KR20130027448A - 갈리박테리움 아나티스로부터의 세포용해 ｒｔｘ-독소 - Google Patents

갈리박테리움 아나티스로부터의 세포용해 ｒｔｘ-독소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물 건강 분야 및 특히 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)를 포함하는 갈리박테리움 종(Gallibacteruim spp)에 의해 야기되는 신규 박테리아 가금 질병의 감염 인자(causative agent)에 관한 것이다. 본 발명은 상기 갈리박테리움 종으로부터의 신규 RTX 독소를 제공하며, 신규 독소는 GtxA (갈리박테리움 독소)로 명명된다. 게다가, 본 발명은 GtxA의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 불활성화된 톡소이드 또는 톡소이드의 단편을 포함하는 백신 뿐만 아니라 새를 면역화하여 상기 질병을 예방하는 방법 및 새에서 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis) 감염을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

갈리박테리움 아나티스로부터의 세포용해 ＲＴＸ-독소{A CYTOLYTIC RTX-TOXIN FROM GALLIBACTERIUM ANATIS}
본 출원, 또는 본 발명의 출원에서 인용되는 모든 특허 및 비-특허 참고문헌은 또한 그것 전체가 본원에 참고로써 포함된다.
본 발명은 동물 건강 분야 및 특히 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)를 포함하는 갈리박테리움 종(Gallibacteruim spp)에 의해 야기되는 신규 박테리아 가금 질병의 감염 인자(causative agent)에 속한다. 본 발명은 상기 갈리박테리움 종(Gallibacterium species)으로부터 GtxA (갈리박테리움 독소)로 명명되는 신규 독소인 신규 RTX를 제공한다. 추가로 본 발명은 GtxA의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 불활성화된 독소 또는 독소의 단편을 포함하는 백신 뿐만 아니라 상기 질병을 예방하기 위한 새의 면역화 방법 및 새에서 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)의 진단 방법을 제공한다.
최근 십년 동안, 생산성을 증가시키는 집중적 가금업 방법은 모든 주요 가금 생산 국가를 통해 증가된 질병 징후를 초래하였다. 이것은 새롭고 더 양호한 백신 및 이 질병을 제어하는 백신접종 프로그램에 대한 증가된 필요를 야기하였다. 요즘에는 많은 동물들이 다수의 바이러스 및 박테리아 기원 질병에 대해 면역화되어 있다. 가금류 바이러스 질병의 예는 뉴캐슬병, 전염성 기관지염, 조류 뉴모바이러스, 계두, 전염성 F낭 병이다. 박테리아 질병의 예는 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum) (상기도), 보르데텔라 아비윰(Bordetella avium)(상기도), 오르니토박테리움 리노트라키알레(Ornithobacterium rhinotracheale)(하기도), 살모넬라(Salmonella ) 감염(소화관), 가금콜레라(패혈증), 및 E. coli 감염 병인인 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida)에 의해 야기되는 조류 코리자(Avian Coryza)이다.
생식기관 및 난막(egg-layer)의 배막에서 염증은 산란능력 감소를 야기하는 상업적 난막 플록(flock) 내의 재발 문제이며, 사망률 및 결과적 경제 손실을 증가시키고, 동물 복지를 저하시킨다. 조류 병원성 E. coli는 종종 이 병변들로부터 분리되지만, 몇몇 연구들은 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)가 단독으로 또는 공동-병인으로서 난소염, 난관염 및 복막염의 빈번한 원인이 된다는 것을 증명하였다. 게다가, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 패혈증, 간염, 장염 및 상기도관 병변의 조류 경우로부터 분리되었다. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 난생(egg-laying) 닭 및 다른 조류 종의 상기도와 하부 생식기의 정상세균총(Normal flora)의 통상적인 부분이며(Bojesen A.M., Nielsen S.S., Bisgaard M., Prevalence and transmission of haemolytic Gallibacterium species in chicken production systems with different biosecurity levels, Avian Pathol. (2003) 32:503-510), 따라서 기회감염성 병원체로서 여겨질 수 있다. 그것의 발병과정은 깊이 연구되지 않았으며, 특히 분자 수준에서 연구되지 않았고, 질병을 야기하는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 능력 뒤의 유전자 및 메커니즘에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 2가지의 생태형; β-용혈성 생태형 헤몰리티카(헤몰리티카) 및 비-용혈성 생태형 아나티스(anatis)로 나뉘어진다. 적혈구를 용해하는 능력은 병원성 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 분리물의 우세한 표현형이다 (Christensen H., Bisgaard M., Bojesen A.M., Mutters R., Olsen J.E., Genetic relationships among avian isolates classified as Pasteurella haemolytica, 'Actinobacillus salpingitidis' or Pasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen. nov., comb. nov and description of additional genomospecles within Gallibacterium gen. nov, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2003) 53:275-287). 갈리박테리움은 γ-프로테오박테리아 과 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae)에 속하는 그램-음성 속이며(Christensen et al, op cit), 다양한 병원성 구성원의 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae), 예를 들어 인간, 치주 질병의 원인인 아그레가티박터 악티노마이셈코미탄스(Aggregatibacter actinomycemcomitans), 소 수송열(bovine shipping fever) 맨하이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 병인, 및 돼지 병원체 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae)는 RTX-독소(repeat in toxin, 독소 내 반복체)의 군에 속하는 헤몰리신 및 류코톡신을 만든다.
불활화 또는 생, 약독 박테리아로 구성되는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)가 이용가능하다. 그러나, 이 백신은 이 종들로부터 분비된 용혈성 단백질에 대한 보호를 부여하지 않는다.
본 발명의 목적은 진핵세포와 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카의 상호작용을 시험하고, 용혈성 표현형을 초래하는 유전자 및 단백질을 확인하고 특징짓는 것이었다. 본 발명자들은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)가 조류 대식세포에 대해 매우 세포독성이 되며, 특성은 발명에 중요한 역할을 할 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 더 나아가, 본 발명자들은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카에서 백혈구 독성 및 용혈성 활성을 초래하는 새로운 종류의 RTX-독소를 확인하고, 특징지었다.
본 발명은 갈리박테리움 속의 박테리아, 가장 바람직하게는 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)의 군으로부터 선택되는 GtxA 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 분리된 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는
a) SEQ ID No. 1, 2 또는 3;
b) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
c) 임의의 a) 중 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단 서열 내 아미노산 중 30개 이하가 그렇게 변경된다)
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO 1에서 설명되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 갈리박테리움 게놈종(G. anatis)으로부터의 RTX 독소이다. GtxA (Gallibacterium toxin)으로 명명되는 단백질은 2026개의 아미노산(aa)으로 구성된다. 이것은 고전적인 기공-형성(pore-forming) RTX-독소 크기의 2배이다. GtxA C-말단의 1000 aa은 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae)의 다른 구성원 중에서 RTX-독소와 상동성이며, 예를 들어 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) ApxIA와 38% 서열 유사성이다. 대조적으로, N-말단의 대략 950 aa은 GenBank 데이터베이스에서 유의한 매치를 가지지 않지만, 알려지지 않은 기능의 11개의 57-aa 반복체를 함유한다.
GtxA 독소는, 제한되는 것은 아니지만 톡소이드 백신 및 일반적으로 새 및 특히 가금류에서 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 대해 존재하는 면역 반응을 드러내기 위한 진단적 사용으로서 사용을 포함하여 몇 가지 유용성을 가진다.
추가 양태에서, 본 발명은 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 상기 폴리뉴클레오티드는
a) SEQ ID No. 4, 5 또는 6;
b) SEQ ID No. 4, 5 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 60% 서열 동일성을 가진다);
c) 임의의 a)의 적어도 450개 연속하는 뉴클레오티드로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 핵산은 다른 핵산으로 변경되는데, 단 서열 내 핵산 중 90개 이하가 그렇게 변경된다);
d) SEQ ID No. 4, 5 또는 6와 상보적인 폴리뉴클레오티드에 매우 엄격 하게 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오티드;
e) SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
f) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 서열 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
g) 임의의 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(선택된 서열 내에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단, 서열 내 아미노산 중 30개 이하는 그렇게 변경된다)
로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 벡터의 의학적 사용에 관한 것이다.
바람직하게 의학적 사용은 박테리아 감염에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 임의의 손상의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 박테리아 감염에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 임의의 손상의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 약제의 제조를 위한 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 또는 형질도입(transduction)된 분리된 숙주 세포 및 본 발명의 감염성 비리온을 만들 수 있는 세포주의 포장에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은
a) SEQ ID No. 1, 2 또는 3;
b) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
c) 임의의 a)의 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편(선택된 서열 내에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단, 서열 내에서 30개 이하의 아미노산이 그렇게 변경된다)
으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산을 가지는 분리된 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
GtxA에 대해 이 항체들은 진단 및 치료 양태에서 사용될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 폴리펩티드의 불활성화를 위한 방법에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 선택적으로 하나 이상의 적당한 애주번트(들), 부형제(들), 에멀젼화제(들) 또는 담체(들)과 함께 본 발명의 네이키드 DNA 또는 벡터로서 제조된 분리된 폴리펩티드 또는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명되는 조류 종에 본 발명의 백신을 투여하는 방법에 관한 것이며, 상기 백신은 근육 내 또는 피하내 주사, 경구, 예를 들어 음식 또는 물을 통해, 에어로졸, 예를 들어 발 또는 윙 웹(wing web)에서, 예를 들어 난절에 의해, 예컨대 점안액에 의해, 예를 들어 난황내 투여에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 진단 마커로서 사용을 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조류 종 내 병원성 박테리아 갈리박테리움(Gallibacterium) 감염의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드의 검출, 상기 폴리펩티드에 대한 항체의 검출, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 검출을 포함한다.
바람직하게 병원성 박테리움은 갈리박테리움(Gallibacterium) 속, 더 바람직하게 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)로부터 선택된다.
또한 본 발명의 폴리펩티드 존재를 검출하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 상기 폴리펩티드와 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 단백질을 포함하고, 상기 결합 단백질은 고체 지지체에 연결된다. 바람직하게 상기 결합 단백질은 항체이다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 검출을 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 고체 지지체에 고정된 상기 폴리펩티드를 포함한다.
도 1: 갈리박테리움 아나티스 ( G. anatis ) 배양물 상청액의 용혈성 활성 및 GtxA의 발현.
a. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 무세포 배양물 상청액의 성장 및 용혈성 활성. 밤새 배양물을 1:100으로 희석하였고, 무세포 배양물 상청액 중의 성장(600nm 흡광도에 의해 측정한 세포 밀도) 및 용혈성 활성을 기록하였다. BHI 중에서 100배 희석한 상청액의 용혈성 활성을 나타낸다. 웨스턴 블롯에 대한 세포 밖 단백질을 병행하여 수확하였다. 실험을 3회 반복하였고, 용혈성 활성의 수준은 변했지만 상대적 패턴은 일관되었다.
b. ApxI-항혈청으로 웨스턴 블롯팅에 의해 결정된 GtxA의 수준. 상청액을 표시한 시점에 수확하였고, 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 100-배 농축하였고, 3-8% 겔 중에서 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 블롯팅하였다. ΔgtxA로부터의 세포 밖 단백질(ΔgtxA 표시한 레인)을 OD600 = 2에서 수확하였다. WC = 야생형으로부터 전세포 용해물, 세포를 접종 5시간 후에 수확하였다. 크기 마커를 왼쪽에 표시한다. 실험을 동일 결과에 의해 반복하였다.
도 2: 갈리박테리움 아나티스 (G. anatis ) 12656-12 야생형( wt ) 및 동유전자 형의 gtxA 돌연변이체 (Δ gtxA )의 용혈성 활성 및 세포독성.
a. β-용혈. 박테리아를 5% 소 혈액과 함께 BHI-한천 플레이트 상에 도말하였고, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다.
b. 식염수(모크(mock))로 wt 또는 ΔgtxA로 한 시간 인큐베이션 후 광 현미경(100 × 확대)의 HD11 세포. 박테리아를 늦은 지수기(late exponential phase)(OD600=1)에 수확하였고, 10. C의 m.o.i에 부가하였다. 세포독성을 LDH 활성으로 정량화하였다. HD11 세포를 1B에서 설명한 박테리아와 함께 인큐베이션하였다. 평균 3개의 복제물 웰을 나타내고, 막대는 S.E.를 나타낸다.
도 3
a. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12에서 gtxA, gtxC 및 그것의 옆 유전자의 유전적 조직. 화살표는 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 예측된 전사 종결자는 gtxC의 하류를 나타낸다.
b. GtxA. K의 조직체는 상보적 리신 잔기를 나타낸다(Lys1484 및 Lys1607). 글리신 아스파르테이트-풍부 영역(위치 1640-1830)이 표시된다.
C. GtxA의 N-말단 도메인 내 15개의 반복체의 배열, 배열을 레이더로 만들어 냈다[Heger A., Holm L., Rapid automatic detection and alignment of repeats in protein sequences, Proteins (2000) 41:224-237]. 오른쪽의 숫자는 GtxA의 아미노산 위치를 나타낸다. 아미노산이 반복물의 50%이상에서 동일(검정) 또는 유사(회색)한 경우 위치가 표시된다.
도 4: E. coli 발현 GtxA 의 세포독성 활성
a. 30℃에서 인큐베이션한 5% 소 혈액 및 0.1 mM IPTG와 함께 LB-한천 상에서 성장시킨 E. coli ER2566의 β-용혈성 활성. T1SS: + 또는 -는 E. coli T1SS-성분 HlyB 및 HlyD를 발현시키는 플라스미드 pLG575의 존재 또는 부재를 나타낸다. RTX = GtxA의 아미노산 931-2026, N-말단 = GtxA의 아미노산 1-949.
b. 다른 버전의 GtxA를 발현시키는 E. coli ER2566/pLG575에 의한 액체 용혈 분석 및 LDH 세포독성 분석.
도 5: E. coli 에서 GtxA 의 발현
IPTG로 유도 후 E. coli ER2566으로부터 전세포 용해물(WC) 및 세포 밖 단백질(EC) 상의 웨스턴 블롯. 단백질을 4-12% 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 PVDF-막 상에서 블롯팅하였다. 블롯을 ApxI-항혈청과 함께 프로빙하였다. 단백질을 4-12% 겔 중에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 PVDF-막 상에서 블롯팅하였다. 블롯을 ApxI-항혈청으로 프로빙하였다. B= 검정, 크기 마커를 오른쪽에 표시한다(PageRuler Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas)). 각 레인에서 상부 밴드는 예상된 크기의 전장 GtxA (215 kDa) 또는 RTX-도메인(117 kDa)을 가진다. 더 작은 크기의 밴드는 분해 생성물일 가능성이 있다.
도 6: 다양한 갈리박테리움 ( Gallibacterium ) 균주로부터 아미노산 서열의 배열. GtxA (SEQ ID No 1)의 위치 1133-1515 내 아미노산은 다른 갈리박테리움(Gallibacterium) 균주로부터 유래된 다른 독소의 아미노산 서열에 대해 배열된다. 점은 동일한 잔기들을 나타내는 반면, 비보존 위치는 강조된다.
도 7
다양한 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 균주 및 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1)(CCM5974) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)(CCM5976)의 기준주(type strain)로부터의 배양 상청액을 OD600=0.6에서 수확하였고, 여과-멸균하였다. 세포 밖 단백질을 방법에서 설명한 바와 같이 침전시키고, 3-8 % Tris-아세테이트 SDS-겔 상에서 분리하고, PVDF 막에 블롯팅하고, ApxIA-항혈청으로 프로빙하였다. GtxA (215 kDa)는 화살표로 표시된다. 더 큰 밴드는 GtxA (도 3 참조)와 관련되지 않은 미확인 단백질 또는 GtxA의 변형된 버전 중 하나이다. M = 분자 크기 마커 (Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas)), 크기는 오른쪽에 표시된다 (kDa).
도 8: T1SS -돌연변이체 중에서 GtxA 의 β-용혈성 활성 및 하위세포의 편재화 .
A. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12 및 동질유전자 돌연변이체의 β-용혈. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 후 12656-12 (wt), gtxA- 및 gtxBD 돌연변이체의 도말과 함께 혈액 한천 플레이트의 촬상. 박테리아를 콜로니 하에서 용혈현상을 나타내는 도말의 왼쪽 부분으로부터 제거하였다. B. GtxA의 하위세포의 편재화. 세포 및 상청액을 전이에서 고정상으로 수확하였다(OD600=1.7). 세포 밖 단백질을 방법에서 설명한 바와 같이 침전시켰다. 전세포 용혈물(펠렛) 및 세포 밖 단백질(상청액)을 3-8 % Tris-아세테이트 SDS-겔 상에서 분리하였고, PVDF 막 상에서 블롯팅하고, ApxIA-항혈청으로 프로빙하였다. GtxA는 화살표로 표시된다. 동일성을 질량 분석기에 의해 확인하였다. 항혈청은 야생형과 돌연변이체 균주 둘 다에 존재하는 대략 270 kDa의 미확인 단백질을 인식한다. 크기 마커는 왼쪽에 나타낸다(Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas)).
도 9: 갈리박테리움 아나티스 ( G. anatis ) 12656-12 중에서 gtxAC 및 gtxEBD 의 조직체.
화살표는 오픈 리딩 프레임(ORF)를 나타낸다. gtxA 및 gtxEBD의 검출을 위해 사용한 프라이머 쌍의 위치는 작은 화살표로 상기한 각각의 ORF를 나타낸다. 전형적인 RTX-독소 위치의 조직체(Frey & Kuhnert 2002)를 비교를 위해 포함한다.
