KR102033185B1 - 그룹 a 스트렙토콕쿠스 다가 백신 - Google Patents

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Abstract

본원에는 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS)에 특이적인 면역 반응을 유도하는데 유용한 면역원성 조성물이 제공된다. 본원에서 제공된 면역원성 조성물은 다가이고, 다수의 면역원성 펩티드 또는, GAS에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 면역원성 조성물은 면역원성 조성물에 포함된 면역원성 펩티드(M 단백질 또는 Spa 단백질로부된 유도됨)에 의해 제공된 GAS 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하고, 면역원성 조성물에 포함된 임의의 면역원성 펩티드에 의해 제공되지 않은 혈청형에 대한 면역 반응을 또한 유도한다. GAS에 대한 면역 반응을 유도하고 GAS 감염의 발생 가능성을 치료 또는 감소시키는 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

그룹 A 스트렙토콕쿠스 다가 백신{GROUP A STREPTOCOCCUS MULTIVALENT VACCINE}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은, 2011년 6월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/498,397호 및 2012년 5월 2일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/641,448호의 35 U.S.C. §119(e)하의 우선권을 주장하며, 이들은 각각 본원에서 전부 참조로 인용된다.
정부 권리의 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 허여 번호 AI-010085, AI-060592 및 5T35DK007405하의 정부 지원으로 이루어졌다.
서열 목록에 관한 진술
본원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고, 이의해 의해 본 명세서에 참조로서 도입된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 화일의 명칭은 920098_ 414PC_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 화일은 93 KB이고, 2012년 6월 14일에 작성되었고, EFS-Web를 통해 전자적으로 제출된다.
기술 분야
그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS) 감염을 예방하기 위한 안전한 및 효과적인 백신이 요구되고 있다. 다수의 GAS 혈청형에 대해 면역 반응을 유도하고 이를 필요로 하는 대상체의 면역화에 유용할 수 있는 다가 백신이 본원에서 기재된다.
관련 기술의 기재
그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS) 감염을 예방하는 안전한 및 효과적인 백신을 개발하기 위한 노력은 수십년 동안 진행되어 왔다. 다수의 GAS 항원이 강력한 백신 성분으로 동정되었지만[참조: Steer et al., Curr . Opin . infect . Dis . 22:544-52(2009)], 선두 후보는 표면 M 단백질의 아미노-말단 영역을 제시하는 종-특이적 펩티드이다[참조: Kotloff et al., JAMA 292:709-15(2004); McNeil et al., Clin. Infect. Dis. 41: 1114-22(2005)].
북미, 유럽 및 기타 경제적 개발도상 지역 및 개발도상국에서 주요 부담의 질환은 단순 인두염 및 심각한 침윤성 감염이다[참조: Carapetis et al., The Lancet Infectious Diseases 5: 685-94(2005)]. 세계적 부담의 GAS 감염은 급성 류마티스성 열(ARF) 및 류마티스성 심장 질환(RHD)이 유행하는 빈곤 국가에서 가장 중요하다[참조: Carapetis et al., supra]. M 단백질계 백신을 사용하여 ARF를 유발하는 감염의 백신 예방은 개발도상국에 존재하는 GAS emm 유형이 세계의 경제 개발된 지역과 비교하여 상이하기 때문에 도전이 고려되었다[참조: Steer et al., The Lancet Infectious Diseases 9: 611-16(2009)]. 임상 전[참조: Hu et al., supra] 및 임상 연구[참조: McNeil et al., supra]에서 26가 M 단백질계 백신의 면역원성이 보고되었다. 그러나, 26가 백신은 개발도상국 및 개발된 국가 둘 다에서 최적 이익 및 사용을 위해 충분한 수의 상이한 GAS 혈청형에 의한 감염에 대한 보호를 제공하지 않는다.
따라서, GAS 감염을 치료 및 예방하기 위해, 경제적으로 생산될 수 있는, 개선된 치료제 및 백신의 개발이 요구되고 있다.
요약하면, 본원에는 GAS의 다중 균주에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드, 및 이들 면역원성 단백질 및 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS 감염을 예방 또는 치료하기 위해 당해 기술분야에 이미 기재된 면역원성 조성물에 비해 현저히 개선된다. 당해 면역원성 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드 및 면역원성 조성물 및 방법의 다양한 실시양태가 하기에서 요약된다.
실시양태 1. 적어도 31개 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 각각의 면역원성 펩티드가 상이하고, 또한 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 상이한 M 단백질이 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고, Spa 단백질이 GAS 혈청형 18로부터의 것이고, 면역원성 조성물이 GAS에 대해 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 적어도 4개의 상이한 면역원성 펩티드가 종렬로 연결되어 융합 폴리펩티드를 형성하는, 면역원성 조성물.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 종렬로 연결된 적어도 6개의 상이한 면역원성 펩티드를 각각 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 제2 융합 폴리펩티드, 제3 융합 폴리펩티드 및 제4 융합 폴리펩티드를 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 제1 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 상기 8개 면역원성 펩티드가 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터의 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 상이한 M 단백질이 GAS 혈청형 1, 2, 3, 6, 12, 18 및 28의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고, Spa 부분이 GAS 혈청형 18로부터의 것인, 면역원성 조성물.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 제1 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된 면역원성 펩티드가 제1 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 1의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 7. 실시양태 3에 있어서, 제2 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 상기 8개 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 4, 5 11, 14, 19, 24, 29 및 75의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 8. 실시양태 7에 있어서, 제2 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된 면역원성 펩티드가 제2 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 4의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 10. 실시양태 3에 있어서, 제3 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 상기 8개 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 22, 44, 58, 73, 77, 78, 89 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, 제3 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된 면역원성 펩티드가 제3 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 77의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 13. 실시양태 3에 있어서, 제4 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 7개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 7개 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 49, 81, 82, 83, 87, 92 및 114의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 제4 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된 면역원성 펩티드가 제4 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 복제되는 면역원성 조성물이 GAS 혈청형 83의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 16. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 각각의 면역원성 펩티드가 (a) 복제물 중 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산; (b) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 40개 인접 아미노산; (c) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 45개 인접 아미노산; 또는 (d) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 50개 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 17. (a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제3 융합 폴리펩티드; 및
(d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제4 융합 폴리펩티드를 포함하고,
그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대해 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, (a) 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 19. 실시양태 17에 있어서, (a) 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 20. 실시양태 17에 있어서, (a) 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 21. 실시양태 17에 있어서, (a) 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 22. 실시양태 1 내지 21 중의 어느 한 실시양태에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 23. 실시양태 1 내지 22 중의 어느 한 실시양태에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
실시양태 24. 실시양태 1 내지 22 중의 어느 한 실시양태에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대한 면역 반응이 GAS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118 혈청형의 적어도 각각에 대한 면역 반응을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
실시양태 26. 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염의 발생 가능성을 감소시키는 방법.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
실시양태 28. 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
실시양태 29. 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염을 예방 또는 치료하는 백신을 제조하기 위한, 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태의 면역원성 조성물의 용도.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 24 중의 어느 한 실시양태에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 면역원성 조성물.
실시양태 31. (a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열; 또는
(c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대해 면역 반응을 유도하는, 융합 폴리펩티드.
실시양태 32. 실시양태 31에 있어서,
(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
실시양태 33. 실시양태 31에 있어서,
(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
실시양태 34. 실시양태 31에 있어서,
(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
실시양태 35. 실시양태 31항에 있어서,
(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열;
(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
실시양태 36. 실시양태 31 내지 35 중의 어느 한 실시양태의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
실시양태 37. 적어도 하나의 발현 조절 영역에 작동적으로 연결된 실시양태 36의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
실시양태 38. 실시양태 37의 재조합 발현 벡터로 형질감염, 형질도입 또는 형질전환된 분리된 숙주 세포.
실시양태 39. 실시양태 31 내지 35 중의 어느 한 실시양태에 있어서, (a) 실시양태 38의 분리된 숙주 세포를 배양하는 단계 및
(b) 융합 폴리펩티드를 숙주 세포 배양물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 융합 폴리펩티드를 생산하는 방법.
실시양태 40.
(a) 생물학적 샘플을
(i) M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분의 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드로서, 상기 M 단백질이 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118의 M 단백질로부터 선택되고, 상기 Spa 단백질이 GAS 혈청형 19로부터의 것인 면역원성 펩티드;
(ii) 이량체성 펩테드의 각각의 펩티드가 상이하고 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분의 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 이량체성 펩티드로서, 각각 상이한 상기 M 단백질이 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고, 상기 Spa 단백질이 GAS 혈청형 18로부터의 것인 이량체성 펩티드; 또는
(iii) 실시양태 31 내지 실시양태 35 중의 어느 한 실시양태의 융합 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 생물학적 샘플과의 특이적 결합을 검출하여, 생물학적 샘플이 항체를 함유함을 나타내는 단계를 포함하는, 항체를 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 실시양태 31 내지 35 중의 어느 한 실시양태의 융합 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 ("a", "and" 및 "the")는, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 복수의 이러한 폴리펩티드를 지칭할 수 있고, "하나의 세포" 또는 "당해 세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 당해 기술분야의 기술자에게 공지된 이의 등가물(예: 복수의 세포) 등에 대한 언급을 포함한다. 유사하게는, "조성물"에 대한 언급은 복수의 이러한 조성물을 포함하고, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 조성물을 지칭한다. 방법의 단계가 기재 또는 청구되고 상기 단계가 특정 순서로 발생하는 것으로 기재되는 경우, 제2 단계 "이전"(즉, 전)에 발생하는(또는 수행되는) 제1 단계의 기재는 제2 단계가 제1 단계에 "후속"하여 발생하는(또는 수행되는) 것을 말하는 것으로 개작하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "약"은, 수 또는 수치 범위를 지칭하는 경우, 지칭되는 당해 수 또는 수치 범위가 실험 변산도(또는 통계학적 실험 오차) 내의 근사치이고, 따라서 당해 수 또는 수치 범위는 언급된 수 또는 수치 범위의 1% 내지 15%에서 달라질 수 있다. 용어 "포함하는"(및 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "갖고" 또는 "포함하는" 등의 관련 용어)은, 기타 특정 실시양태에서, 예를 들면, 본원에 기재된 조성물, 방법 또는 공정 등의 임의 조합의 실시양태가 기재된 특징으로 "이루어질" 수 있거나 "본질적으로 이루어질" 수 있음을 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 소정 물질이 이의 본래 환경(예: 천연 발생인 경우에 천연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 천연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 천연 시스템 중의 공존하는 물질 중의 일부 또는 전부로부터 분리된, 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 분리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부분일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부분일 수 있고, 당해 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 분리될 수 있다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬의 생성에 수반된 DNA의 세그먼트를 의미하고; 이는 개개 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론) 뿐만 아니라 코딩 영역 "리더 및 트레일러"에 선행 및 후속하는 영역을 포함한다. 아미노산은 단문자 및 삼문자 코드에 따라 본원에서 지칭될 수 있고, 이는 당해 기술분야의 기술자에게 친숙한 당해 기술분야의 통상의 교본 지식에 따라 이해된다. 본원에 사용된 용어 "융합 폴리펩티드"는 "융합 단백질"과 상호 교대로 사용될 수 있고, 달리 명시되지 않는 한, 2개 용어는 식별가능한 특성 또는 특징을 갖는 분자를 나타내는 것을 의미하지 않는다.
도 1은 30가 M 단백질계 GAS 면역원성 조성물을 포함하는 4개 단백질의 도식적 다이아그램을 나타낸다.
도 2A 내지 2H는 4개 합성 폴리뉴클레오티드(도 2A(서열번호 17); 2C(서열번호 18); 2E(서열번호 19); 및 2G(서열번호 20))의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 구성 재조합 폴리펩티드의 개개 아미노산 서열(도 2B(서열번호 9); 2D(서열번호 10); 2F(서열번호 11); 및 2H(서열번호 12))을 제공한다. 각각의 폴리뉴클레오티드는 상류 T7 프로모터, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈(도 2A, 2C, 2E, 2G 각각의 위치 108에서 개시하는, 볼드체로 ATG), 3' 폴리히스티딘 모티브 및 종결 코돈을 함유하도록 합성되었다.
도 3은 본원에 기재된 30가 면역원성 조성물로 면역화된 동물에서 항체 역가 수준에 대한 래빗에서의 용량 반응을 도시한다.
도 4A 내지 4B는 30가 GAS 면역원성 조성물의 3개 800㎍ 용량으로 면역화시킨 후에 3개 래빗에서 유발된 기하 평균 항체 수준(Log2)을 설명한다. 고상 결합된 항원은 사용된 것으로서 30가 GAS 면역원성 조성물에서 사용된 각각의 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 이량체성 펩티드 또는 합성 펩티드(M44, M78, M118, M83, M81, M87, M49)이다. 도 4B는 30가 M 단백질계 GAS 면역원성 조성물에 의해 유발된 살균 항체 수준의 그래프를 제공한다. 800㎍ 용량의 면역원성 조성물로 면역화시킨 래빗 중의 하나로부터의 면역 혈청은 면역원성 조성물에서 제시된 모든 혈청형의 GAS에 대한 살균 분석에서 사용되었다. 치사율은 실시예에 기재된 바와 같이 계산했다.
도 5A 내지 5B는 30가 면역원성 조성물에서 GAS 펩티드에 의해 제시되지 않은 GAS의 혈청형에 대해 30가 면역원성 조성물에 의해 유발된 살균 항체 수준을 설명한다.
도 6은 30가 면역원성 조성물 대 26가 백신에 의해 유발된 교차-옵소닌 살균 항체의 비교를 나타낸다[참조: Hu et al., supra; U.S. Patent No. 7,270,827]. 임의의 융합 폴리펩티드 작제물에서 제시되지 않은 10개 혈청형에 대해 30가 면역원성 조성물에 의해 촉진된 살균 치사 수준은 26가 항혈청으로 관찰한 살균 치사보다 유의적으로 컸다(평균 64.9% 대 23.6%, p=0.0008, 스튜던트 t-시험, 쌍체, 양측).
본원에는 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS)의 다중 균주에 대해 면역 반응을 유발(즉, 유도)할 수 있고 당해 기술분야에 이미 기재된 면역원성 조성물에 비해 현저한 개선을 나타내는 면역원성 조성물이 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 다가 면역원성 조성물에서 GAS 균주로부터 유도된 면역원성 펩티드의 조합은 당해 면역원성 펩티드가 유도되는 GAS 균주 뿐만 아니라 당해 조성물 중의 면역원성 펩티드에 의해 나타나지 않는 GAS의 다중 추가 균주에 대해 면역 반응을 유발한다.
그룹 A 스트렙토콕쿠스(스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes))는 2개의 주요 표면-노출된 항-식세포 인자, 캡슐 및 M 단백질을 갖고, 이는 이들 생물체가 숙주내에서 서식하고 생존하게 한다. 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS)의 세포 표면 M 단백질은 이러한 병원체에 대한 주요 독성 인자 중의 하나이다. emm 유전자에 의해 코딩되는 M 단백질은 GAS 박테리아의 표면 상에서 세섬유로서 나타나는 α-나선형으로 감긴 코일 이량체로서 세포 표면으로부터 연장한다. M 단백질은 항원 다양성 그룹을 형성하고, GAS 균주는 M 단백질 혈청형에 따라 혈청학적으로 분류되었다. 120개 이상의 M 단백질 혈청형이 동정되었고, 일부 혈청형 내에서, 아형이 또한 동정되었다. 예를 들면, GAS 혈청형 3의 M 단백질은 관련된 아형을 포함하고, 이는 3.0, 3.1, 3.2 등으로 지정되었다. M 단백질에 대한 항체는 혈액에 존재하는 식작용 세포에 의한 옵소닌식작용(opsonophagocytosis)을 촉진시킬 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 북미, 유럽 및 개발도상국에서 우세한 GAS 혈청형의 M 단백질로부터 유도된 면역원성 펩티드를 함유하는 30가 면역원성 조성물(이는 본원에서 및 당해 기술분야에서 백신으로 지칭될 수 있다)이 작제되었다. 당해 조성물에서 제시된 혈청형의 선택은 북미 및 유럽[참조: Shulman et al., Clin. Infect. Dis. 39: 325-32 (2004); Shulman et al., Clin. Infect. Dis. 49: 78-84(2009); O'Loughlin et al., Clin . Infect . Dis . 45: 853-62(2007); Luca-Harari et al., J. Clin . Microbiol . 47: 1155-65(2009)] 및 일부 개발도상국[참조: Steer et al., supra]에서 GAS 감염의 이용가능한 역학 및 혈청형 유병률에 기반한다. 이들 면역원성 조성물은 또한 당해 기술분야에서 Spa로서 지칭된 단백질로부터 면역원성 펩티드를 함유하고, 이는 하나 이상의 GAS 혈청형과 교차 반응하는 항체를 유발한다. 본원에 기재된 면역원성 조성물, 예를 들면, 30개의 상이한 M 단백질 펩티드 면역원 및 Spa 펩티드 면역원을 포함하는 조성물은 보다 적절하게는 인두염 및 침윤성 GAS 감염의 역학을 나타낸다.
또한, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS 혈청형 4의 M 단백질로부터 유도된 면역원성 펩티드를 포함한다. GAS 혈청형 4는 상당 부분의 GAS 질환, 북미에서 대략 9%의 단순한 인두염 및 유럽에서 5%의 침윤성 GAS 감염을 유발한다[참조: Shulman et al., Clin . Infect . Dis . 2009, supra ; Luca-Harari et al., supra]. GAS 혈청형 4 세균의 세포 표면 상에 존재하는 Arp4로서 불리우는 M 단백질 부류의 구성원[참조: Johnsson et al., J Immunol . 153:3557-64 (1994)]은, M 단백질 부류의 다른 구성원[참조: Husmann et al., Infect . Immun . 63:345-48 (1995)]과 달리, 독성 또는 식작용에 대한 내성에 요구되지 않는 것으로 초기에 생각되었다. 추가 실험에 따라, 면역화된 숙주에서 옵소닌 항체를 유발하는 Arp4(M4) 단백질의 아미노 말단으로부터의 면역원성 펩티드가 동정되었다[참조: Courtney et al., supra]. GAS 면역원성 조성물로의 M4 면역원성 펩티드의 첨가는, 이러한 다가 면역원성 조성물이 면역 반응을 유도하는 GAS 균주의 수를 대략 78% 내지 90% 증가시킴으로써, 단순 및 복합 감염 둘 다와 관련하여 다가 백신의 효능을 개선시킨다.
M 단백질과는 별도로, Spa(스트렙토콕쿠스 보호성 항원)로 지정된 폴리펩티드는 옵소닌 보호성 항체의 생성을 유도하는 에피토프를 함유한다. Spa 폴리펩티드는 혈청형 특이적, 예를 들면, GAS 혈청형 36으로부터의 Spa 폴리펩티드일 수 있고, 다른 Spa 폴리펩티드, 예를 들면, GAS 혈청형 18로부터 분리된 Spa 폴리펩티드는 다중 GAS 혈청형에 결합하는 항체를 유발한다. GAS 혈청형 18의 Spa 폴리펩티드는 혈청형 18 뿐만 아니라 혈청형 3 및 28에 결합하고 이에 대해 보호성인 항체를 유도한다[참조: 미국 특허 제7,063,850호; Ahmed et al., Eur. J Clin. Microbial. Infect. Dis. 29:51-57 (2010) Epub 2009 Oct 29; McLellan et al., Infect. Immun. 69:2943-49 (2001); Dale et al., J Clin. Invest. 103:1261-68 (1999)].
한 가지 실시양태에서, 종렬로 연결된 7개 또는 8개 GAS M 단백질 또는 GAS Spa 단백질 면역원성 단편을 각각 포함하는 4개의 상이한 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 예시적 조성물은 래빗에서 면역원성이고, 당해 조성물에 포함된 면역원성 펩티드에 의해 제시된 GAS의 모든 혈청형에 대해 살균 항체를 유발했다. 또한, 예상치 않게 및 당해 기술분야에 이미 기재된 26가 면역원성 조성물과 대조적으로, 본원에 기재된 예시적 30가 조성물로 면역화시킨 동물로부터 수득한 항혈청은 면역원성 펩티드 단편이 당해 조성물에 포함되지 않은 GAS 혈청형에 대해 유의 수준의 살균 항체를 함유했다(즉, 비-백신 GAS 혈청형 또는 비-제시된 GAS 혈청형). 따라서, 본원에 기재된 면역원성 조성물, 예를 들면, 30가 면역원성 조성물의 잠재적 효능은 아단위 M 펩티드 및 Spa 펩티드에 의해 제시된 혈청형 이상으로 확대될 수 있다. 상기 및 기타 실시양태 및 이의 용도는 본원에서 보다 상세히 기재되어 있다.
면역원성 조성물
한 가지 실시양태에서, 복수의 GAS 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 31개 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 각각의 면역원성 펩티드는 각각 31개 상이한 GAS 폴리펩티드의 아미노(또한 본원 및 당해 기술분야에서 NH2로서 불리움) 말단 부분에 위치된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 30개 상이한 면역원성 펩티드 각각은 30개 상이한 GAS 혈청형으로부터의 적어도 30개 M 단백질의 아미노산 서열로부터 각각 유도된다. M 단백질의 각각의 면역원성 펩티드는 M 단백질의 아미노 말단으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 조성물은 또한 Spa 폴리펩티드의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드를 포함하고, 이는 특정 실시양태에서 GAS 혈청형 M18 균주의 세포 표면 상에서 발현되고 표면 상에 존재하는 Spa 폴리펩티드이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 복수의 면역원성 펩티드(예를 들면, GAS M 단백질 또는 GAS Spa 단백질로부터 유도된 적어도 31개 상이한 면역원성 펩티드)를 포함하는 적어도 4개 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
M 단백질의 아미노 말단 영역은 최대 살균(보호성) 활성을 갖는 항체를 유발하는 것으로 밝혀졌고, 적어도 인간 조직과 교차 반응하는 것 같다[참조: Dale, Adv. Exp . Med . Biol . 609: 53-63(2008)]. 한 가지 방법은 그룹 A 스트렙토콕쿠스의 역학적으로 중요한 혈청형에 대한 옵소닌 항체를 유도하도록 계획된 다가 백신 내로 조합된 M 단백질 펩티드를 함유하는 재조합 하이브리드 단백질을 작제하는 것이다[참조: Dale, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 13: 227-43(1999); Hu et al., Infect. Immun. 70: 2171-77(2002)].
본원에 기재된 항-GAS 면역원성 조성물은 이미 기재된 백신 조성물과 비교하여 현저한 개선을 제공한다. 한 가지 실시양태에서, M 단백질 면역원성 펩티드에 의해 제시된 각각의 GAS 혈청형에 대해서 뿐만 아니라 유의적으로는 보다 비-백신 혈청형(즉, M 단백질 면역원성 펩티드 또는 Spa 면역원성 펩티드에 의한 면역원성 조성물에서 제시되지 않은 GAS 혈청형)에 대해서 면역 반응을 유발하는 M 단백질 및 Spa 단백질의 면역원성 펩티드를 포함하는 30가 면역원성 조성물이 제공된다. 중요하게는, 또한, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS 혈청형 4의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드를 포함한다[참조: Courtney et al., Molec. Mcirobiol. 59: 936-47(2006)]. GAS 혈청형 4는 북미에서 대략 9%의 단순 인두염 및 유럽에서 5%의 침윤성 GAS를 유발하고[참조: Shulman et al., Clin . Infect . Dis . 49: 78-84(2009); Luca-Harari et al., J. Clin . Microbiol . 47: 1155-65(2009)], 따라서 M4 면역원성 펩티드의 포함은 다가 GAS 백신의 효능을 크게 개선시킨다.
