존성을 삼중수소화 티미딘의 혼입 또는 비-방사능 검정(예: MTT 검정) 등에 의해 측정하여 측정할 수 있다.
본원에서 기술하는 면역자극성, 면역원성 및/또는 면역조절성 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 특이적 항-항원 면역반응을 유도할 수 있다. IgG, IgA, IgM 및/또는 IgE, 및 이들 부류의 동종형을 포함하는 면역글로불린의 임의의 부류를 포함할 수 있는 항원 특이적 항체의 생산을 야기하는 특이적 체액성 반응이 유도되거나, 유도되거나, 자극될 수 있다. 예를 들면, 혈청, 비강 세척제, 폐 세척액 및 점막 분비물(특히, IgA) 또는 기타 조직 중의 특이적 IgM, IgG 및 IgA의 존재를 본원에서 기술하고 당해 분야에 공지된 다양한 임의의 면역검정법으로 측정할 수 있으며, 이러한 면역검정법에는 ELISA, 면역블롯, 방사선면역검정법, 면역조직화학, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 오키테를로니(Ochterlony) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 면역검정에서 항원 또는 코로나바이러스 특이적 항체를 검출하기 위해, 생물학적 샘플을 정제, 분리, 부분 분리된 항원 또는 이의 단편과 상호작용 또는 접촉하게 하거나, 고정(예를 들면, 에탄올 또는 포름알데히드를 이용하여)되거나 고정되지 않을 수 있거나 비변성된 바이러스와 상호작용 또는 접촉하게 할 수 있다. 점막 분비물은 비인두 및 폐를 포함하는 호흡기도로부터 수거된 것을 포함한다. 미생물의 포식작용 또는 옵소닌화를 촉진하거나 바이러스와 같은 미생물의 숙주 세포내로의 진입, 융합 또는 증식을 예방하는 항원-특이적 항체의 능력과 같은 기능적 검정을 또한 수행할 수 있다.
약제학적 조성물은 적어도 하나(하나 이상)의 코로나바이러스 면역원 또는 이의 융합 단백질 이외에 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 비히클, 담체, 희석제 또는 부형제 및 임의로 기타 성분을 포함할 것이다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체는 S 단백질 면역원의 조성물 또는 이의 융합 단백질, 또는 2개 이상의 S 단백질 면역원 또는 이의 융합 단백질의 칵테일, 또는 S, N 및/또는 M 면역원 또는 이의 융합 단백질의 칵테일과 함께 사용하기에 적합하다. 치료용 약제학적으로 허용되는 담체는 약제 분야에 익히 공지되어 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R. Gennaro, ed., 18th Edition, 1990) and in CRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S. C. Smolinski, ed., 1992)]. 조성물은 또한 증점제, 완충제, 용매, 습윤제, 보존제, 킬레이트, 보조제 등 및 이들의 배합물을 또한 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 이러한 화합물 및 유기 또는 무기 산(산 부가염) 또는 유기 또는 무기 염기(염기 부가염)로부터 유도된 화합물의 염을 의미한다. 화합물은 유리 염기 또는 염 형태로 사용될 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 물 또는 포스페이트 완충 식염(PBS)과 같은 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서 희석제는 숙주에게 생리학적 최종 포스페이트 농도 및 최종 염화나트륨 농도를 전달하도록 제형화된 PBS이다. PBS는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 보다 바람직하게는약 0.5 mM 내지 약 40 mM, 보다 더욱 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 25 mM, 가장 바람직하게는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM 범위의 최종 염화나트륨 농도; 약 100 mM 내지 약 200 mM, 가장 바람직하게는 약 125 mM 내지 약 175 mM의 최종 염 농도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 최종 PBS농도는 약 5mM 포스페이트 및 약 150mM 염(예: NaCl)이다. 특정 양태에서, 상기한 임의의 약제학저 조성물은 본원에서 기술하는 바와 같고 바람직하게는 멸균된 코로나바이러스 항원의 칵테일 포함한다.
본원에서 기술하는 조성물은 당해 조성물을 무균 환경하에 제조하고/하거나 당해 분야에서 이용가능한 방법을 사용하여 당해 조성물을 최종적으로 멸균시킴으로써 멸균되게 할 수 있다. 많은 약제들은 멸균되도록 제조되며, 이러한 기준은 USP XXII <1211>에 정의되어 있다. 당해 양태에서 멸균은 가스 멸균, 이온화 방사선 또는 여과를 포함하여 산업에서 채택되고 USP XXII <1211>에 기재되어 있는 수많은 수단에 의해 달성될 수 있다. 멸균은 USP XXII <1211>에 또한 정의되어 있는 소위 무균 공정에 의해 유지될 수 있다. 가스 멸균용으로 사용되는 허용되는 가스는 에틸렌 옥사이드를 포함한다. 이온화 방사선 방법용으로 사용되는 허용되는 방사선 유형은 감마, 예를 들면, 코발트 60 선원 및 전자 빔을 포함한다. 감마 방사선의 전형적 선량은 2.5 MRad이다. 경우에 따라, 적합한 기공 크기, 예를 들면 0.22㎛를 갖고 적합한 물질, 예를 들면, TeflonR로 이루어진 필터를 사용하여 여과할 수 있다. "USP"란 용어는 미국 약전(Rockville, MD)을 의미한다.
본원에서는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하고 체액성 반응(예를 들면, 점막 IgA, 전신의 IgA, IgG 또는 IgM 반응을 포함) 및/또는 세포 매개성 면역반응인 보호성 면역반응을 유도하는 에피토프를 갖는 적어도 하나의 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하여, 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 기술된다. 당해 S 단백질 면역원 조성물은 투여된 S 단백질 면역원 또는 면역원들 또는 이의 변이체에 특이적인 면여반응을 유도하기에 충분한 용량으로 투여된다. 특정 양태에서, 예방 또는 치료될 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스, SARS 그룹 코로나바이러스 또는 이들의 배합물에 의해 유발될 수 있다.
다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응(체액성 반응(예를 들면, 점막 IgA, 전신의 IgA, IgG 또는 IgM 반응) 및/또는 세포 매개성 면역반응)을 유도하는 에피토프를 갖는 적어도 하나의 코로나바이러스 N 단백질 면역원 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함한다. 당해 N 단백질 면역원 조성물은 투여된 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체에 특이적인 면여반응을 유도하기에 충분한 용량으로 투여된다. 특정 양태에서, 예방 또는 치료될 감염은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 또는 이들의 배합물에 의해 유발될 수 있다.
또 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법은 다수의 코로나바이러스 항원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함한다. 다수의 코로나바이러스 항원은 각각이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 , 서열번호 24 및 서열번호 26으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 2개의 S 단백질 면역원을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 다수의 코로나바이러스 항원은 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 2개의 N 단백질 면역원을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법은 적어도 본원에서 기술하는 하나의 S 단백질 면역원과 본원에서 기술하는 적어도 하나의 N 단백질 면역원을 포함하는 다수의 코로나바이러스 단백질 면역원을 포함한다. 다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법은 S 단백질 면역원, N 단백질 면역원, 코로나바이러스 M 단백질 면역원, 코로나바이러스 E 단백질 면역원로부터 선택될 수 있고 이들의 임의의 배합물을 포함하는 다수의 코로나바이러스 단백질 면역원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 면역원의 각각의 면역원은 체액성 반응(예를 들면, 중화 항체의 유도) 및/또는 세포 매개성 면역반응과 같은 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 에피토프를 갖고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합된다. SARS 코로나바이러스 M 단백질 면역원은 GenBank 수탁번호 AY702026에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 GenBank 수탁번호 AAU07933에 제공된 바와 가은 아미노산 서열을 가질 수 있다. M 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 당해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 전체 SARS 코로나바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 제공하는 공개적으로 이용가능한 데이타베이스에서 수많은 등록번호로 찾아볼 수 있다. 코로나바이러스 S 단백질 및 코로나바이러스 N 단백질의 부가적 아미노산 서열 및 이들 암호화된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열도 마찬가지로 공개적으로 이용가능한 데이타베이스에 제공된 SARS 코로나바이러스 게놈 서열에서 찾아볼 수 있다. 특정 양태에서, 면역원 조성물은 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스, SARS 그룹 코로나바이러스 또는 이들의 배합물에 대해 특이적일 수 있다.