정의
본원에서 사용되는 용어 '애주번트"는 투여된 면역원성 결정소/항원/핵산 구성체와의 혼합물이 상기 결정소에서 면역 반응을 증가시키거나 또는 달리 변형시키는 물질을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "대립유전자 변이체'는 SEQ ID No. 1을 암호화하는 유전자의 또 다른 형태를 말한다. 대립유전자는 핵산 서열 내에서 적어도 하나의 돌연변이로부터 초래될 수 있고, 구조 또는 기능이 변형될 수도 있고 변형되지 않을 수도 있는 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드를 초래할 수 있다. 대립유전자를 생기게하는 흔한 돌연변이 변화는 일반적으로 뉴클레오티드의 천연 결실, 첨가, 또는 치환에 기인한다. 각각의 이런 변화의 유형은 주어진 서열 내에서 1회 이상 단독으로 일어날 수도 있고, 또는 다른 것과 조합하여 일어날 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 '항체'는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 활성 부분을 말한다. 항체는, 예를 들어 면역 활성을 보유하는 무결함 면역글로불린 분자 또는 그것의 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 '항원'은 클론에 의해여 분배된 면역 수용체(T-세포 또는 B-세포 수용체); 보통 펩티드, 폴리펩티드 또는 다중결합 폴리펩티드에 결합할 수 있는 물질을 말한다. 항원은 바람직하게 면역 반응을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '결합 분석'은 임의의 2개 이상의 분자가 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합함으로써 분자들 중 하나의 농도를 측정할 수 있는 임의의 생물학적 또는 화학적 분석을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '생물학적 샘플'은, 제한되는 것은 아니지만, 혈청, 혈장, 전혈, 침, 소변, 림프, 생검, 대변, 눈물, 땀, 젖, 뇌척수액, 복수액, 윤활액의 군으로부터 선택되는 임의의 샘플을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '담체'는 면역 반응의 유발을 돕기 위해 항원이 커플링되는 독립체 또는 화합물을 말한다.
본원에서 정의되는 용어 '보존적 아미노산 치환'은 하나의 아미노산이 하나 이상의 공유된 화학적 및/또는 물리적 특성을 가지는 다른 것으로 치환되는 것에 의한 치환을 말한다. 아미노산은 공유된 특성에 따라서 그룹화될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 사전결정된 아미노산 기 내에서 하나의 아미노산의 동일 기 내에서 다른 아미노산으로의 치환이며, 사전결정된 기 내에서 아미노산은 유사한 또는 실질적으로 유사한 특성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 '검출 모이어티'는, 바람직하게는 제한되는 것은 아니지만 단백질이 되며, 다른 분자와 결합할 수 있고, 다른 분자를 검출할 수 있는 분자의 특정 부분을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '진단 마커'는 개체가 앓고 있는 장애를 결정하기 위해 사용될 수 있는 단백질과 같은 화합물의 특징을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '장애'는 질병 또는 의학적 문제를 말하며, 특이적 증상 및 징후와 관련된 신체의 기능을 손상시키는 유기체의 비정상적 상태이다. 그것은 유기체를 침해하는 것과 같은 외부 인자에 의해 야기될 수도 있고, 또는 내부 기능장애에 의해 야기될 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 '단편'은 핵산 또는 폴리펩티드의 비-전장 부분을 말한다. 따라서, 단편은 또한 그 자체가 각각 핵산 또는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 용어 '면역원성'은 면역 반응을 유발하는 항원 또는 에피토프와 같은 특정 물질의 능력을 말하며, 상기 면역 반응은 세포 또는 체액성일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '의약'은 약 또는 약물로서 언급되는 약제학적 약물을 말하며, 예방적, 치유적, 개선적 또는 증상적 사용을 위해 의도되는 임의의 화학적 물질, 바람직하게는 백신으로서 막연히 정의될 수 있다. 본 발명의 의도된 사용은 필연적으로 임의의 질병의 100% 예방, 치료 또는 완화뿐만 아니라 부분적 예방, 치료 또는 완화를 포함한다는 것이 상기로부터 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 '병원성'은 유기체 내에서 감염성 질병을 만드는 미생물, 예컨대 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)와 같은 병원체의 능력을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '플라스미드'는 염색체 DNA의 독립성을 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터의 염색체외 DNA 분자 분리를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '폴리뉴클레오티드'는 사슬 내 공유적으로 결합된 뉴클레오티드 모노머로 구성되는 유기 폴리머 분자, 예를 들어 DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)를 말한다
본원에서 사용되는 용어 '폴리펩티드'는 적어도, 및 바람직하게는 2개 이상의 아미노산을 가지는 펩티드인 단백질로서 알려진 유기 화합물을 말한다. 포괄적인 용어 아미노산은 'D' 또는 'L' 이성질체 형태로 있을 수 있는 임의의 천연 및 비-천연 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '예방적 치료'는 질병을 치료 또는 치유하기 보다는 예방하기 위한 목적의 임의의 의학적 절차를 말한다. 용어 예방하는 것은 절대적인 것으로 의도되지 않으며, 또한 질병 또는 하나 이상의 질병의 증상의 부분적 예방을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '프로모터'는 RNA 폴리머라아제가 결합하여 하나 이상의 근처의 구조적 유전자에 의해 메신저 RNA의 전사를 개시하는 DNA 사슬 내 결합 자리를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 'RTX 독소'(구조적 독소 내 반복체)는 넓은 범위의 병원성 그램-음성 박테리아에 의해 생성되는 기공-형성 단백질 독소를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '서열 동일성'은 2 서열들 사이의 동일성 백분율의 결정을 말하며, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 2서열들의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적 예는 Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서와 같이 변형된 Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 포함된다.
동일성을 특징짓기 위해서, 대상 서열은 배열되고, 따라서 가장 높은 순서의 상동성(매치)이 얻어진다. 이 일반적 원칙을 기반으로, 2개의 핵산 서열의 "동일성 백분율"은 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 BLASTN 알고리즘 [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 서열 - 단백질과 뉴클레오티드 서열의 비교를 위한 신규 툴(tool); FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250]을 사용하고, 여기에 제안된 디폴트 설정(즉, 매치에 대한 보상 = 1; 미스매치에 대한 페널티 = -2; 스트랜드 선택 = 스트랜드 둘 다; 오픈 갭 = 5; 익스텐션 갭 = 2; 페널티 갭 x_하락 = 50; 예상치 = 10; 글자 크기 = 11; 필터 온)을 사용하여 결정될 수 있다. BLASTN 알고리즘은 2개의 배열된 뉴클레오티드 서열 사이의 중첩 범위에서 서열 동일성%를 결정한다. Blast가 지역 배열(Local alignment)이기 때문에, 다른 길이의 두 개의 관련 서열 사이의 중첩 범위에서 서열 동일성%를 계산하는데 가장 적합하다.
서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한, 비-제한적 예는 CLUSTAL W (1.7) 배열 알고리즘이다(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: 서열 칭량, 위치-특이적 갭 페널티 및 중량 매트릭스를 통해 점진적인 복수 서열 배열의 민감도를 개선함. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680.). CLUSTAL W는 매트릭스를 스코어링 하는 것에 따라서 바람직하게 BLOSUM 62를 사용하는 복수 서열 배열에 대해 사용될 수 있다. 서열 동일성을 계산할 때, CLUSTAL W는 기준 서열의 길이 내 배열에 의해 만들어지는 임의의 갭을 포함한다. 서열 동일성은 매치의 수를 갭이 있는 배열된 서열의 길이로 나눔으로써 계산된다.
본원에서 사용되는 용어 '단일 펩티드'는 또한 정렬 펩티드(sorting peptide)로서 언급되는 세포 내 단백질의 종국적인 위치를 결정하는 아미노산의 짧은 서열을 말한다.
본원에서 사용되는 '독소'는 신체 조직과 접촉 또는 신체 조직에 의한 흡착에서 질병을 야기할 수 있는 살아있는 세포 또는 유기체에 의해 생성되는 독성 물질을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '톡소이드'는 독성이 화학적 또는 열 처리에 의해 약화되고 억제되는 한편, 다른 특성, 예를 들어 면역원성은 유지되는 박테리아 독소를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '전사 인자'는 특이적 DNA 서열에 결합하고, 그것에 의해서 DNA로부터 mRNA에 유전 정보의 전달을 제어하는 단백질을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '백신'은 동물 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 물질 또는 조성물을 말한다. 면역 반응은 유기체 내에서 기억을 유발하고, 감염원을 초래하고, 1차 반응보다는 2차 반응에 의해 충족되어, 따라서 숙주 유기체 상에서 그것의 영향을 감소시키는 면역 반응(체액/항체 및/또는 세포)이다.
본원에서 사용되는 용어 '벡터'는 외래 유전 물질을 다른 세포에 전달하는 비히클로서 사용되는 DNA 분자를 말한다.
새에서 갈리박테리움 속(Gallibacterium genus)으로부터 박테리아에 의한 박테리아 감염에 의해 야기되는 임의의 질병의 치료 및/또는 예방적 치료에서 약제로서 사용을 위해 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis) 또는 면역원성 변이체 또는 그것의 단편을 포함하는 특이적 RTX 독소, GtxA을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것은 본 발명의 주요 목적이다.
갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)는 닭 및 다른 조류종의 상기도 및 하부 생식기의 정상세균총의 부분이다. 그러나, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 병적 병변으로부터 분리되었고, 따라서 잠재적 병원체가 되는 것으로 고려된다. 본 발명은 신규 병원력 인자; 비전형적 조직 및 넓은 표적 세포 범위를 가지는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) RTX-독소를 제공한다.
갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 배양물로부터 무세포, 여과-멸균된 상청액은 적혈구와 한 가지 이상의 외독소의 생성을 나타내는 조류-유래 대식세포-유사 세포(HD11)를 용해한다. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 게놈 서열에서, 본 발명자들은 RTX-독소 유전자를 확인하였다. 암호화된 단백질, 즉 GtxA (갈리박테리움 독소(Gallibacterium toxin))는 2026개의 아미노산(aa)으로 구성된다. 이것은 고전적인 기공-형성 RTX-독소의 2배 크기이다. GtxA의 C-말단 1000개의 aa은 파스퇴렐라세애(Pasteurelleceae)의 다른 구성원의 RTX-독소와 상동성, 예를 들어 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) ApxIA와 38% 서열 유사성이 있었다. 대조적으로, N-말단의 대략 950개 aa은 GenBank 데이터베이스에서 유의한 매치를 가지지 않지만, 알려지지 않은 기능의 11개 57-aa 반복체를 함유하였다. gtxA 및 그것의 아세틸트랜스퍼라아제 활성제, gtxC를 발현시키는 E. coli는 용혈성이고 백혈구독성(leukotoxic)이 되었다. GtxA의 다양한 절단된 버전의 기능이 시험되었다. C-말단의 RTX-도메인은 무결함 독소보다 낮은 용혈성 활성을 나타내었고, N-말단의 도메인은 필수적인 것은 아니지만 최대 용혈성 활성을 필요로 한다는 것을 나타내었다. HD11 세포에 대한 세포독성은 C-말단 단독으로 검출되지 않았으며, 신규 N-말단 반복체-도메인이 백혈구에 대한 세포독성 효과에 필수적이 된다는 것을 제안한다.
gtxA의 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 발현은 웨스턴 및 노던 블롯팅으로 시험되었다. GtxA을 성장 단계-의존적 방식으로 세포 밖 단백질 분획 중에서 검출하였지만, 독소의 예측된 분비와 일치하는 세포-결합 단백질 분획 중에서 검출되지 않았다.
11개의 유전자형으로 및 표현형으로 다양한 갈리박테리움(Gallibacterium) 균주를 gtxA, GtxA 분비 수준의 존재 및 발현 및 배양물 상청액의 용해 활성을 위해 시험하였다. gtxA는 넓게 분포되었고, 갈리박테리움 게놈종(Gallibacterium genomospecies) 1 및 2를 포함하는 모든 시험 균주 중에서 발견되었다(도 6, 배열). 발현은 균주 중에서 실질적으로 다양하였고, 독성이 없는 비-용혈형 균주, 즉 F149T는 아주 적은 양으로 발현되었다. 상청액 중의 GtxA 수준은 HD11 세포에 대해서 용혈성 활성 및 세포독성 활성의 수준과 어느 정도 관련되었다.
본 발명자들은 GtxA가 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 병원성에 상당히 기여할 것으로 기대한다.
GtxA
앞서 설명하지 않았지만, GtxA는 SEQ ID No. 1을 가지는 215 kDa 중량의 2026개 아미노산의 거대한 폴리펩티드이다. 그것은 C-말단 및 N-말단의 단편으로 나뉠 수 있다. 예시적인 C-말단의 단편은 6개의 나란하게 반복되는 나노펩티드를 특징으로 하는 고전적인 RTX 독소와 비슷한 1,077개의 아미노산(SEQ ID No. 2)로 구성된다. 예시적인 N-말단은 상대적으로 소수성이며 다른 RTX 독소 또는 GenBank의 다른 단백질과 서열 유사성을 거의 공유하지 않는 949개의 아미노산(SEQ ID No. 3)으로 구성된다. 독소 활성은 활성자, GtxC에 의존하는데, 이것은 GtxA의 지방산 아실화를 촉진하고, 즉 독성은 폴리펩티드의 전사 후 아실화에 의존한다. 비-아실화 단백질은 독성이 아니다.
GtxA는 주로 용혈성이고 백혈구독성인 세포용해 표현형을 나타낸다. C-말단의 RTX-도메인은 무결함 독소보다 더 낮은 용혈성 활성을 나타내며, N-말단의 도메인은 필수적 이지는 않지만 최대 용혈성 활성을 필요로 하는 것을 나타낸다. 조류-유래 대식세포-유사 HD11 세포에 대한 세포독성은 C-말단 단독으로 검출되지 않았고, 신규 N-말단의 반복체-도메인은 백혈구에 대한 세포독성 효과에 필수적인 것으로 제안한다.
다른 지리학적 영역(덴마크, 체코 공화국 및 멕시코)으로부터 갈리박테리움(Gallibacterium) 균주는 gtxA 유전자의 존재에 대해 스크리닝되었고, 개개의 균주 사이의 발현에서 실질적인 변형이 있다 해도 이것은 시험한 모든 균주들 중에서 발견되었다. 이 변형은 지리적 기원과 관련되지 않는 것으로 나타났다.
갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 닭, 난생 암닭 및 기타 조류종의 상기도 및 하부 생식기의 정상세균총의 부분이다. 그러나, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 또한 조류의 병적 병변으로부터 분리되었고, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)는 가금의 병원체에 상당한 역할을 하는 것으로 여겨졌다.
따라서 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제로서 사용을 위해 GtxA 단백질 또는 그것의 면역학적으로 활성인 폴리펩티드 변이체로부터 유래된 톡소이드 백신을 제공하는 것은 본 발명의 목적이다. 상기 질병은 정온 동물의 박테리아 감염으로부터 초래될 수 있고, 상기 질병을 예방 또는 치료하는 것은 본 발명의 추가 목적이다. 본 발명의 다른 양태는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 GtxA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 면역적으로 활성인 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
GtxA 폴리펩티드는 도 6의 부분적 아미노산 서열의 배열에 의해 증명되는 바와 같이 다른 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis) 분리균을 가로질러 크게 보존된다. 따라서 GtxA 톡소이드를 포함하는 백신 조성물은 매우 많은 다른 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 분리균에 대해 그리고 심지어 갈리박테리움 속(Gallibacterium genus)의 관련 종에 대해 유효할 것으로 기대된다.
박테리아 종
본 발명은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드-운반 발현 벡터에 관한 것이다. 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)로부터 유래된다. 추가적으로, 본 발명은 또한 GtxA 폴리펩티드 및 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 과의 박테리아로부터, 더 바람직하게는 갈리박테리움 속(genus Gallibacterium), 가장 바람직하게는 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 다룬다.
GtxA는 다른 RTX 독소와 크게 다른 것으로 판명되었다. 본원에서 제공되는 분자 툴에 의해, 발명자들은 가능한 갈리박테리움 속으로부터 추가 GtxA-유사 독소의 클로닝 또는 프로빙을 만들었다.
관련 종들로부터 이러한 GtxA-유사 독소들은 SEQ ID NO 1, 2 또는 3과 특정 정도의 서열 상동성을 나타내는 것으로 기대되며, 암호 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 기반으로 한 프로브를 혼성화하는 것으로 기대된다.
유전적으로 변형된 균주
실시예 2에서 설명되는, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) gtxA 돌연변이체 균주는 본 발명자들에 의해 만들어졌다. 균주는 지정된 ΔgtxA이었다. 실시예 7은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) ΔgtxA 돌연변이체와 같은 감염 시도를 설명하며, 새는 실제로 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 의한 천연 감염으로부터 관찰된 병변에 대응하는 생식기관 및 배막을 포함하는 파종성 및 화농성 염증이 일반적으로 발생한 야생형 미생물로 감염되었다. 반면에 ΔgtxA 돌연변이체로 감염된 새는 일반적으로 난소에 편재화된 더 경증의 염증이 발생하였다.
따라서 gtxA는 닭에서 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 병원체에 실질적으로 기여하는 것으로 증명되었다. 따라서 본 발명자들은 상기 본원에서 정의된 ΔgtxA 균주가 유기체를 면역화하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명한 것으로 결론지어질 수 있다. 비-gtxA 항원에 대해 만들어진 항체들을 통해, 예를 들어 미생물이 gtxA 발현 및/또는 분비가 없어진 미생물로서 동일 종을 가지는 특이적 병원성 미생물의 표면상에서, 이러한 면역화된 유기체, 예를 들어 조류 종들은 따라서 gtxA를 발현시키는 야생형 유기체에 대한 면역을 발현시킬 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 내인성 gtxA 유전자가 파괴되어 기능적 gtxA 폴리펩티드의 발현을 없앤 트랜스제닉 녹아웃 미생물에 관한 것이며, 상기 미생물은 비-트랜스제닉 대조군 미생물에 비해 감소된 병원성을 나타낸다.
한 구체예에서, 미생물은 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)이다.