본원에 기재된 GAS 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은, GAS에 대해 및 보다 특히는 백신에서 제시되고 면역원성 펩티드가 유도되는 GAS 혈청형 각각에 대해 면역 반응을 유발한다. 또한, 본원에 기재된 면역원성 조성물은, 면역원성 펩티드가 수득되지 않고 따라서 면역원성 조성물에 포함되지 않은 GAS 혈청형에 대해 면역 반응을 유발한다(또한 비-백신 GAS 혈청형 또는 비-제시된 GAS 혈청형으로 본원에서 불리움). 본원에 기재된 용어, 예를 들면, "30가" 또는 "26가"는 면역원성 펩티드가 수득되거나 유도되는 GAS 혈청형의 수를 지칭한다. 면역원성 조성물에 포함된 면역원성 펩티드의 수는 지시된 결합가보다 클 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 31개 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은, 당해 조성물에 포함된 Spa 면역원성 펩티드(본원에서 및 당해 기술분야에서 기재됨)가 GAS 혈청형 M18로부터 수득될 수 있고 혈청형 M18의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드가 상기 백신 조성물에 또한 포함되기 때문에 30가 조성물로서 지칭될 수 있다.
면역원성 조성물은, 기하 위치와 무관하게, 최대수의 임상적으로 관련된 GAS 혈청형에 대해 면역 반응을 유발하는 조성물을 제공하기 위해 계획 및 작제되었다. 따라서, 임상적 용도 및 효능을 최대화하기 위해, 당해 기술분야에서 이용가능한 역학적 데이타로부터 측정될 수 있는 하나 이상의 기하 부분에서 우세한 GAS 혈청형이 M 단백질 면역원성 단편 또는 기타 GAS 폴리펩티드 면역원성 단편(예: Spa 면역원성 단편)의 공급원으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 면역원성 조성물 중의 면역원성 단편에 의해 제시된 GAS 혈청형은 비-침윤성 감염(예: 인두염, 농가진, 단독 및 봉와직염)을 유발하는 것들 및 침윤성 감염(예: 혈액(균혈증), 근육 및 폐(폐렴), 괴사성 근막염 및 스트렙토콕쿠스 독성 쇼크 증후군), 및 비화농성 후유증, 예를 들면, 류마티스성 열, 반응성 관절염 및 사구체신염을 유발하는 GAS 혈청형을 포함한다[참조: Cunningham, Clin. Microbiol. Rev. 13: 470(2000)].
역학적 데이타는 공공 및/또는 개인 지역, 국가 및 국가간 조직 및 연구자로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, GAS의 혈청형으로부터의 M 단백질의 면역원성 펩티드가 비-침윤성 감염, 예를 들면, 북미에서 소아 대상체의 인두염[참조: Shulman et al., Clin. Infect. Dis. 2009, supra]; (2) 침윤성 GAS 감염[참조: Active Bacterial Core Surveillance of the Emerging Infections Program Network, supported by the Centers for Disease Control and Prevention](참조: O'Loughlin et al., supra); (3) 유럽에서 침윤성 감염(예를 들면, StrepEuro consortium, Luca-Harari et al.에 의해 보고됨, supra); 및/또는 개발도상국에서 일반적인 GAS 혈청형[참조: Steer et al., The Lancet Infectious Diseases 9: 611-16(2006)]의 역학에 기반한 면역원성 조성물에서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 면역원성 조성물(예: 30가 백신 조성물)에는 현재 또는 조직학적으로 "류마티스원성"인 것으로 간주되는 GAS의 혈청형으로부터의 M 펩티드가 포함된다[참조: Shulman et al., Clin . Infect . Dis . 42: 441-47(2006)]. 또한, Spa18의 아미노-말단 펩티드 단편, 즉 그룹 A 스트렙토콕쿠스의 적어도 몇몇 혈청형에 의해 발현되는 보호 항원, 예를 들면, 이로써 제한되는 것은 아니지만, GAS 혈청형 18, GAS 혈청형 3 및 GAS 혈청형 28은 본원에 기재된 다가 면역원성 조성물에 포함될 수 있다[참조: Dale et al., J. Clin. Invest. 103: 1261-68(1999); 미국 특허 제7,063,850호; 국제 특허 공개공보 WO 00/37648호].
M 단백질의 아미노산 서열 및 M 단백질의 아형은 단백질 데이타베이스, 예를 들면, cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes 주소로 인터넷에 접근함으로써 발견할 수 있는 질환 제어 센터(Center for Disease Control(CDC)) emm 타이핑 센터에서 입수가능하다. Spa 폴리펩티드의 아미노산 서열은 또한 공공 데이타베이스에서 입수가능하고, 문헌[참조: Dale et al., J. Clin. Invest. 103: 1261-68(1999); 미국 특허 제7,063,850호; 및 국제 특허 공개공보 WO 00/37648호]에 기재되어 있다. 당해 기술분야에서 현재 사용되는 GAS M 혈청형의 아형에 대한 기준은 문헌[참조: Facklam et al., Emerg . Infect . Dis . 5: 247-53(1999)]에 기재되어 있다.
당해 기술분야에 또한 오랫동안 공지된 바와 같이, M 단백질의 영역(들)은 숙주 조직, 예를 들면, 인간 심장[참조: Dale et al., J Exp. Med. 156:1165-76 (1982); Dale et al., J Exp . Med . 161:113-22 (1985)], 뇌[참조: Bronze et al., J Immunol . 151:2820-28 (1993)], 근육, 신장 및 연골과 교차 반응하는 항체를 유도하는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 다가 면역원성 조성물의 설계는, 각각의 M 단백질이 하나 이상의 인간 단백질과 마찬가지로 5개 이상의 인접 아미노산을 갖고 따라서 인간 조직에 결합할 수 있는 항체를 잠재적으로 유도할 수 있는지를 측정하기 위한 M 단백질에서의 아미노산 서열 분석을 포함한다. 본원에 기재된 면역원성 조성물에 포함된 면역원성 단백질을 포함하는 M 단백질 및 융합 폴리펩티드의 면역원성 펩티드는 공지된 인간 단백질의 5개 이상의 인접 아미노산과 동일한 5개 이상의 인접 아미노산을 결여한다.
M 단백질의 아미노산 서열과 인간 단백질과의 비교는 당해 기술분야의 기술자에게 이용가능한 하나 이상의 몇몇 정렬 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 정렬 도구(이는 또한 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, M 단백질을 코딩하는 것들을 비교하는데 유용할 수 있다)는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, BlastP, BLAST, tBLAST 및 MegAlign을 포함한다. 다른 소프트웨어 프로그램은 레이저진 바이오인포매틱 컴퓨터 슈트(Lasergene bioinformatics computing suite)(DNASTARR Madison, Wisconsin); CLUSTALW 프로그램[참조: Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991)]; 및 "GeneDoc" [참조: Nicholas et al., EMBNEW News 4:14 (1991)]에서 제공된다. ALIGN 또는 BLAST 등의 알고리즘에 대한 참조는, 예를 들면, 문헌[참조: Altschul, J Mol. Biol. 219:555-565, 1991; and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992]에서 발견할 수 있다. Align 및 BLAST 알고리즘을 포함하는 알고리즘은 NCBI 웹사이트[참조: [online] Internet at ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST]에서 이용가능하다. 디폴트(default) 파라미터가 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산을 비교하고 최적 정렬을 측정하기 위한 당해 기술분야에서 이용가능한 추가의 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology , pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); and Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)]에 기재된 방법을 포함한다.
본원에 기재된 다가 백신 조성물(즉, 다가 면역원성 조성물)에 사용될 수 있는 GAS 면역원성 펩티드는 전장(full-length) GAS 폴리펩티드의 면역원성 부분을 포함하고, 성숙 폴리펩티드(즉, 시그날 펩티드 서열이 제거된 폴리펩티드)의 아미노 말단 부분의 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 이상의 인접 아미노산(또는 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 40-55 또는 55-60개 사이의 임의 수의 아미노산 또는 60개 이상의 인접 아미노산)을 포함한다. 임의 특정 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 이상의 인접 아미노산(또는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 40-55 또는 55-60개 사이의 임의 수의 아미노산 또는 60개 이상의 인접 아미노산)을 포함할 수 있다. 성숙 또는 전장 GAS 폴리펩티드의 면역원성 부분은 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프를 갖고, 이는 면역원성 펩티드, 및 성숙 및 전장 폴리펩티드 내의 면역원성 부분, 및 당해 폴리펩티드를 발현하는 GAS 박테리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도한다. 보다 특정 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 또는 적어도 50개 인접 아미노산을 포함한다. 특정한 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하고, 여기서 면역원성 펩티드는 복제물에 존재하고, 당해 복제물은 종렬로 직접 연결된다. 달리는 및 예를 들면, 선택된 면역원성 영역이 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분의 아미노산 잔기 1 내지 25개를 포함하는 경우, 복제물 중의 면역원성 펩티드는 아미노산 1 내지 25개의 제2 반복체에 종렬로 연결된 아미노산 잔기 1 내지 25개를 포함한다(즉, 제1 복제물의 아미노산 잔기 25는 제2 복제물의 아미노산 잔기 1에 직접 결합한다).
한 가지 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 적어도 30개 상이한 GAS 혈청형을 대표하는(또는 이로부터 수득되는, 이로부터 유도되는) 면역원성 펩티드를 포함한다. 보다 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물에서 제시된 GAS 혈청형 중의 하나는 M4이고, 면역원성 펩티드는 M4 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 30개의 상이한 GAS 혈청형을 대표하는 적어도 31개의 면역원성 펩티드를 포함한다. 보다 특정 실시양태에서, 31개 면역원성 펩티드 각각의 아미노산 서열은 상이하고, 각각은, GAS 혈청형 (1) M1; (2) M2; (3) M3; (4) M4; (5) M5; (6) M6; (7) Mll; (8) M12; (9) M14; (10) M18; (11) M19; (12) M22; (13) M24; (14) M28; (15) M29; (16) M44; (17) M49; (18) M58; (19) M73; (20) M75; (21) M77; (22) M78; (23) M81; (24) M82; (25) M83; (26) M87; (27) M89; (28) M92; (29) M114; (30) M118 중의 하나 및 (31) GAS 혈청형, 예를 들면, GAS 혈청형 M18로부터 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 이상의 인접 아미노산(또는 25-30, 30-35, 35-40, 30 40-45, 45-50, 40-55 또는 55-60개 사이의 임의 수의 아미노산 또는 60개 이상의 인접 아미노산)을 포함한다. 또 다른 보다 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 복제물 중에 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 적어도 40개 인접 아미노산 또는 적어도 45개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 적어도 50개 인접 아미노산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 혈청형에 따르는 GAS 세균을 지칭할 때, 세균은, 예를 들면, GAS 혈청형 3, GAS M 혈청형 3 또는 GAS 혈청형 M3으로 불리울 수 있다. 특정 혈청형의 M 단백질을 지칭할 때, M 단백질이 유도되는 GAS 혈청형, 예를 들면, M3의 지정은 당해 문맥에 따라 단어 단백질 또는 면역원성 펩티드가 통상적으로 수반된다(즉, M3 단백질 또는 M3 면역원성 펩티드).
따라서, 달리 말하면, 상기 기재된 면역원성 조성물의 실시양태는 적어도 하기 면역원성 펩티드를 포함한다: GAS 혈청형 1로부터의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 2로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 3으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 4로부터 M 단백질의 아미노산 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 5로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 6으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 11로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 12로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 14로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 18로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 19로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 22로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 24로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 28로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 29로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 44로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 49로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 58로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 73으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 75로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 77로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 78로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 81로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 82로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 83으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 87로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 89로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 92로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 114로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; GAS 혈청형 118로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드; 및 GAS 혈청형, 예를 들면, GAS 혈청형 18로부터 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드. 본원에 기재된 바와 같은 특정한 실시양태에서, 각각의 상술한 면역원성 펩티드는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있다(또는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 40-55 또는 55-60개 사이의 임의 수의 아미노산 또는 60개 이상의 인접 아미노산). 또 다른 특정 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 복제물 중에 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 적어도 40개 인접 아미노산 또는 적어도 45개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 적어도 50개 인접 아미노산을 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45개 또는 그 이상의 상이한 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 상이한 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118로부터의 M 단백질 및 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질(상기한 바와 같음)의 아미노 말단 부분으로부터 31개 면역원성 펩티드를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 추가의 상이한 GAS 혈청형 또는 아형으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 면역원성 펩티드 및/또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 하나 이상의 추가의 상이한 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 추가의 면역원성 펩티드의 선택은 역학 데이타; GAS 단백질과 인간 단백질과의 5개 이상의 인접 아미노산의 공유 동일성의 결여; 이러한 면역원성 조성물을 사용한 면역화에 반응하여 생성된 항체에 의해 인식된 비-제시 GAS 혈청형의 수를 증가시키는 하나 이상의 추가의 면역원성 펩티드의 능력을 포함하는 면역원성, 살균 및/또는 보호 데이타에 의해 알 수 있다.
본원에 기재되고 당해 기술분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, M 단백질 및 Spa 단백질의 아미노 말단 부분은, 보호 면역 반응을 유발하지만 인간 세포 및 조직에 의해 발현된 단백질과 교차 반응하는 항체를 유도하지 않는 하나 이상의 면역원성 에피토프를 갖는 M 단백질 및 Spa 단백질의 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분은 신호 펩티드 서열을 결실하는 발현된 단백질인 성숙 단백질을 지칭한다. 당해 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 분비되거나 막 결합된 단백질인 폴리펩티드는 초기 폴리펩티드의 아미노 말단에서 신호 펩티드와 상호작용하는 전좌 기구에 의해 각각 막을 통해 또는 막에 전좌된다. 세균에서, 신호 펩티드 서열은 성숙 폴리펩티드를 형성하기 위해 세균 프로테아제에 의해 생체내에서 초기 해독된 폴리펩티드로부터 통상 분리된다. 따라서, 달리 명시하지 않는 한, M 단백질(예를 들면)의 잔기 1 내지 50의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드로서 면역원성 펩티드에 대한 본원에서의 기재는 잔기 1이 신호 펩티드 서열의 부재하에 M 단백질의 아미노 말단에 존재한다. 면역원성 펩티드에 대한 예시적 아미노산 서열은 서열번호 29 내지 59에 제공되어 있다(참조: 서열목록 및 표 1).
M 단백질 또는 Spa 단백질의 용어 "아미노 말단 부분"은 폴리펩티드의 아미노 말단 절반에 위치된 폴리펩티드의 부분 또는 영역으로 당해 기술분야의 기술자에게 용이하게 이해된다. M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 아미노산을 포함하는 본원에 기재된 면역원성 펩티드는, 반드시 그렇지는 않지만, 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함할 수 있다(즉, 성숙 폴리펩티드의 아미노산 1 내지 25). 다른 예에서, 면역원성 펩티드는 성숙 단백질의 아미노 말단에 위치된 하나 이상의 아미노산을 결실하는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 유도된 적어도 25개 인접 아미노산을 포함할 수 있다(예: 성숙 단백질의 아미노산 2 내지 26, 3 내지 27, 4 내지 28 등). 다른 실시양태에서 및 예를 들면, 적어도 25개 인접 아미노산은 아미노산 부분 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25에서 시작하는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 유도될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 각각의 면역원성 펩티드의 아미노산 서열은, 적어도 부분적으로, 적어도 하나의 면역원성 에피포트의 존재 및, 공지된 인간 단백질에 존재하는 적어도 5개의 인접 아미노산과 동일한 적어도 5개의 인접 아미노산의 결실에 기초하여 선택된다.
한 가지 실시양태에서, 적어도 31개 상이한 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은 분리된 펩티드로서 개개 면역원성 펩티드를 각각 함유한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 그 이상의 상이한 면역원성 펩티드를 포함할 수 있고, 각각의 개개 면역원성 펩티드를 분리된 펩티드로서 함유한다. 각각의 이들 면역원성 펩티드는 각각 본원 및 당해 기술분야에 보다 상세히 기재된 기술 및 방법에 따라 화학적으로 합성되거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 개개 펩티드는 함께 조합되고 면역원성 조성물로 제형화될 수 있다. 본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 면역원성 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 적합한 부형제를 포함할 수 있고, 하나 이상의 약제학적으로 적합한 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 개개 면역원성 펩티드, 이량체 펩티드 및/또는 삼량체 펩티드의 조합물로서 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 4개의 상이한 면역원성 펩티드는 함께 종렬로 연결되어, 면역원성 조성물에 포함시키기 위한 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드(예를 들면, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45개 또는 그 이상의 상이한 면역원성 펩티드)를 포함하는 면역원성 조성물은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 융합 폴리펩티드는 함께 종렬로 연결된 적어도 4개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 보다 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물에 포함된 하나 이상의 융합 단백질은 종렬로 연결된 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 또는 그 이상의 개개 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 보다 구체적 실시양태에서, 종렬로 연결된 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고 본원에 기재된 면역원성 조성물에 사용되는 각각의 융합 폴리펩티드는 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 본원에 기재된 보다 구체적 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, GAS M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단으로부터의 각각 및 적어도 6개, 7개, 8개 또는 9개의 상이한 면역원성 펩티드는 4개의 융합 폴리펩티드를 제공하는 방식으로 함께 연결된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, GAS M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터의 각각 및 7개 또는 8개의 상이한 면역원성 펩티드는 4개의 융합 폴리펩티드를 제공하는 방식으로 융합 폴리펩티드당 종렬로 함께 연결된다. 언급된 또 다른 방식에서, 각각의 적어도 31개 상이한 면역원성 펩티드는 이들 4개 융합 폴리펩티드 중의 하나에 포함된다.
보다 구체적 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드(예를 들면, GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118로부터의 M 단백질 및 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터의 면역원성 펩티드)를 포함하고, 여기서 적어도 6, 7, 8 또는 9개의 상이한 면역원성 펩티드는 종렬로 함께 연결되어 적어도 4개의 융합 폴리펩티드를 형성한다. 한 가지 특정 실시양태에서, 4개의 융합 폴리펩티드 각각은 적어도 7개 또는 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 면역원성 조성물은 4개의 융합 폴리펩티드(이는 편의상 제1 융합 폴리펩티드, 제2 융합 폴리펩티드, 제3 융합 폴리펩티드 및 제4 융합 폴리펩티드로 불리울 수 있다)를 포함하고, 각각의 융합 폴리펩티드는 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드로부터 독립적으로 선택된 7 또는 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 어떠한 면역원성 펩티드가 제1, 제2, 제3 및 제4 융합 폴리펩티드 각각에 포함되는지 및 당해 면역원성 펩티드가 연결되는 순서는 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 통상적으로 실시되는 방법 및 기술을 사용하여 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 각 폴리펩티드의 면역원성의 최적화를 보장하기 위해 과도한 실험, 시험 및 오차 분석을 필요로 하지 않는다. 2개의 상이한 면역원성 펩티드가 종렬로 연결되는 결합부에 위치된 아미노산이 인간 단백질과의 동일성을 공유하는 5개의 인접 아미노산 서열이 삽입되어 있지 않다는 것을 측정하기 위해, 각 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원에 기재되고 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 데이타베이스에서 이용가능한 인간 단백질의 서열과 비교한다.
GAS 혈청형으로부터 M 단백질 및 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 3개 이상의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드는 아미노 말단에 위치된 면역원성 펩티드가 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에서 반복(즉, 복제)되도록 작제된다. 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에서 복제 면역원성 펩티드의 부재하에, 끝에서 두번째 및 카복시 말단 펩티드의 면역원성은 감소되거나 손상될 수 있다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 카복시 말단에서 아미노 말단 펩티드의 반복은 융합 단백질에 포함된 모든 펩티드의 면역원성을 보존하고, 목적하는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 당해 기술분야에서 사용되는, 비-GAS 담체 단백질, 예를 들면, 파상풍 톡소이드, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 기타 단백질 또는 단백질 단편의 함유 요구를 감소시키거나 제거한다(참조: 미국 특허 제6,716,433호 및 제7,402,316호).
본원에 기재된 바와 같이, M 단백질 및 Spa 단백질의 아미노산 서열은 당해 기술분야에서 용이하게 이용가능하다. CDC emm 타이핑 센터 웹사이트에서 제공된 바와 같은 데이타베이스는 GAS 혈청형으로부터의 M 단백질(본원에서 및 당해 기술분야에서 GAS 아형으로 지칭됨) 또는 GAS 혈청형으로부터의 Spa 단백질 내에서 아미노산 서열의 변이성을 측정하기 위해 이용할 수 있다. M 단백질(또는 Spa 단백질)의 아미노 말단 부분의 비교를 위한 정렬 도구는 가변성일 수 있는 아미노 말단 부분 내의 아미노산 잔기를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예시적이고, GAS에 대해 면역 반응을 유도하는데 유용한 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드는, 당해 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 면역원성에 역효과(통계학상 유의적 방식 또는 생물학적 또는 임상학적 유의적 방식으로 저하 또는 감소)를 미치지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식으로, 각각 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 면역원성과 실질적으로 유사한 변이체 펩티드 또는 변이체 융합 폴리펩티드의 면역원성이 바람직하다. GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118로부터의 M 단백질 및 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터의 면역원성 펩티드에 대한 예시적 아미노산 서열은 표 1에 제공되어 있다.
보다 구체적 실시양태에서 본원에는 특정 지리학적 영역에 사용될 수 있는 면역학적 조성물이 제공된다. 예를 들면, 특정 실시양태에서 본원에는 적어도 23개의 상이한 면역원성 펩티드(예를 들면, GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 58; 73; 75; 77; 78; 89; 118로부터의 M 단백질 및 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터의 면역원성 펩티드)를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되고, 여기서 적어도 6, 7, 8 또는 9개의 상이한 면역원성 펩티드는 함께 종렬로 연결되어 적어도 3개 또는 적어도 4개의 융합 폴리펩티드를 형성한다. 한 가지 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 각각 포함하는 3개의 융합 폴리펩티드 각각을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 면역원성 조성물은 3개의 융합 폴리펩티드(이는 편의상 제1 융합 폴리펩티드, 제2 융합 폴리펩티드 및 제3 융합 폴리펩티드로 불리울 수 있다)를 포함하고, 각각의 융합 폴리펩티드는 7 또는 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 이러한 예시적 면역원성 조성물은 유럽 등의 기타 세계 영역보다 북미의 GAS 감염에 보다 일반적인 GAS 혈청형을 포함한다. 49, 81, 82, 83, 87, 92 및 114 등의 GAS M 혈청형은 GAS 감염의 원으로서 북미보다 유럽에서 보다 빈번히 동정된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드는, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실(또한 본원에서 변이체라 함)을 갖는, 각각 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드 종을 포함한다. 본원에 기재된 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 펩티드 종 또는 융합 폴리펩티드 종은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실(또한 본원에서 변이체라 함)을 갖는 면역원성 펩티드 종 및 융합 폴리펩티드 종을 각각 포함한다. 면역원성 펩티드 변이체는, 면역원성 펩티드의 본원에 기재된 예시적 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하고 동일한 개개 GAS 혈청형의 상이한 아형의 아미노산 서열(Spa 단백질 또는 M 단백질의 아미노 말단 부분의 적어도 25개 인접 아미노산)을 포함하는 것들을 포함한다[참조: Dale et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:833-36 (2005); Facklam et al., Emerg. Infect. Dis. 5:247-53 (1999)]. 융합 폴리펩티드 변이체는 적어도 하나의 면역원성 펩티드 변이체를 포함하는 종을 포함한다. M 단백질 아형의 아미노산 서열은 CDC emm 타이핑 센터 웹사이트(supra)를 포함하는 공공 데이타베이스에서 이용가능하다.
면역원성 펩티드 변이체 및 융합 폴리펩티드 변이체는, 화학적 합성 또는 재조합 생성 동안 도입될 수 있고 임의의 방법을 사용하여 특정 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 생성하는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것들을 또한 포함한다. GAS에 대한 면역 반응의 유도에 유용한 면역원성 펩티드 변이체 융합 폴리펩티드 변이체는, 본원에 기재되고 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식으로 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 면역원성에 역효과를 미치지 않거나 면역원성을 변경(저하 또는 감소)시키지 않는 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. 또 다른 수단을 언급하면, 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 변이체는 각각 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 의해 제시된 면역원성을 보유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역원성의 유지는 GAS에 대한 면역 반응을 유발하는 능력, 예를 들면, 동계(cognate) 면역원성 펩티드 및/또는 융합 폴리펩티드, 동계 전장 또는 성숙 M 단백질 또는 Spa 단백질(분리되거나 GAS 세균의 세포 표면 상에 존재하는)에 특이적으로 결합하고 살균 및 식균 활성을 갖는 것들을 포함하는 항체의 생성을 포함한다.