코로나바이러스 면역원 조성물 또는 제형을 이용한 치료에 적합한 피험체 또는 숙주는 질환 발생의 위험에 대한 익히 확립된 지표 또는 존재하는 질환의 익히 확립된 특질로 확인할 수 있다. 예를 들면, 감염의 지표는 발열, 건성 기침, 호흡곤란(숨가쁨), 두통, 저산소혈증(낮은 혈중 산소 농도), 림프구감소증(감소된 림프구 수), 경미하게 상승된 아미노트랜스퍼라제 수준(간 손상을 나타냄), 미생물 양성 배양물, 염증 등을 포함한다. 본원에서 기술하는 코로나바이러스 면역원 백신으로 치료될 수 있는 감염은 감염이 1차, 2차 또는 기회 감염인지에 관계없이 코로나바이러스에 의해 또는 코로나바이러스 때문에 유발된 감염을 포함한다. 코로나바이러스의 예에는 SARS 코로나바이러스를 포함하여 임의의 아유형, 균주, 이들 바이러스의 항원성 변이체가 포함된다. 예를 들면, SARS 감염은 고열, 근육통, 건성(dry) 및 비-습성(non-productive) 호흡곤란, 림프구감소증 및 흉부 방사선사진 상의 침윤을 포함하는 감기 유사 증상을 특징으로 한다. 2002년 내지 2003년의 SARS 유행 동안의 사망율은 약 10%였지만, 노년층에서는 50% 정도로 높았다[참조: Stadler et al., Nat. Rev. 1:209, 2003].
본 발명의 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 포함하는 약제학적 조성물은 당해 조성물이 사람 또는 비-사람 동물과 같은 피험체에게 투여될 수 있도록 하는 어떠한 형태로도 존재할 수 있다. 예를 들면, S 또는 N 단백질 면역원, 융합 단백질, 및/또는 다가 조성물은 지질 용액으로서 제조하고 투여할 수 있거나, 고체 형태로 투여할 수 있거나 투여와 동시에 용액에 재현탁시킬 수 있는 고체 형태(예: lyophilized)로 제조할 수 있다. 하이브리드 폴리펩타이드 조성물은 당해 조성물에 함유된 활성 성분들이 피험체 또는 환자에게 조성물의 투여시 생체이용성이 되거나 서방출을 통해 생체이용성이 되도록 제조하거나 제형화된다. 피험체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여량 단위의 형태를 취할 수 있으며, 예를 들면, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 하나 이상의 본 발명의 화합물 하나 이상의 용기는 다수의 투여량 단위를 보유할 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 본 발명의 코로나바이러스 면역원 또는 면역원들의 칵테일을 포함하는 상기한 임의의 약제학적(치료학적) 조성물은 용기, 바람직하게는 멸균 용기내에 있다.
하나의 양태에서, 치료학적(약제학적) 조성물은 비강 투여되며, 여기서, 코로나바이러스 면역원 또는 칵테일 조성물은 비강-관련 림프조직에 위치하는 세포와 같은 세포에 의해 흡수될 수 있다. 다른 전형적 투여 경로에는, 제한됨이 없이, 장내, 비경구, 경피/경점막, 비강 및 흡입 투여가 포함된다. 본원에서 사용되는 "장내"란 용어는 면역원성 조성물이 경구, 직장 및 설하를 포함하는 위장관 또는 경구 점막을 통해서 흡수되는 투여 경로이다. 본원에서 사용되는 "비경구"란 용어는 동맥내, 피내, 근육내, 비강내, 안구내, 복강내, 정맥내, 피하, 점막하 및 질내 주사 또는 주입 기술을 포함하는, 위장관을 우회하는 투여 경로를 말한다. 본원에서 사용되는 "경피/경점막"이란 용어는 국소 투여를 포함하는, 면역원성 조성물이 피부를 통해 또는 피부에 의해 투여되는 투여 경로이다. "비강" 및 "흡입"은 폐내 또는 경폐 투여를 포함하는, 면역원성 조성물이 세(細)기관지내로 도입되는 투여 기술을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 비강 투여된다.
또 다른 양태에서, 코로나바이러스 항원에 특이적으로 결합하고 바이러스의 중화를 촉진하고(즉, 바이러스 감염성을 감소 또는 제거하고), 불활성화를 촉진하고, 바이러스 조립을 방지 또는 억제하고/하거나 핵산 복제, 전사 또는 해독을 억제하는 항체를 투여하여 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 코로나바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에서 기술하고 당해 분야에서 실시되는 수많은 방법 중 어느 하나로 생산하고 제조할 수 있다.
하나의 양태에서, 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 다수의(2개 이상)의 분리된 항체는 바람직하게는 체액성 반응을 포함하는 보호성 면역반응을 유도하는 에피토프를 갖는 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질 면역원(예를 들면, S 단백질 면역원, N 단백질 면역원 및/또는 M 단백질 면역원)을 함유하는 조성물을 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질 면역원에 대해 특이적인 항체를 유도하기에 충분한 용량으로 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스의 예방 방법인 방법에 의해 생산된다. 혈청, 림프, 비인두 세척액, 혈액, 복수, 폐 세척액 또는 기타 체액과 같은 생물학적 샘플은 숙주로부터 수득할 수 있으며, 코로나바이러스 단백질은 친화성 정제 방법과 같은 당해 분야의 숙련가에 의해 실시되는 방버에 따라 분리할 수 있다. 예를 들면, 코로나바이러스 단백질에 대해 특이적인 항체는 생물학적 샘플을 코로나바이러스 단백질 또는 이의 단편의 공급원과 접촉시킴으로써 당해 생물학적 샘플의 다른 항체 및 성분으로부터 제거하거나 분리할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혈청을 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질 면역원으로 면역화시킨 숙주로부터 수득하고 IgA 또는 IgG와 같은 특정 면역글로불린 부류를 증대시킬 수 있다. 이러한 면역 혈청의 제조방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 면역 혈청은 바람직하게는 당해 혈청이 투여되는 종과 동일한 숙주 종으로부터 분리시킨다. 특정 양태에서, 항체를 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스, SARS 그룹 코로나바이러스 또는 이들의 배합물 중 적어도 하나로 면역화시킨 피험체로부터 수득하여, 숙주로부터 분리된 항체 또는 수득된 혈청이 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 또는 SARS 그룹 코로나바이러스에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함하도록 할 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 적어도 하나의 코로나바이러스 그룹으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 함유할 수 있다.
다른 양태에서, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법은 본원에서 기술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 및 다수의 항체를 포함하는 조성물을 피험체에게 투여함을 포함한다. 또한, 코로나바이러스 감염을 획득하거나 이의 발생 위험에 쳐한 피험체는 코로나바이러스 단백질 면역원(제1 코로나바이러스 S 단백질 면역원 또는 제1 코로나바이러스 N 단백질 면역원)과 상이한 적어도 하나의 코로나바이러스 단백질 면역원(예를 들면, 제2 코로나바이러스 S 단백질 면역원 또는 제2 코로나바이러스 N 단백질 면역원 또는 제2 코로나바이러스 S 단백질 면역원 및 제2 코로나바이러스 N 단백질 면역원)을 포함하는 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 제1 코로나바이러스 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 가질 수 있다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 제1 또는 제2 면역원 또는 제3 S 단백질 면역원 등일 수 있는 코로나바이러스 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 , 서열번호 24 및 서열번호 26로부터 선택될 수 있는 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 기술하는 바와 같이, 제1 또는 제2 면역원 또는 제3 N 단백질 면역원 등일 수 있는 코로나바이러스 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38로부터 선택될 수 있는 아미노산 서열과 동일하거나 적어도 80%(85%, 90%, 또는 95% 또는 80% 내지 100% 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 코로나바이러스 M 단백질 면역원 또는 코로나바이러스 E 단백질 면역원, 또는 이들의 배합물을 투여하여 면역반응을 유도할 수 있으며, 이때 S 단백질 면역원 또는 N 단백질 면역원을 포함하는 상이한 면역원 각각은 체액성 반응 또는 세포 매개성 면역반응과 같은 보호성 면역반응을 유도하는 적어도 하나의 에피토프를 갖는다. 이러한 조성물은 본원에서 기술하는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 기술하는 바와 같이, 적어도 하나의 코로나바이러스 항원에 대해 특이적인 항체는 수동적으로 제공될 수 있는 반면에, 피험체는 백신 접종되어 하나 이상의 상이한 코로나바이러스 면역원에 특이적인 항체를 능동적으로 유도한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 면역원에 특이적인 항체는 수동적으로 제공될 수 있는 반면, 피험체는 하나 이상의 동일한 코로나바이러스 항원 뿐만 아니라 하나 이상의 상이한 코로나바이러스 항원으로 백신 접종되어 하나 이상의 코로나바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 능동적으로 유도한다.