추가 구체예에서, 트랜스제닉 미생물은 항생물질 내성을 가지지 않는다.
GtxA 폴리펩티드
한 야생형 GtxA 즉, 단백질의 천연적으로 발생하는 비-돌연변이 버전은 SEQ ID No. 1에서 확인된다.
한 양태에서, 본 발명은 분리된 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는
a) SEQ ID No. 1, 2 또는 3;
b) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
c) 임의의 a) 중 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단 서열 내 아미노산 중 30개 이하가 그렇게 변경된다)
로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가서 야생형 GtxA 폴리펩티드는 다른 갈리박테리움 종(Gallibacterium species)으로부터 및 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)의 다른 분리물로부터 분리될 수 있다. 이 GtxA는 도 6의 단편의 배열에서 나타내는 것과 같이 SEQ ID NO 1, 2, 및/또는 3과 높은 정도의 서열 동일성을 공유하는 것으로 기대된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1과 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 GtxA과 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96% 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98% 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 99.5 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99.9% 서열 동일성을 포함하는 SEQ ID No. 1 및 GtxA 서열 변이체에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 2에서 정의되는 GtxA 폴리펩티드의 C-말단 도메인 및 SEQ ID No. 2와 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 GtxA 서열의 C-말단 도메인과 더 바람직하게는 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 변이체에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 3에서 정의되는 GtxA 폴리펩티드의 N-말단 도메인, 및 GtxA 서열의 N-말단 도메인과 SEQ ID No. 3과 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 변이체에 관한 것이다.
전장 GtxA에 더하여, 본 발명은 GtxA의 단편에 관한 것이다. 예를 들어, C-말단의 GtxA 도메인 및 N-말단의 GtxA 도메인. 추가적으로, 본 발명은 이 폴리펩티드들의 단편에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 단편은 적어도 150개의 연속하는 아미노산, 바람직하게는 적어도 200개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 300개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 500개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 750개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1000개 아미노산, 더 바람직하게는 1250개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1500개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1750개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 2000개 아미노산으로 구성된다.
GtxA 단편은 야생형 GtxA 서열로부터의 하나 이상의 위치와 다를 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 단편은 최대 30개까지의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 최대 25개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 20개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 15개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 10개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 5개까지의 치환, 예컨대 4, 3, 2 또는 1개의 치환을 함유할 수 있다.
본 발명에 의해 다뤄지는 다른 변이체들은 SEQ ID No. 1, 2 및 3의 폴리펩티드의 변이체에 관한 것이며, 보존적 아미노산 치환이 일어났다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1, 2 또는 3을 포함하는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이며, 폴리펩티드 서열 내 임의의 아미노산은 다른 아미노산과 보존적으로 치환되었다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 서열 변이체 및 단편은 면역원성이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 서열 변이체 및 단편은 독성과 같은 생물학적 활성을 보유하며, 상기 독성은 피이식자의 세포막 중에서 기공의 형성, 예를 들어, 세포용해 세포독성과 같은 세포독성, 예를 들어 용혈성 세포독성을 포함한다.
본 발명은 또한 SEQ ID No, 1, 2 및 3의 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 독성과 같은 생물학적 활성을 제거하는 것에 관해서는 특이적으로 변형되었지만, 예를 들어 면역원성과 같은 활성을 유지하였다. 따라서, 바람직한 구체예에서, SEQ ID No. 1, 2 및 3의 폴리펩티드는 바람직하게는 열 또는 방사선에 의해, 더 바람직하게는 비-아실화된 형태중에서 발현됨으로써, 더 바람직하게는 예를 들어 포름알데히드와 같은 화학적 물질에 노출에 의해 불활성화되었다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1, 2 또는 3을 포함하는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이며, 단일 펩티드는 이종성의 단일 펩티드에 의해 치환된다.
정제의 목적을 위해, 본 발명은 태그될 수 있다. 바람직한 구체예에서, SEQ ID No. 1, 2 및 3은 친화도 태그, 바람직하게는 절단가능한 태크, 예컨대 폴리His 태그, 예를 들어 HA 태그, 예컨대 FLAG 태그, 예를 들어 C-myc 태그, 예컨대 HSV 태그, 예를 들어 V5 태그, 예컨대 말토오스 결합 단백질, 예를 들어 셀룰로오스 결합 도메인 태그, 예컨대 BCCP 태그, 예를 들어 칼모듈린 태그, 예컨대 Nus 태그, 예를 들어 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 태그, 예컨대 녹색형광 단백질 태그, 예를 들어 티오레독신 태그, 예컨대 S 태그, 예를 들어 연쇄상 구균(Strep) 태그로 태그될 수 있다.
바람직하게, 태그는 바로 C-말단에서와 같은 단백질의 C-말단 부분에 있다. 더 바람직하게는, 태그는 태그와 RTX 폴리펩티드 사이에 삽입된 프로테아제 절단 자리를 가지는 것에 의해 GtxA 폴리펩티드로부터 절단가능하다.
GtxA 폴리뉴클레오티드
특이적 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4, 5 및 6에서 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 상기 폴리뉴클레오티드는
a) SEQ ID No. 4, 5 또는 6;
b) SEQ ID No. 4, 5 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 60% 서열 동일성을 가진다);
c) 임의의 a)의 적어도 450개 연속하는 뉴클레오티드로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 핵산은 다른 핵산으로 변경되는데, 단 서열 내 핵산 중 90개 이하가 그렇게 변경된다);
d) SEQ ID No. 4, 5 또는 6와 상보적인 폴리뉴클레오티드에 매우 엄격 하게 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오티드;
e) SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
f) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 서열 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
g) 임의의 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(선택된 서열 내에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단, 서열 내 아미노산 중 30개 이하는 그렇게 변경된다)
로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
뉴클레오티드 프로브와 상동성 DNA 또는 RNA 서열 사이의 혼성화를 결정하기 위한 적당한 실험 조건은 DNA 단편 또는 RNA를 함유하는 필터의 사전 침지(pre-soaking)를 수반하여 10분 동안 5 x SSC [염화나트륨/시트르산나트륨; Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989 참조] 중에서 혼성화되고, 5 x SSC, 5 x 덴하르트 용액 [Sambrook et al.; Op cit. 참조], 0.5 % SDS 및 100 μg/ml의 변성된 음파처리 연어정자 DNA [Sambrook et al.; Op cit. 참조]의 용액 중에서 필터의 사전-혼성화 후, 12시간 동안 대략 45℃에서 무작위-증폭되고(random-primed) [Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], 32P-dCTP-표시된(특이적 활성 > 1 x 109 cpm/μg) 프로브의 10 ng/ml의 농도를 함유하는 동일 용액 중에서 혼성화된다. 다음으로 필터는 적어도 60℃(중간/높은 엄격 조건), 바람직하게는 적어도 65℃(높은 엄격 조건), 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 75℃(매우 높은 엄격 조건)의 온도에서 0.1 x SSC, 0.5 % SDS 중에서 30분 동안 2회 세척된다. 이 조건들 하에서 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화하는 분자는 x-레이 필름을 사용하여 검출될 수 있다.
한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID No. 4, 5, 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열로부터 단일 뉴클레오티드와 다르다. 단일 치환은 침묵 돌연변이일 수도 있고, 또는 보존적 아미노산 치환이 일어날 수도 있다. 단일 치환 또는 결실은 또한 틀 이동 돌연변이가 생길 수 있다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 4의 폴리뉴클레오티드와 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 4와 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 90 %, 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98 %, 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 5의 폴리뉴클레오티드와 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 5와 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 90 %, 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98 %, 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 6의 폴리뉴클레오티드와 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 6와 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 90 %, 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98 %, 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID No. 1, 2 및 3의 폴리뉴클레오티드의 단편에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 단편은 적어도 450개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 600개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 750개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 1000개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 1500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 2000개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 2500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 3000개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 3500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 4000개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 4500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 5000개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 5500개의 연속하는 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 6000개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다.
폴리뉴클레오티드 단편은 야생형 GtxA 폴리뉴클레오티드 서열로부터 하나 이상의 위치에서 다를 수 있고, 이것으로부터 상기 단편이 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 단편은 최대 90개까지의 뉴클레오티드 치환, 더 바람직하게는 최대 80개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 70개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 60개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 50개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 40개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 30개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 20개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 10개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 5개까지의 치환, 예컨대 4, 3, 2 또는 1개의 치환을 함유할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 높은 엄격 혼성화 조건 하에서 SEQ ID No. 4, 5 및 6의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 대립유전자 핵산 변이체가 자연적으로 발생할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 SEQ ID No. 4, 5 및 6의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴크레오티드는 Escherichia coli 내 발현을 위해 최적화되었다.
발현 벡터
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 임의의 적당한 벡터, 예컨대 발현 벡터 또는 클로닝 벡터 내에서 구성될 수 있다. 수많은 벡터가 이용가능하며, 특정 목적에 적합한 임의의 벡터가 선택될 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 과정에 의해 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 DNA는 당업계에 잘 알려진 기법을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 자리(들)에 삽입될 수 있다. 본 발명에 관한 핵산 서열을 제외하고, 벡터는 하나 이상의 신호 서열, 복제원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 또한 추가 서열, 예컨대 인핸서, 폴리-A 꼬리, 링커, 폴리링커, 작동 링커, 복수의 클로닝 자리(MCS), STOP 코돈, 내부 리보좀 진입 자리(internal ribosomal entry sites, IRES) 및 통합에 대한 숙주 상동성 서열 또는 다른 정해진 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 적당한 세포 내에서 발현을 지시하는 조절 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 예컨대 진핵세포 플라스미드 벡터, 더 바람직하게는 원핵세포 플라스미드 벡터이다.
다른 바람직한 구체예에서, 벡터는 또한 레트로비리다에(Retroviridae) 과, 예컨대 렌티바이러스(lentivirus), 예를 들어 HIV, 예컨대 SIV, 예를 들어 EAIV, 예컨대 CIV로부터 유래되는 바이러스 벡터이다.
또한 바람직한 구체예에서, 벡터는, 제한되는 것은 아니지만, 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 바큘로바이러스, HSV, 코로나바이러스, 소유두종 바이러스, Mo-MLV로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 아데노연관 바이러스이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 프로모터를 포함하며, 더 바람직하게는 상기 프로모터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.
바람직한 구체예에서, 상기 프로모터는, 제한되는 것은 아니지만, 원핵 프로모터로부터 선택되며, 바람직하게는 원핵 프로모터는 추가 요소, 예컨대 RNA 폴리머라아제 결합 자리, 예를 들어 프리브노 박스(Pribnow box) 또는 그것의 부분, 예컨대 -35 요소 또는 그것의 부분을 포함한다. 본 발명의 원핵 벡터는, 예를 들어 E. coli에서 불활성화된 GtxA 중의 재조합 발현을 위해 사용될 수 있다. E. coli가 GtxC 유전자를 함유하지 않기 때문에, E. coli에서 발현된 GtxA는 적절하게 아실화되지 않고 결과적으로 비-독성이다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 프로모터는, 제한되는 것은 아니지만, 진핵 프로모터로부터 선택되며, 진핵 프로모터는 추가 요소, 예컨대 RNA 폴리머라아제 결합 자리, 예를 들어 TATA 박스 또는 그것의 부분, 예컨대 임의의 진핵 전사 인자에 대한 적어도 하나의 결합 자리를 포함한다.
본 발명의 벡터의 바람직한 구체예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 진핵 프로모터를 포함하는 네이키드 DNA 백신이다.
백신
일반적으로, 백신은 기능적 면역계를 가지는 살아있는 종 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 물질 또는 조성물이다. 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: "활성 성분" 예컨대 항원(들) (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 등), 다른 요소등 중에서 하나 이상의 항원들을 포함하는 핵산 구성체, 세포, (예를 들어, 장약된 APC, 양자 이입(adoptive transfer)을 위한 T 세포), 복합체 분자(항체들, TCR 및 MHC 복합체들 그 이상), 담체, 애주번트 및 약제학적 담체. 본 발명은 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)로부터 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 바람직하게는 상기 폴리펩티드의 불활성화된 형태, 또는 면역원성 변이체 또는 그것의 단편을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 '백신'은 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)로부터 기원하는 질병에 대해 특이적 면역을 유발하는 목적을 위한 수의과의 백신을 말한다.
본 발명은 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 불활성화된 형태, 그것의 기능적 상동체, 적어도 70% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 면역학적으로 활성인 단편을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 백신은 톡소이드 백신을 칭한다. 톡소이드 백신은 그것의 독성을 상실하였지만, 그것의 면역원성을 보유한 독소가 표적 유기체에서 면역 반응을 유발하기 위해 사용된 백신이며, 상기 표적 유기체는 동일한 또는 유사한 박테리아 종으로부터 기원하는 상기 독소 또는 유사한 독소에 의한 장래의 감염에 내성이 생기게 된다.
바람직한 구체예에서, 상기 백신은 불활성화된 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 독성에 대해 불활성화되었지만, 남은 면역원은 바람직하게는 열에 의해, 더 바람직하게는 포름알데히드와 같은 화학물질에 노출에 의해, 더 바람직하게는 비-아실화된 형태로 SEQ ID No. 1의 폴리펩티드를 발현시킴으로써 불활성화된다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 백신은 불활화 또는 생, 약독 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)를 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 추가로 바이러스 또는 미생물 병원체로부터 조류 종까지 적어도 하나의 다른 항원에 관한 것이며, 상기 바이러스 또는 미생물은, 제한되는 것은 아니지만, 전염성 기관지 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 전염성 F낭 병 바이러스, 닭 빈혈증 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 뉴모바이러스, 닭 수두바이러스, 조류뇌척수염바이러스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 헤모필루스 파라갈리나룸, 파스투렐라 물토시다 및 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli)로 구성된다.
독소와 같은 항원이 숙주 유기체에 도입될 때, 추가적인 성분들이 면역 반응을 상승시키기 위해 사용된다. 이러한 성분들은 통상적으로 애주번트로서 언급된다. 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 애주번트 및/또는 담체를 포함한다. 애주번트는 백신 조성물로 혼합되어 GtxA 폴리펩티드 또는 그것의 면역원성 단편에 대한 면역 반응을 증가 또는 달리 변화시키는 임의의 물질이다. 담체는, 예를 들어 GtxA 폴리펩티드 또는 그것의 면역원성 단편이 결합될 수 있고, 항원의 존재에 도움을 주는 스캐폴드 구조, 예를 들어 폴리펩티드 또는 다당류이다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은, 제한되는 것은 아니지만 프로인트 완전 및 불완전 애주번트, 비타민 E, 비-이온성 차단 중합체, 무라밀디펩티드, quil A, 미네랄 오일 및 비-미네랄 오일, 식물성 오일 및 카르보폴의 군으로부터 선택되는 애주번트 및/또는 담체를 포함한다. 본 발명의 백신은 또한 Span 또는 Tween와 같은 에멀젼화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 몇몇 경로, 예를 들어 근육 내 또는 피하내 주사, 경구, 예를 들어 음식 또는 물을 통해, 예컨대 에어로졸, 예를 들어 발 또는 윙 웹(wing web)에서, 예를 들어 난절에 의해, 예컨대 점안액에 의해, 예를 들어 난황내 투여에 의해 투여될 수 있다.
새
파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 과의 대부분의 구성원은 정온 동물, 바람직하게는 새의 점막에 공생자로서 살고 있다. 갈리박테리움 속의 구성원은 공생성 및 병원성 균주를 둘 다 포함하며, 상기 병원성 균주는 주로 조류 숙주의 기도 및 생식관에서 감소를 야기한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 정온 동물, 더 바람직하게는 조류 종에서, 예컨대 오리(Anas), 예를 들어 기러기(Anser), 예컨대 흰죽지(Aythya), 예를 들어 사향오리(Biziura), 예컨대 흑기러기(Branta), 예를 들어 백조(Cygnus), 예컨대 제비꼬리 갈매기(Creagrus), 예를 들어 큰부리제비갈매기(Gelochelidon), 예컨대 괭이갈매기(Larus), 예를 들어 북극흰갈매기(Pagophila), 예컨대 목테갈매기(Xema), 예를 들어 황새과(Ciconiidae), 예컨대 비둘기(Columba), 예를 들어 땅비둘기(Columbina), 예컨대 황제비둘기(Ducula), 예를 들어 붉은가슴비둘기(Gallicolumba), 예컨대 다이아몬드 비둘기(Geopelia), 예를 들어 메추라기비둘기(Geotrygon), 예컨대 왕관비둘기(Goura), 예를 들어 비티레부비둘기(Gymnophaps), 예컨대 긴눈썹비둘기(Hemiphaga), 예를 들어 렙토틸라(Leptotila), 예컨대 류코사르시아(Leucosarcia), 예를 들어 마크로피기아(Macropygia), 예컨대 육지비둘기(Metriopelia), 예를 들어 오시팝스(Ocyphaps), 예컨대 오에나(Oena), 예를 들어 파타기오에나스(Patagioenas), 예컨대 팝피트레론(Phapitreron), 예를 들어 프틸리노푸스(Ptilinopus), 예컨대 스카르다펠라(Scardafella), 예를 들어 멧비둘기(Streptopelia), 예컨대 청비둘기(Treron), 예를 들어 슴새(Turtur), 예컨대 제나이다(Zenaida), 예를 들어 아에파이포디우스(Aepypodius), 예컨대 알렉투라(Alectura), 예를 들어 꿩과(Phasianidae), 예컨대 테트라오니나에(Tetraoninae), 예를 들어 사다새과(Pelecanidae), 예컨대 홍학과(Phoenicopteridae), 예를 들어 유황앵무과(Cacatuidae), 예컨대 진홍앵무과(Loriidae), 예를 들어 앵무과(Psittacidae), 예컨대 에뮤과(Dromaiidae), 예를 들어 프테로세미아(Pterocnemia), 예컨대 레아(Rhea) 예를 들어 타조과(Struthionidae)에서 박테리아 감염의 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 벡터에 관한 것이다.