일반적으로, 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 포함될 수 있는 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 아미노산의 보존적 치환은 공지되어 있고, M 단백질 또는 Spa 폴리펩티드에서 자연적으로 발생할 수 있거나 당해 펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 재조합에 의해 생성될 때에 도입될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이해되는 다양한 기준은 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 특정 위치에서 치환되는 아미노산이 보존적(또는 유사한)인지의 여부를 나타낸다. 예를 들면, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 아미노산은 하기 범주에 포함될 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예: 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산); 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신,프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하는 것이 보다 어려운 것으로 간주되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(예: 류신,발린, 이소류신 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 특정 상황에서, 글루탐산 대신에 글루타민 또는 아스파르트산 대신에 아스파라긴의 치환은, 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 2개 폴리펩티드 사이의 "유사성"은, 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 실시되는 Align 또는 BLAST 알고리즘 또는 기타 알고리즘 등의 임의의 하나의 알고리즘을 사용하여, 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이에 대한 보존된 아미노산 치환체를 제2 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열과 각각 비교함으로써 측정된다.
아미노산 치환, 결실 및 부가는, 당해 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성 동안 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 또는, 아미노산 치환, 결실 및 부가는 공지된 및 통상 실시되는 돌연변이유발 방법을 사용하여 재조합에 의해 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001]. 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적(또는 세그먼트 특이적) 돌연변이유발 공정을 사용하여, 목적하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변화된 특정 코돈을 갖는 변화된 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 또는, 랜덤 돌연변이유발 기술, 예를 들면, 알라닌 주사 돌연변이유발, 실수 유발 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발 및 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발을 사용하여, 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다[참조: Sambrook et al., supra]. 면역원성 펩티드 변이체 또는 융합 폴리펩티드 변이체는, 서열 목록(예를 들면, 서열번호 1 내지 12에 제시된 융합 폴리펩티드 및 서열번호 29 내지 59에 제시된 면역원성 펩티드)에 포함되는 본원에 제공된 임의의 예시적 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 각각 포함한다. 하나 이상의 추가 서열에 대한 특정 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 사용되는 임의의 정렬 도구를 사용하여 측정할 수 있다.
면역원성 활성을 나타내고 인간 세포 상에서 발현된 단백질과 교차 반응하는 항체를 유도하는 바람직하지 않은 에피토프를 결실하는 M 단백질 및 Spa 단백질의 영역에 관한 당해 기술분야 및 본원에서의 기재가 제공되면, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 M 단백질 및 Spa 단백질의 아미노산 말단 부분에서의 어느 아미노산이 보다 변화시키기 쉬운지의 여부(즉, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가) 및 어느 아미노산이 변화시키기 쉽지 않은지의 여부를 용이하게 측정할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드 중에 돌연변이를 도입하고, 이들 펩티드 및 폴리펩티드 및 이의 변이체를 분리하고 이들을 분석하기 위한 본원의 기재 및 당해 기술분야에서 통상 실시되는 다수의 분자 생물학, 단백질 발현 및 단백질 분리 기술 및 방법이 제공되면, 목적하는 면역원성은 과도한 실험 없이 용이하게 이루어질 수 있다. 면역원성의 유지는 GAS에 대한 면역 반응을 유발하는 능력, 예를 들면, 면역원성 펩티드 및/또는 융합 폴리펩티드, 동계 성숙 M 단백질 또는 Spa 단백질(GAS 세균의 세포 표면 상에서 분리되거나 존재하는), 또는 동계 전장 M 단백질 또는 Spa 단백질에 특이적으로 결합하고 살균 및 식균 활성을 갖는 것들을 포함하는 항체의 생성을 포함한다.
M 단백질 또는 Spa 단백질의 면역원성 펩티드 또는 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드의 변이체가 비-변이체 펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 비교가능한 형태로 중첩하는지의 여부를 평가하는 분석은, 예를 들면, 천연 또는 비중첩 에피토프에 특이적인 모노 또는 폴리클로날 항체와 반응하는 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 능력, 리간드-결합 기능의 보유 및 프로테아제를 사용한 소화에 대한 돌연변이체 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 감수성 또는 내성을 포함한다[참조: Sambrook et al., supra]. 본원에 기재된 면역원성 펩티드 변이체 및 융합 폴리펩티드 변이체는, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 실시되는, 본원에 기재된 이들 방법 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법에 따라 동정, 특성화 및/또는 제조될 수 있다.
개개 면역원성 펩티드 및 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드의 변이체는 생성 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않고서 제조될 수 있다(즉, 통계학적으로 유의한, 임상학적으로 유의한 또는 생물학적으로 유의한 방식으로 하나 이상의 면역원성 활성을 변화시키지 않고서 제조될 수 있다). 본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 예를 들면, 이러한 치환은 일반적으로 아미노산을 동일한 그룹, 예를 들면, 극성 잔기, 하전된 잔기, 소수성 잔기 및/또는 작은 잔기 등의 그룹에 포함되는 또 다른 아미노산으로 교환함으로써 이루어진다. 임의의 아미노산 치환의 효과는 생물학적 분석에서 기능하고 동계 리간드 또는 표적 분자, 예를 들면, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 결합하는 능력에 대해 수득된 변형된 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 시험함으로써 단순하게 경험적으로 측정할 수 있다.
4개 융합 폴리펩티드를 포함하는 예시적 항- GAS 면역원성 조성물
한 가지 특정 실시양태에서, GAS에 대한 면역 반응을 유도하는데 유용한 면역원성 조성물은 31개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 4개 융합 폴리펩티드 중의 하나에 도입된다. 각각의 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118 중의 하나로부터의 M 단백질의 아미노 말단 부분 또는 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질의 아미노 말단 부분의 것이다. 3개의 융합 폴리펩티드(편의상, 각각 제1, 제2 및 제3 융합 폴리펩티드라 함)는 각각 종렬로 연결된 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 제4 융합 폴리펩티드는 종렬로 연결된 적어도 7개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 융합 폴리펩티드는 상이한 8개의 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 1, 2, 3, 6, 12, 18, 28 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분 및 GAS 혈청형 18로부터 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 방식으로 언급하면, 제1 융합 폴리펩티드는 종렬로 연결된 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 M1 단백질, M2 단백질, M3 단백질, M6 단백질, M12 단백질, M18 단백질, M28 단백질 중의 하나 및 Spa 18 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다(즉, 융합 폴리펩티드는 따라서 M1 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 면역원성 펩티드, M2 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 면역원성 펩티드, M3 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 면역원성 펩티드 등을 포함한다). 면역원성 펩티드 중의 하나는 융합 폴리펩티드의 아미노 및 카복시 말단 각각에서 반복된다. 보다 특정 실시양태에서, 제1 융합 폴리펩티드는 GAS 혈청형 1로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드의 복제물(반복체)을 포함하고, 하나의 복제물은 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치되고, 제2 복제물은 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된다.
제2 융합 폴리펩티드는 상이한 8개 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 4, 5, 11, 14, 19, 24, 29 및 75 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 방식으로 및 제1 융합 폴리펩티드의 기재와 유사하게 언급하면, 제2 융합 폴리펩티드는 종렬로 연결된 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 M4 단백질, M5 단백질, M11 단백질, M14 단백질, M19 단백질, M24 단백질, M29 단백질 및 M75 단백질 중의 하나의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함한다. 면역원성 펩티드 중의 하나는 제2 융합 폴리펩티드의 아미노 및 카복시 말단의 각각에서 반복된다. 보다 특정 실시양태에서, 제2 융합 폴리펩티드는 GAS 혈청형 4로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드의 복제물(반복체)을 포함하고, 하나의 복제물은 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치되고, 제2 복제물은 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된다.
특정한 실시양태에서, 제3 융합 폴리펩티드는 상이한 8개의 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 22, 44, 58, 73, 77, 78, 89 및 118 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 방식 및 상기와 같이 언급하면, 제3 융합 폴리펩티드는 종렬로 연결된 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 M22 단백질, M44 단백질, M58 단백질, M73 단백질, M77 단백질, M78 단백질, M89 단백질 및 M118 단백질 중의 하나의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접한 아미노산을 포함한다. 면역원성 펩티드 중의 하나는 제3 융합 폴리펩티드의 아미노 및 카복시 말단의 각각에서 반복된다. 보다 특정 실시양태에서, 제3 융합 폴리펩티드는 GAS 혈청형 77로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드의 복제물(반복체)을 포함하고, 하나의 복제물은 융합 폴리펩티드의 아미노 말단 부분에 위치되고, 제2 복제물은 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된다.
제4 융합 폴리펩티드는 각각 상이한 7개의 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 GAS M 혈청형 49, 81, 82, 83, 87, 92 및 114 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 방식 및 상기와 같이 언급하면, 제4 융합 폴리펩티드는 종렬로 연결된 적어도 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 각각의 면역원성 펩티드는 M49 단백질, M81 단백질, M82 단백질, M83 단백질, M87 단백질, M92 단백질 및 M114 단백질 중의 하나의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함한다. 면역원성 펩티드 중의 하나는 제4 융합 폴리펩티드의 아미노 및 카복시 말단의 각각에서 반복된다. 보다 특정 실시양태에서, 제4 융합 폴리펩티드는 GAS 혈청형 83으로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드의 복제물(반복체)을 포함하고, 하나의 복제물은 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치되고, 제2 복제물은 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치된다.
각각의 제1, 제2, 제3 및 제4 융합 폴리펩티드에서 각각의 면역원성 펩티드는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 또는 그 이상의 인접 아미노산을 독립적으로 포함한다(또는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 40-55 또는 55-60 사이의 임의 수의 아미노산 또는 60개 이상의 인접 아미노산). 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 복제물 중에 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 복제물은 종렬로 존재한다(즉, 융합 단백질의 상이한 M 또는 Spa 단백질로부터 하나 이상의 면역원성 펩티드에 의해 분리되지 않음). 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 40개의 인접 아미노산 또는 적어도 45개의 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 펩티드는 각각의 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 50개의 인접 아미노산을 포함한다.
특정 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 면역원성 펩티드는 각각의 M 단백질의 아형으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 특정 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 3의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 3.1의 것이다. 다른 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 6의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 6.4의 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 5의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 5.0(모 아형)의 것이다. 특정한 실시양태에서, GAS 혈청형 14의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 14.3의 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 29의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 29.2의 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 49의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 49.1의 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, GAS 혈청형 83의 M 단백질로부터의 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 83.1의 것이다. 아형이 지정되지 않는 경우, M 단백질은 당해 기술분야에서 "모(parent)" 아형으로 고려되는 아형, 예를 들면, M12.0, M18.0, M28.0 등으로부터 유도된다.
보다 구체적 실시양태에서, 면역원성 펩티드가 GAS M 혈청형 1, 2, 3, 6, 12, 18, 28 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분 및 상기한 바와 같이 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 독립적으로 선택되는 8개의 면역원성 펩티드를 포함하는 제1 융합 폴리펩티드는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 하기 순서로 종렬로 연결된다: M1, M3.1, M6.4, M2, M18, M28, M12, Spa 및 M1. 각각의 M1, M18, M28, M12 및 Spa 면역원성 펩티드는 각각의 성숙 M 단백질 또는 Spa 단백질 각각으로부터 아미노산 잔기 1 내지 50을 포함한다. GAS 혈청형 3.1을 대표하는 면역원성 펩티드는 성숙 M3.1 단백질의 위치 22-71에 아미노산 잔기를 포함한다. M3.1 단백질 및 M6.4 단백질의 각각의 면역원성 펩티드는 잔기 1 내지 25의 복제물(즉, 반복체)에 종렬로 직접 연결된 각각의 성숙 M 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 25를 포함한다. M2 단백질의 면역원성 펩티드는 잔기 2 내지 26의 복제물(즉, 반복체)에 종렬로 직접 연결된 각각의 성숙 M 단백질의 아미노산 잔기 2 내지 26을 포함한다. 면역원성 펩티드가 GAS M 혈청형 4, 5, 11, 14, 19, 24, 29 및 75 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 독립적으로 선택되는 8개의 면역원성 펩티드를 포함하는 제2 융합 폴리펩티드는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 하기 순서로 종렬로 연결된다: M4, M5.0, M11, M75, M19, M29.2, M14.3, M24 및 M4. 각각의 M4, M11, M75, M29.2, M14.3 및 M24 면역원성 펩티드는 각각의 성숙 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 아미노산 잔기 1 내지 50을 포함한다. M5.0 단백질 및 M19 단백질의 각각의 면역원성 펩티드는 잔기 1 내지 25의 복제물(즉, 반복체)에 종렬로 직접 연결된 각각의 성숙 M 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 25를 포함한다. 면역원성 펩티드가 GAS M 혈청형 22, 44, 58, 73, 77, 78, 89 및 118 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 독립적으로 선택되는 8개의 면역원성 펩티드를 포함하는 제3 융합 폴리펩티드는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 하기 순서로 종렬로 연결된다: M77, M22, M73, M89, M58, M44, M78, M118 및 M77. 각각의 이들 M 단백질 면역원성 펩티드는 각각의 성숙 M 단백질의 아미노 말단 부분에 아미노산 잔기 1 내지 50을 포함한다. 면역원성 펩티드가 GAS M 혈청형 49, 81, 82, 83, 87, 92 및 114 중의 하나로부터 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 독립적으로 선택되는 7개의 면역원성 펩티드를 포함하는 제4 융합 폴리펩티드는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 하기 순서로 종렬로 연결된다: M83.1, M82, M81, M87, M49.1, M92, M114 및 M83.1. 각각의 이들 M 단백질 면역원성 펩티드는 각각의 성숙 M 단백질의 아미노 말단 부분에 아미노산 잔기 1 내지 50을 포함한다(또한 도 1 참조).
제1, 제2, 제3 및 제4 융합 폴리펩티드의 각각의 구체적 실시양태에 대한 예시적 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3 및 4에 제공되어 있다. 본원에 기재된 예시적 융합 폴리펩티드를 포함하는 임의의 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드는 발현, 가용화, 안정화, 분리 및/또는 검출을 촉진시키기 위해 아미노 또는 카복시 말단 또는 이들 둘 다에 이종성 펩티드 또는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 펩티드 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 재조합 방법에 따라 생성되는 경우, 아미노 말단에서의 개시 메티오닌 잔기가 통상 포함된다(예를 들면, 각각 제1, 제2, 제3 및 제4 융합 폴리펩티드에 상응하는 서열번호 5, 6, 7 및 8). 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 분리, 가용화, 안정화 및/또는 검출을 촉진시키기 위해 아미노 또는 카복시 말단에 부가될 수 있는 아미노산 서열(또한 폴리펩티드 태그라 함)의 예는 폴리히스티딘 태그(예: 6-His 태그), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), FLAGR 에피토프 태그(DYKDDDDK, 서열번호 60), 베타-갈락토시다제, 알칼리 포스파타제, 키틴 결합 단백질(CBP), XPRESSTM 에피토프 태그(DLYDDDDK, 서열번호 61; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 말토즈 결합 단백질(MBP), 티오레독신(가용화 태그) 및 폴리(NANP)(가용화 태그)를 포함한다[참조: 미국 특허 제5,011,912호; Hopp et al., (Bio/Technology 6:1204 (1988)]. 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 재조합에 의해 생성되는 경우, 친화성 서열은 벡터, 예를 들면 pBAD/His(Invitrogen)에 의해 제공되는 헥사-히스티딘 태그에 의해 공급될 수 있다. 또는, 친화성 서열은 합성에 의해 부가되거나, 핵산 코딩 서열을 재조합에 의해 생성하는데 사용된 프라이머 내로 조작될 수 있다(예: 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여). 폴리펩티드 태그를 사용하는 추가의 방법 및 기술은 당해 기술분야에서 통상 실시되고 목적하는 펩티드 또는 폴리펩티드에 태그를 부가하는 시스템 및 키트를 제조하는 상업적 공급자로부터 입수가능하다. 예를 들면, 제1, 제2, 제3 및 제4 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제를 촉진시키기 위해 폴리히스티딘 태그를 도입할 수 있다(각각 서열번호 9 내지 12 참조).
융합 폴리펩티드 변이체는, 서열 몰록(예: 서열번호 1 내지 12)를 포함하여, 본원에서 제공된 임의의 예시적 융합 폴리펩티드 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. GAS에 대한 면역 반응을 유도하는데 유용한 융합 폴리펩티드는, 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식으로 융합 폴리펩티드의 면역원성에 역효과를 미치지 않거나 면역원성을 변화(저하 또는 감소)시키지 않는 상술한 임의의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. 또 다른 방식으로 언급하면, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드의 변이체는 모(the parent) 또는 비-변이체 융합 폴리펩티드에 의해 제시된 면역원성을 보유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역원성의 보유는 GAS에 대한 면역 반응을 유발하는 능력, 예를 들면, 동계 면역원성 펩티드 및/또는 융합 폴리펩티드, 동계 성숙 또는 전장 M 단백질 또는 Spa 단백질(분리되거나 GAS 세균의 세포 표면 상에 존재하는)에 특이적으로 결합하고 살균 및 식균 활성을 갖는 것들을 포함하는 항체의 생성을 포함한다.
실시예에 기재된 바와 같이, 상기 기재된 예시적 제1, 제2, 제3 및 제4 융합 폴리펩티드를 각각 포함하는 면역원성 조성물을 사용한 동물의 면역화는 M 단백질 면역원성 펩티드 및 Spa 면역원성 펩티드(즉, GAS 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118)에 의해 제시된 각각의 Gas 혈청형에 특이적으로 결합한 살균 항체의 생성을 유발했다. 또한, 면역화된 동물로부터의 항혈청은, M 단백질 또는 Spa 단백질로부터의 면역원성 펩티드가 융합 폴리펩티드 중의 임의의 하나에서 제시되지 않는 GAS 혈청형의 절반 이상에 대해 살균성이다. 이러한 개선된 효능은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 다른 다가 조성물을 사용하는 이미 기재된 결과에 기초하여 예상할 수 있는 것보다 더욱 크다. 이미 기재된 26가 백신[참조: 미국 특허 제7,270,827호; Hu et al., supra]과 비교하는 경우, 본원에 기재된 면역원성 펩티드의 특정 조합은 비-백신 GAS 혈청형을 보다 유의적으로 인식했다(실시예 4 참조). 26가 조성물에 포함되지 않은 본원에 기재된 30가 면역원성 조성물에서 제시된 혈청형은 GAS M 혈청형 4, 29, 58, 44, 49, 73, 78, 81, 82, 83, 87, 118을 포함한다. 본원에 기재된 조성물 중의 면역원성 펩티드에 의해 제시되지 않는 26가 조성물 중의 혈청형은 GAS M 혈청형 1.2, 13, 33, 43, 59, 76 및 101을 포함한다.
2개의 상이한 면역원성 펩티드는 종렬로 직접 연결되어 이량체성 펩티드(또한 디펩티드라 함)를 형성할 수 있고, 이는 특정한 실시양태에서 면역원성 펩티드에 특이적인 항체를 검출하는 방법에 유용하다. 이량체성 펩티드는 당해 기술분야에서 통상 사용되고 실시되는 방법 및 기술에 따라 본원 및 당해 기술분야에 기재된 바와 같이 재조합에 의해 생성될 수 있다[참조: Hu et al., supra]. 또는, 이량체성 펩티드는 본원 및 당해 기술분야에 기재된 방법에 따라 화학적으로 합성할 수 있다. 이량체성 펩티드는 본원에 기재된 임의의 2개의 상이한 면역원성 펩티드로 구성될 수 있다. 예를 들면, 이량체성 펩티드(이는 면역원성 이량체성 펩티드를 포함함)는 2개의 면역원성 펩티드로 구성되고, 이량체성 펩티드의 각 펩티드는 상이하고, 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분의 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하며, 여기서 각각의 상이한 M 단백질은 GAS 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고, Spa 단백질은 GAS 혈청형 18로부터의 것이다.
면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드의 생성
본원에는, 그룹 A 스트렙토콕쿠스의 상이한 혈청형으로부터 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 단백질 및 이들 면역원성 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 각각의 면역원성 펩티드, 면역원성 이량체성 펩티드(즉, 2개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하는 폴리펩티드) 및 융합 폴리펩티드는 재조합에 의해 생성되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 개개 면역원성 펩티드, 면역원성 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 방법에 의해 작제되거나 화학적으로 합성될 수 있고, 작제된 또는 합성된 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서 당해 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 생성을 위해 발현 벡터 내로 도입될 수 있다.
펩티드 및 폴리펩티드는 수동 기술 또는 자동화 공정에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 폴리펩티드의 자동화 합성을 위한 장비는 공급업자, 예를 들면, 퍼킨-엘머, 인코포레이티드(Perkin-Elmer, Inc.) 및 어플라이드 바이오시스템스 디비젼(Applied BioSystems Division; Foster City, CA)로부터 상업적으로 입수가능하고, 제조업자의 지시에 따라 작동시킬 수 있다. 예를 들면, 고상 폴리펩티드 합성은 1960년대 초반 이래로 수행되어 왔다[참조: Merrifield, J. Am . Chem . Soc . 85:2149-2154 (1963)]. 합성 방법에 대한 다수의 개선이 개발되었고, 다수의 방법이 자동화되었으며, 화학이 말단 및 기타 반응성 그룹을 보호하기 위해 개발되었다[참조: Geysen et al., J. Immun . Meth . 102:259-274 (1987); Miranda et al., Proc. Nat !. Acad . Sci . USA 96:1181-86 (1999); Frank et al., Tetrahedron 44:6031-6040 (1988); Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 (1996); Perry-O'Keefe et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 93:14670-675 (1996); Schn6lzer, et al. Int . J. Pept . Protein Res . 40, 180-193 (1992); Hackeng et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 94:7845-50 (1997); Creighton, T. E. Protein:Structures and Molecular Properties, pp. 55-60, W. H. Freeman and Co., New York, NY (1984)]. 자동화 합성을 수행하는 장비는 다양한 제조업자로부터 이용가능하다. 합성된 펩티드, 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드는 다수의 상이한 통상의 펩티드 합성 제조업자로부터 수득할 수 있다. 필요한 경우, 합성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 예비 역상 크로마토그래피, 부분 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 전기영동 또는 이온-교환 크로마토그래피 또는 당해 기술분야에서 사용되는 기타 방법을 사용하여 정제할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 또한 화학적으로 합성될 수 있거나, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 재조합 방법에 의해 작제될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 자동 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 목적하는 특정 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈으로 설계될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 코돈은 뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있는 의도된 숙주를 위해 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 제조하는 한 가지 재조합 방법은 완전한 코딩 서열을 제조하기 위해 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터의 조립을 포함한다[참조: Au et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 248:200-203 (1998); Stemmer et al., Gene 164:49-53 (1995); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993)); Sambrook et al., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001); 등]. 화학적 합성 또는 재조합 합성 후에 폴리뉴클레오티드를 정제하는 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다[참조: Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra].
프라이머 및 프로브를 위한 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 오랫 동안 당해 기술분야에서 실시되어 왔다[참조: Letsinger et al., J. Am . Chem . Soc . 98:3655-61 (1976); Matteucci et al., J. Am . Chem . Soc . 103:3185-9 (1981)]. 보다 신속한 결과, 보다 큰 수율 및 보다 긴 폴리뉴클레오티드를 제공하는, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 합성하는 개선된 방법이 개발 및 자동화되었다[참조: Gao et al., Biopolymers 73:579-96 (2004); Mueller et al., Chem . Biol . 16:337-47 (2009); Lee et al., Nucleic Acids Res. 38:2514-21 (2010)]. 본원에 기재된 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상업적으로 합성할 수 있다[참조: GENSCRIPT, Piscataway, NJ].
본원에 기재된 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다양한 상이한 숙주 세포에서 재조합에 의해 발현될 수 있다. 재조합 발현 작제물을 함유하는 숙주 세포는 벡터 및/또는 발현 작제물(예를 들면, 클로닝 벡터, 셔틀 벡터 또는 발현 작제물)을 사용하여 유전학적으로 조작될 수 있다(형질도입, 형질전환 또는 형질감염). 벡터 또는 작제물은 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태로 존재할 수 있다. 유전자 조작된 숙주 세포는 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선택 또는 특정 유전자 또는 코딩-뉴클레오티드 서열의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 특정 숙주 세포에 대한 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등의 선택 및 유지는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백해질 것이다. 일반적으로 목적하는 숙주 세포는 충분한 양의 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 안정한 세포주를 수득하기 위해 배양물에서 지속된 증식으로 적용될 수 있는 것이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 지수상 성장 후의 배양물에서 반복적으로 계대(생존 상태를 유지하면서 적어도 10배)할 수 있는 세포주를 지칭하는 불명 세포주이다. 다른 실시양태에서, 세포주를 생성하는데 사용된 숙주 세포는 비조절된 성장을 가능하게 하는 세포, 예를 들면, 암 세포 또는 형질전환된 세포 또는 악성 세포이다.