다른 양태에서, 본원에서 기술하는 코로나바이러스 단백질 면역원 및 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. S 단백질 면역원 및 N 단백질 면역원 또는 이들 면역원의 변이체 및 단편과 같은 코로나바이러스 단백질 항원(면역원)을 사용하여 S 또는 N 단백질 면역원 및 이의 변이체상에 존재하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적인 항체를 유도한다. 바람직한 양태에서, 항체는 코로나바이러스 S 또는 N 단백질상에 존재하는 특이적 보호성 에피토프에 결합한다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항-이디오타입 항체 및 이의 항원-결합 단편, 예를 들면, F(ab')2, Fab', Fd, Fv 및 Fab 단편, 재조합에 의해 또는 합성에 의해 제조된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 항체는 모노클로날 항체가 특이적으로 결합하도록 하는 가변 영역을 포함하며, 이는 항체가 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3, 또는 SARS 그룹 코로나바이러스로부터의 코로나바이러스 S 또는 N 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 선택적으로 결합할 수 있음을 의미한다. "에 특이적인", "면역특이적" 또는 "특이적으로 결합하는"은 그룹 1, 2, 3, 또는 SARS 코로나바이러스로부터의 코로나바이러스 S 또는 N 단백질 또는 그룹 1, 2, 3, 또는 SARS 코로나바이러스로부터의 합성된 코로나바이러스 S 또는 N 단백질의 면역원을 암호화하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 특이적으로(선택적으로) 결합하는 단백질(예: 항체)의 능력을 의미한다. 또 다른 양태에서, 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 설치류 모노클로날 항체(본원에서 기술하고 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조됨)는 본원에서 기술하고 당해 분야에 공지된 과정에 따라서 사람화되거나 완전히 사람일 수 있다.
특이적 항원에 대한 항체의 "연합" 또는 "결합"에는 일반적으로 정전기적 상호작용, 수소결합, 반데르발스 상호작용 및 소수성 상호작용이 관여한다. 이들 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 배합은 항체와 이의 항원 간의 결합에 관여할 수 있다. 이러한 항체는 일반적으로 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107 또는 적어도 108의 친화 상수(Ka)로 항원과 결합한다. 친화 상수는 널리 공지된 기술을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해[참조; Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, 1949] 및 표면 플라스몬 공명(SPR; BIAcoreTM, Biosensor, Piscataway, NJ; 참조: Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565 (1993))에 의해 및 측정될 수 있다. 또한, 코로나바이러스 단백질 면역원에 대한 항체의 결합 특성은 일반적으로, 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 수행될 수 있는 효소 연계 면역흡착 검정(ELISA), 면역침전, 면역블롯팅, 역류 면역전기영동, 방사선면역검정, 돗트 블롯 검정, 억제 또는 경쟁 검정 등을 포함하는 면역검출 방법[참조: 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]을 사용하여 측정 및 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 "항체"란 용어는 천연 발생 항체 뿐만 아니라 비-천연 발생 항체를 포함하여, 예를 들면, 일본쇄 항체, 키메릭, 이작용성 및 사람화 항체 뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 비-천연 발생 항체는 고체상 펩타이드 합성법을 사용하여 작제할 수 있으며, 재조합적으로 생산할 수 있거나, 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 이루어진 조합적 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다[참조: Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]. 예를 들면, 키메릭, 사람화, CDR-이식된(grafted), 일본쇄 및 이작용성 항체의 이러한 및 기타 제조방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조; Winter and Harris, Immunol. Today 14:243, 1993; Ward et al., Nature 341 :544, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed., Oxford Univ. Press, 1995; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press, 1992].
폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스, 햄스터 또는 랫트를 포함하는 각종 온혈동물로부터 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 간략하게 언급하면, 목적하는 S 단백질 면역원 또는 이의 변이체 또는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체, 또는 코로나바이러스 항원 또는 이의 변이체의 혼합물을 비경구, 복강내, 근육내, 안내 또는 피하 주사를 통해 또는 비강 투여하여 동물을 면역화시킨다. 관심대상의 폴리펩타이드의 면역원성은 프로테오좀, 프로톨린, 백반, Ribi 보조제 및 프로인트 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통해서 증가시킬 수 있다. 일단 동물의 혈청 중의 특이적 항체의 역가가 S 또는 N 단백질 면역원 또는 이의 변이체에 대한 반응성과 관련해 편평기(plateau)에 도달하면, 동물을 주기적, 예를 들면, 매주 채혈하거나 또는 실혈시켜 보다 많은 양의 폴리클로날 면역 혈청을 용이하게 수득할 수 있다. 이어서, 폴리클로날 항체를 적합한 고체 지지체에 고정된 단백질 A 또는 단백질 G를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다[참조: Coligan, supra, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al., Purification of 면역글로불린 G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The 사람a Press, Inc. (1992)]. 대안으로서, 항혈청이 특이적으로 결합하는 코로나바이러스 단백질 항원(면역원) 또는 특정 면역화된 동물의 Ig 불변 영역에 특이적인 항체를 적합한 고체 지지체에 고정화시키는 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
또한, 코로나바이러스 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 목적하는 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 불멸 진핵 세포주의 실례인 하이브리도마를 문헌[참조: Kohl er and Milstein, Nature, 256:495- 497; 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1975)]의 기술 및 이를 개선시킨 기술[참조: Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1 :2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); 미국 특허 제4,902,614호, 제4,543,439호 및 제4,411,993호; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett et al. (eds.) (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Brand et al., Planta Med. 70:986-92 (2004)]을 사용하여 제조할 수 있다. 동물, 예를 들면, 랫트, 햄스터 또는 바람직하게는 마우스를 본원에서 기술한 바와 같은 면역원으로 면역화시킨다. 특이적 항체 생산의 존재는, 초기 주사(주사는 폴리클로날 항체의 제조를 위한 본원에서 기술하고 당해 분야에 공지된 수가지 경로 중 어느 하나에 의해 투여할 수 있다) 후 및/또는 부스터 주사 후에 혈청 샘플을 수득하고 당해 분야에 공지되어 있고 본원에서 기술하는 수가지 면역검출 방법 중 어느 하나를 사용하여 코로나바이러스 면역원에 결합하는 항체의 존재를 검출함으써 모니터할 수 있다. 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 동물로부터, 림프계 세포, 가장 통상적으로 비장 또는 림프절로부터의 세포를 제거하여 항체-형성 세포인 림프계 세포인 B-림프구를 수득한 다음, 약물-민감화된 골수종(형질세포종) 세포 융합 파트너와의 융합에 의해 불멸화시킬 수 있다(예를 들면, 내인성 Ig 유전자 산물 발현 불능, 예를 들면, P3X63 - Ag 8.653(ATCC 번호 CRL 1580); NSO, SP20). 수득된 하이브리도마 세포를 모노클로날 항체 분야에 널리 공지된 방법에 따라서 배양하고 분리하여 분석할 수 있다. 하이브리도마를 (예를 들면, 제한 희석 클로닝 또는 연질 아가 플라크 분리에 의해) 클로닝하고, 항원에 특이적인 항체를 생산하는 양성 클론을 선별하고 배양한다. 코로나바이러스 면역원에 대한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 쥐 모노클로날 항체의 대안적 제조방법은 동계 마우스, 예를 들면, 모노클로날 항체를 함유하는 복수액의 형성을 촉진하도록 처리된(예를 들면, 프리스탄-초회감작된) 마우스의 복강내로 하이브리도마 세포를 주사하는 것이다. 크로마토그래피(예: 크기 배제, 이온 교환), 겔 여과, 침전, 추출 등[참조: Coligan, supra, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)]과 같은 통상의 기술을 사용하여 배합물을 제거할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체의 특정한 특성(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 동종형, 결합 특이성 등)에 기반하에 선택된 적절한 리간드를 사용한 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제할 수 있다. 고체 지지체에 고정된 적합한 리간드의 예로는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역(경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입 항체, 특이적 코로나바이러스 면역원 또는 이의 유도체가 포함된다.
항-코로나바이러스 단백질 항체는 사람 모노클로날 항체일 수 있다. 사람 모노클로날 항체는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 임의의 수의 기술로 제조할 수 있다. 이러한 방법으로는 사람 말초혈 세포(예를 들면, B 림프구를 포함)의 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 형질전환, 사람 B 세포의 시험관내 면역화, 삽입된 사람 면역글로불린 유전자를 보유한 유전자전이된(transgenic) 마우스로부터의 비장세포의 융합, 사람 면여글로불린 V 영역 파아지 라이브러리로부터의 분리 또는 당해 분야에 공지되어 있고 본원의 개시내용에 기초하는 다른 과정이 포함된다. 유전자전이된 마우스로부터 사람 항체를 수득하는 방법은 예를 들면, 문헌[참조: Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994); Lonberg et al., Nature 368:856 (1994); Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994); 미국 특허 제 5,877,397호; Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997); Jakobovits et al, Ann. N Y. Acαd. Sd. 764:525-35 (1995)]에 기술되어 있다. 사람 모노클로날 항체는 이후에 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 유전자전이된 마우스를 면역화시켜 수득할 수 있다. 면역화된 유전자전이된 마우스의 림프계 세포를 사용하여 본원에서 기술하는 방법에 따라서 사람 항체-분비 하이브리도마를 제조할 수 있다. 사람 항체를 함유하는 폴리클로날 항체도 또한 면역화된 동물의 혈액으로부터 수득할 수 있다.