더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 벡터는 오리, 칠면조 및 닭, 더 바람직하게는 난생 암닭으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조류 종에서 박테리아 감염의 치료에 사용된다.
항체
본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 면역원성 단편의 존재를 검출하기 위해서, 상기 폴리펩티드 또는 그것의 면역원성 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체들을 만드는 것은 유용하다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체들은 혈청-유래 다클론성 항체 또는 단클론성 또는 재조합 항체일 수 있으며, 상기 항체들은 Fv, scFv, Fab, Fab' 또는 F(ab)2, 다이머 IgA 분자 또는 5가의 IgM와 같은 멀티머 형태, 애피바디 또는 디아바디와 같은 항원 결합 단편을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 IgA 항체, 가장 바람직하게는 닭 IgA 항체에 관한 것이다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1과 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 1과 적어도 70%, 더 바람직하게는 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
또한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 2와 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 2와 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 3와 적어도 70%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 3와 75% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 95 % 서열 동일성, 예를 들어 적어도 96 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 98 % 서열 동일성, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1, 2 및 3의 임의의 폴리펩티드의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체에 관한 것이며, 상기 단편은 적어도 150개의 연속하는 아미노산, 바람직하게는 적어도 200개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 300개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 500개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 750개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1000개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1250개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1500개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1750개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 2000개 아미노산으로 구성된다.
또한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이며, 상기 단편은 최대 30개까지의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 최대 25개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 20개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 15개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 10개까지의 치환, 더 바람직하게는 최대 5개까지의 치환, 예컨대 4, 3, 2 또는 1개의 치환을 함유할 수 있다.
진단
진단 시험 키트는 본 발명에 관한 진단 방법을 수행하기 위한 모든 구성요소의 수집품이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 시험 키트에 관한 것이며, 박테리아 종의 존재하에서 갈리박테리움 속으로부터 초래되는 박테리아 감염의 증상은 생물학적 샘플에서 검출된다. 상기 증상은 임의의 상기 폴리펩티드에 대해 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 임의의 폴리펩티드 또는 그것의 기능적 변이체 또는 항체의 존재일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 폴리펩티드 또는 항체들의 존재는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 검출될 수 있다. ELISA는 샘플 중에서 단백질, 또는 임의의 다른 항원의 존재를 검출하기 위해 사용되는 정량적 기법이다. ELISA에서 알려지지 않은 양의 항원이 표면에 부착된 다음, 특이적 항체가 표면을 거쳐서 세척되고, 따라서 그것은 항원에 결합할 수 있다. 이 항체는 효소에 결합되고, 최종 단계에서 물질이 부가되어 효소는 일부 검출가능한 신호로 전환될 수 있다.
몇 가지 유형의 ELISA가 존재한다:
간접 ELISA
샌드위치 ELISA
경쟁적 ELISA
역 ELISA
또한 다른 면역-기반 분석, 예를 들어 화학발광 면역계수측정 분석 및 해리-향상 란타나이드 면역분석이 샘플 중의 상기 폴리펩티드 또는 상기 항체들을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 갈리박테리움 아나티스 GtxA에 특이적인 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 다른 특이적 DNA 또는 RNA 서열의 존재를 검출하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 실시간 (RT)-PCR 방법에 관한 것이다. PCR은 증폭을 위한 기법이고, 그것에 의해서 궁극적으로 DNA의 하나의 복제물 또는 얼마 안 되는 복제물의 조각을 검출하여, 몇 제곱에 걸쳐서 특정 DNA 서열의 수천 내지 수백만의 복제물을 만드는 것이다. 본 방법은 DNA 융해 및 DNA의 효소 복제를 위한 반응의 반복된 가열 및 냉각 주기를 구성하는 열 순환에 의존한다. DNA 폴리머라아제와 함께 표적 영역에 상보적인 서열을 함유하는 프라이머(짧은 DNA 단편)는 선택적이고 반복된 증폭을 할 수 있는 중요한 성분이다. PCR을 진행함에 따라서, 생성된 DNA는 그 자체가 복제를 위한 주형으로서 사용되고, DNA 주형이 기하급수적으로 증폭되는 작동중인 연쇄 반응을 설정한다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터의 의학적 사용
톡소이드 백신으로서 불활성화된 독소는 대게 수의학 용도, 바람직하게는 가금류 무리를 치료하기 위해 박테리아 감염의 치료 및/또는 예방적 치료에 사용된다.
톡소이드 백신에 의한 목적은 침입 박테리아가 아니라 오히려 침입 박테리아에 의해 생성되는 독소와 싸우는 면역계를 유지하는 것이다.
따라서, 본 발명의 GtxA 폴리펩티드, GtxA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 GtxA 독소 및/또는 유사한 독소를 분비하는 박테리아에 의해 야기되는 병원성 질환의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 톡소이드 백신을 만들기 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 새에서 수동적 면역을 제공하기 위한 투약은 백신의 용량 당 약 0.25ml이다. 다른 구체예에서, 투약은 백신의 용량 당 약 0.4ml이다. 또 다른 구체예에서, 투약은 백신의 용량 당 약 0.6ml이다. 구체예에서, 투약은 백신의 용량 당 약 0.5ml이다. 한 구체예에서, 조류는, 제한되는 것은 아니지만, 오리, 칠면조 및 닭으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구체예에서, 조류는 난생 암닭이다.
본 발명은 또한 조류를 보호하기 위해 조성물에 다른 백신을 포함하여 다양한 질병에 대해 본 발명의 백신을 조류에 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명은 새, 바람직하게는 오리, 칠면조 또는 닭, 더 바람직하게는 난생 암탉의 백신접종으로 GtxA 독소에 대해 활성 면역을 제공하는 것을 포함한다. 병아리 및/또는 칠면조병아리는 아직 어릴 때, 약 1일령 또는 약간 더 후(1주령 내에)에 백신의 1회 또는 2회 투여로 백신접종된다. 활성 면역을 얻기 위한 적절한 백신 투약량은 약 0.05 ml 내지 약 0.5 ml으로 다양할 것이다. 특정 구체예에서, 백신 투약량은 약 0.05 ml 내지 약 0.1 ml이다.
각각의 새는 1-3개월 내에 예를 들어 2회와 같이 1회 이상 백신접종될 필요가 있는 것으로 기대된다. 예를 들어 난생 암닭의 장수명(life-long) 보호를 위해 매년 재접종이 필요로 될 수 있다.
또한 추가 구체예에서, 본 발명의 독소 또는 면역원성 단편은 새에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 백신으로서 사용된 GtxA 독소 또는 그것의 면역원성 단편은 동물마다 용량 당 약 1 μg/kg 체중 내지 약 1000 μg/kg 체중, 예시적인 범위로 용량 당 약 10 μg/ kg 체중 내지 약 100 μg/kg 체중 일 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예
실시예 1: 신규 도메인 조직체에 의한 갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis ), 세포용해 RTX -독소로부터의 GtxA
요약
갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)는 닭 및 다른 조류 종의 병원체이며, 이는 난관염 및 복막염의 중대한 원인이다. 본 발명자들은 용혈성 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카로부터의 박테리아 세포 및 무세포, 여과-멸균된 배양물 상청액이 조류-유래 대식세포-유사 세포(HD11)에 대해 높은 세포독성이 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 게놈 서열을 얻었고, 본 발명자들이 GtxA로 명명한 2026개의 아미노산 RTX-독소(갈리박테리움 독소( G allibacterium toxin))를 암호화하는 것으로 예측된 유전자를 확인하기 위한 합리적 접근을 사용하였다. gtxA 녹아웃 돌연변이체의 구성은 gtxA가 G. anatis의 용혈성 및 백혈구독성 활성을 초래한다는 것을 나타내었다. 게다가, E. coli 발현 gtxA 및 인접한 아실트랜스퍼라아제, gtxC는 세포용해되었다. GtxA는 시험관내 성장 동안 발현되었고, 성장단계 의존적 방식으로 세포 밖 단백질 분획 중에서 편재화된다. GtxA는 흔치않은 모듈 구조를 가졌고; GtxA의 C-말단의 1000개 아미노산은 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae)의 다른 구성원에서 고전적인 기공-형성 RTX-톡소와 상동성이다. 반대로, N-말단의 대략 950개 아미노산은 서열 데이터베이스에서 유의한 매치가 거의 없었다. 절단된 GtxA 단백질의 발현은 C-말단의 RTX-도메인이 정장 독소보다 더 낮은 용혈성 활성을 가진다는 것을 증명하였으며, N-말단의 도메인이 최대 용혈성 활성을 필요로 한다는 것을 나타낸다. HD11 세포에 대해 세포독성은 C-말단 단독으로 검출되지 않았으며, N-말단의 도메인이 백혈구독성에 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
물질 및 방법
박테리아 균주 및 성장 조건
갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis) 생태형 헤몰리티카 균주 12656-12 Liver (12656-12로서 언급됨)를 이 연구에서 사용하였으며, 이 균주는 본래 패혈증 닭의 간으로부터 분리하였다[Bojesen A.M., Torpdahl M., Christensen H., Olsen J.E., Bisgaard M., Genetic diversity of Gallibacterium anatis isolates from different chicken flocks, J. Clin. Microbiol. (2003) 41:2737-2740]. 밀폐한 비닐봉투 내에서 5% 시트르산 첨가된 소 혈액으로 보충한 뇌심장 침출액 (BHI) (Oxoid) 한천 또는 에어레이션과 함께 BHI 브로스 중에서 37℃에서 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12를 성장시켰다. Anaerogen (Oxoid)을 인큐베이터 자(jar) 내의 혐기성 조건을 만들기 위해 사용하였다. E. coli 균주를 Luria-Bertani 브로스 및 한천 중에서 성장시켰고, 적절할 때 배지를 50 μg/mL 카나마이신 및 20 μg/mL 클로르암페니콜로 보충하였다. 모든 화학물질을 Sigma로부터 구입하였다.
생물정보학 분석
갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카 12656-12 간(A. M. Bojesen, unpublished data)의 게놈 서열의 초안 버전(115개 콘틱)을 염기서열분석(pyrosequencing)-기반 방법을 사용하여 454 Life Sciences로부터 얻었다[ Margulies M., Egholm M., Altman W.E., Attiya S., Bader J.S., Bemben L.A., et al., Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors, Nature (2005) 437:376-380]. 유전자 어노테이션(annotation)을 Victorian Bioinfomatics Consortium, Monash University, Australia에 의해 제공된 원핵 유기체에 대한 웹-기반 어노테이션 시스템인 Wasabi를 사용하여 수행하였다[ Bulach D.M., Zuerner R.L., Wilson P., Seemann T., McGrath A., Cullen P.A., Davis J., Johnson M., Kuczek E., Alt D.P., Peterson-Burch B., Coppel R.L., Rood J.I., Davies J.K., Adler B., Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:14560-14565]. 게놈 유사성 검색을 BLASTP를 사용하여 수행하였다[Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J.H., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J., Gapped BLAST 및 PSI-BLAST: 새로운 세대의 단백질 데이터베이스 검색 프로그램, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402] (데이터베이스: non-redundant protein sequences (GenBank) 및 SwissProt), FASTA [Pearson W.R., Lipman D.J., Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-2448] 및 SSEARCH (데이터베이스: UniProtKB 및 SwissProt), 및 HHpred [Soding J., Biegert A., Lupas A.N., The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction, Nucleic Acids Res. (2005) 33:W244-W248] (데이터베이스: Interpro (2009)). 모든 검색을 2009년 3월에 수행하였다. Transterm [Kingsford C.L., Ayanbule K., Salzberg S.L., Rapid, accurate, computational discovery of Rho-independent transcription terminators illuminates their relationship to DNA uptake, Genome Biol. (2007) 8:R22]를 전사 종결자를 예측하기 위해 사용하였다.
용혈현상 분석
용혈성 활성을 앞서 설명한 바와 같이 분석하였고[Rowe G.E., Welch R.A., Assays of Hemolytic Toxins, Methods Enzymol. (1994) 235:657-667]; 소 혈액을 TN 버퍼(10 mM Tris-HCl, 0.9% NaCl, pH 7.5) 중에서 상부 층이 무색을 나타낼 때까지 반복적으로 세척하였다. 2% (vol/vol) 적혈구 용액을 10 mM CaCl2로 보충한 TN-버퍼 중에서 제조하였다. 달리 언급되지 않는다면 적혈구를 1시간 동안 1:1 비율로 37℃에서 여과-멸균된 박테리아 배양물 상청액 또는 박테리아와 함께 인큐베이션하였다. 미용해 적혈구 및 세포 파편을 원심분리에 의해 수집하였고, 방출된 헤모글로빈의 양을 540 nm에서 플레이트 판독기 중에서 측정하였다. 100% 용혈을 1% triton-X로 결정하였고, 배경 용해(background lysis)를 차감하여 용혈성 활성을 계산하였다. 60℃에서 30분 동안 상청액을 인큐베이션하여 가열의 효과를 시험한 후, 용혈현상을 분석하였다. 프로테이나아제 K의 효과를 37℃에서 30분 동안 4 μg/mL 프로테이나아제 K와 함께 상청액을 인큐베이션하여 시험한 후 용혈현상을 분석하였다.
HD11 세포 및 LDH 세포독성 분석의 배양
닭 골수 세포의 MC29 형질전환으로부터 유래된 대식세포-유사 세포주 HD11[ Beug H., Vonkirchbach A., Doderlein G., Conscience J.F., Graf T., Chicken Hematopoietic-Cells Transformed by 7 Strains of Defective Avian Leukemia Viruses Display 3 Distinct Phenotypes of Differentiation, Cell (1979) 18:375-390]을 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 + GlutaMAXTM-I + 25 mM HEPES (Gibco) 중에서 유지하였다. 배지를 2.5% 닭 혈청, 7.5% 소 태아 혈청(FBS), 및 25 μg/mL 겐타마이신으로 보충하였다. 세포를 5% CO2의 분위기로 37℃에서 부착 세포주로서 배양하였고, 2일 또는 3일마다 하위-배양(sub-culture)하였다. 세포독성 분석 동안, 세포를 총 100 μL의 부피로 5% FBS를 첨가한 RPMI 중에서 2 × 104개 세포로 96 웰 플레이트 중에서 파종하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하였고, 배지를 변경하였다. 여과-멸균된 배양물 상청액 또는 박테리아를 식염수(0.9% NaCl) 중에서 재현탁하였고, 세포에 첨가하였고, 한 시간 동안 인큐베이션하였다. E. coli에 대해, 재조합 단백질의 발현을 섹션 2.7에서 설명한 바와 같이 유도하였고, OD600 (600 nm에서 광학 밀도)을 대략 6 × 108 CFU/mL에 대응하는 1로 조절하였다. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 세포 및 상청액을 늦은 지수기에 수확하였다(OD600 =1). 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 현탁액을 대략 4 × 108 CFU/mL에 대응하는 1의 OD600로 조절하였다. 여과-멸균된 배양물 상청액을 얼음 상에 저장하였고, 수확 후 30분 내에 세포에 첨가하였다. 세포독성을 제조업자에 의해 설명되는 LDH 세포독성 분석(Promega)으로 결정하였다. 각 샘플을 3중 웰에서 분석하였고, 실험을 최소 3회 반복하였다.
갈리박테리움 아나티스 ( G. anatis ) gtxA 돌연변이체의 구성
뉴클레오티드 140 내지 1648의 gtxA로 구성되는 1508 bp 단편을 프라이머 4240 및 4242로 PCR-증폭하였고, 뉴클레오티드 4240 및 4242로 구성되는 1483 bp 단편을 프라이머 4243 및 4245로 증폭하였다(프라이머 서열을 표 1에 열거한다). 2개의 단편을 제한 효소로 분해하였고, 플라스미드 pWSK129 중에서 대응하는 제한 자리에 결찰하였다[Wang R.F., Kushner S.R., Construction of versatile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli, Gene (1991) 100:195-199]. EcoRI-분해된 pUC4-KISS로부터의 겔-정제 카나마이신-카세트(Tn903)[Barany F., 2-Codon Insertion Mutagenesis of Plasmid Genes by Using Single-Stranded Hexameric Oligonucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:4202-4206]를 2개의 PCR-단편 사이의 EcoRI 자리로 결찰하였다. 카나마이신 내성 유전자를 gtxA와 동일한 전사 방향으로 삽입하였다. 플라스미드 DNA를 XhoI 및 SalI로 분해에 의해 선형화하였고, 컬럼을 정제하였다. 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 천연 기능을 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)에 대해 앞서 설명한 바와 같이 MIV-방법에 의해 유도하였다[Poje G., Redfield R.J., Transformation of Haemophilus influenzae, Methods Mol. Med. (2003) 71:57-70]; 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)를 0.2의 OD600로 BHI 중에서 성장시켰고, MIV 중에서 한 번 세척하고, 100분 동안 MIV 중에서 인큐베이션하였다. 선형 DNA를 0.5 μg DNA/mL의 농도에서 세포에 첨가하였다. 20분 후, 2부피의 BHI를 첨가하였고, 박테리아를 1시간 동안 인큐베이션한 후 형질전환체를 5 μg/mL 카나마이신이 있는 혈액 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 콜로니를 재도말하였고, 검출을 프라이머 쌍 39F + kanR, kanF + 5334R 및 2871F + 3270R로 확인하였다. 균주를 ΔgtxA로 지정하였다.