유용한 세균 발현 작제물은 작동 프로모터로 작동 판독 상에서 적합한 해독 개시 및 종결 신호와 함께 목적하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 구조 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입함으로써 제조된다. 작제물은, 벡터 작제물의 유지를 보장하기 위해 및, 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선별가능한 마커 및 복제 기원을 포함할 수 있다. 형질전환을 위한 적합한 원핵세포 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 속 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로콕쿠스(Staphylococcus) 내의 다양한 종을 포함하지만, 다른 것들도 또한 선택 사항으로서 사용될 수 있다. 임의의 기타 플라스미드 또는 벡터는, 당해 플라스미드 또는 벡터가 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 당해 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합체 발현 작제물로서 다양한 발현 벡터 작제물 중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터 및 작제물은 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를 들면, 세균 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합물로부터 유도된 벡터; 바이러스 DNA, 예를 들면, 백시니아, 아데노바이러스, 가금 폭스 바이러스 및 위광견병을 포함한다.
적절한 DNA 서열(들)은 통상의 기술자가 친숙한 다양한 공정에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 특정한 예에서, DNA 서열은 당해 기술분야에 공지된 공정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 현저하게는, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 펩티드 중의 어느 하나 사이에 임의의 제한 효소 부위를 결여한다. 제한 부위, 및 제한 부위에 의해 코딩된 아미노산 서열의 누락은, 바람직하지 않은 면역원성(예를 들면, 표준 인간 단백질을 인식하는 항체의 제조를 유도하는)을 가질 수 있는, 목적하는 면역원성 에피토프가 역으로 변화될 수 있거나 에피토프가 우연히 부가될 수 있는 가능성을 제거하기 위해 의도된다. 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 수반하는 효소적 반응을 위한 표준 기술, 및 다양한 분리 기술은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되고 통상 사용되는 것들이다. 다수의 표준 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993) and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001)]에 기재되어 있다.
발현 벡터에서 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하기 위해 적어도 하나의 적절한 발현 조절 서열(예: 프로모터 또는 조절된 프로모터)에 작동적으로 연결된다. 이러한 발현 조절 서열의 대표적 예는, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac 또는 trp, 파지 람다 PL 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스에서 유전자의 발현을 조절하기 위해 공지된 기타 프로모터를 포함한다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별가능한 마커를 갖는 기타 벡터를 사용하여 임의의 목적하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 특정한 세균 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T5, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp를 포함한다. 진핵 프로모터는 CMV 즉시 초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택, 및 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 또는 조절된 프로모터를 포함하는 특정 재조합체 발현 작제물의 제조는 당해 기술분야의 통상의 기술자의 수준 내에 있다.
유도가능한, 관련된 프로모터 및/또는 엄격하게 조절된 프로모터의 설계 및 선택은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 특정 숙주 세포 및 발현 시스템에 따라 달라질 수 있다. pBAD 발현 시스템(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)은, 아라비노즈 대사 경로를 조절하는, 이. 콜라이 아라비노즈 오페론(PBAD 또는 PARA)[참조: Guzman et al., J. Bacteriology 177:4121-30 (1995); Smith et al., J. Biol . Chem . 253:6931-33 (1978); Hirsh et al., Celli Ⅱ :545-50 (1977)]을 사용하는 엄격하게 조절된 발현 시스템의 예이다. 이러한 시스템을 사용하는 다양한 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 엄격하게 조절된 프로모터-유도된 발현 시스템의 다른 예는 스트라타진(Stratagene, La Jolla, CA)로부터 입수가능한 PET 발현 시스템(참조: 미국 특허 제4,952,496호) 또는 tet-조절된 발현 시스템[참조: Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992); Gossen et al., Science 268:1766-69 (1995)]을 포함한다. pLP-TRE2 수용체 벡터(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)는, 부위-특이적 Cre-lox 재조합 시스템[참조: Sauer, Methods 14:381-92 (1998); Furth, J Mamm. Gland Biol. Neoplas. 2:373 (1997)]을 사용하여 목적하는 유전자의 엄격하게 조절된 유도가능한 발현을 위한 테트라사이클린-조절된 발현 작제물을 신속하게 형성하기 위해 CLONTECH CreatorTM 클로닝 키트에서 사용하기 위해 설계되고, 이는 또한 숙주 세포 불멸에 사용될 수 있다[참조: Cascio, Artif. Organs 25: 529 (2001)].
4개의 예시적 융합 폴리펩티드(서열번호 1 내지 4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13, 17, 21 및 25(서열번호 1을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다); 서열번호 14, 18, 22 및 26(서열번호 2를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다); 서열번호 15, 19, 23 및 27(서열번호 3을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다) 및 서열번호 16, 20, 24 및 28(서열번호 4를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다에 제공되어 있다. 각각의 서열번호 25, 26, 27 및 28은 발현 조절 서열, 개시 메티오닌 잔기를 코딩하는 코돈, 및 폴리-히스티딘 태그를 코딩하는 코돈을 결실한다. 각각의 서열번호 21, 22, 23 및 24는 각각의 융합 폴리펩티드의 개시 메티오닌 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 발현 조절 서열 및 폴리-히스티딘 태그 코딩 서열을 결실한다. 각각의 서열번호 17, 18, 19 및 20은 발현 조절 서열, 개시 메티오닌 잔기를 코딩하는 코돈 및 폴리-히스티딘 태그를 코딩하는 코돈을 포함한다(도 2A, 2C, 2E 및 2F 참조). 각각의 서열번호 13, 14, 15 및 16은 발현 조절 서열 및 개시 메티오닌 잔기를 코딩하는 코돈을 포함하지만, 폴리-히스티딘 태그를 코딩하는 코돈을 결실한다.
M 단백질 및 Spa 단백질을 코딩하는 예시적 뉴클레오티드 서열은 공공 데이타베이스[참조: cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes에서의 인터넷을 통해 접근된 GenBank; GenEBML; CDC emm 타이핑 센터 웹사이트]으로부터 본원에 기재된 바와 같이 용이하게 수득할 수 있다. M 단백질 변이체 또는 Spa 단백질 변이체의 뉴클레오티드 서열(또는 M 단백질 변이체 또는 Spa 단백질 변이체의 아미노 말단 부분)은, 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 사용되는 정렬 알고리즘 중의 어느 하나를 사용하여, 당해 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을, 특정 M 단백질 또는 Spa 단백질을 코딩하는 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 공지된 폴리뉴클레오티드와 비교함으로써 측정 및/또는 동정할 수 있다. 따라서, 2개 폴리뉴클레오티드 사이의 퍼센트 동일성은 용이하게 측정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 최대 대비를 위해 정렬될 때에 2개 서열의 뉴클레오티드 잔기가 동일한 경우에 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, M 단백질 면역원성 펩티드 변이체-코딩 폴리뉴클레오티드 또는 Spa 단백질 또는 면역원성 펩티드 변이체-코딩 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 또는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분을 코딩하는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 폴리뉴클레오티드의 영역의 뉴클레오티드 서열(면역원성 펩티드가 각각 유도되는)은 본원에 기재되어 있는 각 M 단백질 또는 Spa 단백질의 각각의 면역원성 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 98% 동일하다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한, 유전자 코드의 축퇴에 기인하여 뉴클레오티드 서열 동일성이 상이하고 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 공지된 아미노산 서열을 갖는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 코딩 폴리뉴클레오티드에 상보성인 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 임의의 면역원성 펩티드 또는 이의 변이체를 코딩하는 특정 폴리뉴클레오티드는 또한 프로브, 프라이머, 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 DNA 또는 RNA(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 사슬 RNA(예: 게놈 또는 합성) 또는 DNA(예: cDNA 또는 합성)일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 본원에 기재된 정렬 공정에 의해 동정할 수 있고, 또한 하이브리드화 방법에 의해 동정할 수 있다. 2개 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화는 적합한 적절하게 엄격한 조건의 사용을 도입하는 방법을 사용하여, 예를 들면, 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50℃-70℃, 5×SSC에서 1 내지 16시간 동안 하이브리드화하고; 이어서 0.05 내지 0.1% SDS를 함유하는 하나 이상의 각각의 2×, 0.5× 및 0.2× SSC로 22 내지 65℃에서 20 내지 40분 동안 세척하여 수행할 수 있다. 추가의 엄격성을 위해, 조건은 50 내지 60℃에서 15분 동안 0.1×SSC 및 0.1% SDS에서의 세척을 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 하이브리드화 조건의 엄격성에서의 변화는 예비-하이브리드화, 하이브리드화 및 세척 단계에 사용된 시간,온도 및/또는 용액 농도를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 적합한 조건은 또한 사용된 프로브의 특정 뉴클레오티드 서열(즉, 예를 들면, 구아닌 + 시토신(G/C) 대 아데닌 + 티미딘(A/T) 함량)에 부분적으로 좌우될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 프로브의 목적하는 선택성을 동정할 때에 적절하게 엄격한 조건이 과도한 실험 없이 용이하게 선택될 수 있음을 인지할 것이다.
경우에 따라, 면역원성 펩티드 변이체 및 융합 폴리펩티드 변이체는 유전자 조작 및 재조합 분자 생물학 방법 및 기술에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 1차 및 2차 아미노산 서열의 분석 및 당해 폴리펩티드의 3차 구조를 분석하기 위한 이들의 컴퓨터 모델링은 구조 및 결과적으로, 잠재적으로는 당해 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역원성을 변화시키지 않고서 치환, 부가 또는 결실될 수 있는 특이적 아미노산 잔기의 동정을 보조할 수 있다. 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예: DNA)의 변형은 DNA의 부위 특이적 또는 부위-지시된 돌연변이유발을 포함하는 다양한 방법에 의해 수행할 수 있고, 이들 방법은 DNA 주형에 변이체를 도입 및 변화시키기 위해 프라이머를 사용한 DNA 증폭, 예를 들면, 중복 신장(SOE)에 의한 PCR 스플라이싱을 포함한다. 돌연변이는, 비-변이체 서열의 단편에 대한 결찰을 가능하게 하는 제한 부위에 의해 플랭킹된, 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 위치에 도입될 수 있다. 결찰 후, 생성되는 재구성된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 변이체를 코딩한다. 본원에 기재된 바와 같이, 제한 부위는 돌연변이유발 공정 동안 도입될 수 있지만, 코딩된 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에서 제한 부위의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산의 포함은 목적하지 않는 에피토프의 도입 가능성을 감소시키기 위해 회피된다.
면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위 지시된 돌연변이유발은 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 실시되는 다수의 방법중 어느 하나에 따라 수행할 수 있다[참조: Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984); KunkelProc. Nat!. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987)]. 돌연변이(예: 치환되거나 또는 결실된)된 경우, 리간드(예: 모노클로날 또는 폴리클로날 항체)에 대한 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 결합을 변화시키는 잔기를 동정하기 위한 랜덤 돌연변이유발 방법이 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 실시되는 공정에 따라 또한 수행될 수 있다(예를 들면, 알라닌 주사 돌연변이유발; 실수 유발 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발; 및 뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)]). 변이체 또는 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 GAS에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 면역원성 조성물에서 사용하도록 의도되는 경우, 당해 변이체는 바람직하게는, 비-변이체 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 방식(즉, 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식)으로, 특이적 항체에 결합하고 GAS 세균에 결합하고 살균성인 항체의 생성을 유발하는 능력을 보유한다.
면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드의 특성화
본원에서 상세히 기재된 바와 같이, 면역원성 펩티드, 및 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드는 인간에서 GAS 감염을 유발하는 다수의 GAS 혈청형에 대한 면역 반응, 특히 보호 면역 반응을 유도하기 위한 면역원으로서 사용하도록 의도된다. 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드의 면역원성, 임의 수의 면역분석, 식작용 및 살균 분석을 측정 및 특성화하기 위해, 동물 연구가 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 실시되는 방법에 따라 수행될 수 있다. 대상체에게 투여되는 면역원성 조성물의 안전성을 평가하는 추가의 임상 전 연구가 통상 수행된다. 궁극적으로, 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 안전성 및 효능은 규제 당국에 의해 모니터링되는 임상 연구에 의해 결정될 수 있다.
면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드(또는 이를 함유하는 면역원성 조성물)의 면역원성은 본원에 기재된 면역원성 조성물을 본원 및 당해 기술분야에 기재된 면역화 프로토콜에 따라 숙주(또는 대상체, 환자)에게 투여함으로써 측정할 수 있다. 통상적으로, 초기 용량의 면역원성 조성물을 숙주에게 투여(또한 1차 면역화라 함)한 후, 1회, 2회 또는 그 이상 용량의 면역원성 조성물(또한 부스팅 또는 부스터 용량이라 함)을 투여한다.
일반적으로, 동물에서 임상 전 연구 동안 면역화된 숙주의 면역 반응을 모니터링하기 위해, 혈청은 제1 용량 전에 동물로부터 수득하고(즉, 면역 전 혈청) 및 최종 부스팅 용량 후에 수득한다. 혈청은 또한 1차 용량 및 최종 부스팅 용량 사이의 하나 이상의 부스팅 용량 후에 수득할 수 있다. 임상 연구 또는 판매후 연구 동안 면역화된 숙주의 면역 반응을 모니터링하기 위해, 혈청은 또한 1차 면역화 전 및 면역원성 조성물의 1회 이상의 투여 후에 인간으로부터 수득할 수 있다.
면역원에 펩티드(및 융합 폴리펩티드, 이량체성 펩티드, 전장 및 성숙 단백질, 또는 당해 단백질을 발현하는 GAS 세균)에 특이적으로 결합하는 항체는 임의의 면역글로불린 부류, 예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA에 속할 수 있다. 본원에 기재된 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드를 특성화하기 위해, 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체의 사용이 바람직할 수 있다. 항체는 동물, 예를 들면, 가금(예: 닭) 및 포유동물로부터 수득되거나 이들로부터 유도될 수 있고, 이는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 마우스, 랫트, 햄스터, 래빗 등의 설치류, 소, 말, 양, 염소, 낙타, 인간 등의 영장류를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 폴리클로날 항혈청은 동물을 면역원성 펩티드, 복수의 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드 또는 복수의 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로 면역화함으로써 동물로부터 수득한다.
면역화된 숙주(인간 숙주 포함)에서 면역원성 펩티드-특이적 항체의 생성은 IgG, IgA, IgM 및/또는 IgE를 포함하는 임의 부류의 면역글로불린 및 당해 부류 내의 이소형의 생성을 포함할 수 있다. 특이적 IgG, IgM, IgE 및 IgA(특히 점막 분비에서)의 존재는 면역화된 숙주로부터 수득한 생물학적 샘플(예: 혈청, 비 세척, 폐 세척 또는 기타 조직)에서 검출할 수 있다. 면역분석에서 면역원성 펩티드- 및 GAS-특이적 항체의 검출을 위해, 생물학적 샘플은 정제, 분리, 부분적으로 분리되는 항원 또는 이의 단편과 상호작용 또는 접촉하거나, 고정(예: 에탄올 또는 포름알데히드) 또는 비고정 또는 비변성될 수 있는 생물체와 상호작용 또는 접촉하게 할 수 있다. 점막 분비물은 인두 및 폐를 포함하는 호흡 도관으로부터 수집한 것들을 포함한다. 작용성 분석, 예를 들면, GAS의 식작용 또는 옵소닌화를 촉진시키고 GAS의 성장을 억제시키거나 세균을 치사시키거나 숙주 세포 내로 GAS의 도입을 방지하는 면역원-특이적 항체의 능력을 또한 수행할 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기재되어 있고, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 실시된다.
면역 혈청(즉, 1회 이상 용량의 면역원성 조성물로 면역화시킨 후에 숙주로부터 수득한 혈청) 또는 기타 생물학적 샘플은 면역 조성물(융합 폴리펩티드 내로 도입된 것들을 포함)에 포함된 하나 이상의 면역원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(면역글로불린)의 존재에 대해 평가할 수 있다. 본원에 기재된 면역분석 등과 같이 생물학적 샘플에서 특이적 항체의 존재를 검출하는 분석은 또한 성숙 또는 전장 M 단백질 또는 Spa 단백질 및/또는 전체 GAS 세균을 사용할 수 있다. 면역 혈청 중의 항체가 면역원성 조성물 중의 면역원성 펩티드에 의해 제시된 GAS 혈청형에 결합하는 수준, 및 항체가 조성물 중의 면역원성 펩티드에 의해 제시되지 않는 GAS 혈청형(또한 비-백신 GAS 혈청형이라 함)에 결합하는 수준을 측정할 수 있다. 항체가 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드, M 단백질, Spa 단백질 또는 GAS 세균에 결합하는 수준(통상 당해 기술분야에서 역가로서 지칭됨)은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 실시되는 임의의 하나 이상의 면역분석을 사용하여 용이하게 측정될 수 있다. 비제한적 예로서, 면역분석은 ELISA, 면역블롯, 방사면역분석, 면역조직화학, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 옥털로니(Ouchterlony) 등을 포함한다. 면역분석은 면역화 조성물에 포함된 하나 이상의 면역원성 펩티드를 사용하여 수행할 수 있고, 이는 당해 분석에서 개개 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드로서 사용될 수 있다.
한 가지 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있고 임의 부류 또는 이소형일 수 있고 본원에 기재된 생물학적 샘플에 존재하거나 존재하는 것으로 의심될 수 있는 항체를 검출하는 방법이 제공되고, 여기서 항체는 면역원성 펩티드(예를 들면, 서열번호 29 내지 59 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드를 포함), 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드(본원에 기재된 예시적 융합 폴리펩티드, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 3, 4 및 서열번호 5 내지 12 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드 중의 어느 하나를 포함) 중의 어느 하나에 결합한다. 당해 방법은 생물학적 샘플을, 샘플 중의 항체가 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 상호작용하기에 충분한 조건하에 시간 동안 상기 및 본원에 기재된 적어도 하나의 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 접촉시킴을 포함한다(즉, 혼합, 배합 또는 일부 방식에서는 생물학적 샘플 및 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 이량체성 펩티드가 상호작용하게 함). 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플에 존재하는 항체는 항체-항원 결합을 검출하기 위해 본원 및 당해 기술분야에 기재된 예시적 검출 방법 중의 어느 하나를 사용하여 검출할 수 있다. 비제한적 예를 들면, 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 결합된 항체는 항체의 보존된 영역, 예를 들면, 항체의 Fc 부분에 특이적인 시약을 사용하여 검출할 수 있고, 당해 시약은 항체의 공급원(즉, 항체가 포유동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 염소 또는 양 등의 것인지 또는 항체가 인간의 것인지)에 따라 통상 선택된다. 이러한 시약은 통상, 검출가능한 표지, 예를 들면, 효소, 형광 표지, 발광 표지 또는 방사활성 표지를 포함한다. 추가의 예시적 시약은 특이적 이소형 또는 부류의 항체를 검출하는 것들을 포함한다. 다수의 이러한 시약은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다.
온도, 완충제(염, 양이온, 매질 포함), 및 당해 분석에 사용된 면역 전 및 면역 혈청 내의 항체의 통합성 및 항원의 통합성을 유지하는 기타 성분(이는 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드, M 단백질, Spa 단백질 또는 세균)을 포함하는 특정 분석 조건은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하고/하거나 용이하게 결정할 수 있다. 혈청 등의 생물학적 샘플은 당해 샘플에 존재하는 항원과 항체 사이의 상호작용을 허용하기에 충분한 조건하에 시간 동안 항원과 접촉된다(혼합, 배합 또는 일부 방식에서는 상호작용하게 함). 면역 혈청 샘플(또는 기타 생물학적 샘플)에 존재하는 항원 대 항체의 상호작용 또는 결합 수준을 측정하고, 면역 전 샘플에 존재하는 각각의 항원 대 항체의 결합 수준(또는 달리는 적합한 음성 대조군)과 비교할 수 있다. 면역 전 혈청 샘플과 비교된 면역 혈청 샘플에 대한 항원의 결합 수준의 증가는 면역원성 조성물이 특이적 항체의 생성을 유발했음을 나타낸다. 본원에서 주목한 바와 같이, 면역화된 숙주로부터 샘플에 존재하는 항체에 대한 면역원의 결합 수준은 당해 기술분야에서 역가로서 통상 지칭된다.
특정 항원에 대한 항체의 상호작용 또는 결합은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용 및 소수성 상호작용을 일반적으로 수반한다. 이들 중의 어느 하나 또는 이의 임의의 조합은 항체와 이의 항원 사이의 결합에 중요한 역활을 담당할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체는, 당해 항체를 개개 면역원과 검출가능한 수준에서 반응시키는 경우, 바람직하게는 약 104 M-1 이상, 또는 약 105 M-1 이상, 약 106 M-1 이상, 약 107 M-1 이상, 또는 108 M-1 이상의 친화성 상수(Ka)로, 면역원성 펩티드, 당해 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, M 단백질, Spa 단백질 또는 GAs 세균에 "특이적"이거나 "특이적으로 결합"하는 것을 보여준다. 이의 동계 리간드(본 예에 있어서, 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드, M 단백질, Spa 단백질 또는 세균)에 결합하는 항체의 능력은 또한 해리 상수(KD)로서 나타낼 수 있고, 항체는, 결합하는 경우, 10-4 M 이하, 10-5 M 이하, 10-6 M d이하, 10-7 M 이하 또는 10-8 M 이하의 KD로 이의 동계 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다.
면역원성 펩티드 또는 면역원성 펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드에 대한 항체의 친화성은 통상의 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51: 660(1949)]에 기재된 것들 및 표면 플라스몬 공명(SPR; BIAcoreTM, Biosensor, Piscataway, NJ)을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 표면 플라스몬 공명에 있어서, 표적 분자는 고체 상에 고정되고, 유동 세포를 따라 작동하는 이동 상으로 리간드에 노출된다. 고정된 표적에 대한 리간드 결합이 발생하는 경우, 국소 굴절 지수가 변화하여 SPR 각의 변화를 유도하고, 이는 반사광의 강도 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링할 수 있다. 표면 플라스몬 공명 신호의 변화률을 분석하여 결합 반응의 결합 및 해리 상에 대한 외관 속도 상수를 수득할 수 있다. 이들 값의 비는 외관 평형 상수(친화성)를 제공한다[참조: Wolff et al., Cancer Res . 53: 2560-65 (1993)].
본원에 기재되고 당해 기술분야에서 통상 실시되는 시험관내 분석 중 몇몇을 사용하여, 본원에 기재된 면역원성 및 융합 폴리펩티드에 의해 유발된 특이적 항체의 활성을 측정할 수 있다. 예시적 분석은 옵소닌식작용 분석이고, 이는 시험 항혈청에 존재하는 옵소닌 항체의 존재에 의해 촉진된 식작용을 검출한다. 요약하면, 당해 분석은 면역 혈청의 존재하에 세균을 예비 배양한 후에 호중구에 의한 세균의 식작용 수준을 측정한다. 면역 전 또는 기타 적합한 음성 대조군이 또한 이러한 분석에 포함된다. 이어서, 예비배양된 세균을 적합한 숙주, 예를 들면, 옵소닌 보호가 요구되는 숙주(예: 인간)로부터의 전혈과 혼합하여, 옵소닌 항체에 의해 촉진된 식세포 활성의 척도인, 세균 세포와 결합하는 호중구의 비율을 측정한다. 면역 혈청과 함께 예비배양한 세균과 결합된 호중구의 비율은 면역 전 혈청(항-GAS 혈청을 함유하지 않는 것으로 생각되거나 공지된 기타 적합한 혈청)과 예비배양한 세균과 결합한 호중구의 비율과 비교할 수 있다. 면역 전 혈청과 함께 예비배양한 세균과 결합된 호중구의 비율과 비교하여, 면역 혈청과 함께 예비배양한 세균과 결합된 보다 큰 비율(즉, 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의하게 증가된 비율)의 호중구는 시험 면역 혈청이 옵소닌 항체를 함유함을 나타낸다.