코로나바이러스 단백질 특이적 모노클로날 항체의 제조방법은 사람 말초혈 세포를 EBV 형질전환[참조: 미국 특허 제4,464,456호]에 의해 면역화시킴을 포함한다. 항-코로나바이러스 단백질 항체를 생산하는 림프모구 세포주의 안정성은 형질전환된 세포주를 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 쥐 골수종과 융합하여 마우스-사람 하이브리드 세포주를 생산함으로써 개선시킬 수 있다[참조: Glasky et al., Hybrodoma 8:377-89 (1989)]. 특정 양태에서, 항-코로나바이러스 단백질 항체를 생산하는 B 세포를 선별하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 당해 분야에 공지된 분자생물 기술에 따라서 B 세포로부터 클로닝한다[참조: WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052호; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:7843-48 (1996)].
사람화 항체를 포함하는 코로나바이러스 단백질에 특이적인 키메릭 항체를 또한 제조할 수 있다. 키메릭 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유래된 적어도 하나의 불변 영역 도메인과 제2의 다른 포유동물 종으로부터 유래된 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 갖는다[참조; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-55 (1984)]. 하나의 양태에서, 키메릭 항체는 랫트 또는 햄스터 모노클로날 항체로부터의 가변 영역과 같은 비-사람 모노클로날 항체로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 사람 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터내로 클로닝하여 작제될 수 있다[참조: Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Walls et al., Nucleic Acids Res. 21 :2921-29 (1993)].
비-사람/사람 키메릭 항체를 추가로 유전자 조작하여 "사람화" 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 사람화 항체는 비-사람 포유동물 종으로부터 유래된 다수의 CDR, 하나 이상의 사람 가변 주쇄(framework) 영역 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 사람화는 특정 양태에서 예를 들면, 상기한 바와 같은 코로나바이러스 단백질 결합 가변 영역이 수득되어지는 비-사람 모노클로날 항체 또는 이러한 V 영역과 적어도 하나의 사람 C 영역을 갖는 키메릭 항체와 비교하여 감소된, 특이적 코로나바이러스 단백질에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 제공할 수 있다. 따라서, 사람화 항체를 고안하는데 유용한 전략은, 예를 들면, 예시로서 제한된이 없이, 키메릭 항체의 비-사람 주쇄 영역에 가장 상동인 사람 가변 주쇄 영역의 동정을 포함한다. 이론으로 제한됨이 없이, 이러한 전략은 사람화 항체가 코로나바이러스 단백질에 대한 특이적 결합 친화성을 보유할 가능성을 증가시킬 수 있으며, 이러한 친화성은 일부 바람직한 양태에서 코로나바이러스 단백질에 대한 실질적으로 동일한 친화성일 수 있고 특정한 다른 양태에서 코로나바이러스 단백질에 대한 보다 큰 친화성일 수 있다[참조: Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988)].
따라서, 이러한 사람화 항체의 고안은 컴퓨터 모델링에 의해 비-사람 가변 영역의 CDR 루프 입체형태 및 구조적 결정인자를 결정한 다음, CDR 루프 및 결정인자를 공지된 사람 CDR 루프 구조 및 결정인자와 비교함을 포함할 수 있다[참조: Padlan et al., FASEB 9:133-39 (1995); Chothia et al., Nature, 342:377-383 (1989)]. 컴퓨터 모델링은 또한 비-사람 가변 영역과의 서열 상동성으로 선별된 사람 구조 주형을 비교하는데 사용할 수 있다[참조: Bajorath et al., Ther. Immunol. 2:95-103 (1995); EP-0578515-A3]. 비-사람 CDR을 사람화시킨 결과 결합 친화성이 감소된다면, 컴퓨터 모델링은 부위-지시된 돌연변이유발 또는 다른 돌연변이유발 기술에 의해 변화되어 부분적으로, 완전히 또는 가장 최적으로(즉, 비-사람화 항체의 수준보다 더 큰 수준으로 증가시킴) 친화성을 회복시킬 수 있는 특이적 아미노산 잔기를 동정하는 것을 보조할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 기술에 친숙하며 상기 고안 전략에 대한 수많은 변경 및 변형을 용이하게 인지할 것이다.
사람화 항체의 다른 제조방법은 베니어링(veneering)이라 불린다. 주쇄(FR) 잔기의 베니어링은 실질적으로 모든 천연 FR 폴리펩타이드 폴딩 구조를 보유하는 항원-결합 부위를 포함하는 이종(xenogeneic) 분자를 제공하기 위해 예를 들면, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기를 사람 FR 잔기로 선택적 치환시킴을 의미한다. 베니어링 기술은 항원-결합 부위의 리간드 결합 특성이 항원-결합 표면내의 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 성질에 의해 주로 결정된다는 이해에 근거한다[참조: Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, (1990)]. 따라서, 항원 결합 특이성은 CDR 구조, CDR 서로의 상호작용 및 V 영역 도메인의 나머지와 이의 상호작용이 주의 깊게 유지되는 경우에 사람화 항체에서 보존될 수 있다. 베니어링 기술을 사용함으로써, 면역계와 쉽게 만나게되는 외부(예를 들면, 용매-접근성) FR 잔기를 사람 잔기로 선택적으로 치환시켜, 약한 면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성 베니어링된 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 제공한다. 베니어링 과정은 카벳(Kabat) 등에 의해 문헌[참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987)]에 종합된 사람 항체 가변 도메인에 대한 이용가능한 서열 데이타, 갱신된 카벳 데이타베이스 및 기타 접근가능한 미국 및 외국의 데이타베이스(핵산 및 단백질 둘다)을 사용한다.
특정한 용도로, 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 예를 들면, 통상의 방법에 따라서 전체 항체를 펩신 또는 파파인 분해시키는 것과 같이 항체를 단백질분해성 가수분해시켜 수득할 수 있다. 예시로서, 항체를 펩신을 이용하여 효소적 절단하여 항체 단편을 생산하여 F(ab')2로 지정된 단편을 제공할 수 있다. 상기 단편을 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단하여 Fab' 일가 단편을 생산할 수 있다. 임의로, 절단 반응은 디설파이드 연결의 절단으로부터 수득되는 설피드릴 그룹에 대한 차단 그룹을 사용하여 실시할 수 있다. 대안으로서, 파파인을 사용하여 항체를 효소적 절단하여 2개의 일가 Fab 단편 및 Fc 단편을 생산한다[참조: 미국 특허 제4,331,647; Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston (1986)].
항체 단편은 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성한다는 점에서 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작된 단백질일 수도 있다. 예를 들면, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 이루어진 분리된 단편, 중쇄와 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 Fv 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결된 재조합 일본쇄 폴리펩타이드 분자(scFv 단백질) 및 초가변 영역을 모사하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 본원에서 기술하는 항체는 바람직하게는 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 포함한다.
최소 인식 단위는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 단편이다. 이러한 CDR 펩타이드는 관심대상의 항체의 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 작제하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, 당해 분야의 숙련가에 의해 실시되는 방법에 따라서 항체 생산 세포의 mRNA를 주형으로서 사용하여 가변 영역을 합성한다[참조: Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]. 대안으로서, 이러한 CDR 펩타이드 및 기타 항체 단편은 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
특정 양태에 따라서, 본원에서 기술하는 임의의 면역글로불린 분자의 비-사람, 사람, 또는 사람화 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 scFv 폴리펩타이드 단편(일본쇄 항체)로서 작제할 수 있다[참조: Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85:5879-5883 (1988)]으로서 작제될 수 있다. 다작용성 scFv 융합 단백질은 scFv 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 임의의 각종 공지된 이펙터 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열과 프레임내에서 연결시켜 제조할 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들면, EP-B1-0318554, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제 5,091,513호 및 미국 특허 제5,476,786호에 개시되어 있다. 예를 들면, 이펙터 단백질은 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함할 수 있다[참조: Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Methods 188:1-7]. 이펙터 단백질의 다른 예는 효소이다. 비제한적 예로서, 이러한 효소는 치료학적 목적을 위한 생물학적 활성을 제공할 수 있거나[참조: Siemers et al., Bioconjug. Chem. 8:510-19 (1997)] 진단학적 사용을 위한 검출가능한 활성, 예를 들면, 널리 공지된 임의의 기질의 검출가능한 생성물로의 서양고추냉이 퍼옥시다제-촉매된 전환을 제공할 수 있다.