발현 플라스미드의 구성
GtxC가 있는 및 GtxC가 없는 전장 GtxA를 암호화하는 플라스미드, GtxA의 N-말단 도메인(아미노산 1-949) 및 GtxA의 RTX-도메인 (아미노산 931-2026)을 발현 벡터 pET28a (Novagen)에 PCR 단편의 결찰에 의해 구성하였다(Novagen). PCR 단편을 pfx50 폴리머라아제(Invitrogen)로 증폭하였고, 컬럼을 정제하였고 NcoI 및 XhoI으로 이중으로 분해하였고, 다시 컬럼 정제하거나 또는 겔-정제하였다(단편 >6 kb). 각 구성체에 대해 사용한 프라이머를 표 2에 열거한다. 구성체 Nterm+C, gtxC이 있는 오페론 중에서 gtxA의 뉴클레오티드 1-2847을 중첩 확대에 의한 스플라이싱의 사용에 의해 만들었으며[Horton R.M., Cai Z.L., Ho S.N., Pease L.R., Gene-Splicing by Overlap Extension - Tailor-Made Genes Using the Polymerase Chain-Reaction, Biotechniques (1990) 8:528-535], 프라이머 GtxUP-NcoI 및 gtxC-r-XhoI를 PCR의 제2 라운드에서 사용하였다. 플라스미드 pET28a를 NcoI 및 XhoI로 이중으로 분해하였고, 앤타크틱 포스파타아제(NEB)로 탈인산화하였고, 겔을 정제하였다. 벡터 및 PCR-단편을 1:3의 몰 비율로 결찰하였고, 화학적으로 능숙한 E. coli Top10F'(Invitrogen)으로 형질전환하였고, 카나마이신이 있는 LB-한천 플레이트 상에서 선택하였다. 각각의 플라스미드 내 삽입 순서를 DNA-서열에 의해 확인하였다(Macrogen, Korea). 플라스미드를 E. coli 발현 균주 ER2566 (New England Biolabs)로 형질전환하였다. 플라스미드 pLG575는 E. coli hlyB 및 hlyD, T1SS 분비 HlyA의 성분를 암호화하고[Mackman N., Nicaud J.M., Gray L., Holland I.B., Genetical and functional organisation of the Escherichia coli haemolysin determinant 2001, Mol. Gen. Genet. (1985) 201:282-288], 도입되어 발현된 단백질의 분비를 촉진하였다.
E. coli 내 재조합 GtxA 단백질의 발현
30℃에서 인큐베이션한 0.1 mM IPTG를 함유하는 한천 플레이트 상에서 단백질 발현을 유발하였다. 브로스 중에서 유도를 위해, 밤새 배양물을 1:50으로 희석하였고, 배양물이 0.6의 OD600에 도달할 때까지 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, IPTG (0.2 mM)를 첨가하였고, 2시간 동안 30℃에서 유도를 유지하였다. 세포로부터 재조합 단백질을 방출시키기 위해, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 본래 부피의 1/25으로 0.1 M Tris/0.9% NaCl 중에서 재현탁하였고, 45초 동안 비드 비팅(bead beating)에 의해 용해하였고, 4℃에서 교반하고, 액체 용혈현상 분석 및 LDH 세포독성 분석을 위해 즉시 상청액을 사용하였다.
SDS PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
총 세포 단백질을 500 μL의 배양물을 수확하고, 수확 시간에 10 mM Tris, 500μL/ OD 단위 중에서 세포 펠렛을 재현탁함으로써 얻었다. 세포 밖 단백질을 여과-멸균된 배양물 상청액으로부터 제조하였다(낮은 단백질 결합 필터(0.22 μm) (Millex? GP (Millipore)). 단백질을 1부피의 빙냉 96% 에탄올의 첨가에 의해 밤새 침전시켰고, 원심분리에 의해 수집하였고(30분 동안 0℃에서 13000 g), 10 mM Tris (원래 부피의 1/100) 중에서 재현탁하였다. 단백질을 NuPAGE? Novex 겔 (Invitrogen) 중에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Invitrogen)으로 옮겼다. 단백질을 NuPAGE? Novex 겔 (Invitrogen) 중에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Invitrogen)으로 옮겼다. 제1 항체, 즉 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae)로부터의 ApxI에 대해 상승된 토끼 항혈청[Schaller A., Kuhn R., Kuhnert P., Nicolet J., Anderson T.J., MacInnes J.I., Seger R.P.A.M., Frey J., Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae, Microbiology (1999) 145:2105-2116]을 1:1333 희석에서 사용하였고, 제조업자에 의해 설명된 Westernbreeze 화학발광 웨스턴 블롯 면역검출 키트(Invitrogen)로 검출하였다.
RNA 정제
밤새 배양물을 BHI 중에서 1:100으로 희석하였고 에어레이션과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 OD600 0.17, 0.6, 2, 3에서뿐만 아니라 성장을 중단시키고 1시간 후 및 인큐베이션의 24시간 후 수확하였다. 전체 RNA를 RNeasy protect Mini Kit (Qiagen)로 분리하였고, 컬럼 상 DNAse 처리를 제조업자(Qiagen)에 의해 설명된 바와 같이 수행하였다.
노던 블롯팅
RNA의 블롯팅, 프로프 표지([α-32 P]-dCTP로) 및 혼성화를 기본적으로 설명되는 바와 같이 수행하였다[Frees D., Chastanet A., Qazi S., Sorensen K., Hill P., Msadek T., Ingmer H., Clp ATPases are required for stress tolerance, intracellular replication and biofilm formation in Staphylococcus aureus, Mol. Microbiol. (2004) 54:1445-1462]. gtxA의 RTX-절반 내에서 384 bp 단편을 프라이머 3487F 5'-GCCTCTACCGCCGTTTCTG-3' 및 3874R 5'-GGCTGGCTAATAATTCATCACCTTG-3'에 의해 PCR-증폭하였고, 프로브 표지 반응에서 주형으로서 사용하였다.
결과
갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 세포 용해 활성
갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카는 소-혈액 한천 플레이트 상에서 β-용혈성이다[Christensen H., Bisgaard M., Bojesen A.M., Mutters R., Olsen J.E., Genetic relationships among avian isolates classified as Pasteurella haemolytica , 'Actinobacillus salpingitidis' or Pasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen. nov., comb. nov and description of additional genomospecles within Gallibacterium gen. nov, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2003) 53:275-287]. 표적 범위를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 다른 종들로부터의 혈액으로 한천 플레이트 상에서 균주 12656-12의 용혈현상, 및 말, 소, 돼지 또는 닭 혈액을 함유하는 한천 플레이트 상에서 성장시킬 때(데이터 미제시) β-용혈현상의 박테리아 생성 투명대(clear zone)를 시험하였고, Greenham and Hill에 의해 보고되는 넓은 표적 범위를 확인하였다[Greenham L.W., Hill T.J., Observations on an Avian Strain of Pasteurella haemolytica, Vet. Rec. (1962) 74:861-863]. 박테리움은 호기성과 혐기성 배양 조건 하에서 용혈성이었다.
이 용혈성 활성은 분비된 헤몰리신으로부터 기원하는 것으로 제안되었다[Greenham L.W., Hill T.J., Observations on an Avian Strain of Pasteurella haemolytica, Vet. Rec. (1962) 74:861-863]. 이것을 시험하기 위해서, 액체 용혈현상 분석을 수행하였으며, 다른 성장단계에서 수확한 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12 무세포 배양물 상청액을 소 적혈구의 현탁과 함께 인큐베이션하였고, 방출된 헤모글로빈의 양을 측정하였다. 중간 내지 늦은 대수기의 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 상청액은 적혈구를 효율적으로 용해하였다(도 1A). 이 활성은 열 (60℃) 및 프로테이나아제 K에 의해 불활성화되었고, 칼슘 킬레이터 EGTA에 의해 감소되었고(데이터 미제시), 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)가 칼슘-의존적 분비 용혈성 단백질을 생성한다는 것을 확인하였다.
적혈구의 용해는 숙주의 철 획득에 역할을 하지만, 다른 형태의 세포, 예를 들어 백혈구와 상호작용에서 천연 감염 동안 더 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 조류-유래 대식세포-유사 세포주 HD11을 사용하여 백혈구에 대한 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 세포독성 활성을 시험하였다. HD11 세포는 라운딩(rounding)을 나타내었고 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 노출 후 표면으로부터 분리하였다(도 2b). 세포독성을 락트산탈수소효소(LDH)를 세포독성 분석을 사용하여 정량화하였고, 확연한 세포사멸을 나타내었다(도 2c). 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 백혈구독성 활성은 이 박테리아의 발명에 필수적이 될 수 있고, 백혈구독성 활성을 초래하는 단백질은 따라서 중요한 병원력 인자가 되는 것으로 기대된다.
갈리박테리움 아나티스 ( G. anatis ) 게놈 서열에서 RTX -독소의 확인
갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 세포독성 표현형을 초래하는 특이적 단백질을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 게놈 서열을 얻었고, 가능한 독소를 암호화하는 서열을 찾았다. 기공-형성 RTX-독소의 군에 속하는 단백질은 중요한 병원력 인자이고, 갈리박테리움(Gallibacterium)과 관련된 박테리아에서 용혈성 및 백혈구독성 활성을 초래하며[Frey J., Kuhnert P., RTX toxins in Pasteurellaceae, Int. J. Med. Microbiol. (2002) 292:149-158], 이런 종류의 단백질이 확실한 표적을 찾도록 만든다. BLAST는 2026 아미노산의 추정적 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) RTX-독소의 확인을 유발한 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12 게놈 서열에 대해 다른 RTX-독소의 아미노산 서열로 검색한다. 이 단백질을 암호화하는 6081 뉴클레오티드(nt) 오픈 리딩 프레임(ORF)은 gtxA: 갈리박테리움 독소( G allibacterium toxin)에 대해 gtx 그리고 다른 RTX 오페론 중의 독소 유전자의 지정으로 유사체에 의해 A를 명명하였다[ Frey J., Kuhnert P., RTX toxins in Pasteurellaceae, Int. J. Med. Microbiol. (2002) 292:149-158]. gtxA 다음에는 매우 짧은 5개의 뉴클레오티드(nt) 유전자 사이 영역 및 163개의 아미노산의 예측된 단백질을 암호화하는 492개 nt ORF (도 3a)가 있다. 이 단백질은 RTX-독소의 활성화를 필요로 하는 아실트랜스퍼라아제 단백질과 상동성을 가지며, E. coli로부터 아실트랜스퍼라아제 HlyC와 38% 동일성 및 60% 유사성을 나타내었고, 유전자를 gtxC로 명명하였다. ρ-독립 전사 종결자를 gtxC의 하류에서 발견하였고, 대게는 gtxA와 gtxC를 둘 다 포함하는 전사 단위의 마지막을 표시한다. gtxA-C 오페론 옆에 있는 유전자를 이노시톨-1-모노포스파타아제 및 만노에이트 디히드라타아제 유전자(gtxC의 하류의 uxuA) (도 3a)를 암호화하기 위해 예측하였는데(gtxA 상류의 suhB), 둘 다 GtxAC 작용에 수반될 가능성은 없다.
흥미롭게도, GtxA (2026 aa)는 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae)과의 다른 구성원 및 E. coli의 HlyA로부터 설명되는 "전형적인" RTX-독소(대략 1000 aa [ Frey J., Kuhnert P., RTX toxins in Pasteurellaceae, Int. J. Med. Microbiol. (2002) 292:149-158])의 2배만큼 크다. GtxA의 C-말단에서 1000개 아미노산은 영역이 대략 20% 서열 동일성 및 35% 서열 유사성을 공유하는 이 RTX-독소와 상동성이다. 이 C-말단 영역은 또한 RTX-독소의 몇몇 보존적 특징을 함유한다. E. coli로부터의 HlyA는 Lys564 및 Lys690에서 아실화되고[Stanley P., Packman L.C., Koronakis V., Hughes C., Fatty Acylation of 2 Internal Lysine Residues Required for the Toxic Activity of Escherichia coli Hemolysin, Science (1994) 266:1992-1996]; 이 리신과 선행하는 글리신 잔기는 둘 다 GtxA에서 보존적이고(Lys1484 및 Lys1607 (도 3b)), 따라서 이것들은 GtxC에 의해 매개되는 GtxA의 아실화 자리일 수 있다. 예측된 아실화 자리의 하류(aa 1640-1830), GtxA는 글리신 및 아스파르테이트-풍부 영역을 가지는데, 이것은 또한 RTX-독소의 보존적 특징이다.
대조적으로, N-말단의 영역(aa 1 내지 대략 950)은 이용가능한 서열과 제한된 유사성을 가지고, GenBank 데이터베이스에 대해 BLASTP 검색에 의해 유의하지 않은 상동성을 발견하였다. 그러나 aa 520 내지 879의 영역은 예측한 막 단백질로부터 알려지지 않은 기능의 보존적 도메인(COG1511)과 유사성(E-값 0.007)을 가진다. RTX-도메인과 비교하여, N-말단의 도메인은 덜 산성이며, 더 큰 비율의 소수성 아미노산, 특히 세린을 함유한다. 2차 구조는 주로 알파-나선을 구성하는 것으로 예측하였다. N-말단 도메인의 기능의 개념을 얻기 위해서, 본 발명자들은 서열 유사성 및 상동성 예측을 위한 더 민감한 검색 툴의 사용에 의해 그것의 아미노산 서열의 생물정보학 분석을 수행하였다. 아메바 딕티오스텔리움 디스코이데움(amoeba Dictyostelium discoideum)로부터의 진핵 세포골격 단백질 Talin-A 및 Talin-B(각각 E-값 3.4 × 10-7 및 0.0061), 및 닭으로부터의 Talin(Gallus gallus) (E-값 0.0087)과 서열 유사성이 발견된 FASTA 및 SSearch을 사용하여 상동성을 검색한다. 더 나아가, 상동성 검출 서버 HHpred는 탈린과 상동성을 예측하였다(가능성 = 100%). 탈린은 액틴, 비쿨린 및 인테그린의 세포질 부분을 포함하는 다른 단백질의 범위에 결합한다. 거대 단백질은 종종 57개 아미노산의 15 반복을 발견한 반복 탐지 레이터[16]로 N-말단 도메인의 중첩 및 검사에 의해 생기는 반복체를 구성한다(도 3c).
따라서 GtxA는 2개의 도메인을 구성한다: N-말단의 반복 도메인 및 C-말단의 RTX/세포용해소 도메인.
GtxA 는 GtxC 에 의존적인 세포용해 활성을 가진다
GtxA가 세포용해 단백질인지 여부를 시험하기 위해서, gtxA를 예측한 아실트랜스퍼라아제 유전자, 즉 gtxC와 함께 클로닝하였고, 비-용혈성 발현 균주 E. coli ER2566에 도입하였다. gtxA 및 gtxC의 발현 시, 이 균주는 GtxAC가 용혈성 활성을 보유한다는 것을 나타내는 혈액 한천 플레이트 상에서 그리고 액체 용혈성 분석에서(도 4) 용혈성 표현형을 나타내었다. RTX-독소는 보통 특이적 T1SS에 의해 전해지는 세포 밖 단백질이다. E. coli hlyBD에 의해 암호화되는 T1SS를 발현시키는 플라스미드(pLG575)의 도입은 용혈현상 구역을 증가시켰고(도 4a), 면역블롯팅은 더 큰 분획의 GtxA가 세포 밖 단백질 분획에서 존재한다는 것을 나타내었고, E. coli 분비 시스템이 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) GtxA을 분비할 수 있다는 것을 증명하였다. HD11 세포에 대해 GtxA의 세포독성 활성을 LDH 방출 분석에 의해 분석하였고, 발현 gtxAC를 발현시키는 E. coli ER2566는 HD11 세포에 독성이 있었다. 삽입물이 없는 벡터를 함유하는 E. coli (음성 대조군)는 한 시간 인큐베이션 후 독성을 나타내지 않았다(도 4b).
번역 후 아실화의 요구는 RTX-독소의 특질 중 하나이다. 이것이 또한 비전형적 GtxA에 대한 경우인지 여부를 평가하기 위해서, 본 발명자들은 그것의 예측된 아실트랜스퍼라아제 GtxC 없이 발현된 GtxA의 활성을 시험하였다. 도 4는 GtxA가GtxC 부재하에서 발현될 때, 적혈구 또는 백혈구에 대해 세포용해 활성을 가지지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 비-아실화 프로톡신은 불활성이고, 번역후 아실화는 그것의 용혈성과 백혈구독성 활성에 대해 필수적이다. GtxA의 분비는 아실화의 결여에 의해 방해받지 않는데, 비-아실화 GtxA가 아실화된 독소와 유사한 양으로 배양물 상청액 중에서 검출되기 때문이다(도 5).
GtxA 는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 세포독성 활성을 초래한다
갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 용혈성 및 백혈구독성 활성이 GtxA로부터 기원하는지 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 gtxA 녹아웃 돌연변이체를 구성하였다. 갈리박테리움의 유전적 조작을 위한 분자 툴을 앞서 설명하지 않았지만, 본 발명자들은 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12가 천연 형질전환에 의한 안정한 gtxA 돌연변이체의 구성에서 천연적으로 만족할 만한 본 발명자들이 개발한 특성이라는 것을 발견하였다. 결과 돌연변이체에서, gtxA의 위치 1648과 3995 사이의 2347 뉴클레오티드를 결실시키고, 카나마이신 내성 카세트에 의해 대신하였다.
야생형과 반대로, ΔgtxA 돌연변이체는 혈액 한천 플레이트 상에서(도 2a) 또는 액체 용혈현상 분석에서 용혈성이 아니었다(데이터 미제시). 더 나아가서, ΔgtxA는 HD11 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았다(도 2b 및 2c). 동일한 결과를 2개의 독립적으로 구성된 gtxA 돌연변이체로부터 얻었다. 따라서, gtxA는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 대해 용혈성 및 백혈구독성 활성을 초래한다.
