CN102781954A

CN102781954A - 来自鸡卡氏杆菌的细胞溶解性rtx-毒素

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Publication number: CN102781954A
Application number: CN2010800456438A
Authority: CN
Inventors: 安德斯·麦基·玻约森; 博迪尔·玛丽·克里斯滕森
Original assignee: Koebenhavns University
Current assignee: Koebenhavns University
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2012-11-14
Also published as: US20120258515A1; WO2011042026A1; KR20130027448A; MX2012003827A; CA2774734A1; BR112012009366A2; RU2012118977A; TW201113373A; JP2013507103A; EP2486046A1

Abstract

本发明涉及动物健康且特别是由卡氏杆菌属(Gallibacterium spp)，包括鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)、卡氏杆菌基因种1(Gallibacterium genomospecies 1)和卡氏杆菌基因种2(Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新细菌性家禽疾病的病原体领域。本发明提供来自卡氏杆菌物种的新型RTX毒素，将该新型毒素称为GtxA(卡氏杆菌毒素)。此外，本发明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活类毒素或类毒素片段的疫苗，以及免疫禽类来预防该疾病的方法及禽类的鸡卡氏杆菌感染的诊断方法。

Description

来自鸡卡氏杆菌的细胞溶解性RTX-毒素

本申请中或本申请所引用的所有专利及非专利文献，在此亦以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明属于动物健康领域且特别是由卡氏杆菌属(Gallibacterium spp)，包括鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)、卡氏杆菌基因种1(Gallibacteriumgenomospecies 1)和卡氏杆菌基因种2(Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新细菌性家禽疾病的病原体。本发明提供来自卡氏杆菌(Gallibacterium)物种的新型RTX毒素，将该新型毒素称为GtxA(卡氏杆菌毒素)。此外，本发明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活的类毒素或类毒素片段的疫苗，以及免疫禽类来预防该疾病的方法及诊断禽类的鸡卡氏杆菌感染的方法。

背景技术

在过去十年间，在所有主要的家禽生产国中提高生产率的密集型家禽饲养法造成了疾病表现的增加。这引起了对于控制这些疾病的新型及较佳疫苗及疫苗接种计划的需求增加。如今，已对多种动物进行了针对大量病毒及细菌源性疾病的免疫。家禽病毒性疾病的例子如鸡新城疫(Newcastle Disease)、传染性支气管炎(Infectious Bronchitis)、禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、禽痘(Fowlpox)、传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease)等。细菌性疾病的例子如由副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)(上呼吸道)、禽波氏杆菌(Bordetella avium)(上呼吸道)、鼻气管鸟杆菌(Omithobacteriumrhinotracheale)(下呼吸道)所引起的禽鼻炎(Avian Coryza)，沙门氏菌感染(Salmonella infections)(消化道)，鸡霍乱(fowl cholera)(败血症)的病原体多杀性巴斯德菌，(Pasteurella multocida)以及大肠杆菌(E.coli)感染。

产蛋家禽生殖器官及腹膜的炎症是商业产蛋家禽群体中经常发生的问题，引起产蛋量下降、死亡率增加以及随之而来的经济损失及动物福利下降。常常从这些病变中分离出禽病原性大肠杆菌，但若干研究已表明，鸡卡氏杆菌单独或作为共病原体是卵巢炎、输卵管炎及腹膜炎的常见原因。此外，已从禽败血症、肝炎、肠炎及上呼吸道病变病例中分离出鸡卡氏杆菌(G.anatis)。鸡卡氏杆菌是产蛋母鸡及其他禽类物种的上呼吸道与下生殖道正常菌群的常见部分(BojesenA.M.，Nielsen S.S.，Bisgaard M.，Prevalence and transmission of haemolytic Gallibacteriumspecies in chicken production systems with different biosecurity levels，Avian Pathol.(2003)32：503-510)，且因此可被视为机会性病原体。未深入研究其发病机制，尤其没有在分子水平上深入研究，而且对鸡卡氏杆菌引发疾病能力背后的基因及机制知之甚少。鸡卡氏杆菌(G.anatis)分为2个生物变种：β-溶血性生物变种溶血型鸡卡氏杆菌及非溶血性生物变种鸡卡氏杆菌。溶解红血球的能力是病原性鸡卡氏杆菌分离株的主要表型(Christensen H.，Bisgaard M.，Bojesen A.M.，Mutters R.，OlsenJ.E.，Genetic relationships among avian isolates classified as Pasteurella haemolytica，′Actinobacillus salpingitis′or Pasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen.nov.，comb，nov and description of additional genomospecles within Gallibacterium gen.nov，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.(2003)53：275-287)。卡氏杆菌是属于γ-变形菌(γ-proteobacterial)巴斯德菌科(Pasteurellaceae)的革兰氏阴性菌属(Christensen等人，同上)，且巴斯德菌科的各种病原性成员，如引发人类牙周病的伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)，牛运输热(bovine shipping fever)的病原体溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)以及猪病原体胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)产生属于RTX-毒素(RTX是毒素重复单元的缩写)群组的溶血素及白细胞毒素。