항체는 또한 사람 면역글로불린 파아지 라이브러리, 토끼 면역글로불린 파아지 라이브러리 및/또는 닭 면역글로불린 파아지 라이브러리로부터 동정되고 분리될 수 있다[참조: Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., Adv. Immunol. 57:191-280 (1994); 미국 특허 제 5,223,409; Huse et al., Science 246:1275-81 (1989); Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997) and references cited therein; Rader et al., J. Biol. Chem. 275:13668-76 (2000); Popkov et al., J. MoI. Biol 325:325-35 (2003); Andris-Widhopf et al., J. Immunol. Methods 242: 159-31 (2000)]. 비-사람 종 또는 비-사람 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체는 본원에서 기술하고 당해 분야에 공지된 항체 또는 이의 단편을 "사람화"하는 방법에 따라서 유전자 조작할 수 있다. 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합적 라이브러리를 파지 벡터내에서 생성시키고, 이 라이브러리를 스크리닝하여 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 Ig 단편(Fab, Fv, scFv 또는 이들의 다량체)을 선별할 수 있다[참조: 미국 특허 제 5,223,409; Huse et al., Science 246:1275-81 (1989); Sastry et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:4363-66 (1991); Hoogenboom et al., J Molec. Biol. 227:381-388 (1992); Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997) 및 상기 문헌들에 인용된 참조문헌; 미국 특허 제6,703,015호].
특정 양태에 따라서, 면역글로불린 Fab 단편은 또한 파아지 입자상에 디스플레이(display)될 수 있다[참조: 미국 특허 제 5,698,426]. 또한, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브리를 예를 들면, λImmunoZapTM(H) 및 λImmunoZapTM(L) 벡터(제조원: Stratagene, La Jolla, California)를 사용하여 람다 파아지에서 제조할 수 있다[참조: Huse et al., supra; Sastry et al., supra]. 또한, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 코로나바이러스 단백질에 결합하는 Ig 단편 또는 일본쇄 항체를 선별할 수 있다. 이러한 항체 단편 또는 관련 펩타이드를 암호화하는 후보 핵산 분자(예: DNA)가 삽입되어질 수 있는 다중클로닝 부위를 갖는 적합한 벡터의 예는 다음 문헌을 참조한다[참조: McLafferty et al., Gene 128:29-36, (1993); Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Smith et al., Meth. Enzymol 217:228-257 (1993); Fisch et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 93:7761-66 (1996)].
특정한 다른 양태에서, 코로나바이러스 단백질-특이적 항체는 다량체성 항체 단편이다. 유용한 방법은 예를 들면, 문헌[참조; Hayden et al., Curr Opin. Immunol. 9:201-12 (1997); Coloma et al., Nat. Biotechnol. 15:159-63 (1997)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 다량체성 항체 단편은 미니항체(miniantibody)[참조: 미국 특허 제 5,910 573] 또는 디아바디(diabody)[참조: Holliger et al., Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130 (1997)]를 형성시키는 파아지 기술로 생성시킬 수 있다. 코로나바이러스 단백질-특이적 Fv의 다량체이거나, 상이한 항원 특이성을 갖는 제2 Fv와 비공유 결합된 코로나바이러스 단백질-특이적 Fv를 포함하는 이특이적 항체인 다량체 단편을 생성시킬 수 있다[참조: Koelemij et al., J. Immunother. 22:514-24 (1999)].
아미노산 돌연변이를 코로나바이러스 단백질-결합 면역글로불린 분자내로 도입시키는 것은 코로나바이러스 단백질의 특이성 또는 친화성을 증가시키거나 이펙터 기능을 변경하는데 유용할 수 있다. 코로나바이러스 단백질에 대한 높은 친화성을 갖는 면역글로불린을 특정 잔기의 부위-지시된 돌연변이유발을 이용하여 생성시킬 수 있다. 컴퓨터 보조된 3차원 분자 모델링을 이용하여, 코로나바이러스 단백질에 대한 친화성을 향상시키기 위해 변경될 아미노산 잔기를 동정할 수 있다[참조: Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1-142 (1992)]. 대안으로서, CDR의 조합적 라이브러리를 M13 파아지에서 생성시키고 향상된 친화성을 갖는 면역글로불린 단편에 대해 스크리닝할 수 있다[참조: Glaser et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 91:3809-13 (1994); 미국 특허 제5,792,456호].
특정 양태에서, 항체는 변경된 이펙터 기능을 갖도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들면, 항체는 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력이 변경될 수 있다. 이펙터 기능은 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다[참조: Duncan et al., Nature 332:563-64 (1988); Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995); Eghtedarzedeh-Kondri et al., Bio기술 23:830-34 (1997)]. 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 부분상의 글리코실화 부위를 돌연변이시켜 보체를 고정시키는 면역글로불린의 능력을 변경시킬 수 있다[참조: Wright et al., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)]. 불변 영역 도메인에서의 기타 돌연변이에 의해, 보체를 고정시키거나 ADCC를 야기하는 면역글로불린의 능력을 변경시킬 수 있다[참조: Duncan et al., Nature 332:563-64(1988); Morgan et al., Immunology 86:319-24 (1995); Sensel et al., MoI. Immunol. 34: 1019-29 (1997)]. 대안으로서, A2E 결합 단편, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드, 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드 및 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하는 일본쇄 폴리펩타이드를 재조합적으로 작제할 수 있다[참조: 미국 특허 공보 제2003/01 18592호; 제2003/0133939호].
본원에서 기술한 바와 같은 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 널리 공지된 임의의 각종 핵산 절단, 연결, 형질전환 및 형질감염 방법에 따라서 증식되고 발현될 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 에스케리키아 콜라이와 같은 진핵성 숙주 세포에서의 항체 단편의 발현이 바람직할 수 있다[참조: Pluckthun et al., Methods Enzymol. 178:497-515 (1989)]. 특정한 다른 양태에서는 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)); 동물 세포(포유동물 세포 포함); 또는 식물 세포에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현이 바람직할 수 있다. 적합한 동물 세포의 예는 골수종, COS, CHO 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
특정 양태에서, 코로나바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 항원-결합 단편)를 인식하는 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항-이디오타입 항체의 사용방법이 제공된다. 항-이디오타입 항체 또는 이의 단편은 임의의 상기한 재조합 유전자 조작 방법 또는 파아지 디스플레이 선별에 의해 생성될 수도 있다. 항-이디오타입 항체는 항-코로나바이러스 단백질 항체의 항원-결합 부위와 반응하여, 코로나바이러스 단백질에 대한 당해 항체의 결합이 완전히 억제될 수 있다. 대안으로서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체는 코로나바이러스 단백질에 대한 항-코로나바이러스 단백질 항체의 결합을 완전히 억제하지 않을 수 있다. 항-이디오타입 항체는 생물학적 샘플 중의 항-코로나바이러스 단백질 항체의 존재를 결정하기 위한 면역검정에서 유용하다. 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에 의해 실시되는 ELISA와 같은 면역검정을 사용하여, 본원에서 기술한 바와 같은 코로나바이러스 단백질을 숙주에게 투여(즉, 면역화)함에 의해 유도된 면역반응의 존재를 결정할 수 있다.
본 출원에서 언급되고/되거나 출원 데이타 쉬트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 공보, 미국 특허원, 외국 특허, 외국 특허원 및 비-특허 공보는 이들의 전문이 본원에서 참조로 인용된다.
하기 실시예는 예시로서 제공되며 제한하기 위함이 아니다.
실시예 1
프로테오좀의 제조
본 발명의 면역원은 비공유 상호작용에 의해 프로테오좀과 배합, 혼합 또는 제형화되어 면역화된 사람 또는 동물 피험체에서 보호성 반응을 유도할 수 있는 백신 조성물을 형성할 수 있다. 본 발명의 프로테오좀은 예를 들면, 그룹 B 2형 나이세리아 메닝기티디스로부터 정제된 점막 보조제 전달 비히클이다. 백신 조성물(또는 제제)을 위한 프로테오좀의 사용은 로웰(Lowell, G. H.)에 의해 문헌[참조: "New Generation Vaccines 2" ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong (1997) pages 193-206]에서 검토된 바 있다. 본 발명의 프로테오좀은 페놀-치사된 세균 페이스트를 1M 염화칼슘 중의 6% EmpigenR BB(EBB)(제조원: Albright and Wilson, Whithaven, UK)로 추출한 다음, 에탄올로 침전시키고, 1% EBB-Tris/EDTA-식염수에 가용화시키고 황산암모늄으로 침전시켜 제조할 수 있다. 침전물을 1% EBB 완충액에 재가용화시키고, 투석하고, -70℃에서 0.1% EBB 중에 저장한다. 프로테오좀의 제조시 대안적 공정을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 공정을 단축시키기 위해 황산암모늄 침전 단계를 누락시켜 프로테오좀을 제조할 수 있다. 프로테오좀의 제조는 미국 특허 공보 제2001/0053368호 및 미국 특허 제6,476,201 B1호에 개시되어 있다.