GtxA 및 그것의 활성의 성장 단계 의존적 수준
갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 상청액의 용혈성 활성은 성장 단계 의존적이었다: 늦은 대수기 단계에서 활성은 최고치이었고, 정지 단계로 전이에서 떨어졌고, 밤새 배양물로부터의 상청액에서 낮았다(도 1a). 이것은 본 발명자들이 GtxA의 발현이 유사하게 성장 단계 의존적이라는 가설을 만들도록 유발하였다. 이것을 시험하고 GtxA의 편재화를 확립하기 위해, 본 발명자들은 ApxI-항혈청에 의한 면역 블롯팅을 사용하여 성장을 통해 다른 시간에 배양물 상청액(세포 밖 단백질) 중에서 GtxA 및 전 세포 용해물의 양을 결정하였다(도 1b). ApxI-항혈청은 전장 GtxA의 예측된 분자량(215 kDa)의 크기에 대응하는 밴드를 포함하는 세포 밖 단백질 분획에서 몇몇 단백질을 인식하였다. 이 밴드는 ΔgtxA가 없고, 밴드가 GtxA라는 것을 지지한다. 용혈성 활성과 마찬가지로, 상청액 중의 GtxA의 존재 및 양은 성장 단계-의존적이었다(도 1b): GtxA의 양은 정지 단계로 전이에서 최고이었고, 단백질은 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(A. pleuropneumoniae) ApxI 및 ApxII[Jarma E., Regassa L.B., Growth phase mediated regulation of the Actinobacillus pleuropneumoniae ApxI and ApxII toxins, Microb. Pathog. (2004) 36:197-203] 및 M. haemolytica LktA [Strathdee C.A., Lo R.Y., Regulation of expression of the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant, J. Bacteriol. (1989) 171:5955-5962]에 대해 보고된 패턴과 유사한 하루 된(24시간) 배양물 중에서 검출되지 않았다. 제2 밴드(>215 kDa)는 또한 야생형에 존재하지만 ΔgtxA에 없었으며, GtxA가 가능하게는 번역 후 변형에 기인하는 2개의 다른 형태 중에 존재할 수 있다는 것을 제안한다. 2개의 추가 밴드(각각 65 kDa 및 >215 kDa)를 야생형과 돌연변이체 둘 다에서 검출하였고, GtxA와 관련되지 않을 가능성이 있다. GtxA 크기의 단백질은 예측된 세포 밖 편재화와 연속하여 그리고 합성 후 또는 합성과 관련되어 즉시 분비된 GtxA의 지지체에서 임의의 시점에 전 세포 용혈물에서 검출되지 않았다. gtxA의 전사를 시험하기 위해서, 노던 블롯팅을 성장 단계를 통해 수확한 세포로부터의 RNA로 수행하였다. 블롯은 대수기 성장 동안 그리고 정지 단계의 시작에서 전사된 gtxA를 나타내었지만, 정지 단계로 2시간 동안 그리고 밤새 배양물에서 전사는 검출되지 않았고, gtxA의 전사가 정지 단계 동안 셧 다운을 나타낸다. 결론적으로, GtxA는 시험관내 성장 동안 발현되고, 성장 단계 의존도는 전사 조절, 및 분비된 GtxA의 축적과 그것의 이후의 분해 사이의 균형에 의해 영향받는다.
GtxA 의 N-말단 도메인은 전체 세포독성 활성을 필요로 한다.
생물정보학적 분석은 GtxA가 2개의 부분, 즉 RTX-도메인 및 N-말단의 도메인으로 구성되는 다른 기공-형성 RTX-독소와 비교하여 비전형적 조직체를 가진다는 것을 나타내었다(도 3b). GtxA의 세포용혈 활성에 대한 N-말단 도메인의 기여를 시험하기 위해, N-말단 도메인(아미노산 1-949)과 RTX-도메인(아미노산 931-2026) 둘 다를 E. coli 내에서 별개로 발현시켰고, 그것의 용혈성 및 백혈구독성 활성을 시험하였고, 전장 단백질의 용혈성 및 백혈구독성과 비교하였다(도 4). GtxC와 함께 RTX-도메인을 발현시키는 E. coli는 혈액-한천 플레이트 및 액체 용혈현상 분석에서 용혈성 활성을 나타내었고, 따라서 RTX-도메인은 단독으로 기능적 용혈성 단백질이고, N-말단의 도메인은 적혈구의 용혈에 필수적이지 않다. 그러나, RTX-도메인은 N-말단 도메인이 전체 용혈성 활성에 대해 필요로 하는 것을 나타내는 전체 독소보다 현저하게 더 낮은 용혈성 활성을 나타냈다. RTX-도메인과 HD11 세포 사이의 상호작용으로부터 세포독성 활성이 검출되지 않았고, N-말단의 도메인이 백혈구독성에 필수적인 역할을 한다는 것을 제안하였다. 면역블롯팅(도 5)은 RTX-도메인이 발현되고, 수송하는 것을 나타내었고(도 5); 따라서 활성의 차이는 발현 수준의 주된 차이에 기인하지 않는다.
단지 N-말단의 도메인을 발현시키는 E. coli는 용혈성 또는 세포독성 활성을 가지지 않는다(도 4). 그러나 SDS-PAGE는 이 재조합 단백질이 전체 세포 분획 중에 그리고 세포 밖 단백질 분획 중에 단지 미량으로 우선 존재한다는 것을 나타내었다(데이터 미제시). 따라서 본 발명자들은 N-말단을 발현시키는 세포의 용혈물의 활성을 시험하였고(FastPrep 비드 비팅(bead beating) 또는 리소자임/음파 처리), 이것들은 연장된 인큐베이션에도 불구하고 액체 용혈현상 분석에서 또는 조류 대식세포에 대해 어떤 활성도 나타내지 않았다. 이 결과는 N-말단의 도메인이 단독으로 세포용혈 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 갈리박테리움 중의 gtxA 의 검출
물질 및 방법
염색체 DNA를 DNeasy Kit (Invitrogen)에 의해 갈리박테리움(Gallibacterium) 균주로부터 정제하였다. 표준 PCR을 주형으로서 염색체 DNA (50 ng/50 μl 반응) 및 gtxA의 뉴클레오티드 3332 내지 4589를 증폭시키는 프라이머 rtxA3368F 5'-CAAACCTAATTCAATCGGATG-3' (SEQ ID NO: 24) 및 rtxA4625R 5'-TGCTTCAATAATTTTCCATTTTC-3'(SEQ ID NO: 25)로 행하였다. PCR 조건은 94℃에서 4분, 94℃에서 30초의 35주기, 51℃에서 30초 및 72℃에서 105초이었다. 생성물을 겔 전기영동 및 브롬화 에티듐에 의해 시각화하였다. PCR 생성물을 BigDye 주기 시퀀싱에 의해 서열화하였다(Macrogen, Korea). 뉴클레오티드 서열을 CLC 작업대로 번역하고 배열하였다.
결과
다른 갈리박테리움 균주로부터 GtxA 독소의 배열은 도 6에서 나타낸다.
실시예 3: 서열
이하에서 열거하는 서열들은 본 출원에서 언급하는 아미노산 및 핵산 서열에 관한 것이다.
SEQ ID No . 1
갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)로부터의 전장 GtxA, 균주 12656-12 (아미노산 1-2026)
>GtxA aa1-2026
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQ ID No . 2
갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis )로부터 GtxA 의 C-말단 부분, 균주 12656-12 (아미노산 950-2026)
>GtxA aa950-2026
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQ ID No . 3
갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis )으로부터의 GtxA 의 N-말단 부분, 균주 12656-12 (아미노산 1-949)
>GtxA aa1-949
Figure pct00007
SEQ ID No . 4
갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis )로부터 전장 gtxA , 균주 12656-12 (뉴클레오티드 1-6078)
>gtxA nt1-6078
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQ ID No . 5
갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis )로부터 절단된 gtxA , 균주 12656-12 (뉴클레오티드 2848-6078)
>gtxA nt2848-6078
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQ ID No . 6
갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis )로부터 절단된 gtxA , 균주 12656-12 (뉴클레오티드 1-2847)
>gtxA nt1-2847
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 4: gtxA 서열 및 기능은 용혈성 갈리박테리움 ( Gallibacterium ) 중에서 보존된다
갈리박테리움 균주 사이의 gtxA 뉴클레오티드 1-950의 서열 보존
다른 갈리박테리움 균주의 초안 게놈에 대해 균주 12656-12로부터의 gtxA nt 1-950를 가지는 BlastN.
Figure pct00015
GtxA 는 용혈성 갈리박테리움(Gallibacterium)에 의해 발현되고 분비된다.
물질 및 방법
단백질의 분리를 위해 세포를 배양할 때, 밤새 배양물(16시간)을 대략 1:100으로 희석하였고, OD600를 0.03으로 조절하였고, 박테리아를 100 mL 삼각 플라스크 내에서 30 mL BHI-브로스 중의 적당한 에어레이션(120 rpm) 하에서 인큐베이션하였다. 세포 및 상청액을 OD600=0.6(±0.1)에서 늦은 대수기에 수확하였다.
세포 밖 단백질을 여과-멸균 배양물 상청액으로부터 제조하였다(저 단백질 결합 필터(0.22 μm) (Millex? GP (Millipore)). 단백질을 1부피의 빙냉 96% 에탄올의 첨가에 의해 밤새 침전시켰고(-20℃), 원심분리에 의해 수집하였고(30분 동안 0℃에서 13000 g), 10 mM Tris 중에서 재현탁하였다(원래 부피의 1/100). 단백질 (13 μl)을 Tris-아세테이트 SDS 실행 버퍼 (Invitrogen) 중에서 NuPAGE Novex 3-8 % Tris-아세테이트 미니겔 중의 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막 (Invitrogen)으로 블롯팅하였다. ApxI 항혈청[24]을 1차 항체로서 사용하였고, 결합된 ApxI-항체를 WesternBreeze 화학발광 키트(항-토끼) (Invitrogen)로 검출하였다. 화학발광 신호를 Geliance 600 이미징 시스템(Perkin Elmer Elmer)으로 포획하였다.
GtxA 는 갈리박테리움 아나티스( G. anatis) 에서 주된 세포용혈 독소이다
gtxA의 8개의 유전적으로 다양한 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 생태형 헤몰리티카 균주(10672-6, 10T4, 21K2, 24T10, 4895, 07990, 및 Avicor)를 앞서 설명한 바와 같은 돌연변이에 의해 불활성화하였다(Kristensen et al., 2010). 모든 돌연변이체는 비용혈성을 드러내었고, GtxA가 이 균주들 중의 용혈성 활성을 초래한다는 것을 증명한다. 이 결과는 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에서 우세한 세포용혈 독소로서 GtxA의 역할을 지지한다.
gtxA 는 갈리박테리움 게놈종 1 및 갈리박테리움 게놈종 2의 용혈성 활성을 초래한다.
갈리박테리움 게놈종 1 및 갈리박테리움 게놈종 2 내 gtxA의 존재는 gtxA가 또한 갈리박테리움 게놈종 1 및 2의 용혈성 활성을 초래하였다는 것을 제안하였다. 본 발명자들은 갈리박테리움 게놈종 1형 및 2형 균주의 gtxA 돌연변이체를 구성하였고(CCM5974 및 CCM5976), 그것들은 비용혈성이었고(데이터 미제시), GtxA는 또한 이 종들에서 용혈성 활성을 초래한다는 것을 증명하였다.
실시예 5: GtxA 수송에 필요한 I형 분비 위치( gtxEBD )의 확인 및 특성화
GtxA는 세포 밖 단백질이지만, 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 중의 대부분의 RTX-독소와 달리 그것의 1형 동족 분비 시스템(T1SS)의 성분과 공동전사되지 않는다(도 9). T1SS는 3개 단백질의 멀티머, 내부막 ATPase, 내부막 채널 단백질 및 외부 막 단백질로 구성되며, E. coli에서 T1SS 단백질은 원형 RTX-독소 α-헤몰리신을 분비하는 T1SS 단백질은 각각 HlyB, HlyD 및 TolC를 지정하였다(Holland et al., Mol Membr Biol 2005, 22: 29-39). GtxA-수송을 초래하는 T1SS를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 E. coli HlyB 및 HlyD의 아미노산 서열을 쿼리(query)로서 균주 12656-12의 게놈 서열을 검색하였다. 이 접근에 의해, 본 발명자들은 명백한 기질없이 예측한 T1SS-오페론을 확인하였고, GtxA 분비를 위한 가능한 후보자로 고려하였다. 이 오페론은 3가지의 유전자를 함유하며, 본 발명자들은 gtxE , gtxB , 및 gtxD로 명명하였다(도 9). 암호화된 단백질 GtxE, GtxB 및 GtxC는 각각 외부 막 단백질, 내부 막 ATPase, 및 내부 막 단백질이 되는 것으로 예상하였고, 이것은 1형 분비 시스템을 구성하는데 필요로 되는 3가지 성분들에 대응한다.
오페론이 GtxA 수송에 필요한지 여부를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 대부분의 gtxB(뉴클레오티드 위치 92로부터) 및 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12 중의 gtxD (처음 123 nt)의 시작을 결실시킴으로써 돌연변이체(ΔgtxBD)를 구성하였다.
Δ gtxBD 의 구성
ΔgtxBD의 구성을 위해, 2개의 PCR-단편, 즉 프라이머 2870F-XbaI (5'-CTGATCTAGACGCCGTAAATCGCATAATCA-3') (SEQ ID NO: 26) 및 3821R-EcoRI (5'-CGAATTCCCGGCAGAAAAGGTCAACA-3') (SEQ ID NO: 27)인 하나(951 bp) 및 6044-SOE (TTTCTGCCGGGAATTCGGCGAATGGTGTGAGAAG-5') (SEQ ID NO: 28) 및 7267R-SalI (TCAAGTCGACAAGCCAAAGCCAATACGA-3') (SEQ ID NO: 29)인 다른 하나(1233 nt)을 산출하였다. 프라이머 서열 내 제한 자리를 밑줄로 표시한다. 2개의 PCR-단편을 프라이머 2870f-XbaI 및 7267R-SalI으로 중첩 연장(overlap extension) PCR에 의한 스플라이싱에 의해 연결하였다. 결과된 2184 nt-단편을 SalI 및 XbaI으로 분해하였고, 앤타크틱 포스파타아제(Fermentas)에 의해 포스파타아제-처리하고, 겔-정제하고, XbaI/SalI로 결찰하고, 이중 분해하고 pBluescript로 겔 정제하였다. EcoRI-분해된 pUC4-KISS로부터의 카나마이신-카세트(Tn903)를 겔-정제하였고, SOEing-단편의 EcoRI 자리로 결찰하였다. 카나마이신 내성 유전자를 gtxB와 동일한 전사 방향으로 삽입하였다. 플라스미드 DNA를 SalI 및 XbaI으로 분해에 의해 선형화하였고 컬럼 정제하였다(GFX, Amersham). 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12의 천연 능력을 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)에 대해 앞서 설명한 바와 같은 MIV-방법에 의해 유발하였다(Poje & Redfield, 2003); 간략하게, 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12는 0.2의 OD600로 BHI 중에서 성장시켰고, MIV 중에서 1회 세척하였고, 100분 동안 MIV에서 인큐베이션하였다. 선형 DNA를 0.5 μg DNA/ml의 농도로 세포에 첨가하였다. 37℃에서 20분의 인큐베이션 후, 2부피의 BHI를 첨가하였고, 박테리아를 1시간 동안 인큐베이션한 후(37℃) 형질전환주를 4 μg/ml 카나마이신 혈액 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 형질전환주를 4 μg/mL 카나마이신이 있는 플레이트 상에서 재도말하였고, 프라이머 쌍 TISS2607F (5'-TTTCCTGTAATGCCTGCT-3') (SEQ ID NO: 30) 및 TISS7572R (5'-TTTTGATCGTTCGGGCTT-3') (SEQ ID NO: 31)에 의한 PCR에 의해 결실을 확인하였고, PCR-생성물을 시퀀싱하였다.
실시예 6: GtxA 는 전세포 항원을 기반으로 한 백신의 부분이 될 가능성이 없다
GtxA는 세포 용혈물 중에서 검출가능한 수준으로 존재하지 않으며, I형 분비 gtxEBD의 부재하에서 세포내에 축적되지 않는다.
본 발명자들은 GtxA의 분비에 필요한 I형 분비 시스템 위치(gtxEBD)를 확인하였다.
분비 돌연변이체 ΔgtxBD (실시예 5에서 설명한 바와 같이 구성됨)에서, ΔgtxBD의 용혈성 활성은 야생형과 비교하여 크게 감소되었다(도 8a 참조). 웨스턴 블롯은 gtxBD의 결실이 상청액 중에서 GtxA의 결여를 초래한다는 것을 나타내었다(도 8b). 이 관찰은 gtxEBD가 GtxA 수송을 초래한다는 것을 지지한다. GtxA는 야생형 또는 ΔgtxBD의 전세포 단백질 중에서 검출되지 않았고, 즉 GtxA는 분비 시스템의 부재하에서 세포 내부에 축적되지 않는다. 유사한 관찰이 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans) (백혈구독소 LtxA) 및 E. coli (α-헤몰리신 HlyA)의 RTX-독소 분비-결핍 돌연병이체에 의해 만들어졌다. 이 종에서, 독소의 세포내 축적의 결여는 변경된 전사에 기인하지 않지만, 짐작컨대 세포질 중의 빠른 독소 분해에 기인한다.
실시예 7: GtxA 를 발현시킬 수 없는 갈리박테리움 아나티스( Gallibacterium anatis ) gtxA 돌연변이체에 의한 감염 시험
도입
세포용해 RTX 독소 GtxA는 가금류에서 감염 동안 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 대한 중요한 병원력으로서 제안되었다. 이것을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 야생형(wt) 균주 및 그것의 동질유전자 ΔgtxA 돌연변이체에 의한 감염 동안 관찰한 병변에 대한 GtxA의 기여를 특성화하는 목적으로 난생 닭에서 감염 시험을 수행하였다.