可以获得由失活或活减毒细菌组成的鸡卡氏杆菌疫苗。然而，这些疫苗不会对该物种分泌的溶血性蛋白质给予保护作用。

发明内容

本发明旨在研究鸡卡氏杆菌生物变种溶血型(G.anatis biovar haemolytica)与真核细胞的相互作用，以及识别与表征负责溶血性表型的基因和蛋白质。发明人发现鸡卡氏杆菌对禽类巨噬细胞具有高细胞毒性，这很可能是在发病机制中起关键作用的性状。此外，发明人识别及表征了一种负责鸡卡氏杆菌生物变种溶血型的白血球毒性及溶血活性的新型RTX-毒素。

本发明涉及来自卡氏杆菌(Gallibacterium)属，最优选为选自由鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anati)、卡氏杆菌基因种1(Gallibacterium genomospecies 1)及卡氏杆菌基因组2(Gallibacterium genomospecies 2)构成的组的细菌的GtxA多肽及多核苷酸。

在第一方面，本发明涉及分离的多肽，该多肽包含以下群组中的氨基酸序列：

a)SEQ ID No.1、2或3；

b)选自由SEQ ID No.1、2和3构成的组的氨基酸序列的序列变异体，其中该变异体与所述SEQ ID No.具有至少70％的序列同一性；以及

c)由a)中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，条件是该序列中不超过30个氨基酸被如此改变。

具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽是来自鸡卡氏杆菌的RTX毒素。将这由2026个氨基酸(aa)组成的蛋白质称为GtxA(卡氏杆菌毒素)。这是典型的成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端1000aa与巴斯德杆菌科(Pasteurelleceae)的其他成员的RTX-毒素同源，例如与胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)ApxIA具有38％的序列相似性。与此相反，N-末端约950aa在GenBank数据库中没有显著匹配物，但含有11个未知功能的57-aa重复单元。

GtxA毒素具有多种效用，包括但不限于作为类毒素疫苗的用途，以及用于揭示通常在禽类中且尤其在家禽中针对鸡卡氏杆菌的已存在的免疫反应的诊断用途。

在又一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸包含选自以下群组中的核酸序列：

a)SEQ ID No.4、5或6；

b)选自由SEQ ID No.4、5和6所构成的组的氨基酸序列的序列变异体，其中该变异体与所述SEQ ID No.具有至少60％的序列同一性；

c)由a)中的任一者的至少450个连续核苷酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一核酸改变为不同核酸，条件是该序列中不超过90个核酸被如此改变；

d)能够在高严格条件下与跟SEQ ID No.4、5或6互补的多核苷酸杂交的多核苷酸；

e)编码SEQ ID No.1、2或3的多肽的多核苷酸；

f)编码选自由SEQ ID No.1、2和3构成的组的氨基酸序列的序列变异体的多核苷酸，其中该变异体与所述SEQ ID No.具有至少70％的序列同一性；以及

g)编码由SEQ ID No.1、2或3中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段的多核苷酸，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，条件是该序列中不超过30个氨基酸被如此改变。

此外，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。

在其他方面，本发明涉及本发明的多肽、本发明的多核苷酸及本发明的载体的医学用途。

优选地，医学用途是用于治疗和/或预防性治疗由细菌感染引起的疾病、失调或任何损伤。

在一方面，本发明涉及本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于治疗和/或预防性治疗由细菌感染引起的疾病、失调或任何损伤的药物中的应用。