실시예 2
프로테오좀:지질당류 면역원성 조성물의 제조
프로테오좀 보조제 조성물은 프로테오좀과 LPS를 비공유 결합되도록 혼합하여 제조할 수 있다. LPS는 쉬겔라, 플레시오모나스, 에스케리키아 또는 살모넬라 종과 같은 수많은 그램 음성 세균으로부터 유래될 수 있으며, 이를 실시예 1에서 제조된 프로테오좀과 혼합한다. 간략하게 언급하면, 프로테오좀과 LPS를 4℃에서 밤새 해동시키고 TEEN 완충액 중의 1% EmpigenR로 조정하였다. 당해 두 성분을 실온에서 15분 동안 최종 중량/중량 비가 프로테오좀:LPS 약 10:1 및 약 1:3가 되도록 하는 양으로 혼합하였다. 프로테오좀:LPS 혼합물을 적절한 크기(예: 크기 9)의 10,000 MWCO 중공 섬유 카트리지상에서 TNS 완충액(0.05M Tris, 150mM NaCl pH 8.0)으로 정용여과하였다. 침투액 중의 EmpigenR 함량이 50ppm 미만이 되면(엠피겐 탁도(Empigen Turbidity) 검정 또는 브래드포드 시약(Bradford Reagent) 검정에 의해) 정용여과를 중단하였다. 벌크 보조제(본원에서 OMP-LPS로 지칭됨)를 농축시키고 5mg/mL 단백질(로우리(Lowry) 검정에 의해)로 조정하였다. 마지막으로, 보조제를 0.22㎛ Millipak 20 필터 단위를 사용하여 멸균 여과하였다. 벌크 보조제를 멸균 저장 용기내로 분취해 넣고 동결시켰다.
OMP-LPS 보조제를 (1) 역상 HPLC를 사용하여 Empigen(400 ppm)에 대해 ; (2) Lowry 검정에 의해 단백질 함량에 대해; 및 (3) 2-케토-3-데옥시옥토네이트(KDO) 측정 검정에 의해 LPS 함량에 대해 시험하였다. OMP-LPS 조성물을 입자 크기측정기(Brookhaven Instruments 모델 90 플러스 또는 유사 장치)(10 내지 100회 수행)을 사용하여 정량적 분석으로 측정한 입자 분포에 대해 추가로 특성화하였다. 그러나, 복합체의 입자 크기는 프로테오좀 대 LPS 비가 변화됨에(예를 들면, 보다 높게) 따라 증가되거나 조정될 수 있다. 이렇게 수득된 프로테오좀:LPS 복합체는 프로톨린으로 언급된다. 현재의 안정성 데이타는 당해 제형이 2년 동안 안정함을 보여준다.
필요에 따라 LPS 공급원의 변형을 함유하는 다른 버젼의 프로톨린을 또한 제조할 수 있다. 프로톨린의 비강 보조제 특성을 에스. 플렉스네리 2a LPS로 제조된 프로톨린을 사용하여 평가하는 한편, 이. 콜라이 LPS로 제조된 프로톨린을 제조하였고 유사한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이. 콜라이 LPS로 제조된 프로톨린을 사용한 경우의 이점은 잠재적으로 보다 높은 LPS 수율 뿐만 아니라 에스. 플렉 스네리와 같은 병원성 유기체의 증식과 관련된 오염원 예방책을 요구하지 않는 세균의 형성을 포함한다. 상이한 공급원으로부터의 LPS의 사용은 또한 보호성 면역(적응 또는 선천)의 유도에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 에스. 플렉스네리-기반 프로톨린의 활성 수준을 비교하기 위해 2가지 상이한 이. 콜라이로부터의 LPS를 사용하여 프로톨린을 제조하였다. 당해 데이타는 이. 콜라이 LPS가 보조제 활성을 유지시키면서 프로톨린 중의 에스. 플렉스네리 LPS를 성공적으로 대체할 수 있음을 나타냈다. 상기 이. 콜라이 프로톨린을 프로톨린의 제조 동안 프로테오좀 OMP 입자를 가용화시키기에 충분한 길이의 O-다당류를 갖는 LPS를 갖는 균주를 포함하는 이.콜라이의 다른 잘 특성화된 균주로부터의 LPS와 비교할 수 있다.
또한, 필요에 따라, 프로테오좀:LPS 비의 변형을 함유하는 또 다른 버젼의 프로톨린을 제조할 수 있다. 프로톨린을 이용한 초기 연구는 프로테오좀 OMP 및 LPS를 1:1 중량비로 함유하는 프로톨린으로 실시하였다. 그러나, 사전에 코로나바이러스 항원을 이용하여 동물에서의 효능 시험 또는 사람에서의 임상 시험을 진행기에 앞서, 활성적인 OMP:LPS 비의 범위 입증하고, 최적의 보조제 활성을 갖고 프로톨린을 구성하는 OMP:LPS 복합체를 가용성을 보유하는 비(들)을 조사하는 것이 중요하다. 따라서, 앞서 사용된 동일한 정용여과 기술을 사용하여 4:1, 2:1 및 1:1의 비를 포함하는 몇가지 OMP:LPS 비로 프로톨린을 제조하였다. 약 4: 1 내지 약 5:1 범위의 비를 둘다 나이세리아 메닝기티디스의 OMP 및 LPS로 이루어진 프로톨린을 사용하여 포함시켰다(주: 엔. 메닝기티디스 LPS는 엔. 메닝기티디스 지질당류의 O-측쇄가 이. 콜라이 및 쉬겔라와 같은 다른 그램-음성 세균의 것보다 짧다는 사실을 강조하기 위해 지질올리고당류를 나타내는 LOS로 지칭된다). 엔. 메닝기티디스 LPS를 함유한 프로톨린(프로톨린-Nm)의 제조법은 모든 다른 버젼의 프로톨린과 상이하다. 프로테오좀 OMP의 제조 동안, 엔. 메닝기티디스 LPS를 황산암모늄 침전 기술에 의해 제거하여, 프로테오좀 입자가 2.5% 미만의 엔. 메닝기티디스 LPS를 갖도록 할 수 있다. LPS가 상기 단계에서 제거되지 않는 경우, 수득된 프로테오좀 입자는 존재하는 프로테오좀 OMP의 양과 비교해 20 내지 25% LPS를 가질 수 있 있고, 이에 따라 OMP:LPS 비는 약 5:1 내지 약 4:1의 범위일 수 있다. 따라서, 프로톨린-Nm은 단일 단계로 제조되어, 추가의 프로테오좀 입자 정제 단계 뿐만 아니라 다른 유기체로부터 LPS를 별도로 정제하고 이어서 LPS를 프로테오좀 OMP에 복합체화시킬 필요성을 제거할 수 있다. 각각의 프로톨린의 분취액을 예를 들면, 프로테오좀 OMP가 LPS와 복합체화됨을 확증하기 위한 스핀-다운(spin-down)에서 사용하기 위해 보존시켰다. 이들 버젼의 프로톨린을 각각 S 단백질 면역원과 배합(혼합, 혼화 또는 제형화)하여 상이한 버젼의 프로톨린 S 단백질 면역원성 조성물을 제조한 후 보조제 활성에 대해 마우스에서 시험한다(실시예 4 참조)
실시예 3
재조합 S 단백질의 제조 및 특성화
당해 실시예에서는, 천연의(야생형) 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 제조하는 한가지 방법을 기술한다. 비-글리코실화 S 또는 N 단백질 단편에 대한 합성 및 세균 발현 시스템을 포함하는 다른 방법도 또한 의도된다. 에스. 프루이페르다(S. fruiperda) Sf9 곤충 세포(ExpressSF+TM)를 사용하였다. S 단백질을 암호화 하는 핵산 서열의 서열은 Genbank 수탁번호 AY274119(이는 전체 SARS 게놈 서열을 나타낸다; 뉴클레오타이드 21493번 내지 25259번은 S 단백질을 암호화한다. 도 4 참조)로부터 입수되었다. RNA를 CDC에 의해 제공된 트리졸(TRIZOL) 지침에 따라서 CDC로부터 수득된 SARS 용해물로부터 분리하였다. 상기 RNA 제제를 사용하여, 제조업자의 지침에 따라서 TITAN 키트(Roche)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. S 단백질 암호화 핵산 서열의 전방 말단을 프라이머 2166 및 2167(전방: nt 40-750)을 사용하여 배큘로바이러스 전달 벡터 PSC12내로 직접 클로닝하였다. S 단백질 암호화 핵산 서열의 중간 부분(nt 750-2490) 및 후방 부분(nt 2486- 3768)을 이. 콜라이 pUC 18 벡터내로 직접 클로닝하였다. 정확한 삽입물을 갖는 각종 세균 클론을 동정하고 이를 사용하여 전체길이 S 단백질 암호화 핵산 서열을 배큘로바이러스 전달 벡터 PSC12내로 클로닝하였다.