샘플에 존재하는 항체의 살균 활성을 측정하는 또 다른 예시적 시험관내 분석은 살균 분석[참조: Hu et al., supra; 본원의 실시예]이다. GAS 세균을 면역 혈청 또는 적절한 대조군 혈청(예: 면역 전 혈청)과 함께 배양한 다음, GAS의 성장을 허용하는 배지(예: 양 혈액 아가) 상에 플레이팅한다. 통상적으로, 밤새 배양한 후, 생존 세균의 수를 정량화하고, 결과를 치사율로서 나타낸다. 치사율을 나타내기 위한 간접 살균 분석에 사용된 통상 사용된 식은 [(면역 전 혈청과 함께 예비배양한 세균 샘플의 CFU(콜로니 형성 단위) - (면역 혈청과 함께 예비배양한 세균 샘플의 CFU) ÷ 면역 전 혈청과 함께 예비배양한 세균 샘플의 CFU] × 100이다.
옵소닌화, 식작용 및 살균 분석은 잠재적 항-GAS 예방적 및 치료적 치료의 특성화를 위한 당해 기술분야에서 허용되는 시험관내 동물 모델이다. 예방학적 또는 치료학적 사용을 위한 백신의 유용성을 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 시사하는 하나 이상의 이들 분석으로 수득한 결과는 임상 연구 발견에 의해 뒷받침되었다[참조: 미국 특허 제7,270,827호; Kotloff et al., supra; McNeil et al., supra]. 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드 및 이를 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성을 특성화하는데 사용될 수 있는 동물 모델은 직접 면역치료 모델(즉, 동물을 잠재적 후보 면역원성 조성물로 면역화시킨 다음, GAS로 자극시킴)로서 간주되는 것들, 및 간접 또는 수동 면역치료 모델인 것들(즉, 항혈청, 또는 항혈청으로부터 정제 또는 분리되고 후보 면역원성 조성물로 면역화시킨 동물로부터 수득한 항체, 또는 GAS 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 GAS 자극 세균 이전에 또는 동시에 투여함)을 포함한다.
비-침윤성 질환, 예를 들면, 인두염과 유사한 동물 모델은 설치류 모델을 확립하는 것이 곤란했다. GAS 농가진을 연구하기 위한 마우스 모델은 문헌[참조: Scaramuzzino et al., Infect. Immun. 68:2880-87 (2000)]에 기재되어 있다. 인두염 연구용으로 성공적으로 개발된 비-인간 영장류 모델은 인간 질환과 유사한 급성 인두염의 사이노몰거스 마카쿠(cynomolgus macaque) 모델을 포함한다[참조: Ashbaugh et al., Cellular Microbial. 2:283-92 (2000); Sumby et al., in Meth. Malec. Biol. 431 :255-67 (DeLeo et al. ( ed.) Humana Press, Totowa NJ (2008)]. 당해 기술분야에서 이용가능한 다른 동물 모델은 침윤성 질환, 예를 들면, 침윤성 연질 조직 감염[참조: Ashbaugh et al., J Clin. Investig. 102:550-60 (1998); Boyle et al., J Infect. Dis. 177:991-97 (1998)]; 패혈증[참조: Goldmann et al., J Inf. Dis. 187:854-61 (2003); Kapur et al., Microbial. Pathogenesis 16:443-50 (1994); Medina et al., J Infect. Dis. 184:846-52 (2001)] 및 괴사 근막염[참조: Patel et al., J Inf. Dis. 181:230-34 (2000)]에 대한 치료 및 예방을 평가하기 위해 개발되었다.
면역원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체(및 이러한 폴리클로날 항체를 포함하는 면역 혈청)은 본원에 기재되고 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 실시되는 방법을 사용하여 제조할 수 있다[참조: Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992); Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)]. 또한, 문헌[미국 특허 제7,270,827호; 제6,716,433호; 제7,402,316호; 제7,063,850호] 참조. 폴리클로날 항체는 통상 동물, 예를 들면, 랫트, 마우스, 래빗, 염소, 소 또는 양에서 유도되지만, 항체는 또한 유인원 영장류로부터 수득할 수 있다. 개코원숭이를 면역화시키는 일반 기술은, 예를 들면, 국제 특허공개공보 WO 91/11465호(1991) 및 문헌[참조: Losman et al., Int . J Cancer 46:310, 1990]에서 발견할 수 있다.
면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 면역원성 조성물 중의 어느 하나로 면역화시킬 수 있는 비-인간 동물은, 비제한적으로 예를 들면, 마우스, 랫트, 래빗, 햄스터, 쪽제비, 개, 고양이, 낙타, 양, 소, 돼지, 말, 염소, 닭, 및 비-인간 영장류(예: 사이노몰거스 마카쿠, 침팬지, 붉은털 원숭이, 오랑우탕, 및 개코원숭이)를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 하나의 면역원성 조성물은 비경구(예: 정맥내), 복강내, 근육내, 피내, 안내 또는 피하 경로에 의해 동물을 면역화시키기 위해 투여될 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 적합한 아쥬반트를 포함하여 면역원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다[참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. 비-인간 동물의 면역화에 통상 사용된 아쥬반트는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 프레운드 완전(Freund's complete) 아쥬반트, 불완전 아쥬반트, 몬타니드 ISA, 리비 아쥬반트 시스템(RAS)(GlaxoSmithKline, Hamilton, MT), 및 니트로셀룰로즈-흡착된 항원을 포함한다. 일반적으로, 1차 주사 후, 동물은, 특히 면역원, 아쥬반트(경우에 따라) 및/또는 특정 동물 종에 따라 달라질 수 있는 바람직한 계획에 따라 하나 이상의 부스터 면역화를 제공받는다. 면역 반응은 동물을 주기적으로 출혈시키고, 혈청을 수집된 혈액으로부터 분리하고 혈청을 면역분석, 예를 들면, ELISA 또는 옥털로니 확산 분석으로부터 분석하여 특이적 항체 역가를 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 적절한 항체 역가가 확립되면, 동물은 폴리클로날 항혈청을 축적시키기 위해 주기적으로 출혈시킬 수 있다.
이어서, 면역원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는, 예를 들면, 적합한 고체 지지체 상에서 고정된 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 면역 항혈청으로부터 정제할 수 있다[참조: Coligan, supra, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al., Purification oflmmunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)]. 또는, 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 여기서 면역화된 특정 동물 종의 Ig 불변 영역에 특이적인 항체는 적합한 고체 지지체 상에 고정된다. 친화성 크로마토그래피는 또한, 특정 면역원성 펩티드에 대한 이들의 결합 활성에 의해 폴리클로날 항체를 분리하는데 유용할 수 있는, 하나 이상의 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 또는 융합 단백질의 사용을 포함할 수 있다.
면역원성 펩티드 및 목적한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 불멸 진핵 세포주(예: 하이브리도마)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1976), Eur. J Immunol. 6:511-19 (1975)]의 기술 및 이의 개선[참조: Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology , 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); 미국 특허 제4,902,614, 4,543,439, and 4,411,993; Monoclonal Antibodies , Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses , Plenum Press, Kennett et al. (eds.) (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane ( eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); 또한 예를 들어, Brand et al., Planta Med . 70:986-92 (2004); Pasqualini et al., Proc . Nat !. Acad . Sci . USA 101:257-59 (2004)]을 사용하여 또한 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드, 및 복수의 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성을 측정 및 모니터링하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 배야물 등의 진핵 세포 배양물의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 쥐 모노클로날 항체를 생성하는 대체 방법은 마우스, 예를 들면, 모노클로날 항체를 함유하는 복수액의 형성을 촉진시키기 위해 처리된(예: 프리스탄-프라이밍된) 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포를 주사하는 것이다. 오염균은 통상의 기술, 예를 들면, 크로마토그래피(예: 크기 배제, 이온-교환), 겔 여과, 침전, 추출 등에 의해 후속적으로 수거된 복수액으로부터 제거될 수 있다(통상 1 내지 3주 이내)[참조: Coligan, supra, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)]. 모노클로날 항체는 모노클로날 항체의 특정 특성(예: 중쇄 또는 경쇄 이소형, 결합 특이성 등)에 기초하여 선택된 적절한 리간드를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 고체 지지체 상에 고정된 적합한 리간드의 예는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역(경쇄 또는 중쇄) 영역, 항-유전자형 항체, 또는 B 세포의 공급원인 동물의 면역화에 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
필요한 경우, 인간 모노클로날 항체는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 친숙할 수 있는 임의의 기술에 의해 형성될 수 있다. 이러한 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 인간 말초혈 세포(예를 들면, B 림프구 함)의 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus; EBV) 형질전환[참조: 미국 특허 제4,464,456호; Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)], 인간 B 세포의 시험관내 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 면역화된 유전자이식 마우스로부터 비장 세포의 융합, 인간 면역화된 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 분리, 또는 당해 기술분야에 공지되고 본원의 기재에 기초하는 기타 공정을 포함한다. 예를 들면, 유전자이식 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994); Lonberg et al., Nature 368:856 (1994); Taylor et al., Int . Immun . 6:579 (1994); 미국 특허 제 5,877,397; Bruggemann et al., Curr . Opin . Biotechnol . 8:455-58 (1997); Jakobovits et al., Ann . N. Y Acad . Sci . 764:525-35 (1995)]에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 목적하는 항체를 생성하는 B 세포가 선택되고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 당해 기술분야[참조: WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052; Babcook et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:7843-48 (1996)]에 공지되고 본원에 기재된 분자 생물학 기술에 따라 B 세포로부터 클로닝된다. 인간화된 항체를 포함하는 키메라 항체가 또한 형성될 수 있다. 키메라 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유도된 적어도 하나의 불변 영역 도메인 및 별개의 제2 포유동물 종으로부터 유도된 적어도 하나의 가변 영역 도메인을 갖는다[참조: Morrison et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 81:6851-55 (1984); Shin et al., Methods Enzymol . 178:459-76 (1989); Walls et al., Nucleic Acids Res . 21:2921-29 (1993); 미국 특허 제5,482,856]. 비-인간/인간 키메라 항체는 추가로 유전자적으로 조작되어 "인간화된" 항체를 생성할 수 있다[참조: Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988)]. 인간화된 항체의 설계는, 예를 들면, 컴퓨터 모델링에 의해 비-인간 가변 영역의 CDR 루프 형태 및 구조적 결정소를 측정한 다음, CDR 루프 및 결정소를 공지된 인간 CDR 루프 구조 및 결정소와 비교하는 것을 포함할 수 있다[참조: Padlan et al., FASEB 9:133-39 (1995); Chothia et al., Nature, 342:377-83 (1989); Bajorath et al., Ther. Immunol. 2:95-103 (1995); Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, (1990); EP-0578515-A3].
특정 사용을 위해, 항체의 항원-결합 단편이 바람직할 수 있다. 항체 단편, F(ab')2, Fab, Fab', Fv 및 Fd는, 예를 들면, 항체의 단백질분해 가수분해, 예를 들면, 통상에 방법에 따라 완전 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 수득할 수 있다. 항체 단편은 또한, 당해 기술분야에 기재된 다수의 방법에 따라 복합체를 형성하기 위해 특이적 항원에 결합한다는 점에서 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작된 단백질일 수 있다[참조:Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. ( eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., ( eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)].
항체는 또한 인간 면역글로불린 파지 라이브러리, 래빗 면역글로불린 파지 라이브러리, 마우스 면역글로불린 파지 라이브러리 및/또는 닭 면역글로불린 파지 라이브러리로부터 동정 및 분리될 수 있다[참조: Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 (1994); Burton et al., Adv . Immunol . 57:191-280 (1994); ㅁ미국 특허 제5,223,409; Huse et al., Science 246:1275-81 (1989); Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997) 및 여기에서 인용된 문헌; Rader et al., J Biol . Chem. 275:13668-76 (2000); Popkov et al., J Mol . Biol . 325:325-35 (2003); Andris-Widhopf et al., J Immunol. Methods 242:159-31 (2000)]. 비-인간 종 또는 비-인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체는 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 유전자 조작되어 항체 또는 이의 단편을 "인간화"시킬 수 있다. 면역글로불린 가변 영역 유전자 결합 라이브러리는 본원에 기재된 면역원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 Ig 단편(Fab, Fv, scFv 또는 이의 다량체)를 선택하기 위해 스크리닝될 수 있는 파지 벡터에서 생성될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,223,409; Huse et al., Science 246:1275-81 (1989); Sastry et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:4363-66 (1991); Hoogenboom et al., J Molec . Biol . 227:381-388 (1992); Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997) 및 그 안에서 인용된 참조문헌; ㅁ미국 특허 제6,703,015].
면역원성 조성물의 제조
본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체(인간 또는 비-인간 동물)의 면역화에 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 당해 조성물이 인간 또는 비-인간 동물에게 투여하기 위해 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 또는 적합한 조성물, 제제 또는 제형으로 되도록 제형화될 수 있다. 면역원성 조성물은 본원에서 보다 상세히 기재되는 약제학적으로 허용되는(즉, 생리학적으로 적합한 또는 허용되는) 부형제(들)과 배합될 수 있다. 약제학적 조성물에서 사용하기 위해 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 생리학적 또는 약제학적으로 적합한 부형제 또는 담체(즉, 활성 성분의 활성을 간섭하지 않는 무독성 물질)을 본원에 기재된 조성물에 사용할 수 있다. 예시적 부형제는 당해 조성물의 성분(들)의 안정성 및 통합성을 유지하는 희석제 및 담체를 포함한다. 예시적 부형제는 단백질의 안정성 및 통합성을 유지하는 희석제 및 담체를 포함한다. 치료 용도의 부형제는 공지되어 있고, 본원에 보다 상세히 기재되어 있는 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)]에 기재되어 있다. 부형제의 선택은, 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 안정성; 투여 경로 및 투약 계획을 포함하는 몇몇 인자에 좌우된다. 예를 들면, 생리학적 pH의 염수 및 인산염 완충된 염수가 사용될 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향미제(경구 투여되는 경우)가 당해 조성물에 제공될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 또한 적합한 아쥬반트를 포함할 수 있다. 아쥬반트는 면역원성 펩티드 및 당해 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강(또는 개선, 증가)시키는 것으로 의도된다(즉, 아쥬반트 투여의 부재하에 특이적 면역 반응의 수준과 비교하여 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식으로 면역원성 펩티드에 대한 특이적 면역 반응 수준을 증가시킴).
인간에게 투여하기 위해, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트는 적절한 규제 단체에 의해 인간 투여용으로 승인되거나 승인가능한 것이다. 예를 들어, 본원에서 논의되고 당업계에 알려진 바와 같이, 완전 프레운드 아쥬반트는 인간 투여용으로 적합하지 않다. 목적하는 아쥬반트는 정성적 면역 반응에 역효과를 제공할 수 있는 면역원의 형태상 변화를 유발하지 않고서 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 대한 반응을 증대시킨다. 적합한 아쥬반트는 알루미늄 염, 예를 들면, 알룸(황산알루미늄칼륨), 또는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 황산알루미늄 등의 기타 알루미늄 함유 아쥬반트를 포함한다. 기타 약제학적으로 적합한 아쥬반트는, 비제한적으로 예를 들면, 무독성 모노포스포릴 지질 A[참조: Persing et al., Trends Microbial. 10:s32-s37 (2002)], 예를 들면, 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL)[참조: 영국 특허 제GB 2220211] 등의 무독성 지질 A-관련된 아쥬반트를 포함한다. 다른 유용한 아쥬반트는 남아프리카에서 발견되는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 몬리나(Molina) 나무로부터 분리한 트리터펜 글리코사이드 또는 사포닌을 포함하는 QS21 및 QuilA를 포함한다[참조: Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 제5,057,540]. 기타 적합한 아쥬반트는 면역 자극제와 임의로 배합된 수중유 에멀젼, 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A를 포함한다[참조: Stoute et al., N Engl. J Med. 336, 86-91 (1997)]. 기타 적합한 아쥬반트는 폴리글루탐산 또는 폴리리신, 리포솜 및 CpG 등의 중합체성 또는 단량체성 아미노산을 포함한다[참조: Klinman, Int . Rev . Immunol . 25(3-4):135-54 (2006); 미국 특허 제7,402,572; 유럽 특허 제772 619].
본원에 기재된 면역원성 조성물은 복수의 면역원성 펩티드 또는 복수의 융합 폴리펩티드를 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합함으로써 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역원성 조성물은 약제학적으로 적합한 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 통상적으로, 숙주에게 투여되도록 의도된 모든 면역원성 펩티드 또는 모든 융합 폴리펩티드는 단일 면역원성 조성물로 배합되고, 이는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있고 약제학적으로 적합한 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 또는, 예를 들면, 다중 면역원성 조성물은 본원 또는 당해 기술분야에 기재된 통상의 경로로 이루어질 수 있고 순차 또는 동시에 이루어질 수 있는 별도의 투여를 위해 개별적으로 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은, 본원에 기재된 바와 같이, 생리학적으로 허용되는 부형제(이는 또한 담체라 함) 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는, 멸균 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 면역원성 조성물은 고체, 액체 또는 기체(에어로졸)의 형태로 존재할 수 있다. 또는, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 동결건조물(즉, 동결건조된 조성물)로서 제형화될 수 있거나, 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 생물학적 활성 또는 불활성일 수 있는 기타 성분을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 완충제(예를 들면, 중성 완충된 염수 또는 인산염 완충된 염수), 탄수화물(예를 들면, 글루코즈, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질(예: 알부민), 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신, 항산화제, 킬레이트제, 예를 들면, EDTA 또는 글루타티온, 안정화제, 염료, 향미제, 및 현탁화제 및/또는 보존제를 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 부형제의 종류는 투여 방식에 기초하여 선택된다. 본원에 기재된 조성물 및 제제는, 예를 들면, 국소, 구강, 혀내, 경구, 비내, 자궁내, 직장, 질내, 안내, 결막내, 경피내, 설하, 또는 피하, 정맥내, 근육내, 흉골내, 음경해면체내, 관내 또는 요도내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식을 위해 제형화될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사 또는 근육내 주사에 있어서, 담체 또는 부형제는 바람직하게는 물, 염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함하고, 면역원성 조성물은 멸균성이다. 경구 투여에 있어서, 임의의 상기 부형제 또는 고체 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈쿰, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해가능한 미소구(예: 폴리락트산 갈락티드) 및 나노입자가 또한 본원에 기재된 조성물용의 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생분해가능한 미소구는, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기재되어 있다. 당해 조성물 또는 제제가 미소구와 배합되는 특정 실시양태에서, 미소구는 대략 25 마이크론보다 크다. 본원에 기재된 면역원성 조성물은 동결건조될 수 있거나, 달리는 투여시에 희석제로서 하나 이상의 적절한 부형제 용액(예: 슈크로즈, 생리학적 염수)을 사용하여 동결건조된 생성물로서 제형화될 수 있다. 나노입자는 동결건조된 생성물 및 적절한 부형제(들)를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 국소 투여, 예를 들면, 점막 조직 내로 직접 투여를 위해 의도될 수 있고, 이 경우 담체는 적합하게는 용액, 에멀젼, 연고 또는 겔 기재를 포함할 수 있다. 기재는, 예를 들면, 하나 이상의 하기 성분들을 포함할 수 있다: 석유, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 희석제, 예를 들면, 물 및 알콜, 및 유화제 및 안정화제, 증점제는 국소 투여(예: 경구 또는 질내)용 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 면역원성 조성물은 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 사용되는 몇몇 전달 비히클 중의 어느 하나를 사용하여 국소 투여될 수 있고, 여기에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 스폰지, 겔 캡, 좌제, 거즈(또는 치료되는 조직에 도포하기 위한 기타 적절한 직물), 나노입자 및 로젠지를 포함한다. 특정 전달 비히클, 예를 들면, 스폰지, 직물 또는 거즈와 관련하여, 상기 조성물 또는 제제는 치료되는 조직과 접촉시에 상기 조성물 또는 제제의 방출을 허용하는 비히클에 부착, 흡수, 흡착 또는 일부 방식에서는 도포된다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은, 예를 들면, 좌제 또는 로젠지의 형태로, 직장, 경구 또는 질내 투여용으로 의도될 수 있으며, 이는 직장, 경구 또는 질내 공간에서 각각 용해할 수 있고 약물 또는 조성물 성분을 방출할 수 있다. 경구 투여되는 본원에 기재된 조성물 또는 제제는 또한 액체 형태로 존재할 수 있다. 직장 투여용 조성물 또는 제제는 적합한 무자극성 부형제로서 유성 기재를 함유할 수 있다. 이러한 기재는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은, 특히 비경구 전달되는 경우, 바람직하게는 내독소를 비함유한다. 내독소 비함유 조성물은 실질적으로 내독소 및/또는 관련된 발열성 물질을 실질적으로 함유하지 않는다(즉, 내독소는 규제 당국에 의해 허용된 방법으로 검출불가능하여, 내독소가 존재하는지의 여부를 충분한 감도로 증명한다). 내독소는 살아있는 미생물에 존재하는 독소를 포함하고, 미생물이 세포 통합성 또는 다이(die)를 결여하는 경우에만 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 세균 및 기타 미생물의 외부 막에 위치된 열-유도, 열경화성 물질(리포폴리사카라이드 및 글리코단백질)을 포함한다. 이들 물질은, 인간에게 투여하는 경우, 열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 내독소를 함유하지 않는 조성물의 제조는 특별한 장치, 전문가를 필요로 할 수 있고, 내독소를 함유하는 제형보다 제조 비용이 현저히 높을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물의 제조방법이 제공된다. 제조 방법은 목적하는 복수의 면역원성 펩티드 또는 목적하는 융합 폴리펩티드를 배합 또는 혼합하여 본원에 기재된 면역원성 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 제조 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 생리학적으로 적합한(또는 약제학적으로 적합한) 부형제를 배합 또는 혼합하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법은 목적하는 면역원성 펩티드 또는 목적하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 약제학적으로 적합한 아쥬반트와 배합 또는 혼합하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물과 배합 또는 혼합할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 제조 방법은 목적하는 면역원성 펩티드 또는 목적하는 융합 폴리펩티드의 화학적 합성 또는 재조합 생성을 포함한다. 면역원성 펩티드 및 융합 폴리펩티드의 화학적 합성 및 재조합 생성은 본원에서 상세히 기재되어 있다. 각각의 면역원성 펩티드 및 융합 단백질의 제조 동안, 규제 당국에 의해 요구되는 적절한 제조 공정(예를 들면, Good Manufacturing Practices(GMP))이 사용된다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 면역원성 조성물의 제조 동안 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 안정성 및 통합성을 유지하기 위해 취해지는 기술 및 단계에 친숙하다.
면역원성 펩티드, 융합 폴리펩티드 및 면역원성 조성물을 사용하는 방법
복수의 GAS 면역원성 펩티드, 예를 들면, GAS M 단백질 또는 GAS Spa 단백질로부터 유도된 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하는 본원에 기재된 면역원성 조성물, 및 복수의 면역원성 펩티드(예를 들면, GAS M 혈청형 1; 2; 3; 4; 5; 6; 11; 12; 14; 18; 19; 22; 24; 28; 29; 44; 49; 58; 73; 75; 77; 78; 81; 82; 83; 87; 89; 92; 114; 118로부터 M 단백질 또는 GAS 혈청형 18로부터 Spa 단백질 중의 하나의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 각각 독립적으로 포함하는 적어도 31개의 상이한 면역원성 펩티드)를 포함하는 본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 인간 숙주일 수 있는 숙주(또는 대상체)를 GAS 세균에 대한 면역 반응(체액 반응 포함)을 유발하기에 적절한 방식으로 면역화시킴을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 이들 조성물은 GAS에 대한 부적절한 면역성을 갖고 감염에 감수성인 이를 필요로 하는 숙주의 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 유용하다.