在其他方面，本发明涉及经本发明的载体转化或转导的分离的宿主细胞，并涉及能够生产本发明的感染性病毒粒子的包装细胞系。

此外，本发明涉及抗体，其能够特异性结合具有选自以下群组中的氨基酸序列的分离的多肽：

a)SEQ ID No.1、2或3；

这些针对GtxA的抗体可用于诊断及治疗方面。

在其他方面，本发明涉及失活本发明的分离的多肽的方法。

此外，本发明涉及疫苗组合物，其包含本发明的分离的多肽或以裸DNA或载体制备的分离的多核苷酸，可选地连同一种或多种合适的佐剂、赋形剂、乳化剂或介载体。

在另一方面，本发明涉及将本发明的疫苗施与本文所述的禽类物种的方法，其中所述疫苗是通过肌肉内或皮下注射，透过例如食物或水口服，气雾剂，在例如足或翼部划痕，滴眼剂或经胚给药(in-ovo administration)来施用。

在其他方面，本发明涉及本发明的多肽或多核苷酸在作为诊断标记的用途。

本发明也提供了诊断禽类物种中病原性细菌卡氏杆菌(Gallibacterium)感染的方法，所述方法包含检测本发明的多肽，检测针对该多肽的抗体，或检测本发明的多核苷酸。

优选地，病原性细菌来自卡氏杆菌属，更优选地选自由鸡卡氏杆菌、卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因组2构成的组。

本发明也提供了检测本发明的多肽存在的试剂盒，试剂盒包含至少一种能够结合该多肽的结合蛋白，所述结合蛋白与固体支持物连接。优选地，所述结合蛋白是抗体。

在一方面，本发明涉及检测针对本发明的多肽的抗体的试剂盒，其中所述试剂盒包含已固定到固体表面的所述多肽。

附图说明

图1：鸡卡氏杆菌培养物上清液的溶血活性以及GtxA的表达。

A.鸡卡氏杆菌12656-12的生长以及无细胞培养物上清液的溶血活性。将过夜培养物按1∶100稀释并，且记录其生长(在600nm吸光度测量细胞密度)及无细胞培养物上清液的溶血活性。显示了在BHI中按100倍稀释的上清液的溶血活性。平行收获细胞外蛋白质用于蛋白质印迹法(图5B)。实验重复三次，溶血活性的水平有所变化，但相对模式一致。

B.用Apxl-抗血清蛋白质印迹法测定GtxA的水平。在印迹法之前，于指定时间点收获上清液，并如材料与方法中所述浓缩100倍，且通过3％-8％凝胶进行SDS-PAGE分离。在OD₆₀₀＝2时收获来自ΔgtxA的细胞外蛋白质(标记ΔgtxA的泳道)。WC＝来自野生型的全细胞裂解物，接种后5小时收获细胞。尺寸标记物指示在左侧。重复实验，结果相同。

图2：鸡卡氏杆菌12656-12野生型(wt)与同基因的gtxA突变(ΔgtxA)的溶血活性及细胞毒性。

A.β-溶血。将细菌划线接种于含5％牛血的BHI-琼脂培养板上，并在37℃培养18小时。

B.与生理盐水(空白对照)、wt或ΔgtxA共培养1小时后的HD11细胞光学显微镜检测结果(100倍放大)。在指数生长晚期(OD₆₀₀＝1)收获细菌，并以10.C感染量(m.o.i)添加。以LDH活性量化细胞毒性。将HD11细胞用如1B所述的细菌培养。显示了三个重复孔的平均值，柱条表示标准误差(S.E)。

图3

A.鸡卡氏杆菌12656-12中的gtxA、gtxC及其侧翼基因的基因构造。箭头指示开放读码框。在gtxC下游指示出预测的转录终止子。

B.GtxA的构造。K指示保守的赖氨酸残基(Lys1484和Lys1607)。标记了富含甘氨酸、天冬氨酸的区域(位置1640-1830)。

C.GtxA N-末端域的15个重复单元的比对，以Radar法[Heger A.，Holm L，Rapid automatic detection and alignment of repeats in protein sequences，Proteins(2000)41：224-237]来生成比对结果。右边数字指示GtxA中的氨基酸位置。标记了重复单元中50％以上氨基酸相同(黑色)或相似(灰色)的位置。