부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 PSC12 내의 S 단백질의 STM 전체길이 작제물 및 변이체 STM-del 버젼(트랜스막 도메인이 결여된 S 단백질 변이체, 도 1참조) 둘다를 생성시켰다. 절두된 STM-del 단백질이 배지로 분비된 후, 이를 렌틴 렉틴(LL) 및 이온 교환 컬럼에서 정제하여 약 75% 균질성 순도의 단백질을 수득하였다. 히스티딘 에피토프 태그된 S 또는 N 단백질 단편 또는 이의 융합 단백질의 니켈 컬럼 정제와 같은 다른 정제 계획도 또한 의도된다. 예를 들면, 전체길이 STM 단백질을 His-태그와 프레임내에서 융합시켜 His-태그 융합 단백질을 제조하였다. 세포 펠렛을 1 % Tergitol로 가용화시킨 다음, 이를 니켈 및 LL 컬럼에 적용시켜 용출시킴으로써 His-태그된 단백질을 정제하였다. 수득된 STM 단백질 95% 순수하였다. 두 S 단백질 모두가 SARS 환자로부터의 회복기 혈청에 의해 웨스턴 블롯 검정에서 결합되었으며, 이는 재조합적으로 제조된 S 단백질 및 이의 변이체가 S 단백질 항체에 의해 특이적으로 결합되는 천연의 항원성 에피토프를 가짐을 보여준다.
실시예 4
프로톨린-SARS CoV S-단백질 제형
SARS-CoV S 단백질 또는 S 단백질 변이체(트랜스막 도메인이 결여됨, 즉 STM-del)을 함유한 프로톨린을 제조하였다. 마우스(그룹당 10마리)를 0일째 및 14일째에, 프로톨린(1㎍)의 존재 또는 부재하에 정제된 재조합 STM-del 16㎍, 4㎍, 또는 1㎍로 비강내 면역화시켰다. AlhydrogelR(0.5% w/w)에 흡착된 STM-del 단백질(16 ㎍)을 또한 근육내 주사하였으며, 이는 ELISA 조건을 확립하기 위한 혈청을 생성시키기 위해 대조군으로서 사용하였다. 21일째에, 마우스를 CO2 질식 및 심장천자로 안락사시키고, 혈청 및 폐 세척액을 수거하고 각각 STM-del 특이적 IgG 및 IgA 수준에 대해 ELISA로 검정하였다. 결과는 항체의 기하평균 농도로서 표시한다.
도 2는 프로톨린-보조제 부가된 STM-del로 비강내 면역화된 마우스가 동일한 경로로 투여된 단독의 STM-del와 비교하여 최대 48배 높은 항원-특이적 혈청 IgG 수준이 유도하였음을 도시한 것이다. 근육내로 투여된, 백반 보조제 부가된 STM-del 양성 대조군 제제는 비강내 프로톨린 STM-del 조성물에 의해 유도된 역가와 비교하여 4배 높은 혈청 IgG 역가를 유도하였다(도 3A). 그러나, 오직 비강 프로톨린 STM-del 백신만이 혈청 IgG 및 폐 IgA 둘다를 유도하였다(도 3B).
당해 데이타는 프로톨린:S 단백질 변이체 조성물이 기능적으로 활성인 항원-특이적 혈청 항체(실시예 5 참조)와 함께 점막 IgA 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 강력한 혈청 IgG 및 바이러스 중화 반응이 제공되었음에도 불구하고, 백반 보조제 부가된 STM-del 단백질은 점막 IgA를 유도하지 못하였다.
실시예 5
SARS-CoV 중화 검정
당해 실시예는 STM-del 단백질로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 의한 SARS-CoV의 감염성의 중화를 기술한 것이다. 당해 실험에서, 사전 역가측정된 SARS-CoV의 분취액을 실시예 4에서 기술한 바와 같이 면역화된 개별적 마우스 혈청의 연속적 희석된 샘플과 혼합하였다. 마우스 혈청의 2배 연속적 희석액을 1:10 희석율로부터 시작하여 1:640의 최종 희석율까지 제조하였다; 혈청을 항생제, 항진균제(fungizone), 아미노산, 비타민, HEPES 완충액 및 3% 태소 혈청이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에 희석시켰다. 혈청의 각각의 희석액에 SARS-CoV 스톡 바이러스(50㎕당 100 플라크 형성 단위(pfu))을 1:2 내지 1:256의 최종 희석율까지 희석시켰다. 혈청 + 바이러스 혼합물을 온화하게 혼합한 다음, 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 각각의 혼합물 100㎕를 조직 배양 플레이트(96웰 미세역가 플레 이트(Corning-Costar))로 옮기고, 이 플레이트에서 Vero-E6 세포를 컨플루언시(confluency) 직전까지 배양하였다. 상기 세포를 혈청 + 바이러스 혼합물과 함께 37℃에서 3일 동안 항온처리하였다. 세포병변 효과(CPE)의 존재를 각 웰마다 현미경으로 측정하였다. 혈청의 중화 역가를 CPE가 관찰된 희석율 바로 미만의 혈청 희석율로서 지정한다.
프로톨린:STM-del 혼합물에 의해 유도된 혈청 항체는 단독의 STM-del 항원 또는 PBS가 투여된 마우스로부터의 역가보다 4배 높은 20의 중화 역가를 나타냈다는 점에서 기능적으로 활성이었다. 마찬가지로, 백반 보조제 부가된 S-단백질 양성 대조군에 의해 유도된 항체는 시험관내에서 바이러스의 복제를 억제하였으며 160의 역가가 수득되었다.
실시예 6
SARS S-단백질 및 STM-del의 면역원성
당해 실험에서는, 마취된 또는 마취되지 않은 마우스에서 전체 길이 또는 STM-del(ΔTM (트랜스막 결실)) SARS S-단백질 제제의 일정한 용량의 면역원성에 대한 상이한 용량의 프로톨린TM의 효과를 시험하였다. 10마리의 Balb/C 마우스를 각 그룹에 포함시켰다.
0일 및 14일째에, 마취된 또는 마취되지 않은 마우스를 프로톨린TM 10㎍, 3㎍ 또는 1㎍ 용량과 혼합된 전체길이 SARS S-단백질 또는 STM-del 단백질 10㎍ 용량을 함유하는 10㎕로 비강내로 면역화시켰다. 추가의 마우스 그룹에게 AlhydrogelR(백반)에 흡착된 25㎕(SARS 전체길이 S-단백질 25㎍ 또는 STM-del 단백질 25㎍)를 근육내 주사에 의해 투여하였다. 대조군 마우스에게는 오직 PBS만을 비강내로 투여하였다. 21일째에, 마우스를 CO2 질식 및 심장천자로 안락사시켰다. 혈청, 폐 세척액 및 비강 세척액을 수거하였다. 데이타는 도 6(혈청 IgG 역가(㎍/ml)) 및 도 7(폐 IgA 역가(ng/ml))에 제시한다.
각각 개별적 마우스 혈청 및 점막액 중의 SARS-특이적 IgG 및 IgA 항체의 수준을 적절한 SARS S-단백질 제제로 피복된 플레이트를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 특이적 IgG 및 IgA 역가는 기하평균 농도(ng/ml)로 표시하였고, 이의 유의성은 ANOVA 분석(터키-크래머 쌍별 비교(Tukey-Kramer pair-wise comparison))에 의해 평가하였다.
특이적 혈청 IgG 역가는 마취된 마우스와 비교하여 마취되지 않은 마우스에서 2.5 내지 5배 낮았다. 유사하게, 점막 반응은 마우스와 비교하여 마취되지 않은 마우스에서 낮았다. 특이적 IgA는 마취되지 않은 마우스에서 단지 검출할 수 있을 정도였고, 각각의 마취되지 않은 그룹중 유의적 수의 마우스가 비-반응자였다.
프로톨린TM의 동일한 용량에서, 프로톨린TM-제형화된 전체길이 S-단백질로 면역화된 마우스에 의해 유도된 혈청 IgG 역가는 ΔTM-결실된 SARS S-단백질에 의해 유도된 역가보다 약 1.5 내지 2.5배 높았다. 차이는, 시험된 다른 백신에 비해 유 의적으로 낮은 역가를 유도한 1㎍ 프로톨린TM과 제형화된 ΔTM-결실된 SARS S-단백질(P≤O.OO1 - 0.01) 및 프로톨린TM 10㎍과 혼합된 전체길이 S-단백질에 의해 유도된 역가보다 유의적으로 낮은 혈청 IgG 역가를 유도한 프로톨린TM 3㎍과 혼합된 ΔTM-결실된 SARS S-단백질(P≤0.05)을 제외하고는 통계학적으로 유의적이지 않았다. 전체길이와 프로톨린TM 혼합물(제형)(또는 프로톨린TM 10㎍과 혼합된 10㎍ ΔTM 결실된 단백질)과 AlhydrogelR에 흡착되고 근육내로 주사된 단백질 간에 혈청 IgG 역가의 유의차는 관찰되지 않았다.
폐 세척액 및 비강 세척제 중의 특이적 IgA 역가를 또한 측정하였다. 배경값을 유의적으로 초과하는 역가는 비강내 백신이 투여된 모든 마우스 그룹에서 관찰되었지만, Alhydrogel-흡착된 단백질이 주사된 어떠한 마우스에서도 관찰되지 않았다. 용량 반응이 비강내 백신이 투여된 그룹에서 관찰되었지만, 유도된 역가들 간에 차이는 통계학적으로 유의적이지 않았다.