GAS에 대한 면역 반응을 유도하고 GAS 감염을 예방(즉 발생 가능성의 감소) 및/또는 치료하기 위한 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 면역원성 조성물을 목적하는 항-GAS 면역 반응을 유발 및 유도하기 위해 숙주에게 적절한 시간 간격으로 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여하는 것을 포함한다. 당해 기술분야에서 오랫동안 공지된 바와 같이, GAS 감염으로부터 숙주의 보호는 일반적으로 GAS 혈청형-특이적 M 단백질에 대한 옵소닌화 항체의 생성과 관련된다[참조: Lancefield, J Immunol. 89:307, 1962]. 또한, 숙주에서 분비 또는 점막 항-GAS 항체의 존재는 스트렙토콕쿠스에 의한 초기 콜로니화를 방지(발생 가능성을 저하 또는 감소시킴)할 수 있다. 복수의 면역원성 펩티드를 포함하거나 당해 복수의 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기재된 면역원성 조성물은 GAS 감염의 예방, 완화 또는 치료에 사용될 수 있기 때문에, 면역원성 조성물은 또한 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 백신으로 지칭될 수 있다.
각 면역원성 조성물의 용량, 숙주에게 투여되는 용량의 수 및 2개 조성물 용량 사이의 시간 간격은 의학 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 숙주에게 투여되는 면역원성 조성물 중의 각 면역원성 펩티드의 적절한 양 또는 각 융합 폴리펩티드의 양은 숙주 또는 환자(예: 인간) 상태, 즉 질환 정도, 일반 건강 상태, 또한 연령 및 체중, 및 의학 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 기타 인자에 좌우될 것이다. 본원에 기재된 면역원성 조성물로 면역화시킬 수 있는 숙주 또는 대상체는 인간 및 비-인간 숙주 및 대상체를 포함한다. 인간 숙주/대상체는 유아, 어린이 또는 성인을 포함한다. 성인에게 투여하기에 적합한 면역원성 조성물은 성인이 청년, 중년 또는 노년인지에 따라 추가로 제조될 수 있다.
면역원성 조성물은 의학 분야에서 통상의 기술자에 의해 측정되는 바와 같이 치료(또는 예방)되는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 용량 및 적합한 기간 및 빈도의 투여는 환자의 상태, 환자의 연령, 치료 또는 예방되는 환자 질환의 종류 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법 등의 요인에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 섭생은 치료학적 및/또는 예방학적 이점(예를 들면, 개선된 임상 결과, 전체 생존, 또는 증상 중증도의 경감)을 제공하기에 충분한 양으로 면역원성 조성물을 제공한다. 예방학적 사용에 있어서, 용량은 통계학적, 생물학적 또는 임상학적으로 유의한 방식으로 감염의 개시를 예방 또는 지연시키고/시키거나 감염의 중증도를 감소시키기에 충분해야 한다.
최적 용량은 일반적으로 시험관내 실험, 생체내 동물 모델 및/또는 인간 임상 시험을 사용하여 결정될 수 있다. 최적 용량은 숙주의 체질량, 중량 또는 혈량에 좌우될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 양은 약 10㎍ 내지 약 10mg, 약 100㎍ 내지 1mg, 약 150㎍ 내지 500㎍ 또는 약 200㎍ 내지 약 400㎍ 범위의 용량으로 존재한다. 효과적 치료 및/또는 예방을 제공하기에 충분한 최소 용량의 사용이 일반적으로 바람직하다. 환자는 일반적으로 치료 또는 예방되는 상태에 적합한 분석을 사용하여 치료학적 또는 예방학적 효과에 대해 모니터링될 수 있고, 이러한 분석은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙할 것이다. 액체 형태로 투여되는 경우, 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 달라질 수 있지만, 통상 10 내지 60kg 대상체의 경우에 약 1ml 내지 약 500ml(적절한 용량을 포함) 범위일 수 있다.
부스터 면역화는 약 2주 내지 약 26주 범위의 목적하는 시간 간격, 예를 들면, 2, 4, 8, 12, 16 또는 26주 간격으로 복수회(예를 들면, 2회 또는 3회 또는 4회 또는 그 이상) 투여될 수 있다. 상이한 용량(예를 들면, 제1 용량과 제2 용량 사이, 또는 제2 용량과 제3 용량 사이) 사이의 시간 간격은 동일하지 않을 수 있고, 각 2개 용량 사이의 시간 간격은 독립적으로 결정될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 경구, 장내, 비경구, 경피/점막 및 흡입을 포함하는 경로로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 장내는 당해 제제가 위장관 또는 경구 점막을 통해 흡수되는 투여 경로이고, 경구, 직장 및 설하를 포함한다. 본원에 사용된 용어 비경구는 위장관을 우회하고 통상 주사 또는 주입에 의해 투여되는 투여 경로를 기재하고, 동맥내, 피내, 피하, 근육내, 비내, 안내, 복강내, 정맥내, 피하, 점막하, 질내, 흉골내, 음경해면체내, 척추강내, 관내 및 요도내 주사를 포함한다. 본원에 사용된 용어 경피/점막은 당해 제제가 국소를 포함하는 피부를 통해 또는 피부에 의해 투여되는 투여 경로이다. 용어 흡입은 당해 제제가 폐내 및 경폐를 포함하는 기관 내로 도입되는 투여 기술을 포함하고, 비내 투여를 포함한다. 보다 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 경구, 근육내 또는 비내 투여될 수 있다. 면역원성 조성물의 모든 용량은 동일한 경로에 의해 투여되지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 상이한 용량의 면역원성 조성물이 상이한 경로, 예를 들면, 경구, 근육내 및 비내 경로 중의 2개 이상에 의해 전달될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 하기 중의 임의의 하나를 유발하는 GAS 감염의 발생 가능성을 감소시키거나 GAS 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다: 인두염, 성홍열, 괴사성 근막염, 봉와직염, 뇌막염, 폐렴, 스트렙토콕쿠스 독성 쇼크 증후군, 균혈증, 패혈증, 패혈성 관절염, 농피증, 피부 감염(침윤성 및 비-침윤성), 농가진, 단독, 연질-조직 감염, 신염 및 GAS 발열성 반응. GAS에 대한 면역 반응을 유도하고 GAS 감염의 발생 가능성을 감소시키거나 GAS 감염을 치료하기 위한 본원에 기재된 방법은 또한 급성 류마티스성 열, 류마티스성 심장 질환, 반응성 관절염 및 사구체신염 등의 비화농성 후유증의 발생 가능성 또는 중증도를 효과적으로 감소시킬 수 있다.
면역화된 대상체는 일반적으로 치료 또는 예방되는 감염 또는 상태에 적합한 분석을 사용하여 치료학적 또는 예방학적 효과에 대해 모니터링될 수 있고, 이러한 분석은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하고 본원에 기재되어 있다. 상기 기재된 방법에 따라 본원에 기재된 면역원성 조성물을 투여함으로써 유발된 면역 반응은 체액 반응을 포함하는 적응 면역 반응을 포함하고, 또한 면역원성 조성물에서 제시된 각각의 면역원 펩티드에 특이적인 세포 반응(이는 CD4 면역 반응 및 CD8 면역 반응을 포함함)을 포함할 수 있다. 체액 면역 반응(즉, 항체 반응)은 면역분석(예: ELISA, 면역블롯팅), 시험관내 작용성 분석(예: 옵소닌, 식세포 및 치사 분석, 간접 살균 분석) 등 중의 어느 하나를 사용하는 면역화 프로토콜를 통해 모니터링할 수 있다. 이러한 방법은 면역화된 숙주로부터 생물학적 샘플(예: 혈청)에 존재하는 특이적 항체의 결합 수준(즉, 역가)을 모니터링 및 측정하는데 유용하다. 하나 이상의 이들 분석의 결과에 기초하여, 당해 용량 또는 후속 용량의 시간 또는 추가 용량의 필요성을 결정할 수 있다.
세포 매개된 면역 반응은 다양한 유형의 T 세포(즉, T 림프구)를 수반한다. 세포 매개된 반응에서, T 세포는 다수의 메카니즘에 의해 항원을 제거하도록 작용한다. 예를 들면, 특이적 항원을 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포는 사이토킨 등의 가용성 매개체를 방출하여 면역계의 추가 세포를 포집하고 면역 반응에 관여함으로써 반응할 수 있다. 또한, 세포독성 T 세포는 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, GAS 세균 세포 등의 항원-함유 세포에 결합하고 이를 파괴 또는 손상시킴으로써 반응할 수 있다.
세포 면역 반응을 시험하기 위해 당해 기술분야에서 통상 실시되는 분석은 사이토킨, 림포킨, 케모킨, 호르몬, 성장 인자 및 기타 매개체 등의 가용성 매개체의 존재 및 수준을 측정하는 것을 포함한다. 면역분석은 또한 면역 세포의 변화된 작용적 또는 구조적 특성, 예를 들면, 세포 증식, 변화된 운동성, 특이적 유전자 발현 또는 세포분해 거동 등의 분화된 활성의 유도; 세포 성숙 및 Th1 반응 및 Th2 반응 사이의 상관관계의 변화를 분석함으로써 면역 세포의 세포 활성화 상태 변화를 측정하는 것을 포함한다. 이들 및 유사한 분석을 수행하는 공정은, 예를 들면, 문헌[참조: Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998]. 또한 문헌[참조: Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) 및 그 안에서 인용된 참조문헌] 참조.
본원에서 간단히 기재된 바와 같이, 생물학적 샘플은 본원에 기재된 면역원성 조성물을 제공받은 대상체에서 면역원성 펩티드(들), 면역원성 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드 및/또는 전장 또는 성숙 또는 GAS 세균에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 측정하기 위해 대상체로부터 수득할 수 있다. 본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플(이로부터 혈청 또는 혈장이 제조될 수 있음), 생검 시료, 체액(예: 폐 세척, 복수, 점막 세척물, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식, 기관 배양물 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 기타 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물을 제공하기 전에 대상체로부터 수득할 수 있고, 이러한 생물학적 샘플은 기준선(즉, 면역화 전)을 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.
본원에 기재된 면역원성 조성물을 사용한 면역화에 대한 효과 측정은 또한 임상적 평가를 포함할 수 있다. 예를 들면, GAS 감염의 존재는, GAS가 체액 또는 신체 부위, 예를 들면, 목구멍, 점막 조직 또는 피부에 존재하는지를 신속하게 측정하기 위해 임상의가 이용가능한 통상의 분석(세균 세포 배양; 면역형광 분석)을 실시함으로써 측정할 수 있다. 열, 염증, 통증 및 다양한 기타 및 다수의 GAS 감염 증상 등의 징후학은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 모니터링될 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드는 샘플 중의 특이적 항체의 존재 및 수준을 검출하는 시약으로 사용될 수 있다. 생물학적 샘플, 비제한적으로 예를 들면, 면역화된 숙주로부터 본원에 기재된 생물학적 샘플, 또는 특이적 모노클로날 항체를 생성하는 것으로 공지되거나 생성할 것으로 의심되는 세포주로부터 세포 상청액 또는 세포 용액물이 수득된다. 생물학적 샘플은, 생물학적 샘플 및 면역원성 펩티드(단독으로 또는 거대 분자의 일부로서)가 상호작용하기에 적합한 조건하에 충분한 시간 동안 면역원성 펩티드(또는 각각의 면역원성 펩티드를 포함할 수 있는 이량체성 펩티드, 융합 폴리펩티드, 성숙 또는 전장 단백질 또는 GAS 세균)와 접촉(즉, 혼합, 배합 또는 일부 방식에서는 상호작용하게 함)된다. 생물학적 샘플과 면역원성 펩티드 사이의 상호작용 수준을 검출하고, 면역원성 펩티드와, 기준선 또는 음성 대조군으로 사용되는 대조군 생물학적 샘플과의 상호작용 수준을 비교한다. 상호작용 수준(즉, 항체 및 면역원성 펩티드의 결합)은 본원 및 당해 기술분야에 기재되고 당해 기술분야의 기술자가 친숙한 다수의 면역분석 방법 중의 어느 하나에 의해 측정할 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 펩티드, 이량체성 펩티드 및 융합 폴리펩티드는 또한 면역원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 생성하는 방법에 사용될 수 있다. 예시적 방법은 본원에 상세히 기재되어 있다.
실시예
실시예 1
GAS 혈청형 4로부터의 M 단백질
본 실시예는 GAS 혈청형 4의 세포 표면에 의해 발현되거나 표면 상에 존재하는 GAS 항원의 특성화를 기재한다.
하기 및 본원에 기재된 30가 백신의 잠재적 보호 효능은 단백질 2의 성분인 단백질 Arp4의 N-말단 내의 옵소닌 에피토프의 발견에 의해 증강되었다. Arp4는 IgA에 결합하는 것으로 이미 밝혀졌지만, 식작용에 대한 유동성 또는 내성을 요구하지 않는다[참조: Husmann et al., Infect. Immun. 63:345-348 (1995)]. 가장 최근의 역학적 연구는 유형 4 스트렙토콕쿠스 감염이 전체 GAS 감염의 9% 이하를 차지하는 것으로 밝혀졌다. Arp4(M4)의 N-말단 내의 옵소닌 에피토프를 검출하기 위해, 래빗 항혈청을 (1) 단백질의 N-말단 30개 아미노산을 나타내는 합성 펩티드, (2) 5개의 기타 M 펩티드 뿐만 아니라 Arp4의 50개 아미노-말단 잔기를 함유하는 재조합 융합 단백질 또는 (3) 순수한 재조합 Arp4 단백질에 대해 생성했다. 모든 3개 항혈청은, 시험관내 살균 분석(실험 프로토콜에 대한 실시예 3 참조)을 사용하여 시험하는 경우에 유의한 살균 활성을 제공했다: 항-sM4(1-30) 항혈청은 52% 치사를 제공했고; 6가 융합 단백질의 성분으로서 재조합체 50aa Arp4 펩티드로 면역화시킨 래빗으로부터 수득한 항혈청은 85% 치사율을 제공했다. 작용성 치사 분석의 결과는 Arp4(M4)의 N-말단 펩티드가 30가 백신에 포함시키기 위한 적합한 후보임을 나타냈다.
실시예 2
다가 GAS 펩티드 조성물의 설계 및 작제
본 실시예는 M 단백질 면역원성 단편이 선택될 수 있는 GAS 혈청형의 선택을 기재하고, 이들 면역원성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 작제를 기재한다.
M 펩티드는 1) 북미에서 소아과 대상체의 인두염[참조: Shulman et al., Clin. Infect. Dis. 2009, supra]; (2) 침윤성 GAS 감염[참조: Active Bacterial Core Surveillance of the Emerging Infections Program Network, supported by the Centers for Disease Control and Prevention] (참조: O'Loughlin et al., supra) 및 (3) 유럽에서의 침윤성 감염(예를 들면, 문헌[참조: StrepEuro consortium, see Luca-Harari et al., supra]에 보고됨)의 역학에 기초하여 GAS의 혈청형으로부터 선택되었다. 또한, 30가 백신 조성물에는 현재 "류마티스원성"이고 조직학적으로 "류마티스원성"인 것으로 간주되는 GAS의 혈청형으로부터 M 펩티드[참조: Shulman et al., Clin. Infect. Dis. 42:441-47 (2006)] 및 Spa18의 아미노-말단 펩티드(또한 GAS 혈청형 18로부터의 Spa 단백질이라 지칭됨, 그룹 A 스트렙토콕쿠스의 적어도 몇몇 혈청형에 의해 발현되는 보호 항원)[참조: Dale et al., J Clin . Invest . 103:1261-68 (1999); 미국 특허 제7,063,850호; 국제 특허공개공보 WO 00/37648호]가 포함된다.
면역원성 조성물에 포함시키기 위해 선택된 M 단백질의 아미노산 서열은 인터넷 주소 cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes로 접근하여 발견할 수 있는 기관(Center for Disease Control (CDC) emm 타이핑 센터 웹사이트)으로부터 수득했다. 아-유형이 존재하는 경우, 대부분의 경우에, 우세한 아형으로부터 M 단백질의 서열이 선택된다. 성숙 M 단백질 및 Spa의 아미노-말단 영역은 GenBank 데이타베이스의 BlastP에 의해 검색하여 인간 단백질과의 상동성 영역을 동정했다. 인간 단백질과 동일한 5개 이상의 인접 아미노산을 갖는 아미노-말단 영역은 백신 설계에 도입하지 않았다.
재조합 다가 융합 단백질의 작제 및 발현. 각 emm 유전자의 특이적 5' 서열을 사용하여 4개의 하이브리드 DNA 분자를 설계했다. 각각의 유전자는 종렬로 연결된 7 또는 8개 emm 유전자 단편, 상류 T7 프로모터 및 정지 코돈을 수반하는 3'폴리-히스티딘 모티브를 함유하도록 화학적으로 합성했다(GENSCRIPTR, Piscataway, NJ). 26가 백신과 달리[참조: Hu et al., supra; 미국 특허 제7,270,827호], 어떠한 연결 코돈도 emm 서열 사이에 삽입되지 않았다. 이. 콜라이에 대한 코돈 최적화는 후속 부위 돌연변이에 의해서가 아니라 합성 동안 수행되었다. DNA 가닥을 어닐링하고, pUC57 내로 결찰시키고; 합성 유전자 서열의 통합성은 ABI 염료 종결 방법을 사용하여 서열분석함으로써 증명했다. 각각의 다가 융합 단백질의 발현은 IPTG 도입 전후에 전체 세포 용해물을 사용하여 SDS-PAGE 분석으로 검출했다. 6개 히스티딘 잔기(즉, His-tag)의 폴리펩티드 태그는 당해 기술분야에 통상 실시되는 방법에 따라 니켈 친화성 크로마토그래피에 의한 정제의 용이화를 위해 카복시(또한 본원 및 당해 기술분야에서 COOH로 지칭됨) 말단에 부가했다.
도 1은 4개 융합 단백질 각각에 대한 코딩된 M 단백질 면역원성 펩티드의 개략도를 제공한다. M 단백질이 백신 조성물에 포함된 혈청형은 미국 및 캐나다의 모든 인두염의 98%, 미국에서 침윤성 질환의 90% 및 유럽에서 침윤성 감염의 78%를 차지하는 GAS 혈청형을 포함했다. 도 1에서, 각 면역원성 펩티드의 묘사 하부의 번호는 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분에서 아미노산의 위치를 지칭한다. 예시 및 설명의 목적으로, 단백질 1에서, M1 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 1로부터 M 단백질의 아미노 말단으로부터 위치 1-50의 아미노산을 함유하고; M3.1 면역원성 펩티드는 GAS 혈청형 3.1로부터 M 단백질의 아미노산 말단 부분으로부터 위치 22-71의 아미노산을 함유하고; M6.4는 GAS 혈청형 6.4의 아미노 말단 부분으로부터 위치 1-25의 아미노산의 종렬 반복체를 함유한다. 단백질 1의 카복시 말단에서, M1 면역원성 펩티드(아미노산 1-50)는 반복된다. 각 융합 단백질 중의 전체 아미노산 수는 각 단백질에 대한 도식의 우측 말단에 제공되고, 아미노 말단의 개시 메티오닌 잔기는 전체 아미노산 수에 포함된다.
면역원성 펩티드의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있다. 전장 M 단백질의 개시 아미노산(전형적으로 메티오닌)은 융합 단백질의 각 펩티드에 대한 면역원성 단편 펩티드 서열에 포함되지 않는다(표 1 참조). 4개 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 2A 내지 2H에 제시되어 있다. 도 2에 제시된 뉴클레오티드 서열은 코딩 영역 상류의 발현 조절 서열 및 His-태그를 코딩하는 카복시 말단의 뉴클레오티드를 포함한다(참조: 서열번호 17-20, 각각 융합 단백질 1-4를 코딩하는 뉴클레오티드). 발현 조절 서열을 포함하지만 His-tag 코딩 뉴클레오티드를 제외한 융합 단백질 1-4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 13 내지 16에 제공되어 있다. 발현 조절 서열을 제외하고 His-태그 코딩 뉴클레오티드를 제외하고 아미노 말단 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드(ATG)를 포함하는 융합 단백질 1-4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 17 내지 20에 제공되어 있다. 발현 조절 서열을 제외하고 His-태그 코딩 뉴클레오티드를 제외하고 아미노 말단 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드를 제외하는 융합 단백질 1-4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 21 내지 24에 제공되어 있다.
재조합 다가 백신 성분 융합 단백질의 정제. 각각의 융합 단백질은 이미 보고된 공정에 따라 별도로 정제했다[참조: Hu et al., supra]. 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 모니터링했고, 순수한 재조합체 단백질을 함유하는 분획을 합하고 사용할 때까지 20℃에서 저장했다.
개개 재조합체 이량체 M 펩티드의 작제 및 발현. 백신 성분 펩티드를 포함하는 개개 재조합체 이량체성 펩티드를, 이미 기재한 바와 같이 혈청학 시약으로 사용하기 위해 발현시키고 정제했다[참조: Hu et al., supra]. 또한, 7개의 새로운 M 펩티드를 이들 연구를 위해 화학적으로 합성했다[참조: GENSCRIPTR, Piscataway, NJ].
Figure 112014003402558-pct00001
Figure 112014003402558-pct00002
실시예 3
다가 GAS 펩티드 조성물의 면역원성
본 실시예는 다가 면역원성 조성물의 면역학적 특성을 특성화하기 위해 수행된 연구를 기재한다.
백신 제형 및 래빗의 면역화. 4개의 백신 융합 폴리펩티드를 등몰량으로 혼합하고, 알룸에 흡수시켰다(REHYDRAGELR, 저점도, Reheis, Inc., Berkeley Heights, NJ). 백신은 각각 0.5ml 용량이 200㎍, 400㎍, 800㎍ 또는 1000㎍의 단백질 및 대략 등몰량의 알룸 중량을 함유하도록 제형화했다. 3개의 뉴질랜드 백색 래빗의 그룹을 기재된 프로토콜에 따라 0, 4 및 8주에서 근육내 경로를 통해 4개 백신 용량으로 면역화했다[참조: Dale, Vaccine 17: 193-200(1999)]. 혈청은 1차 주사 전 및 최종 주사 2주 후에 수득했다.
종류-특이적 항체의 검출. ELISA는 이미 기재된 방법에 의해 면역 전 및 면역 래빗 혈청을 사용하여 수행했다[참조: Dale, Vaccine 17: 193-200(1999)]. 백신 펩티드를 포함하는 정제된 재조합 이량체성 M 펩티드 또는 합성 펩티드는 고체 상 항원으로 사용했다.
조직 교차-반응성 항체의 분석. 면역 혈청은 이미 기재된 방법에 의해 인간 심장, 뇌 및 신장의 동결 절편을 사용하여 간접 면역형광 분석에 의해 조직 교차-반응성 항체의 존재에 대해 시험했다[참조: McNeil et al., supra].
30가 백신으로 이루어진 4개 재조합 백신 단백질을 정제하고, 4개의 상이한 농도로 알룸 상에서 제형화했다. 용량 반응 연구는 시간 0, 4주 및 8주에서 200㎍, 400㎍, 800㎍ 또는 1000㎍의 3개 주사물을 제공받은 3마리 래빗 세트를 사용하여 수행했다. 최종 주사 2주 후에 수득한 혈청은 시험 항원으로서 백신 아단위 펩티드를 사용하여 ELISA에 의해 분석했다. 재조합 이량체 펩티드 또는 합성 펩티드는 플레이트에 결합된 항원에 대한 공급원으로 사용했다. 분석에 사용된 합성 펩티드는 M44, M78, M118, M81, M87 및 M49 펩티드였다. 용량 반응은 백신 아단위 펩티드에 대해 3개 항혈청에 대한 평균 기하 평균 항체 역가를 계산함으로써 측정했다: 200㎍ 용량 그룹 = 5651 평균 항체 역가, 400㎍ = 8868, 800㎍ = 9619 및 1000㎍ = 8071. 이들 데이타를 도시하는 그래프는 도 3에 제공되어 있다. 면역 혈청 중의 어떠한 것도, 간접 면역형광 분석으로 측정한 결과, 인간 뇌, 신장 또는 심장과 교차-반응한 항체를 함유하지 않았다. 용량-반응 곡선에 기초하여, 모든 후속 실험은, 고도의 면역원성이고 도 4A에 도시된 백신에 함유된 각각의 아단위 펩티드에 대한 유의한 수준의 항체를 유발한 800㎍ 용량 백신을 제공한 래빗의 항체를 사용하여 수행했다.