图4：表达GtxA的大肠杆菌的细胞毒素活性。

A.在30℃培养的生长于含5％牛血和0.1mM IPTG的LB-琼脂中的大肠杆菌ER2566的β-溶血活性。T1SS：+或-指示了表达大肠杆菌的T1SS-组分HlyB和HlyD的质粒pLG575存在与否。RTX＝GtxA的第931-2026位氨基酸，N-端＝GtxA的第1-949位氨基酸。

B.使用表达不同形式的GtxA的大肠杆菌ER2566/pLG575的液体溶血检测和LDH细胞毒性检测。

图5：大肠杆菌中GtxA的表达。

对来自IPTG诱导后的大肠杆菌ER2566的全细胞裂解物(WC)和细胞外蛋白质(EC)进行蛋白质印迹分析。以4-12％凝胶中进行SDS-PAGE来分离蛋白，并在PVDF-膜上形成印迹。用ApxI-抗血清探测印迹。B＝空白，尺寸标记物指示在右侧(PageRuler Prestained Protein Ladder Plus(Fermentas))。各泳道中的上部条带具有预期大小的全长GtxA(215kDa)或RTX-域(117kDa)。尺寸较小的条带很可能是降解产物。

图6：来自不同卡氏杆菌菌株的氨基酸序列比对。将GtxA(SEQ ID No 1)的第1133-1515位氨基酸与源自其他卡氏杆菌菌株的其他毒素的氨基酸序列进行比对。点指示相同残基，而突出显示部分为非保守位置。

图7

在OD₆₀₀＝0.6时收获来自不同鸡卡氏杆菌菌株以及卡氏杆菌基因种1(G.genomospecies 1)(CCM5974)及卡氏杆菌基因种2(CCM5976)的模式菌株的培养物上清液，并过滤除菌。如方法中所述使细胞外蛋白质沉淀，并用3-8％Tris-乙酸盐SDS-凝胶进行分离，在PVDF膜上形成印迹，并用ApxIA-抗血清探测。箭头标出GtxA(215kDa)。较大条带为与GtxA无关的未识别蛋白质(参见图3)或GtxA的修饰形式。M＝分子尺寸标记物(Spectra Multicolor High RangeProtein Ladder(Fermentas))，尺寸指示在右侧(kDa)。

图8：T1SS-突变体中的GtxA的β-溶血活性及亚细胞定位。

A.鸡卡氏杆菌12656-12及同基因突变体的β-溶血。在37℃培养经12656-12(wt)、gtxA-和gtxBD突变体划线接种的血琼脂培养板24小时后的照片。已从划线的左侧部分移除细菌以显露菌落下的溶血。B.GtxA的亚细胞定位。在向生长稳定期转变时(OD₆₀₀＝1.7)收获细胞及上清液。如方法中所述使细胞外蛋白质沉淀。用3-8％Tris-乙酸盐SDS-凝胶分离全细胞裂解物(沉淀)和细胞外蛋白质(上清液)，并在PVDF膜上形成印迹，且用ApxIA-抗血清探测。箭头标出GtxA。通过质谱分析确认同一性。抗血清另外识别了野生型及突变型菌株中皆存在的约270kDa的未识别蛋白质。尺寸标记物指示在左边(Spectra MulticolorHigh Range Protein Ladder(Fermentas))。

图9：鸡卡氏杆菌12656-12中的gtxAC及gtxEBD基因座的构造。

箭头表示开放读码框(ORF)。用小箭头在各ORF上方指出用于检测gtxA及gtxEBD的引物对的位置。为了比较，还包括了典型RTX-毒素基因座的构造(Frey & Kuhnert 2002)。

定义

本文所用术语“佐剂”是指与所施用的免疫原性决定簇/抗原/核酸构建体混合可增强或者改良对所述决定簇的免疫反应的物质。

本文所用术语“等位基因变体”是指编码SEQ ID No.1的基因的替代形式。等位基因可由核酸序列中的至少一个突变产生，且可产生其结构或功能可能有改变或无改变的改变的mRNA或多肽。产生等位基因的常见突变变化一般归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。这类变化各自可在既定序列中单独或与其他变化组合出现一次或多次。