물질 및 방법
총 24마리의 새를 연구에 포함시켰다. 모든 새들을 난소의 근(root)에서 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)의 동일한 양의 깊은 증착을 시도하는 복강내 경로를 통해 감염시켰다. 16마리의 새를 갈리박테리움 아나티스(G. anatis) 12656-12 wt로 감염시킨 한편, 16마리의 새들을 그것의 동질유전자로 감염시켰지만, RTX GtxA를 발현시킬 수 없는 비-용혈성ΔgtxA 돌연변이체로는 감염시키지 않았다(Kristensen et al ., 2010).
결과
감염 시도로부터 얻은 결과의 개요
Figure pct00016
wt로 감염시킨 새들은 일반적으로 실제로 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)에 의한 천연 감염으로부터 관찰한 병변에 대응하는 기도 및 배막에 관련하는 파종성 및 화농성 염증이 발생하였다.
ΔgtxA 돌연변이체로 감염시킨 새들은 일반적으로 난소에 편재화된 더 경증의 염증을 발생시켰다. 소수의 동물들에서(2/8), 편재화된 염증은 48h PI에서 더 강하고 화농성이었던 반면, 8마리 중 2마리의 동물에서 화농성 난소염 및 복막염을 제6일 PI에 관찰하였다.
따라서 GtxA는 닭에서 갈리박테리움 아나티스(G. anatis)의 발병에 실질적으로 기여하는 것으로 결론내릴 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> K?enhavns Universitet <120> A cytolytic RTX-toxin from Gallibacterium anatis <130> P2246PC00 <150> US 61/250,163 <151> 2009-10-09 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2026 <212> PRT <213> Gallibacterium anatis, strain 12656-12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2026) <223> Full length GtxA polypeptide <400> 1 Met Leu Ser Leu Lys Glu Lys Val Thr Gly Ile Asp Phe Asp Ala Ile 1 5 10 15 Lys Asp Lys Val Val Ser Leu Lys Asn Thr Val Ser Asn Ile Asp Phe 20 25 30 Asn Leu Val Lys Glu Asp Ile Ser Ser Leu Lys Ser Asn Ala Leu Ser 35 40 45 Ile Ala Ala Ser Asp Phe Lys Asn Lys Pro Val Leu Phe Lys Asp Ser 50 55 60 Leu Asp Leu Leu Thr Asp Ala Thr Asn Thr Leu Arg Lys Ile Thr Asn 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Ile Ser Glu Ile Ser Asn Lys Ser Leu Asp Leu Leu 85 90 95 Asp Ser Leu Phe Glu Ala Ala Lys Asp Ile Val Asn Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Gly Gly Val Glu Ile Thr Lys Ser Ala Thr Glu Leu Ala Ala Lys 115 120 125 Ala Ala Leu Ile Val Asp Lys Ser Ile Ile Leu Ala Asn Lys 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cataaataaa ctttatggcg gacagggagc agatatttat 5460 ctcttatcca ccaacgccac aaattatatc ttcgatctga caaaaaataa tttagcaaaa 5520 ttagagaatt cagaagatct taaccttcaa ttcactaaag atagcgatga caatgttacc 5580 ttatctttca ataaagatgg caatactatc ggtaaaacca ttatagaaaa atcgagccaa 5640 tttggcacat tctcaatagg tgatggatat tacttagatc ttaatgatgg caaatttaag 5700 tatattttat ccggagaaag ctccaatgcc gatttagctc aaaatacatt acattttaat 5760 aaaggtgaag aacttcaagt tcatgctgct gccaaggata accaaattat attagatcac 5820 gaacatcagc attacattaa tatttatagt aatacacaga ctaatattaa aggctttgaa 5880 gttggtaaag ataagctgca attatcactg ctcagtaata atttaagctc agacaccaaa 5940 ttaaaattca gcggttatga tattgaagga ggcgatgtta atattacttc cggcaatacc 6000 tatattacgt tgtccggtgc ggggcataca gattatgcga gcaaaacatt taatgaactg 6060 gtcactatgt atcttgtt 6078 <210> 5 <211> 3231 <212> DNA <213> Gallibacterium anatis, strain 12656-12 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3231) <223> Polynucleotide sequence coding for N-terminally truncated GtxA polypeptide (nucleotides 2848-6078) <400> 5 caaatcggca taaaagaaga gttaaccaaa ccaatccaag gtttatctaa ttctatttta 60 gatactgcca aaaccttaac ttatgttgta caaattgacc caacaacaga caaaggtaaa 120 ctttctatcg cagatagctc atttgaattg gcaaaatctg ctaaccaaat tgtctcatat 180 attatggatt tatccggcag ctcaagtgaa ctaagccata atattgcgaa tacggctcat 240 caaatcttgt ctatatccca agacagacta ttaagcattg gaaataatat ttctgcattg 300 gcaaatgccg ataaactcac aaaagaaggc gtgaaaatta ttgtagacag ttcatttgcc 360 atcaccagcg atgtaaatgg ctttatcact gatgtggtga aaacagtagg caaagacggc 420 aatcctaaag tggggtcagc cctatcatta tccaactcca ttattgatat gggacattct 480 atcgcaaacc taattcaatc ggatgttaat acaagtagcg ggaaagcggc tattgcagaa 540 ggatcaatta aattaattgg caatattaac ggattagtca gcgatgtgtt aagcctttct 600 aatgcctcta ccgccgtttc tgaagctata agttcttctg cgggaggtat tttaactaat 660 ttatcttctt tgataggttc atcaattaaa cttcataatt ggtctaatat gacccaagcc 720 gatcaaattg cagtggggtt tgatattgga ttgaaagcgg taagcactat tgcgacagga 780 gttggcacaa cagcacaatc cattgcaaaa ataattggta ctactacgat gttgccacaa 840 attggtgctg ctgtatcagg aatcgctctg gcagcaagtc cgttagagat aaaaggctta 900 gttgacgaac ataaatatgt aaaacaaatt gattctcttg catcagaaac aaaaacttat 960 ggttatcaag gtgatgaatt attagccagc cttttaaatg aaaaatttgc acttaatacc 1020 gcatatacag ctacagacat tgctttaaat ttagcaacta cagcgatctc tgtggcagca 1080 acagcaagtg tcattggtgc accgattgcg gcaattgcag gtgtagtgag aggagctatc 1140 ggcggtatta tgtcggcgat caaacaacca gcattggaac atattgctaa acgttatgtc 1200 gatcaaattg aaaagtatgg tgatattcaa aaatactttg atcaaaatac tgaggcaaca 1260 ttaaataaat tctatgcgag tcaggaagtc attcaatcat ttaagcaatt acagaaatta 1320 tataatgttg acaacattat cacccttgat ggcgttgcca gctcagacag tgcgatagaa 1380 ttagccgcta ttaccaaatt agttgagcaa atgaataaag caaataatta tgctcaactt 1440 attcgtaacg gtgaaatcga taaagctctc agcgctcaat atttgagtat ggatgctaaa 1500 acgggcgtgt tggaaattac cgcaccaggc aattcattaa taaaatttaa tagtcctctg 1560 tttgcgccgg gtgttgaaga agcgcgcaga aaagcggttg gcaaaaataa tttttatacc 1620 gatcttatta ttaatggtcc aaatgaacat actattaatg acggcgcagg taataatatt 1680 tttatttcta atgataaata tgcctctgtt ttatatgacg aaaatggaaa attattgaag 1740 catattaacc tcaatatcaa tgccggcgat ggaaatgata cttatattgc tgataacgga 1800 cattctctat ttaatggagg taatggaaca gatagtgtaa gttataataa tgaacatatt 1860 cacggcattg ttgttcatgg gcgagatgcc ggtacttatt ctgtaacaaa acatattgct 1920 gatgcagaag taactgttga aaatattaaa gtgaaaaatc atcaatacgg taaacgacaa 1980 gaacgagttg agtatagaga gttacatatt gaaacaaaat cttatgatgc aagcgatatg 2040 ctttacaacg tcgaagttat cagtgccagt gactatgatg atgttatgta tggtagtaaa 2100 ggtaatgatt acttcctcgc acaaaatggt aatgatcttg tttatggtaa agagggtgat 2160 gacattattt tcggtggtgc tggtgatgat aaactttatg gagaaaccgg taacgacacc 2220 ttaaatggcg gtttaggcaa agatttaatt tatggtggcg aaggaaatga taccattatt 2280 caagatgatg ctcttagttc cgacactatc ttcggcgatg aagggattga tacattagat 2340 cttcgtcatt tagtgattaa tgatgaagga ctcggtgttg ttgctgatct ccagtccgag 2400 aagctttata aaggaaccat ctttgatcat atctatgata tagagaatat tataggtaca 2460 tcaggaaatg ataaccttat tggaaatcat aaagataata tcttaatcgg taatgatggt 2520 gatgatattt tagaaggcta tagcggtaat gatgtacttg ccggaggaag tggcataaat 2580 aaactttatg gcggacaggg agcagatatt tatctcttat ccaccaacgc cacaaattat 2640 atcttcgatc tgacaaaaaa taatttagca aaattagaga attcagaaga tcttaacctt 2700 caattcacta aagatagcga tgacaatgtt accttatctt tcaataaaga tggcaatact 2760 atcggtaaaa ccattataga aaaatcgagc caatttggca cattctcaat aggtgatgga 2820 tattacttag atcttaatga tggcaaattt aagtatattt tatccggaga aagctccaat 2880 gccgatttag ctcaaaatac attacatttt aataaaggtg aagaacttca agttcatgct 2940 gctgccaagg ataaccaaat tatattagat cacgaacatc agcattacat taatatttat 3000 agtaatacac agactaatat taaaggcttt gaagttggta aagataagct gcaattatca 3060 ctgctcagta ataatttaag ctcagacacc aaattaaaat tcagcggtta tgatattgaa 3120 ggaggcgatg ttaatattac ttccggcaat acctatatta cgttgtccgg tgcggggcat 3180 acagattatg cgagcaaaac atttaatgaa ctggtcacta tgtatcttgt t 3231 <210> 6 <211> 2847 <212> DNA <213> Gallibacterium anatis, strain 12656-12 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2847) <223> Polynucleotide sequence coding for C-terminally truncated GtxA (nucleotides 1-2847) <400> 6 gtgctttcat taaaagaaaa agtaactgga atagattttg atgcaatcaa agataaagtc 60 gtttcattaa aaaacacggt ttcaaatatt gattttaatc tggttaaaga agatatttct 120 tctttaaaaa gcaatgcgtt atccatcgcg gcatcagatt ttaaaaataa accggtgtta 180 ttcaaagact ctttagactt acttactgat gctacaaata cactcagaaa gattaccaat 240 caaatgtcat caattagcga aatttctaat aagtcattag atttgctgga ttctcttttt 300 gaggctgcca aagatattgt aaacattgcc tattcaaaag gtggtgtcga aattactaag 360 tctgcgacag aattagcggc aaaagcggca ttaattgttg ataaaagtat catattagca 420 aataaagata atacaattag tgaagctgtt tatcattcta ttaacaactc attacaaaat 480 attcaaaaaa cagctatcaa tattgctaca cattcacata atgaagataa agctgaaatt 540 gctaaagcct cttttgagct gttatctcaa gttagtgatg ttatcagtaa tgcgttaaaa 600 aattcaggtg atataggtat cgaatcacaa ctcttagccg atattaatca gttttctcat 660 tctattttga acacagctaa aacagttact gatatagcta ctatggatat gaatgataaa 720 acctcaatcg ctaaaaatag catttcatta atagccaatg tgaatgatgt tatttccgat 780 attctagtaa tgacggataa agacaccgaa ttattaaatg caattcataa tgttactgcg 840 aaaaatctac agaatatcga agagagtgcg gtcaatcttg caaatgctga tgtgctgtct 900 caagaaggca aagtcagtat tgccattaat tctttaactt taatatcaca aaccaacaaa 960 attgttgcgc aagtgctaaa tgaagctaat ttaagcactg ataaaaccca atttgttggc 1020 gaattaaccg atgtattatt gaataccgca aaaagtatta cattgttagc taccggtaat 1080 aatgcgacaa cagcaggaaa ggaacagctg gcagttgcct caaccaatct tattggtaac 1140 gtgaatgatc tcattcaatc aattaccagc tttaaaggca aagaagatat tggtaacgct 1200 ttacacagtg cggtggacgg acaattatca caaatcaaac aacttgcggt cgcgttatca 1260 aacagtaatc ttgattcttc acaaggtaaa actgcaatag ccatcacctc tttcggcttg 1320 attgcacaag caaataatat tatcaataaa ttcttggata atatgagttt aagtactaat 1380 gtgagtaaat cggttcatag tttgactaat tcagcgctag atgcagccaa aattctcaca 1440 aacgtagtac aagtagatgc taataacaat caaggaaagg tcgtgattgc caatagttca 1500 ttagaacttt ctaaaacagc aagtgatatt gtgtctactg tgttaaaaag cacatctatt 1560 tcaacacaac atattgatat aattcataat gcagtaaata aaacattaac agaaatgaaa 1620 gatagtgcgg tagcaatagc acttgcttca tctgaaaata atagcgctga aattgcaacg 1680 cattcattaa gtctgttatc cgatgcaagt aatatgttga aagatattat gcaaggaatg 1740 agccctaata atgtcattgc tccgaaaaca ttagaattat ttaactcact atttgcgaca 1800 gctcaaaata tcgttcaatt agctgacgca aaatcttcag aaaacattgc taaagctagt 1860 gttgatttgg tacaaagcgc aacgattatc ctcaataacg tattaacgtt ggctaacgtt 1920 gattcttctt taagtaaagc ttttcatcaa tcatttgatg cttcagtttc tcaaattaaa 1980 gaggtagcag ctcaattagc taccgcgtct tctgcctcta ataaagctga gattgcaaaa 2040 ctctcttttg attttattag tcaagtaagt gatttagcga ccaacacctt aacaacagcg 2100 aaaaccggat tagatagcac gctgctgaat aacgttaacg gtctttctca ttccgtctta 2160 aatgcagcaa aatcagtaac cgatattatt gtgagtgata acccagcgaa taccgccagt 2220 ttatccgttt ctttggtgaa taatgccaat gaaattgttt caaatatctt aaccttatcc 2280 ggaaaacaaa atacgctctc cacggcagta cacgatgtaa ccgctaaaca tttagcgccg 2340 attgagaaaa tagcaattaa ccttgcgaat gccgataact caagcagtga tggaaaagtt 2400 gctattgcgt taaactcatt aacattgatt gcacaaagta accatttaat cgaagaagta 2460 ttaaaagagg ctaaattaga taatgcgaag agcgcctttg ctcacaattt aacggattta 2520 gtattagata ccgccaaaac aatcacggca ttagcatcag cggataccag taaagtagac 2580 ggcaagcagc agattgcctc tgcatcaaca catttagtcg gacaaattaa tgagattgtc 2640 aaatcaatca cgacaataac caattcagaa acgaaagtcg gcaatgccgc atatcaagcg 2700 ttaaaaacac atttagagca ggtagaaaca attgcggtta aacttgccgc cgccaatgca 2760 tcaacagcgg aaggcagaac agaaattgcg attgaatctt tcaatttaat cgcaaaaacc 2820 aatggcataa tgaccgattt cctaaat 2847 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer name: 4240 <400> 7 tatcgtcgac tatccatcgc ggcatcag 28 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Primer name: 4242 <400> 8 agctgaattc aagcaagtgc tattgctacc g 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer name: 4243 <400> 9 agctgaattc ttatgtcggc gatcaaacaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer name: 4245 <400> 10 tatgtctaga ggcgttggtg gataagagat 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer name: kanR <400> 11 cgatagattg tcgcacctga 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Primer name: kanF <400> 12 tatggaactg cctcggtga 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Primer name: 39F <400> 13 tgatgcaatc aaagataaag tcg 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Primer name: 5734R <400> 14 aatcggcatt ggagctttc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Primer name: 2871F <400> 15 aaccaaacca atccaaggt 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer name: 3270R <400> 16 attgccgtct ttgcctactg 20 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Primer name: GtxUP-NcoI <400> 17 agtcccatgg gtctttcatt aaaagaaaaa gtaactggaa ta 42 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Primer name: gtxC-r-XhoI <400> 18 cagtctcgag ttatgaattt tcttctataa aagcagc 37 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Primer name: gtxA Cf NcoI <400> 19 agtcccatgg caattgaatc tttcaattta atcgcaa 37 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Primer name: gtxA-Nr-XhoI <400> 20 cagtctcgag ttaatttagg aaatcggtca ttatgccat 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Primer name: gtxA-r-XhoI <400> 21 cagtctcgag ttaaacaaga tacatagtga ccagttcat 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Primer name: SOErev1 <400> 22 gttatccata ataattaatt taggaaatcg gtcattatg 39 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Primer name: SOEfor2 <400> 23 ttcctaaatt aattatggat aacttctcaa ctttagg 37 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Primer name: rtxA3368F <400> 24 caaacctaat tcaatcggat g 21 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Primer name: rtxA4625R <400> 25 tgcttcaata attttccatt ttc 23 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer name: 2870F-XbaI <400> 26 ctgatctaga cgccgtaaat cgcataatca 30 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> Primer name: 3821R-EcoRI <400> 27 cgaattcccg gcagaaaagg tcaaca 26 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Primer name: 6044-SOE <400> 28 tttctgccgg gaattcggcg aatggtgtga gaag 34 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer name: 7267R-SalI <400> 29 tcaagtcgac aagccaaagc caatacga 28 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Primer name: TISS2607F <400> 30 tttcctgtaa tgcctgct 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Primer name: TISS7572R <400> 31 ttttgatcgt tcgggctt 18

Claims (96)

  1. a) SEQ ID No. 1, 2 또는 3;
    b) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
    c) 임의의 a) 중 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단 서열 내 아미노산 중 30개 이하가 그렇게 변경된다)