간접 살균 시험. 살균 시험은 이미 기재된 바와 같이 수행했다[참조: Hu et al., supra]. 요약하면, 세균을 함유하는 0.05ml의 토드-휴이트 배양액(Todd-Hewitt broth)을 시험 혈청 0.1ml 및 혈액 0.35ml에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 순환시켰다. 이어서, 이 혼합물 0.1ml 분획을 용융된 양 혈액 아가에 첨가하고, 분주 플레이트를 준비하고, 37℃에서 밤새 배양한 후에 생존 생물체(CFU)를 계수했다. 시험된 각각의 혈청형에 있어서, 3개의 상이한 접종물을 사용하여, 면역 전 혈청을 함유하는 혈액 중의 성장이 최적화 및 정량화 가능한지를 평가했다. 결과는 하기 식을 사용하여 계산되는 치사율로서 나타냈다: [(면역 전 혈청과 함께 3시간 배양 후의 CFU) - (면역 혈청과 함께 3시간 배양 후의 CFU) ÷ 면역 전 혈청과 함께 3시간 배양 후의 CFU] × 100. 면역 전 혈청의 존재하에 적어도 7세대까지 시험 균주의 성장을 야기한 분석물만을 사용하여 면역 혈청의 존재하에 치사율을 나타냈다.
800㎍ 용량의 백신은, 인간 전혈에서 시험관내 옵소닌식세포 치사 분석에 의해 측정한 결과, GAS의 백신 혈청형에 대해 유의한 수준의 살균 항체를 유도했다. 결과는 도 4B에 제시되어 있다. 50% 초과의 살균 치사율은 면역화된 래빗중 하나의 혈청을 사용하여 GAS의 28/30 백신 혈청형에서 관찰되었다. 50% 미만의 치사율을 갖는 2개 백신 혈청형과 관련하여, 살균 치사는 35 내지 40%였다[참조: 도 4B, GAS M 혈청형 77 및 44]. 모든 백신 혈청형에 대해 관찰된 평균 치사율은 83%였다.
실시예 4
비-백신 혈청형에 대한 면역 혈청의 살균 활성
본 실시예는 30가 백신 조성물로 면역화시킨 동물의 면역 혈청이 백신에서 제시되지 않은 GAS 혈청형에 대한 살균 활성을 나타냈음을 기재한다. 이들 데이타는 이미 기재된 26가 백신으로 면역화시킨 동물로부터 수득한 면역 혈청을 사용하여 수득한 데이타와 대조적이다.
26가 백신에 함유되지 않은 30가 백신에서 제시된 GAS M 혈청형은 M4, M29, M73, M58, M44, M78, M118, M82, M83, M81, M87 및 M49이다. 30가 백신의 성분이 아닌 26가 백신에서 제시된 혈청형은 M1.2, M43, M13, M59, M33, M101 및 M76이다[참조: Hu et al., supra; 미국 특허 제7,270,827호]. 특정 혈청형, 예를 들면, M1 혈청형은 현재 사용된 emm-타이핑 시스템 전에 특수형이었다[참조: Facklam et al., Emerg. Infect. Dis. 5:247-53 (1999)]. M1.2로 지정된 혈청형은 혈청형 M1.0으로부터의 현저한 아미노산 변화를 갖고, 보다 새로운 타이핑 표준하에서 M1 혈청형으로 간주되지 않을 것이다[참조: Dale et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:833-36 (2005)].
비-백신 혈청형에 대한 항혈청의 살균 활성. 살균 분석은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행했다. 또한, 30가 백신에 대한 면역 혈청(실시예 3 참조)은 백신에 제시되지 않은 GAS 혈청형의 패널에 대한 간접 살균 분석에 사용했다. 도 5A에 제시된 1차 실험에서, 50% 초과의 살균 활성은 내부 실험 모집단으로부터 랜덤으로 선택된 11/21 혈청형에 대해 관찰되었다. 50% 초과의 치사율을 나타낸 11개 혈청형에 대해 관찰된 평균은 80% 치사율이었고, 시험된 모든 21개 혈청형은 50%였다. 면역 혈청은 시험된 21개 비-백신 혈청형중 4개 혈청형에 대해 살균 활성을 결여했다.
2차 실험에서, 백신에 제시되지 않은 다수의 GAS 혈청형이 살균 활성 분석에 포함되었다. 도 5B에 제시된 바와 같이, 50% 초과의 살균 활성은 실험 모집단으로부터 선택된 33/47 혈청형에 대해 관찰되었다. 50% 초과 치사율을 나타낸 33개 혈청형에 대해 관찰된 평균은 80% 치사율이었고, 시험된 모든 47개 혈청형의 평균은 63%였다. 면역 혈청은 시험된 47개 비-백신 혈청형중 4개 혈청형에 대해 살균 활성을 결여했다.
비-백신 혈청형에 대해 30가 대 26가 백신에 의해 유발된 살균 항체 활성의 비교. 30가 백신에 의해 유발된 교차-옵소닌 항체가 이미 보고된 26가 백신[참조: Hu et al., supra; 미국 특허 제7,270,827호]보다 감염으로부터 보다 광범위한 보호를 잠재적으로 제공할 수 있는지를 측정하기 위해, 살균 분석을 동일한 실험에서 두 항혈청으로 수행했다. 30가 또는 26가 백신에 포함되지 않은 21개 GAS 혈청형은 본 실험에 포함시키기 위해 랜덤으로 선택했다. 결과는 도 6에 제시되어 있다. 백신 작제물에 제시되지 않은 10개 혈청형에 대해 30가 백신에 의해 촉진된 살균 치사 수준은 26가 항혈청으로 관찰된 것보다 유의적으로 보다 컷다(평균 64.9% 대 23.6%, p=0.0008, 스튜던트 t-시험, 쌍체, 양측).
상기 기재된 다양한 실시양태를 종합하여 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 참조되고/되거나 출원 데이타 시트에 수록된 모든 미국 특허, 미국 특허출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비특허 공보는 이들의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다. 당해 실시양태의 관점은, 필요한 경우, 변형시켜, 추가의 실시양태를 제공하기 위해 다수의 특허, 특허출원 및 공보의 개념을 사용할 수 있다.
당해 실시양태에 대한 이들 및 기타 변화가 상기 상세한 설명에 비추어 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 특허청구범위에서, 사용된 용어는 명세서 및 특허청구범위에 개시된 특정 실시양태로 당해 권리를 제한하는 것으로 해석되어서는 않되고, 이러한 청구범위가 권리가 있는 균등물의 전체 범위와 마찬가지로 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 당해 개시에 의해 제한되지 않는다.
<110> University of Tennessee Research Foundation <120> GROUP A STREPTOCOCCUS MULTIVALENT VACCINE <130> IPA131251 <150> US 61/498,397 <151> 2011-06-17 <150> US 61/641,448 <151> 2012-05-02 <160> 61 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 1 Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val Ile Glu Asp Leu Ala Ala Asn 1 5 10 15 Asn Pro Ala Ile Gln Asn Ile Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp Leu 20 25 30 Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys 35 40 45 Arg Ala Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser 50 55 60 Asn Tyr Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln 65 70 75 80 Lys Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu 85 90 95 Gln Glu Leu Asn Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp 100 105 110 Lys Ala Arg Glu Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Arg Val Phe 115 120 125 Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu Leu 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streptococcus M proteins. <400> 13 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatcatatg aacggtgacg 120 gtaacccgcg tgaagttatc gaagacctgg ctgctaacaa cccggctatc cagaacatcc 180 gtctgcgtca cgaaaacaaa gacctgaaag ctcgtctgga aaacgctatg gaagttgctg 240 gtcgtgactt caaacgtgct ctgctggacc aggttaccca gctgtacacc aaacacaact 300 ccaactacca gcagtacaac gctcaggctg gtcgtctgga cctgcgtcag aaagctgaat 360 acctgaaagg tctgaacgac tgggctgaac gtctgctgca ggaactgaac cgtgttttcc 420 cgcgtggtac cgttgaaaac ccggacaaag ctcgtgaact gctgaacaaa tacgacgttg 480 aaaaccgtgt tttcccgcgt ggtaccgttg aaaacccgga caaagctcgt gaactgctga 540 acaaatacga cgttgaaaac tccaaaaacc cggttccggt taaaaaagaa gctaaactgt 600 ccgaagctga actgcacgac aaaatcaaaa acctgtccaa aaacccggtt ccggttaaaa 660 aagaagctaa actgtccgaa gctgaactgc acgacaaaat caaaaacctg gctccgctga 720 cccgtgctac cgctgacaac aaagacgaac tgatcaaacg tgctaacgac tacgaaatcc 780 agaaccacca gctgaccgtt gaaaacaaaa aactgaaaac cgacaaagaa cagctgacca 840 aagaaaacga cgacctgaaa gctgaatccc cgaaatccac cgaaacctcc gctaacggtg 900 ctgacaaact ggctgacgct tacaacaccc tgctgaccga acacgaaaaa ctgcgtgacg 960 aatactacac cctgatcgac gctaaagaag aagaaccgcg ttacaaagct gaccactccg 1020 acctggttgc tgaaaaacag cgtctggaag acctgggtca gaaattcgaa cgtctgaaac 1080 agcgttccga actgtacctg cagcagtact acgacaacaa atccaacggt tacaaaggtg 1140 actggtacgt tcagcagctg gactccgttt ccggtctgga agttgctgac ccgtccgact 1200 ccaaaaaact gatcgaactg ggtctggcta aatacctgaa cgacaaactg ccgttcaaaa 1260 ccaaagaaga ctccgaaatc ctgtccgaac tgcgtgacgt tctgaaaaac aacggtgacg 1320 gtaacccgcg tgaagttatc gaagacctgg ctgctaacaa cccggctatc cagaacatcc 1380 gtctgcgtca cgaaaacaaa gacctgaaag ctcgtctgga aaacgctatg gaagttgctg 1440 gtcgtgactt caaacgtgct tag 1463 <210> 14 <211> 1463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 14 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg gctgaaatca 120 aaaaaccgca ggctgactcc gcttggaact ggccgaaaga atacaacgct ctgctgaaag 180 aaaacgaaga actgaaagtt gaacgtgaaa aatacctgtc ctacgctgac gacaaagaaa 240 aagacccgca gtaccgtgct gctgttaccc gtggtaccat caacgacccg cagcgtgcta 300 aagaagctct ggacaaatac gaactggaaa accacgctgt tacccgtggt accatcaacg 360 acccgcagcg tgctaaagaa gctctggaca aatacgaact ggaaaaccac accgaagtta 420 aagctgctgg tcagtccgct ccgaaaggta ccaacgtttc cgctgacctg tacaactccc 480 tgtgggacga aaacaaaacc ctgcgtgaaa aacaggaaga atacatcacc aaaatccaga 540 acgaagaaac caaaaacaaa gaagaagaac gtaccttcac cgaactgccg tacgaagctc 600 gttacaaagc ttggaaatcc gaaaacgacg aactgcgtga aaactaccgt cgtaccctgg 660 acaaattcaa caccgaacag ggtaaaacca cccgtctgga agaacagaac cgtgttcgtt 720 acacccgtca caccccggaa gacaaactga aaaaaatcat cgacgacctg gacgctaaag 780 aacaccgtgt tcgttacacc cgtcacaccc cggaagacaa actgaaaaaa atcatcgacg 840 acctggacgc taaagaacac cgtgtttaca tcacccgtcg tatgaccaaa gaagacgttg 900 aaaaaatcgc taacgacctg gacaccgaaa accacggtct gaaacagcag aacgaacagc 960 tgtccaccga aaaacagggt ctggaagaac agaacaaaca gctgtccacc gaccgtgttt 1020 cccgttccat gtcccgtgac gacctgctga accgtgctca ggacctggaa gctaaaaacc 1080 acggtctgga acaccagaac accaaactgt ccaccgaaaa caaaaccctg caggaacagg 1140 ctgaagctcg tcagaaagaa gttgctaccc gttcccagac cgacaccctg gaaaaagttc 1200 aggaacgtgc tgacaaattc gaaatcgaaa acaacaccct gaaactgaaa aactccgacc 1260 tgtccttcaa caacaaagct ctgaaagacc acaacgacga actgaccgaa gctgaaatca 1320 aaaaaccgca ggctgactcc gcttggaact ggccgaaaga atacaacgct ctgctgaaag 1380 aaaacgaaga actgaaagtt gaacgtgaaa aatacctgtc ctacgctgac gacaaagaaa 1440 aagacccgca gtaccgtgct tag 1463 <210> 15 <211> 1463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 15 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg gaaggtgttt 120 ccgttggttc cgacgcttcc ctgcacaacc gtatcaccga cctggaagaa gaacgtgaaa 180 aactgctgaa caaactggac aaagttgaag aagaacacaa aaaagaccac gaacagctgg 240 aaaaaaaatc cgaagacgtt gaatcctcca acaacgctga atcctccaac atctcccagg 300 aatccaaact gatcaacacc ctgaccgacg aaaacgaaaa actgcgtgaa gaactgcagc 360 agtactacgc tctgtccgac gctaaagaag aagaaccgcg ttacaaagct gacaaccagt 420 ccccggctcc ggttaaaaaa gaagctaaaa aactgaacga agctgaactg tacaacaaaa 480 tccaggaact ggaagaaggt aaagctgaac tgttcgacaa actggaaaaa gttgaagaag 540 aaaacaaaaa agttaaagaa gactccgaca acatcaaccg ttccgtttcc gttaaagaca 600 acgaaaaaga actgcacaac aaaatcgctg acctggaaga agaacgtggt gaacacctgg 660 acaaaatcga cgaactgaaa gaagaactga aagctaaaga aaaatcctcc gactcctccc 720 gtgaagttac caacgaactg accgcttcca tgtggaaagc tcaggctgac tccgctaaag 780 ctaaagctaa agaactggaa aaacaggttg aagaatacaa aaaaaactac gaaaccctgg 840 aaaaaggtta cgacgacctg gctgaatccc gttccgtttc ccagggttcc gtttccctgg 900 aactgtacga caaactgtcc gacgaaaacg acatcctgcg tgaaaaacag gacgaatacc 960 tgaccaaaat cgacggtctg gacaaagaaa acaaagaata cgcttcccag gaatcccaga 1020 actcccgttc catcaccaac gaacagctga tcgacaaact ggttgaagaa aacaacgacc 1080 tgaaagaaga acgtgctaaa tacctggacc tgctggacaa ccgtgaaaaa gacccgcagt 1140 accgtgctct gatgggtgaa gctgaaaaaa aagttgaagt tgctgactcc aacgcttcct 1200 ccgttgctaa actgtacaac cagatcgctg acctgaccga caaaaacggt gaatacctgg 1260 aacgtatcga agaactggaa gaacgtcaga aaaacctgga aaaactggaa gaaggtgttt 1320 ccgttggttc cgacgcttcc ctgcacaacc gtatcaccga cctggaagaa gaacgtgaaa 1380 aactgctgaa caaactggac aaagttgaag aagaacacaa aaaagaccac gaacagctgg 1440 aaaaaaaatc cgaagacgtt tag 1463 <210> 16 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 16 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg gacaacccgc 120 gttacaccga cgctcacaac gctgttaccc agggtcgtac cgttccgctg cagaacctgc 180 tgcacgaaat ggacaaaaac ggtaaactgc gttccgaaaa cgaagaactg aaagctgacc 240 tgcagaaaaa agaacaggaa gactcctcct cccgtgacat 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ctgttcgaca 1140 aactggaaaa agttgaagaa gacaacccgc gttacaccga cgctcacaac gctgttaccc 1200 agggtcgtac cgttccgctg cagaacctgc tgcacgaaat ggacaaaaac ggtaaactgc 1260 gttccgaaaa cgaagaactg aaagctgacc tgcagaaaaa agaacaggaa tag 1313 <210> 17 <211> 1481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 17 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatcatatg aacggtgacg 120 gtaacccgcg tgaagttatc gaagacctgg ctgctaacaa cccggctatc cagaacatcc 180 gtctgcgtca cgaaaacaaa gacctgaaag ctcgtctgga aaacgctatg gaagttgctg 240 gtcgtgactt caaacgtgct ctgctggacc aggttaccca gctgtacacc aaacacaact 300 ccaactacca gcagtacaac gctcaggctg gtcgtctgga cctgcgtcag aaagctgaat 360 acctgaaagg tctgaacgac tgggctgaac gtctgctgca ggaactgaac cgtgttttcc 420 cgcgtggtac cgttgaaaac ccggacaaag ctcgtgaact gctgaacaaa tacgacgttg 480 aaaaccgtgt tttcccgcgt ggtaccgttg aaaacccgga caaagctcgt 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caccaccacc accaccacta g 1481 <210> 19 <211> 1481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 19 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg gaaggtgttt 120 ccgttggttc cgacgcttcc ctgcacaacc gtatcaccga cctggaagaa gaacgtgaaa 180 aactgctgaa caaactggac aaagttgaag aagaacacaa aaaagaccac gaacagctgg 240 aaaaaaaatc cgaagacgtt gaatcctcca acaacgctga atcctccaac atctcccagg 300 aatccaaact gatcaacacc ctgaccgacg aaaacgaaaa actgcgtgaa gaactgcagc 360 agtactacgc tctgtccgac gctaaagaag aagaaccgcg ttacaaagct gacaaccagt 420 ccccggctcc ggttaaaaaa gaagctaaaa aactgaacga agctgaactg tacaacaaaa 480 tccaggaact ggaagaaggt aaagctgaac tgttcgacaa actggaaaaa gttgaagaag 540 aaaacaaaaa agttaaagaa gactccgaca acatcaaccg ttccgtttcc gttaaagaca 600 acgaaaaaga actgcacaac aaaatcgctg acctggaaga agaacgtggt gaacacctgg 660 acaaaatcga cgaactgaaa gaagaactga aagctaaaga 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accaggttac ccagctgtac 180 accaaacaca actccaacta ccagcagtac aacgctcagg ctggtcgtct ggacctgcgt 240 cagaaagctg aatacctgaa aggtctgaac gactgggctg aacgtctgct gcaggaactg 300 aaccgtgttt tcccgcgtgg taccgttgaa aacccggaca aagctcgtga actgctgaac 360 aaatacgacg ttgaaaaccg tgttttcccg cgtggtaccg ttgaaaaccc ggacaaagct 420 cgtgaactgc tgaacaaata cgacgttgaa aactccaaaa acccggttcc ggttaaaaaa 480 gaagctaaac tgtccgaagc tgaactgcac gacaaaatca aaaacctgtc caaaaacccg 540 gttccggtta aaaaagaagc taaactgtcc gaagctgaac tgcacgacaa aatcaaaaac 600 ctggctccgc tgacccgtgc taccgctgac aacaaagacg aactgatcaa acgtgctaac 660 gactacgaaa tccagaacca ccagctgacc gttgaaaaca aaaaactgaa aaccgacaaa 720 gaacagctga ccaaagaaaa cgacgacctg aaagctgaat ccccgaaatc caccgaaacc 780 tccgctaacg gtgctgacaa actggctgac gcttacaaca ccctgctgac cgaacacgaa 840 aaactgcgtg acgaatacta caccctgatc gacgctaaag aagaagaacc gcgttacaaa 900 gctgaccact ccgacctggt tgctgaaaaa cagcgtctgg aagacctggg tcagaaattc 960 gaacgtctga aacagcgttc cgaactgtac ctgcagcagt actacgacaa caaatccaac 1020 ggttacaaag gtgactggta cgttcagcag ctggactccg tttccggtct ggaagttgct 1080 gacccgtccg actccaaaaa actgatcgaa ctgggtctgg ctaaatacct gaacgacaaa 1140 ctgccgttca aaaccaaaga agactccgaa atcctgtccg aactgcgtga cgttctgaaa 1200 aacaacggtg acggtaaccc gcgtgaagtt atcgaagacc tggctgctaa caacccggct 1260 atccagaaca tccgtctgcg tcacgaaaac aaagacctga aagctcgtct ggaaaacgct 1320 atggaagttg ctggtcgtga cttcaaacgt gcttag 1356 <210> 22 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 22 atggctgaaa tcaaaaaacc gcaggctgac tccgcttgga actggccgaa agaatacaac 60 gctctgctga aagaaaacga agaactgaaa gttgaacgtg aaaaatacct gtcctacgct 120 gacgacaaag aaaaagaccc gcagtaccgt gctgctgtta cccgtggtac catcaacgac 180 ccgcagcgtg ctaaagaagc tctggacaaa tacgaactgg aaaaccacgc tgttacccgt 240 ggtaccatca acgacccgca gcgtgctaaa gaagctctgg acaaatacga actggaaaac 300 cacaccgaag ttaaagctgc tggtcagtcc gctccgaaag gtaccaacgt ttccgctgac 360 ctgtacaact 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tgaaagctaa agaaaaatcc 600 tccgactcct cccgtgaagt taccaacgaa ctgaccgctt ccatgtggaa agctcaggct 660 gactccgcta aagctaaagc taaagaactg gaaaaacagg ttgaagaata caaaaaaaac 720 tacgaaaccc tggaaaaagg ttacgacgac ctggctgaat cccgttccgt ttcccagggt 780 tccgtttccc tggaactgta cgacaaactg tccgacgaaa acgacatcct gcgtgaaaaa 840 caggacgaat acctgaccaa aatcgacggt ctggacaaag aaaacaaaga atacgcttcc 900 caggaatccc agaactcccg ttccatcacc aacgaacagc tgatcgacaa actggttgaa 960 gaaaacaacg acctgaaaga agaacgtgct aaatacctgg acctgctgga caaccgtgaa 1020 aaagacccgc agtaccgtgc tctgatgggt gaagctgaaa aaaaagttga agttgctgac 1080 tccaacgctt cctccgttgc taaactgtac aaccagatcg ctgacctgac cgacaaaaac 1140 ggtgaatacc tggaacgtat cgaagaactg gaagaacgtc agaaaaacct ggaaaaactg 1200 gaagaaggtg tttccgttgg ttccgacgct tccctgcaca accgtatcac cgacctggaa 1260 gaagaacgtg aaaaactgct gaacaaactg gacaaagttg aagaagaaca caaaaaagac 1320 cacgaacagc tggaaaaaaa atccgaagac gtttag 1356 <210> 24 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 24 atggacaacc cgcgttacac cgacgctcac aacgctgtta cccagggtcg taccgttccg 60 ctgcagaacc tgctgcacga aatggacaaa aacggtaaac tgcgttccga aaacgaagaa 120 ctgaaagctg acctgcagaa aaaagaacag gaagactcct cctcccgtga catcaccgaa 180 gctggtgttt ccaaattctg gaaatccaaa ttcgacgctg aacagaaccg tgctaacgaa 240 ctggaaaaaa aactgtccgg ttacgaaaaa gactacaaaa ccctggaaca ggaatacgaa 300 aacgctggtt ccgaagaaaa cgttccgaaa cagcagtaca acgctctgtg ggaagaaaac 360 gaagacctgc gtggtcgtga acgtaaatac atcgctaaac tggaaaaaga agaaatccag 420 aacggtgaac tgaacgaaaa aaaccgtaaa ctggaatccc cgcgtgaagt taccaacgaa 480 ctggctgctt ccgtttggaa aaaaaaagtt gaagaagcta aagaaaaagc ttccaaactg 540 gaaaaacagc tggaagaagc tcagaaagac tactccgaaa tcgaaggtaa actggaacag 600 ttcgttgaaa aaaaagttga agctgctgaa aacaacgttt cctccgttgc tcgtcgtgaa 660 aaagaactgt acgaccagat cgctgacctg accgacaaaa acggtgaata cctggaacgt 720 atcggtgaac tggaagaacg tcagaaaaac ctggacgacc gttccgtttc caccaactcc 780 ggttccgttt ccaccccgta caacaacctg ctgaacgaat acgacgacct gctggctaaa 840 cacggtgaac tgctgtccga atacgacgct ctgaaagaaa aacaggacaa aaaccaggaa 900 gaaaactcca aaaacccggc tccggctccg gcttccgctg ttccggttaa aaaagaagct 960 accaaactgt ccgaagctga actgtacaac aaaatccagg aactggaaga aggtaaagct 1020 gaactgttcg acaaactgga aaaagttgaa gaagacaacc cgcgttacac cgacgctcac 1080 aacgctgtta cccagggtcg taccgttccg ctgcagaacc tgctgcacga aatggacaaa 1140 aacggtaaac tgcgttccga aaacgaagaa ctgaaagctg acctgcagaa aaaagaacag 1200 gaatag 1206 <210> 25 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 25 aacggtgacg gtaacccgcg tgaagttatc gaagacctgg ctgctaacaa cccggctatc 60 cagaacatcc gtctgcgtca cgaaaacaaa gacctgaaag ctcgtctgga aaacgctatg 120 gaagttgctg gtcgtgactt caaacgtgct ctgctggacc aggttaccca gctgtacacc 180 aaacacaact ccaactacca gcagtacaac gctcaggctg gtcgtctgga cctgcgtcag 240 aaagctgaat acctgaaagg tctgaacgac tgggctgaac gtctgctgca ggaactgaac 300 cgtgttttcc cgcgtggtac cgttgaaaac ccggacaaag ctcgtgaact gctgaacaaa 360 tacgacgttg aaaaccgtgt tttcccgcgt ggtaccgttg aaaacccgga caaagctcgt 420 gaactgctga acaaatacga cgttgaaaac tccaaaaacc cggttccggt taaaaaagaa 480 gctaaactgt ccgaagctga actgcacgac aaaatcaaaa acctgtccaa aaacccggtt 540 ccggttaaaa aagaagctaa actgtccgaa gctgaactgc acgacaaaat caaaaacctg 600 gctccgctga cccgtgctac cgctgacaac aaagacgaac tgatcaaacg tgctaacgac 660 tacgaaatcc agaaccacca gctgaccgtt gaaaacaaaa aactgaaaac cgacaaagaa 720 cagctgacca aagaaaacga cgacctgaaa gctgaatccc cgaaatccac cgaaacctcc 780 gctaacggtg ctgacaaact ggctgacgct tacaacaccc tgctgaccga acacgaaaaa 840 ctgcgtgacg aatactacac cctgatcgac gctaaagaag aagaaccgcg ttacaaagct 900 gaccactccg acctggttgc tgaaaaacag cgtctggaag acctgggtca gaaattcgaa 960 cgtctgaaac agcgttccga actgtacctg cagcagtact acgacaacaa atccaacggt 1020 tacaaaggtg actggtacgt tcagcagctg gactccgttt ccggtctgga agttgctgac 1080 ccgtccgact ccaaaaaact gatcgaactg ggtctggcta aatacctgaa cgacaaactg 1140 ccgttcaaaa ccaaagaaga ctccgaaatc ctgtccgaac tgcgtgacgt tctgaaaaac 1200 aacggtgacg gtaacccgcg tgaagttatc gaagacctgg ctgctaacaa cccggctatc 1260 cagaacatcc gtctgcgtca cgaaaacaaa gacctgaaag ctcgtctgga aaacgctatg 1320 gaagttgctg gtcgtgactt caaacgtgct tag 1353 <210> 26 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 26 gctgaaatca aaaaaccgca ggctgactcc gcttggaact ggccgaaaga atacaacgct 60 ctgctgaaag aaaacgaaga actgaaagtt gaacgtgaaa aatacctgtc ctacgctgac 120 gacaaagaaa aagacccgca gtaccgtgct gctgttaccc gtggtaccat caacgacccg 180 cagcgtgcta aagaagctct ggacaaatac gaactggaaa accacgctgt tacccgtggt 240 accatcaacg acccgcagcg tgctaaagaa gctctggaca aatacgaact ggaaaaccac 300 accgaagtta aagctgctgg tcagtccgct ccgaaaggta ccaacgtttc cgctgacctg 360 tacaactccc tgtgggacga aaacaaaacc ctgcgtgaaa aacaggaaga atacatcacc 420 aaaatccaga acgaagaaac caaaaacaaa gaagaagaac gtaccttcac cgaactgccg 480 tacgaagctc gttacaaagc ttggaaatcc gaaaacgacg aactgcgtga aaactaccgt 540 cgtaccctgg acaaattcaa caccgaacag ggtaaaacca cccgtctgga agaacagaac 600 cgtgttcgtt acacccgtca caccccggaa gacaaactga aaaaaatcat cgacgacctg 660 