本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫活性的片段。

本文所用术语“抗原”是指可以结合到呈无性繁殖分布的免疫受体(T-细胞或B-细胞受体)的物质；通常为肽、多肽或多聚多肽。抗原优选为能够诱发免疫反应。

本文所用术语“结合检测”是指任何两个或更多分子以共价或非共价形式彼此结合，从而能测量该分子之一的浓度的任何生物或化学检测。

本文所用的术语“生物样本”是指选自由血清、血浆、全血、唾液、尿、淋巴、活检组织、精液、粪便、眼泪、汗液、乳汁、脑脊髓液、腹水、滑液构成的组的任何样本，但不限于此。

本文所用术语“载体”是指与抗原耦合而有助于诱发免疫反应的实体或化合物。

本文所定义的术语“保守氨基酸取代”是指将一个氨基酸被另一个具有一种或多种共有化学和/或物理特性的氨基酸取代的取代。氨基酸可根据共有特性分组。保守氨基酸取代是将既定氨基酸组内的一个氨基酸用同一组内的另一个氨基酸取代，其中既定组内的氨基酸展现相似或实质上相似的特性。

本文所用术语“检测部分”是指一分子的能够结合并检测另一分子的特定部分，分子优选但不限于蛋白质。

本文所用术语“诊断标记”是指一化合物，例如蛋白质，可以用于确定个体罹患何种失调的特征。

本文所用术语“失调”是指疾病或医学问题，并为生物体中与特定症状及体征相关且损害身体机能的异常情况。这可能由外部因素，如侵入生物体引起，或者可能由内部机能失调引起。

本文所用术语“片段”是指核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身亦分别为核酸或多肽。

本文所用术语“免疫原性”是指特定物质，如抗原或抗原表位激发免疫反应的能力，其中所述免疫反应可为细胞免疫反应或体液免疫反应。

本文所用术语“药物”是指医药药物，也称为药品或药剂，可将其宽泛地定义为任何旨在用于预防性、治疗性、改善性或症状性用途的化学物质，优选为疫苗。根据上文应该了解，本发明的期望用途并非必定包含100％预防、治疗或改善任何疾病，而是也包含部分预防、治疗或改善。

本文所用术语“致病性”是指病原体，如微生物，如鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)在生物体中产生传染性疾病的能力。

本文所用术语“质粒”是指从染色体DNA分离的能够不依赖于染色体DNA进行复制的染色体外DNA分子。

本文所用术语“多核苷酸”是指由以链形式共价键结合的核苷酸单体，例如DNA(脱氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)组成的有机聚合物分子。

本文所用术语“多肽”是指也称为蛋白质的有机化合物，其为具有至少两个且优选具有两个以上氨基酸的肽。通用术语氨基酸包含天然及非天然氨基酸，它们皆可呈“D”或“L”异构形式。

本文所用术语“预防性治疗”是指目的在于预防而非治疗或治愈疾病的任何医学方法。术语预防不意为绝对的，而是也包括部分预防疾病或疾病的一个或多个症状。

本文所用术语“启动子”是指在DNA链中与RNA聚合酶结合而启动通过一个或多个临近结构基因进行的信使RNA转录的结合位点。

本文所用术语“RTX毒素”(结构毒素重复单元)是指由大量病原性革兰氏阴性细菌产生的成孔蛋白质毒素。

本文所用术语“序列同一性”是指两个序列之间的同一性百分比的测定，并可以使用数学算法来获得。一个用于比较两个序列的数学算法的优选的、非限制性实例为Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，改良为Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877的算法。这种算法并入到了Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。

为了表征同一性，比对目标序列以便获得最高水平的同源性(匹配度)。基于这些一般原理，两个核酸序列的“同一性百分比”可采用BLASTN算法[Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden：Blast 2 sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences；FEMS Microbiol.Lett.1999 174 247-250]，可从National Center for Biotechnology Information(NCBI)网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得，并使用此处建议的默认设置(即，匹配的加分＝1；错配的罚分＝-2；链选项＝双链；空位开放＝5；延伸空位＝2；罚分空位x dropoff＝50；预期值＝10；序列长度＝11；过滤器开启)来确定。BLASTN算法确定两个所比对的核苷酸序列重叠范围内的序列同一性百分比。由于Blast是局部比对，所以最适用于计算长度不同的两个相关序列之间重叠范围内的序列同一性百分比。