실시예 5에 기술한 바와 같이 당해 연구의 마우스로부터의 혈청으로 중화 검정을 실시하였다. 중화 역가는 측정된 IgG 역가와 매우 유의적으로 상관관계가 있었다(P<0.0001).
또한, 당해 연구의 마우스의 세포성 면역반응의 표현형을 측정하였다. 전체길이 S 단백질로 재자극 후의 반응의 표현형, 즉 사이토킨 프로파일을 측정하는 검정을 마우스 비장세포로 실시하였다. 전체길이 S 단백질(10㎍/ml) 및 프로톨린(10 ㎍/ml)으로 면역화된 마우스로부터의 비장을 수거(pool)하고, 전체길이 S 단백질 및 백반으로 면역화된 마우스로부터의 비장을 수거하고, 이어서 두 수거물을 표준 방법에 따라서 단일 세포 현탁액으로 가공하였다. 이어서, 비장세포 현탁액을 전체길이 S 단백질(측정되는 사이토킨에 따라서 1.7㎍/ml 또는 5㎍/ml)과 함께 항온처리하였다. 배양 상청액으로 방출된 사이토킨(IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-6)을 OptEIA 키트(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 정량적 ELISA로 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 보조제로서의 프로톨린의 사용은, 면역반응을 백반으로 면역화된 동물에서 관찰된 2형 표현형이 아닌 1형 표현형(세포성 반응을 포함)쪽으로 편중(skew)시켰다.
상기 기재내용으로부터, 본 발명의 구체적 양태가 본원에서 예시 목적으로 기술되었다 해도, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어남이 없이 각종 변형이 이루어질 수 있음이 인지될 것이다.
<110> ID BIOMEDICAL CORPORATION OF QUEBEC <120> Vaccine compositions for treating coronavirus infection <130> 484112.404PC <150> US 60/584,704 <151> 2004-06-30 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3768 <212> DNA <213> SARS coronavirus strain Tor2 <400> 1 atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60 acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120 tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180 ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240 atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300 tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360 actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420 tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480 ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540 cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600 caacctatag atgtagttcg tgatctacct 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Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly 180 185 190 Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp 195 200 205 Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu 210 215 220 Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro 225 230 235 240 Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr 245 250 255 Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile 260 265 270 Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys 275 280 285 Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn 290 295 300 Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr 305 310 315 320 Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser 325 330 335 Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 340 345 350 Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 355 360 365 Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala 370 375 380 Asp Ser Phe Val 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Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr 595 600 605 Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr 610 615 620 Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu 625 630 635 640 His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile 645 650 655 Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys 660 665 670 Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala 675 680 685 Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile 690 695 700 Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys 705 710 715 720 Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu 725 730 735 Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile 740 745 750 Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys 755 760 765 Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe 770 775 780 Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile 785 790 795 800 Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met 805 810 815 Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile 820 825 830 Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr 835 840 845 Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala 850 855 860 Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe 865 870 875 880 Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn 885 890 895 Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala 900 905 910 Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly 915 920 925 Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu 930 935 940 Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn 945 950 955 960 Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp 965 970 975 Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln 980 985 990 Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 995 1000 1005 Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe 1010 1015 1020 Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His 1025 1030 1035 1040 Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn 1045 1050 1055 Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro 1060 1065 1070 Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln 1075 1080 1085 Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val 1090 1095 1100 Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr 1105 1110 1115 1120 Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys 1125 1130 1135 Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser 1140 1145 1150 Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu 1155 1160 1165 Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu 1170 1175 1180 Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu 1185 1190 1195 1200 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu 1205 1210 1215 Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys 1220 1225 1230 Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 1235 1240 1245 Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1250 1255 <210> 52 <211> 1269 <212> DNA <213> SARS coronavirus Urbani <400> 52 atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60 cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag 120 cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat 180 ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt 240 ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc 300 aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct 360 tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg 420 aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta 480 caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc 540 agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct 600 ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc 660 gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa 720 caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc 780 caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca 840 gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa 900 cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc 960 attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020 gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080 tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140 cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200 atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260 caggcataa 1269 <210> 53 <211> 422 <212> PRT <213> SARS coronavirus Urbani <400> 53 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile 1 5 10 15 Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn 35 40 45 Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly 65 70 75 80 Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr 100 105 110 Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys 115 120 125 Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys 130 135 140 Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu 145 150 155 160 Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly 165 170 175 Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg 180 185 190 Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro 195 200 205 Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 210 215 220 Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser 245 250 255 Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr 260 265 270 Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly 275 280 285 Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln 290 295 300 Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg 305 310 315 320 Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly 325 330 335 Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile 340 345 350 Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro 370 375 380 Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp 385 390 395 400 Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser 405 410 415 Ala Asp Ser Thr Gln Ala 420 <210> 54 <211> 1269 <212> DNA <213> SARS coronavirus HB <400> 54 atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60 cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag 120 cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat 180 ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt 240 ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagctcgtgg tggtgacggc 300 aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct 360 tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg 420 aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta 480 caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc 540 agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct 600 ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc 660 gcgctattgc tgctagacag attgaaccgg cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa 720 caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc 780 caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca 840 gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa 900 cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc 960 attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020 gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080 tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140 cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200 atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260 caggcataa 1269 <210> 55 <211> 422 <212> PRT <213> SARS coronavirus HB <400> 55 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile 1 5 10 15 Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn 35 40 45 Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly 65 70 75 80 Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ala Arg 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr 100 105 110 Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys 115 120 125 Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys 130 135 140 Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu 145 150 155 160 Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly 165 170 175 Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg 180 185 190 Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro 195 200 205 Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 210 215 220 Leu Asp Arg Leu Asn Arg Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser 245 250 255 Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr 260 265 270 Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly 275 280 285 Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln 290 295 300 Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg 305 310 315 320 Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly 325 330 335 Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile 340 345 350 Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro 370 375 380 Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp 385 390 395 400 Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser 405 410 415 Ala Asp Ser Thr Gln Ala 420

Claims (52)

  1. (a) 보조제; (b) 약제학적으로 허용되는 부형제; 및 (c) 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 코로나바이러스에 대한 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 소수성 잔기를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 소수성 잔기가 소수성 폴리펩타이드 또는 지질인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 부형제가 리포좀인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 보조제가 프로테오좀(Proteosome) 또는 프로톨린(Protollin)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 보조제가 백반, 프로인트 보조제, 프로테오좀 또는 프로톨린인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 보조제가 프로톨린인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 적어도 2개의 S 단백질 면역원이 투여되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 제2 아미노산 서열에 연결되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제2 아미노산 서열이 태그 또는 효소인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 태그가 히스티딘 태그인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스에 의해 유발되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 사람 코로나바이러스가 SARS-CoV인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 조성물이 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 조성물이 비강 투여되는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 면역반응이 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 유도함을 포함하는 방법.
  21. (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원; 및 (b) 프로테오좀 또는 프로톨린을 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  24. 제21항에 있어서, S 단백질 면역원이 소수성 잔기를 추가로 포함하는 조성 물.
  25. 제24항에 있어서, 소수성 잔기가 소수성 폴리펩타이드 또는 지질인 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 하나 이상의 S 단백질 면역원이 제2 아미노산 서열에 연결되는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 제2 아미노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 제2 아미노산 서열이 태그 또는 효소인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 제2 아미노산 서열이 히스티딘 태그인 조성물.
  30. 제21항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  31. 제21항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  32. 제21항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제21항에 있어서, 하나 이상의 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 제2 S 단백질 면역원에 프레임(frame)내에서 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
  34. (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; 및 (b) 다가 융합 코로나바이러스 면역원 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
  35. 제34항에 따른 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.
  36. (a) 프로테오좀 또는 프로톨린; (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 방법.
  38. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 방법.
  39. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 소수성 잔기를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 소수성 잔기가 소수성 폴리펩타이드 또는 지질인 방법.
  41. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 제2 아미노산 서열에 연결되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 제2 아미 노산 서열에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 제2 아미노산 서열이 태그 또는 효소인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 태그가 히스티딘 태그인 방법.
  45. 제36항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 하나 이상에 의해 유발되는 방법.
  46. 제36항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 그룹 1 코로나바이러스, 그룹 2 코로나바이러스, 그룹 3 코로나바이러스 및 SARS 그룹 코로나바이러스 중 2개 이상에 의해 유발되는 방법.
  47. 제36항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 사람 코로나바이러스에 의해 유발되고, 상기 사람 코로나바이러스가 SARS- CoV인 방법.
  48. 제36항에 있어서, 조성물이 장내, 비경구, 경피, 경점막, 비강 및 흡입으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 방법.
  49. 제36항에 있어서, 조성물이 비강 투여되는 방법.
  50. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  51. 제36항에 있어서, 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원이 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  52. 제36항에 있어서, 조성물이 프로톨린, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 코로나바이러스 S 단백질 면역원을 포함하는 방법.
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