gacgctaaag aacaccgtgt tcgttacacc cgtcacaccc cggaagacaa actgaaaaaa 720 atcatcgacg acctggacgc taaagaacac cgtgtttaca tcacccgtcg tatgaccaaa 780 gaagacgttg aaaaaatcgc taacgacctg gacaccgaaa accacggtct gaaacagcag 840 aacgaacagc tgtccaccga aaaacagggt ctggaagaac agaacaaaca gctgtccacc 900 gaccgtgttt cccgttccat gtcccgtgac gacctgctga accgtgctca ggacctggaa 960 gctaaaaacc acggtctgga acaccagaac accaaactgt ccaccgaaaa caaaaccctg 1020 caggaacagg ctgaagctcg tcagaaagaa gttgctaccc gttcccagac cgacaccctg 1080 gaaaaagttc aggaacgtgc tgacaaattc gaaatcgaaa acaacaccct gaaactgaaa 1140 aactccgacc tgtccttcaa caacaaagct ctgaaagacc acaacgacga actgaccgaa 1200 gctgaaatca aaaaaccgca ggctgactcc gcttggaact ggccgaaaga atacaacgct 1260 ctgctgaaag aaaacgaaga actgaaagtt gaacgtgaaa aatacctgtc ctacgctgac 1320 gacaaagaaa aagacccgca gtaccgtgct tag 1353 <210> 27 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 27 gaaggtgttt ccgttggttc cgacgcttcc ctgcacaacc gtatcaccga cctggaagaa 60 gaacgtgaaa aactgctgaa caaactggac aaagttgaag aagaacacaa aaaagaccac 120 gaacagctgg aaaaaaaatc cgaagacgtt gaatcctcca acaacgctga atcctccaac 180 atctcccagg aatccaaact gatcaacacc ctgaccgacg aaaacgaaaa actgcgtgaa 240 gaactgcagc agtactacgc tctgtccgac gctaaagaag aagaaccgcg ttacaaagct 300 gacaaccagt ccccggctcc ggttaaaaaa gaagctaaaa aactgaacga agctgaactg 360 tacaacaaaa tccaggaact ggaagaaggt aaagctgaac tgttcgacaa actggaaaaa 420 gttgaagaag aaaacaaaaa agttaaagaa gactccgaca acatcaaccg ttccgtttcc 480 gttaaagaca acgaaaaaga actgcacaac aaaatcgctg acctggaaga agaacgtggt 540 gaacacctgg acaaaatcga cgaactgaaa gaagaactga aagctaaaga aaaatcctcc 600 gactcctccc gtgaagttac caacgaactg accgcttcca tgtggaaagc tcaggctgac 660 tccgctaaag ctaaagctaa agaactggaa aaacaggttg aagaatacaa aaaaaactac 720 gaaaccctgg aaaaaggtta cgacgacctg gctgaatccc gttccgtttc ccagggttcc 780 gtttccctgg aactgtacga caaactgtcc gacgaaaacg acatcctgcg tgaaaaacag 840 gacgaatacc tgaccaaaat cgacggtctg gacaaagaaa acaaagaata cgcttcccag 900 gaatcccaga actcccgttc catcaccaac gaacagctga tcgacaaact ggttgaagaa 960 aacaacgacc tgaaagaaga acgtgctaaa tacctggacc tgctggacaa ccgtgaaaaa 1020 gacccgcagt accgtgctct gatgggtgaa gctgaaaaaa aagttgaagt tgctgactcc 1080 aacgcttcct ccgttgctaa actgtacaac cagatcgctg acctgaccga caaaaacggt 1140 gaatacctgg aacgtatcga agaactggaa gaacgtcaga aaaacctgga aaaactggaa 1200 gaaggtgttt ccgttggttc cgacgcttcc ctgcacaacc gtatcaccga cctggaagaa 1260 gaacgtgaaa aactgctgaa caaactggac aaagttgaag aagaacacaa aaaagaccac 1320 gaacagctgg aaaaaaaatc cgaagacgtt tag 1353 <210> 28 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion protein of group A streptococcus M proteins. <400> 28 gacaacccgc gttacaccga cgctcacaac gctgttaccc agggtcgtac cgttccgctg 60 cagaacctgc tgcacgaaat ggacaaaaac ggtaaactgc gttccgaaaa cgaagaactg 120 aaagctgacc tgcagaaaaa agaacaggaa gactcctcct cccgtgacat caccgaagct 180 ggtgtttcca aattctggaa atccaaattc gacgctgaac agaaccgtgc taacgaactg 240 gaaaaaaaac tgtccggtta cgaaaaagac tacaaaaccc tggaacagga atacgaaaac 300 gctggttccg aagaaaacgt tccgaaacag cagtacaacg ctctgtggga agaaaacgaa 360 gacctgcgtg gtcgtgaacg taaatacatc gctaaactgg aaaaagaaga aatccagaac 420 ggtgaactga acgaaaaaaa ccgtaaactg gaatccccgc gtgaagttac caacgaactg 480 gctgcttccg tttggaaaaa aaaagttgaa gaagctaaag aaaaagcttc caaactggaa 540 aaacagctgg aagaagctca gaaagactac tccgaaatcg aaggtaaact ggaacagttc 600 gttgaaaaaa aagttgaagc tgctgaaaac aacgtttcct ccgttgctcg tcgtgaaaaa 660 gaactgtacg accagatcgc tgacctgacc gacaaaaacg gtgaatacct ggaacgtatc 720 ggtgaactgg aagaacgtca gaaaaacctg gacgaccgtt ccgtttccac caactccggt 780 tccgtttcca ccccgtacaa caacctgctg aacgaatacg acgacctgct ggctaaacac 840 ggtgaactgc tgtccgaata cgacgctctg aaagaaaaac aggacaaaaa ccaggaagaa 900 aactccaaaa acccggctcc ggctccggct tccgctgttc cggttaaaaa agaagctacc 960 aaactgtccg aagctgaact gtacaacaaa atccaggaac tggaagaagg taaagctgaa 1020 ctgttcgaca aactggaaaa agttgaagaa gacaacccgc gttacaccga cgctcacaac 1080 gctgttaccc agggtcgtac cgttccgctg cagaacctgc tgcacgaaat ggacaaaaac 1140 ggtaaactgc gttccgaaaa cgaagaactg aaagctgacc tgcagaaaaa agaacaggaa 1200 tag 1203 <210> 29 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 29 Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val Ile Glu Asp Leu Ala Ala Asn 1 5 10 15 Asn Pro Ala Ile Gln Asn Ile Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp Leu 20 25 30 Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys 35 40 45 Arg Ala 50 <210> 30 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 30 Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser Asn Tyr 1 5 10 15 Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln Lys Ala 20 25 30 Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln Glu 35 40 45 Leu Asn 50 <210> 31 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 31 Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr 20 25 30 Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val 35 40 45 Glu Asn 50 <210> 32 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 32 Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu Ala 1 5 10 15 Glu Leu His Asp Lys Ile Lys Asn Leu Ser Lys Asn Pro Val Pro Val 20 25 30 Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu His Asp Lys Ile Lys 35 40 45 Asn Leu 50 <210> 33 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 33 Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Tyr Glu Ile Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn 20 25 30 Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu Asn Asp Asp 35 40 45 Leu Lys 50 <210> 34 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 34 Ala Glu Ser Pro Lys Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asn Gly Ala Asp Lys 1 5 10 15 Leu Ala Asp Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Thr Glu His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 Asp Glu Tyr Tyr Thr Leu Ile Asp Ala Lys Glu Glu Glu Pro Arg Tyr 35 40 45 Lys Ala 50 <210> 35 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 35 Asp His Ser Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Arg Leu Glu Asp Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Phe Glu Arg Leu Lys Gln Arg Ser Glu Leu Tyr Leu Gln Gln 20 25 30 Tyr Tyr Asp Asn Lys Ser Asn Gly Tyr Lys Gly Asp Trp Tyr Val Gln 35 40 45 Gln Leu 50 <210> 36 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 36 Asp Ser Val Ser Gly Leu Glu Val Ala Asp Pro Ser Asp Ser Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Glu Leu Gly Leu Ala Lys Tyr Leu Asn Asp Lys Leu Pro Phe 20 25 30 Lys Thr Lys Glu Asp Ser Glu Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asp Val Leu 35 40 45 Lys Asn 50 <210> 37 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 37 Ala Glu Ile Lys Lys Pro Gln Ala Asp Ser Ala Trp Asn Trp Pro Lys 1 5 10 15 Glu Tyr Asn Ala Leu Leu Lys Glu Asn Glu Glu Leu Lys Val Glu Arg 20 25 30 Glu Lys Tyr Leu Ser Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Asp Pro Gln Tyr 35 40 45 Arg Ala 50 <210> 38 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 38 Ala Val Thr Arg Gly Thr Ile Asn Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala 1 5 10 15 Leu Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Asn His Ala Val Thr Arg Gly Thr Ile 20 25 30 Asn Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Glu Leu Glu 35 40 45 Asn His 50 <210> 39 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 39 Thr Glu Val Lys Ala Ala Gly Gln Ser Ala Pro Lys Gly Thr Asn Val 1 5 10 15 Ser Ala Asp Leu Tyr Asn Ser Leu Trp Asp Glu Asn Lys Thr Leu Arg 20 25 30 Glu Lys Gln Glu Glu Tyr Ile Thr Lys Ile Gln Asn Glu Glu Thr Lys 35 40 45 Asn Lys 50 <210> 40 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 40 Glu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Tyr Lys 1 5 10 15 Ala Trp Lys Ser Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Arg Thr 20 25 30 Leu Asp Lys Phe Asn Thr Glu Gln Gly Lys Thr Thr Arg Leu Glu Glu 35 40 45 Gln Asn 50 <210> 41 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 41 Arg Val Arg Tyr Thr Arg His Thr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Lys Ile 1 5 10 15 Ile Asp Asp Leu Asp Ala Lys Glu His Arg Val Arg Tyr Thr Arg His 20 25 30 Thr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Lys Ile Ile Asp Asp Leu Asp Ala Lys 35 40 45 Glu His 50 <210> 42 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 42 Arg Val Tyr Ile Thr Arg Arg Met Thr Lys Glu Asp Val Glu Lys Ile 1 5 10 15 Ala Asn Asp Leu Asp Thr Glu Asn His Gly Leu Lys Gln Gln Asn Glu 20 25 30 Gln Leu Ser Thr Glu Lys Gln Gly Leu Glu Glu Gln Asn Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Thr 50 <210> 43 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 43 Asp Arg Val Ser Arg Ser Met Ser Arg Asp Asp Leu Leu Asn Arg Ala 1 5 10 15 Gln Asp Leu Glu Ala Lys Asn His Gly Leu Glu His Gln Asn Thr Lys 20 25 30 Leu Ser Thr Glu Asn Lys Thr Leu Gln Glu Gln Ala Glu Ala Arg Gln 35 40 45 Lys Glu 50 <210> 44 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 44 Val Ala Thr Arg Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu Arg 1 5 10 15 Ala Asp Lys Phe Glu Ile Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn Ser 20 25 30 Asp Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu Leu 35 40 45 Thr Glu 50 <210> 45 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 45 Glu Gly Val Ser Val Gly Ser Asp Ala Ser Leu His Asn Arg Ile Thr 1 5 10 15 Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Lys Val 20 25 30 Glu Glu Glu His Lys Lys Asp His Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ser Glu 35 40 45 Asp Val 50 <210> 46 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 46 Glu Ser Ser Asn Asn Ala Glu Ser Ser Asn Ile Ser Gln Glu Ser Lys 1 5 10 15 Leu Ile Asn Thr Leu Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu Arg Glu Glu Leu 20 25 30 Gln Gln Tyr Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Lys Glu Glu Glu Pro Arg Tyr 35 40 45 Lys Ala 50 <210> 47 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 47 Asp Asn Gln Ser Pro Ala Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Lys Leu Asn 1 5 10 15 Glu Ala Glu Leu Tyr Asn Lys Ile Gln Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala 20 25 30 Glu Leu Phe Asp Lys Leu Glu Lys Val Glu Glu Glu Asn Lys Lys Val 35 40 45 Lys Glu 50 <210> 48 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 48 Asp Ser Asp Asn Ile Asn Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 Glu Leu His Asn Lys Ile Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His 20 25 30 Leu Asp Lys Ile Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys 35 40 45 Ser Ser 50 <210> 49 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 49 Asp Ser Ser Arg Glu Val Thr Asn Glu Leu Thr Ala Ser Met Trp Lys 1 5 10 15 Ala Gln Ala Asp Ser Ala Lys Ala Lys Ala Lys Glu Leu Glu Lys Gln 20 25 30 Val Glu Glu Tyr Lys Lys Asn Tyr Glu Thr Leu Glu Lys Gly Tyr Asp 35 40 45 Asp Leu 50 <210> 50 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 50 Ala Glu Ser Arg Ser Val Ser Gln Gly Ser Val Ser Leu Glu Leu Tyr 1 5 10 15 Asp Lys Leu Ser Asp Glu Asn Asp Ile Leu Arg Glu Lys Gln Asp Glu 20 25 30 Tyr Leu Thr Lys Ile Asp Gly Leu Asp Lys Glu Asn Lys Glu Tyr Ala 35 40 45 Ser Gln 50 <210> 51 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 51 Glu Ser Gln Asn Ser Arg Ser Ile Thr Asn Glu Gln Leu Ile Asp Lys 1 5 10 15 Leu Val Glu Glu Asn Asn Asp Leu Lys Glu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu 20 25 30 Asp Leu Leu Asp Asn Arg Glu Lys Asp Pro Gln Tyr Arg Ala Leu Met 35 40 45 Gly Glu 50 <210> 52 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 52 Ala Glu Lys Lys Val Glu Val Ala Asp Ser Asn Ala Ser Ser Val Ala 1 5 10 15 Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Ala Asp Leu Thr Asp Lys Asn Gly Glu Tyr 20 25 30 Leu Glu Arg Ile Glu Glu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Asn Leu Glu Lys 35 40 45 Leu Glu 50 <210> 53 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 53 Asp Asn Pro Arg Tyr Thr Asp Ala His Asn Ala Val Thr Gln Gly Arg 1 5 10 15 Thr Val Pro Leu Gln Asn Leu Leu His Glu Met Asp Lys Asn Gly Lys 20 25 30 Leu Arg Ser Glu Asn Glu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Gln Lys Lys Glu 35 40 45 Gln Glu 50 <210> 54 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 54 Asp Ser Ser Ser Arg Asp Ile Thr Glu Ala Gly Val Ser Lys Phe Trp 1 5 10 15 Lys Ser Lys Phe Asp Ala Glu Gln Asn Arg Ala Asn Glu Leu Glu Lys 20 25 30 Lys Leu Ser Gly Tyr Glu Lys Asp Tyr Lys Thr Leu Glu Gln Glu Tyr 35 40 45 Glu Asn 50 <210> 55 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 55 Ala Gly Ser Glu Glu Asn Val Pro Lys Gln Gln Tyr Asn Ala Leu Trp 1 5 10 15 Glu Glu Asn Glu Asp Leu Arg Gly Arg Glu Arg Lys Tyr Ile Ala Lys 20 25 30 Leu Glu Lys Glu Glu Ile Gln Asn Gly Glu Leu Asn Glu Lys Asn Arg 35 40 45 Lys Leu 50 <210> 56 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 56 Glu Ser Pro Arg Glu Val Thr Asn Glu Leu Ala Ala Ser Val Trp Lys 1 5 10 15 Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ser Lys Leu Glu Lys Gln 20 25 30 Leu Glu Glu Ala Gln Lys Asp Tyr Ser Glu Ile Glu Gly Lys Leu Glu 35 40 45 Gln Phe 50 <210> 57 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 57 Val Glu Lys Lys Val Glu Ala Ala Glu Asn Asn Val Ser Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Arg Glu Lys Glu Leu Tyr Asp Gln Ile Ala Asp Leu Thr Asp Lys 20 25 30 Asn Gly Glu Tyr Leu Glu Arg Ile Gly Glu Leu Glu Glu Arg Gln Lys 35 40 45 Asn Leu 50 <210> 58 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 58 Asp Asp Arg Ser Val Ser Thr Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Pro Tyr 1 5 10 15 Asn Asn Leu Leu Asn Glu Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys His Gly Glu 20 25 30 Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Leu Lys Glu Lys Gln Asp Lys Asn Gln 35 40 45 Glu Glu 50 <210> 59 <211> 50 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 59 Asn Ser Lys Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ala Val Pro Val Lys 1 5 10 15 Lys Glu Ala Thr Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu Tyr Asn Lys Ile Gln 20 25 30 Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Glu Leu Phe Asp Lys Leu Glu Lys Val 35 40 45 Glu Glu 50 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag sequence <400> 60 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag sequence <400> 61 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (40)

  1. 적어도 31개 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서,
    여기서 각각의 면역원성 펩티드는 상이하고, 또한 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하며,
    각각의 상이한 M 단백질이 그룹 A 스트렙토콕쿠스(GAS, Group A Streptococcus) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고,
    Spa 단백질은 GAS 혈청형 18로부터의 것이고,
    면역원성 조성물이 GAS에 대해 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 4개의 상이한 면역원성 펩티드가 종렬로(in tandem) 연결되어 융합 폴리펩티드를 형성하는, 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 융합 폴리펩티드, 제2 융합 폴리펩티드, 제3 융합 폴리펩티드 및 제4 융합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 융합 폴리펩티드 각각은 종렬로 연결된 적어도 6개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 상기 8개 면역원성 펩티드 각각이 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하고, 상이한 M 단백질 각각이 GAS 혈청형 1, 2, 3, 6, 12, 18 및 28의 M 단백질로부터 독립적으로 선택되고, Spa 단백질이 GAS 혈청형 18로부터의 것인, 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치한 면역원성 펩티드가 제1 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 1의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 제2 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 상기 8개 면역원성 펩티드 각각이 GAS 혈청형 4, 5 11, 14, 19, 24, 29 및 75의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제2 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치한 면역원성 펩티드가 제2 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 4의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제3항에 있어서, 상기 제3 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 8개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 상기 8개 면역원성 펩티드 각각이 GAS 혈청형 22, 44, 58, 73, 77, 78, 89 및 118의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제3 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치한 면역원성 펩티드가 제3 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 77의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  13. 제3항에 있어서, 상기 제4 융합 폴리펩티드가 종렬로 연결된 7개의 상이한 면역원성 펩티드를 포함하고, 7개 면역원성 펩티드 각각이 GAS 혈청형 49, 81, 82, 83, 87, 92 및 114의 M 단백질로부터 독립적으로 선택된 상이한 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제4 융합 폴리펩티드의 카복시 말단에 위치한 면역원성 펩티드가 제4 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 면역원성 펩티드의 복제물인, 면역원성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 복제되는 면역원성 펩티드가 GAS 혈청형 83의 M 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역원성 펩티드 각각이 (a) 복제물 중 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 25개의 인접 아미노산; (b) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 40개의 인접 아미노산; (c) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 45개의 인접 아미노산; 또는 (d) 상이한 M 단백질 또는 Spa 단백질의 아미노 말단 부분으로부터 적어도 50개의 인접 아미노산을 포함하는, 면역원성 조성물.
  17. (a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제3 융합 폴리펩티드; 및
    (d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제4 융합 폴리펩티드를 포함하고,
    그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대해 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  18. 제17항에 있어서, (a) 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  19. 제17항에 있어서, (a) 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  20. 제17항에 있어서, (a) 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  21. 제17항에 있어서, (a) 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (b) 제2 융합 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (c) 제3 융합 폴리펩티드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; (d) 제4 융합 폴리펩티드가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  22. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  23. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  24. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스에 대한 면역 반응이 GAS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 44, 49, 58, 73, 75, 77, 78, 81, 82, 83, 87, 89, 92, 114 및 118 혈청형의 적어도 각각에 대한 면역 반응을 포함하는, 면역원성 조성물.
  25. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염의 발생 가능성을 감소시키기 위한 것인, 면역원성 조성물.
  26. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  27. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 포함하는, 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신.
  28. 제1항, 제2항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 A 스트렙토콕쿠스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 면역원성 조성물.

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