用于比较序列的数学算法的另一优选的、非限制性实例为CLUSTAL W(1.7)比对算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680.)。CLUSTAL W可以用于多序列比对，优选使用BLOSUM 62作为计分矩阵。当计算序列同一性时，CLUSTAL W包括由比对参照序列的长度所产生的任何空位。序列同一性是由将匹配数目除以具有空位的比对序列的长度来计算。

本文所用术语“信号肽”是指决定蛋白质在细胞中的最终位置的氨基酸短序列，也称为分选肽。

本文所用术语“毒素”是指由活细胞或生物体产生的能够在与身体组织接触或由身体组织吸收时引起疾病的有毒物质。

本文所用术语“类毒素”是指毒性已经化学或热处理而被减弱或抑制但保持其他特性，例如免疫原性的细菌毒素(通常为外毒素)。

本文所用术语“转录因子”是指结合至特定DNA序列并从而控制遗传信息从DNA向mRNA传递的蛋白质。

本文所用术语“疫苗”是指能够在动物体内诱发免疫反应的物质或组分。免疫反应是指在生物体内诱生记忆，产生传染因子，遇到继发反应而非初次反应，从而降低其对宿主生物体的影响的免疫反应(体液的/抗体的和/或细胞的)。

本文所用术语“载体”是指作为运载工具将外来遗传物质转移至另一细胞中的DNA分子。

具体实施方式

本发明的主要目的在于提供疫苗组合物，其包含来自鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anati)的特定RTX毒素，GtxA或其免疫原性变异体或片段，用作治疗和/或预防性治疗禽类的由卡氏杆菌(Gallibacterium)属细菌感染引起的任何疾病的药物。

鸡卡氏杆菌是鸡及其他禽类物种上呼吸道与下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，鸡卡氏杆菌也已从病理性病变中分离出来并因此将其认为是潜在病原体。本发明提供一种新型毒性因子；即具有非典型构造及广泛靶细胞范围的鸡卡氏杆菌RTX-毒素。

来自鸡卡氏杆菌培养物的无细胞且经滤除菌的上清液溶解有红血球及源自禽类的巨噬细胞样细胞(HD11)，这表明产生了一种或多种外毒素。在鸡卡氏杆菌12656-12的基因组序列中，鉴定出RTX-毒素基因。所编码的蛋白质，称为GtxA(卡氏杆菌毒素)，由2026个氨基酸(aa)组成。这是典型成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端1000个aa与巴斯德杆菌科(Pasteurelleceae)其他成员的RTX-毒素同源，例如与胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)ApxIA具有38％序列相似性。与此相反，N-末端约950个aa在GenBank数据库中没有显著匹配物，但含有11个未知功能的57-aa重复单元。表达gtxA及其乙酰转移酶激活子gtxC的大肠杆菌(E.coli)变得具有溶血性和白血球毒性。研究了GtxA的各种截短形式的功能。C-末端RTX-域所展现的溶血活性低于完整毒素，这表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。仅用C-末端未检测出对HD11细胞的细胞毒性，这表明新型N-末端重复单元域是对白血球的细胞毒性效应所必需的。

用蛋白印迹法(western blotting)和northern印迹法研究鸡卡氏杆菌中gtxA的表达。在细胞外蛋白质部分中以生长期依赖性方式检测到GtxA，但未在细胞相关的蛋白质部分中检测到GtxA，这与预测的毒素分泌相符。

针对gtxA的存在及表达、GtxA分泌水平以及培养物上清液的裂解活性，研究了11种不同基因型及表型的卡氏杆菌菌株。gtxA分布广泛且可见于所测试的所有菌株中，包括卡氏杆菌基因种(Gallibacterium genomospecies)1和2(图6，比对)。菌株间的表达情况实质上不同，且无毒性非溶血型菌株F149^T表达量微小。上清液中的GtxA水平与对HD11细胞的溶血活性及细胞毒性活性的水平在某种程度上相关。

预期GtxA显著促成了鸡卡氏杆菌的致病性。

GtxA

先前未有描述，GtxA是分子量为215kDa且具有SEQ ID No.1序列的2026个氨基酸的大多肽。它可分为C-末端片段及N-末端片段。示例性C-末端片段由1077个氨基酸(SEQ ID No.2)组成，类似特征为6个串联重复九肽的典型RTX毒素。示例性N-末端由949个氨基酸(SEQ ID No.3)组成，其相对疏水且与GenBank中的其他RTX毒素或其他蛋白质几乎不共有序列相似性。毒素活性依赖于激活子，GtxC，其促进GtxA的脂肪酸酰化，即，毒性依赖于多肽的转录后酰化。未酰化的蛋白质不具有毒性。