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열의 대립유전자 변이체가 자연적으로 발생하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 과, 더 바람직하게는 갈리박테리움 속(genus Gallibacterium), 더 바람직하게는 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)의 군으로부터 선택되는 갈리박테리움 속으로부터 기원하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 제1항에서 설명된 변이체 폴리펩티드이며, 선택된 서열 중에서 특정된 임의의 아미노산이 변경되어 보존적 치환을 만드는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 신호 펩티드는 이종성 신호 펩티드에 의해 대신된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, SEQ ID No. 1과 적어도 70% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 1의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, SEQ ID No. 2와 적어도 70% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 2의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, SEQ ID No. 3과 적어도 70% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 3의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단편은 적어도 150개 아미노산, 바람직하게는 적어도 200개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 300개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 500개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 750개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 1000개 아미노산, 더 바람직하게는 1250개 아미노산, 더 바람직하게는 1500개 아미노산, 더 바람직하게는 1750개 아미노산, 가장 바람직하게는 2000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 그것의 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 구체적으로 변형되어 독성 활성을 제거하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 생물학적으로 활성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 생물학적 활성은 피이식자의 기공 형성을 포함하는 독성, 더 바람직하게는 세포독성, 더 바람직하게는 세포용혈 세포독성, 또한 더 바람직하게는 용혈성 세포독성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 면역원성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제9항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO 1과 비교하여 30개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 25개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 20개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 15개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 치환, 더 바람직하게는 아미노산 치환 없음을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 친화도 태그, 예컨대 폴리His 태그, GST 태그, HA 태그, FLAG 태그, C-myc 태그, HSV 태그, V5 태그, 말토오스 결합 단백질 태그, 셀룰로오스 결합 도메인 태그, BCCP 태그, 칼모듈린 태그, Nus 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 태그, 녹색형광 단백질 태그, 티오레독신 태그, S 태그, 연쇄상 구균(Strep) 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 임의의 친화도 태그는 절단가능한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 열 또는 방사선에 의해 불활성화된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  19. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 포름알데히드에 노출에 의해 화학적으로 불활성화된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  20. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID No. 1의 비-아실화된 형태인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  21. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 그것의 임의의 단편은 면역원성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 박테리아 감염에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 임의의 손상의 치료, 및/또는 예방적 치료를 위한 제22항의 사용.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 박테리아 감염은 정온 동물 중에 있는 것을 특징으로 하는 사용.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 정온 동물은 조류 종인 것을 특징으로 하는 사용.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 조류 종은 오리과(Anatidae), 더 바람직하게는 오리(Anas), 기러기(Anser), 흰죽지(Aythya), 사향오리(Biziura), 흑기러기(Branta) 또는 백조(Cygnus); 도요목(Charadriiformes), 더 바람직하게는 제비꼬리 갈매기(Creagrus), 큰부리제비갈매기(Gelochelidon), 괭이갈매기(Larus), 북극흰갈매기(Pagophila), 목테갈매기(Xema); 황새목(Ciconiiforme), 더 바람직하게는 황새과(Ciconiidae); 비둘기목(Columbiformes), 더 바람직하게는 비둘기(Columba), 땅비둘기(Columbina), 황제비둘기(Ducula), 붉은가슴비둘기(Gallicolumba), 다이아몬드 비둘기(Geopelia), 메추라기비둘기(Geotrygon), 왕관비둘기(Goura), 비티레부비둘기(Gymnophaps), 긴눈썹비둘기(Hemiphaga), 렙토틸라(Leptotila), 류코사르시아(Leucosarcia), 마크로피기아(Macropygia), 육지비둘기(Metriopelia), 오시팝스(Ocyphaps), 오에나(Oena), 파타기오에나스(Patagioenas), 팝피트레론(Phapitreron), 프틸리노푸스(Ptilinopus), 스카르다펠라(Scardafella), 멧비둘기(Streptopelia), 청비둘기(Treron), 슴새(Turtur) 또는 제나이다(Zenaida); 순계목(Galliformes), 더 바람직하게는 아에파이포디우스(Aepypodius), 알렉투라(Alectura), 꿩과(Phasianidae), 테트라오니나에(Tetraoninae); 사다새목(Pelecaniformes), 더 바람직하게는 사다새과(Pelecanidae); 홍학목(Phoenicopteriformes), 더 바람직하게는 홍학과(Phoenicopteridae); 앵무목(Psittaciformes), 더 바람직하게는 유황앵무과(Cacatuidae), 진홍앵무과(Loriidae) 또는 앵무과(Psittacidae); 화식조목(Casuariiformes), 더 바람직하게는 에뮤과(Dromaiidae); 레아목(Rheiformes), 더 바람직하게는 프테로세미아(Pterocnemia) 또는 레아(Rhea); 타조목 (Struthioniformes), 더 바람직하게는 타조과(Struthionidae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 조류 종은 오리, 칠면조 및 닭, 더 바람직하게는 난생 암닭의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  28. a) SEQ ID No. 4, 5 또는 6;
    b) SEQ ID No. 4, 5 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 60% 서열 동일성을 가진다);
    c) 임의의 a)의 적어도 450개 연속하는 뉴클레오티드로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 핵산은 다른 핵산으로 변경되는데, 단 서열 내 핵산 중 90개 이하가 그렇게 변경된다);
    d) SEQ ID No. 4, 5 또는 6와 상보적인 폴리뉴클레오티드에 매우 엄격하게 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오티드;
    e) SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    f) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 서열 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
    g) 임의의 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(선택된 서열 내에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단, 서열 내 아미노산 중 30개 이하는 그렇게 변경된다)
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 대립유전자 핵산 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 제28항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 갈리박테리움(Gallibacterium) 속, 더 바람직하게는 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)로부터 기원하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제28항에 있어서, 암호화된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No. 4와 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 4의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  32. 제28항에 있어서, 암호화된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No. 5와 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 5의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  33. 제28항에 있어서, 암호화된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No. 6과 적어도 60% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 6의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli) 중의 발현에 대해 최적화되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  36. 박테리아 감염에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 임의의 손상의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 제35항의 사용.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 박테리아 감염은 정온 동물 중에 있는 것을 특징으로 하는 사용.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 정온 동물은 조류 종인 것을 특징으로 하는 사용.
  39. 제35항 또는 제36항에 있어서, 조류 종은 오리과(Anatidae), 더 바람직하게는 오리(Anas), 기러기(Anser), 흰죽지(Aythya), 사향오리(Biziura), 흑기러기(Branta) 또는 백조(Cygnus); 도요목(Charadriiformes), 더 바람직하게는 제비꼬리 갈매기(Creagrus), 큰부리제비갈매기(Gelochelidon), 괭이갈매기(Larus), 북극흰갈매기(Pagophila), 목테갈매기(Xema); 황새목(Ciconiiforme), 더 바람직하게는 황새과(Ciconiidae); 비둘기목(Columbiformes), 더 바람직하게는 비둘기(Columba), 땅비둘기(Columbina), 황제비둘기(Ducula), 붉은가슴비둘기(Gallicolumba), 다이아몬드 비둘기(Geopelia), 메추라기비둘기(Geotrygon), 왕관비둘기(Goura), 비티레부비둘기(Gymnophaps), 긴눈썹비둘기(Hemiphaga), 렙토틸라(Leptotila), 류코사르시아(Leucosarcia), 마크로피기아(Macropygia), 육지비둘기(Metriopelia), 오시팝스(Ocyphaps), 오에나(Oena), 파타기오에나스(Patagioenas), 팝피트레론(Phapitreron), 프틸리노푸스(Ptilinopus), 스카르다펠라(Scardafella), 멧비둘기(Streptopelia), 청비둘기(Treron), 슴새(Turtur) 또는 제나이다(Zenaida); 순계목(Galliformes), 더 바람직하게는 아에파이포디우스(Aepypodius), 알렉투라(Alectura), 꿩과(Phasianidae), 테트라오니나에(Tetraoninae); 사다새목(Pelecaniformes), 더 바람직하게는 사다새과(Pelecanidae); 홍학목(Phoenicopteriformes), 더 바람직하게는 홍학과(Phoenicopteridae); 앵무목(Psittaciformes), 더 바람직하게는 유황앵무과(Cacatuidae), 진홍앵무과(Loriidae) 또는 앵무과(Psittacidae); 화식조목(Casuariiformes), 더 바람직하게는 에뮤과(Dromaiidae); 레아목(Rheiformes), 더 바람직하게는 프테로세미아(Pterocnemia) 또는 레아(Rhea); 타조목 (Struthioniformes), 더 바람직하게는 타조과(Struthionidae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  40. 제35항 또는 제36항에 있어서, 조류 종은 오리, 칠면조 및 닭, 더 바람직하게는 난생 암닭의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  41. 제28 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  42. 제41항에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  44. 제43항에 있어서, 상기 프로모터는 RNA 폴리머라아제에 대해 전사 시작 자리 및 결합 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  45. 제43항에 있어서, 상기 프로모터는 프리브노 박스(Pribnow box) 또는 그것의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  46. 제43항에 있어서, 상기 프로모터는 a-35 요소 또는 그것의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  47. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 상기 프로모터는 RNA 폴리머라아제에 대해 전사 시작 자리 및 결합 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  49. 제47항에 있어서, 상기 프로모터는 TATA 박스를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  50. 제47항에 있어서, 상기 프로모터는 임의의 진핵 전사 인자에 대해 적어도 하나의 결합 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  51. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  52. 제51항에 있어서, 상기 벡터는 진핵 플라스미드 벡터 또는 원핵 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  53. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스(lentivirus), HIV, SIV, FIV, EAIV 및 CIV를 포함하는 레트로비리다에(Retroviridae) 과로부터 유래되는 벡터들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  54. 제41항 또는 제42항에 있어서, 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 바큘로바이러스, HSV, 코로나바이러스, 소유두종 바이러스, Mo-MLV로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 아데노연관 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 벡터.
  56. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 감염에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 임의의 손상의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 것을 특징으로 하는 벡터.
  57. 제55항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 감염은 정온 동물 중에 있는 것을 특징으로 하는 사용.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 정온 동물은 조류 종인 것을 특징으로 하는 사용.
  59. 제55항 또는 제56항에 있어서, 조류 종은 오리과(Anatidae), 더 바람직하게는 오리(Anas), 기러기(Anser), 흰죽지(Aythya), 사향오리(Biziura), 흑기러기(Branta) 또는 백조(Cygnus); 도요목(Charadriiformes), 더 바람직하게는 제비꼬리 갈매기(Creagrus), 큰부리제비갈매기(Gelochelidon), 괭이갈매기(Larus), 북극흰갈매기(Pagophila), 목테갈매기(Xema); 황새목(Ciconiiforme), 더 바람직하게는 황새과(Ciconiidae); 비둘기목(Columbiformes), 더 바람직하게는 비둘기(Columba), 땅비둘기(Columbina), 황제비둘기(Ducula), 붉은가슴비둘기(Gallicolumba), 다이아몬드 비둘기(Geopelia), 메추라기비둘기(Geotrygon), 왕관비둘기(Goura), 비티레부비둘기(Gymnophaps), 긴눈썹비둘기(Hemiphaga), 렙토틸라(Leptotila), 류코사르시아(Leucosarcia), 마크로피기아(Macropygia), 육지비둘기(Metriopelia), 오시팝스(Ocyphaps), 오에나(Oena), 파타기오에나스(Patagioenas), 팝피트레론(Phapitreron), 프틸리노푸스(Ptilinopus), 스카르다펠라(Scardafella), 멧비둘기(Streptopelia), 청비둘기(Treron), 슴새(Turtur) 또는 제나이다(Zenaida); 순계목(Galliformes), 더 바람직하게는 아에파이포디우스(Aepypodius), 알렉투라(Alectura), 꿩과(Phasianidae), 테트라오니나에(Tetraoninae); 사다새목(Pelecaniformes), 더 바람직하게는 사다새과(Pelecanidae); 홍학목(Phoenicopteriformes), 더 바람직하게는 홍학과(Phoenicopteridae); 앵무목(Psittaciformes), 더 바람직하게는 유황앵무과(Cacatuidae), 진홍앵무과(Loriidae) 또는 앵무과(Psittacidae); 화식조목(Casuariiformes), 더 바람직하게는 에뮤과(Dromaiidae); 레아목(Rheiformes), 더 바람직하게는 프테로세미아(Pterocnemia) 또는 레아(Rhea); 타조목 (Struthioniformes), 더 바람직하게는 타조과(Struthionidae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  60. 제55항 또는 제56항에 있어서, 조류 종은 오리, 칠면조 및 닭, 더 바람직하게는 난생 암닭의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  61. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 또는 형질도입된 분리된 숙주 세포.
  62. 제61항에 있어서, 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp), 피키아 종(Pichia spp), 아스페르길루스(Aspergillus), Sf9 곤충 세포; 더 바람직하게는 CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b 또는 BHK 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  63. 제53항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서 감염성 비리온을 생성할 수 있는 포장 세포주.
  64. a) SEQ ID No. 1, 2 또는 3;
    b) SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 서열 변이체(변이체는 상기 SEQ ID No.와 적어도 70% 서열 동일성을 가진다); 및
    c) 임의의 a) 중 적어도 150개의 연속하는 아미노산으로 구성되는 단편(선택된 서열 중에서 특정된 임의의 아미노산은 다른 아미노산으로 변경되는데, 단 서열 내 아미노산 중 30개 이하가 그렇게 변경된다)
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항체는 조류 항체, 바람직하게는 닭 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  66. 제64항에 있어서, 상기 항체는 다클론성, 혈청-유래 항체 또는 단클론성 또는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  67. 제64항에 있어서, 항체는 Fv, scFv, Fab, Fab' 또는 F(ab)2, 다이머 IgA 분자 또는 5가의 IgM와 같은 멀티머 형태, 애피바디 또는 디아바디와 같은 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  68. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드의 불활성화 방법으로서, 상기 방법은 열 또는 화학물질, 바람직하게는 포름알데히드의 사용을 포함하며, 또는 상기 방법은 비-아실화된 형태로 상기 폴리펩티드의 발현을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 불활성화된 폴리펩티드는 면역원성인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
  71. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 네이키드 DNA 또는 벡터로서 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 한 가지 이상의 적당한 애주번트(들), 부형제(들), 에멀젼화제(들) 또는 담체(들)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  73. 제70항 또는 제71항에 있어서, 제26항의 조류 종에 바이러스 또는 미생물 병원성으로부터의 적어도 한 가지의 다른 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  74. 제73항에 있어서, 상기 바이러스 또는 미생물은 전염성 기관지 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 전염성 F낭 병 바이러스, 닭 빈혈증 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 뉴모바이러스, 닭 수두바이러스, 조류뇌척수염바이러스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 헤모필루스 파라갈리나룸, 파스투렐라 물토시다 및 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
  75. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID No. 1의 비-아실화 형태와 동일한 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  76. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 그것의 임의의 단편은 면역원성인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  77. 제70항 또는 제71항에 있어서, 생, 약독 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항의 백신을 제26항의 조류 종에 투여하는 방법으로서, 상기 백신은 근육 내 또는 피하내 주사, 경구, 예를 들어 음식 또는 물을 통해, 에어로졸, 난절, 예를 들어 발 또는 윙 웹(wing web)에서, 점안액, 예를 들어 난황 내 투여에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 조류 종은 적어도 1회, 예컨대 적어도 2회, 예를 들어 적어도 3회 백신 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 각각의 백신 투약량은 용량 당 단백질의 약 1 μg/kg 체중 내지 약 1000 μg/kg 체중, 바람직하게는 약 10 μg/ kg 체중 내지 약 100 μg/kg 체중을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제78항 또는 제79항에 있어서, 백신의 각 단위 투약량은 약 0.1 ml 내지 약 2 ml, 예컨대 약 0.25 ml 내지 약 1 ml, 예를 들어 대략 0.5ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 진단 마커로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  83. 병원성 박테리아 갈리박테리움(Gallibacterium) 감염의 진단 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 검출, 상기 폴리펩티드에 대한 항체의 검출, 또는 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드의 검출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 병원성 박테리아는 갈리박테리움(Gallibacterium) 속, 더 바람직하게 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis), 갈리박테리움 게놈종 1(Gallibacterium genomospecies 1) 및 갈리박테리움 게놈종 2(Gallibacterium genomospecies 2)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드에 대한 항체의 검출을 포함하며, 상기 항체는 IgA인 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 폴리펩티드와 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 단백질을 포함하며, 상기 결합 단백질은 고체 지지체에 연결되는 것을 특징으로 하는 키트.
  87. 제86항에 있어서, 상기 키트는 결합 단백질을 더 포함하며, 하나의 결합 단백질은 검출 모이어티에 연결되는 것을 특징으로 하는 키트.
  88. 제86항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로입자인 것을 특징으로 하는 키트.
  89. 제86항에 있어서, 상기 결합 단백질은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  90. 제86항에 있어서, 상기 키트는 상기 폴리펩티드의 양을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  91. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 대한 항체의 검출을 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 고체 지지체에 고정된 상기 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  92. 제91항에 있어서, 상기 항체들은 IgA형인 것을 특징으로 하는 키트.
  93. 내인성 유전자가 파괴되어 기능적 gtxA의 발현 및/또는 분비를 없앤 트랜스제닉 녹아웃 미생물에 있어서, 상기 미생물은 동일 종의 야생형 미생물에 비해 감소된 병원성을 나타내는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 녹아웃 미생물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 미생물은 갈리박테리움 아나티스(Gallibacterium anatis)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, gtxA 유전자는 파괴된 것을 특징으로 하는 미생물.
  96. 제93항 또는 제94항에 있어서, gtxBD 유전자는 파괴된 것을 특징으로 하는 미생물.
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