GtxA展现了细胞溶解表型，主要是溶血性及白血球毒性。C-末端RTX-域所展现的溶血活性低于完整毒素，这表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。仅用C-末端未检测出对源自禽类的巨噬细胞样HD11细胞的细胞毒性，这表明新型N-末端重复单元域是对白血球的细胞毒性效应所必需的。

筛选来自不同地理区域(Denmark、Czech Republic和Mexico)的卡氏杆菌菌株的gtxA基因的存在，在所测试的所有菌株中皆发现有该基因，但个别菌株之间表达情况存在实质性差异。这差异似乎与地理起源无关。

鸡卡氏杆菌是鸡、产蛋母鸡及其他禽类物种上呼吸道与下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，鸡卡氏杆菌也已从禽类病理性病变中分离出来，且相信鸡卡氏杆菌对家禽的发病机制发挥了重要作用。

因此，本发明的目的在于提供源自GtxA蛋白质或其免疫活性多肽变异体的类毒素疫苗，用作治疗和/或预防疾病的药物。所述疾病可能由恒温动物的细菌感染引起，且本发明的另一目的在于预防或治疗所述疾病。本发明的另一方面涉及用于治疗和/或预防疾病的编码GtxA蛋白质的多核苷酸或编码免疫活性多肽变异体的多核苷酸。

如由图6中的部分氨基酸序列的比对所证明，GtxA多肽在不同鸡卡氏杆菌分离株间高度保守。因此，预期包含GtxA类毒素的疫苗组合物可对大量不同的鸡卡氏杆菌分离株，甚至对卡氏杆菌属的相关种类有效。

细菌物种

本发明涉及多肽、多核苷酸及带有多核苷酸的表达载体。在一个实施方式中，多核苷酸及多肽源自鸡卡氏杆菌。此外，本发明也涵盖来自巴斯德杆菌科(Pasteurellaceae)，优选来自卡氏杆菌(Gallibacterium)属，最优选来自由鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)、卡氏杆菌基因种1(Gallibacterium genomospecies1)和卡氏杆菌基因种2(Gallibacterium genomospecies 2)构成的组的细菌的多肽及和多核苷酸。

已经证实GtxA与其他RTX毒素广泛不同。通过本文所提供的分子工具，发明人已使得克隆或探测来自卡氏杆菌属的其他GtxA样毒素成为可能。

预期这些来自相关物种的GtxA样毒素与SEQ ID NO 1、2或3展现某种程度的序列同源性，且可预期编码序列与基于本发明的多核苷酸的探针杂交。

遗传修饰的菌株

如实施例2中所述，本发明的发明人已生产了鸡卡氏杆菌gtxA突变型菌株。将该菌株命名为ΔgtxA。实施例7中描述了关于这种鸡卡氏杆菌ΔgtxA突变体的感染实验，其中感染野生型微生物的禽类一般显现涉及生殖道及腹膜的弥散性及化脓性炎症，这与在野外从鸡卡氏杆菌自然感染所观测到的病变相当。另一方面，感染ΔgtxA突变体的禽类一般显现位于卵巢的较轻度炎症。因此，研究已表明在鸡中gtxA实质上促成了鸡卡氏杆菌的发病机制。由此可断定，本发明的发明人已证实上文所定义的ΔgtxA菌株可以用于免疫生物体。这些免疫的生物体，例如禽类物种，因此可以经由对例如特定病原性微生物表面上的非gtxA抗原产生的抗体而对表达gtxA的野生型微生物产生免疫性，特定病原性微生物的种类与gtxA表达和/或分泌已经消除的微生物的种类相同。

因此，在一个方面，本发明涉及转基因敲除的微生物，其中内源gtxA基因已被破坏从而消除了功能性gtxA多肽的表达，且其中所述微生物所展现的致病性相对于非转基因的对照微生物而言有所降低。

在一个实施方式中，微生物是鸡卡氏杆菌。

在另一实施方式中，转基因微生物不具有抗生素抗性。

GtxA多肽

一种野生型GtxA，即天然存在的非突变型蛋白质，以SEQ ID No.1标示。

在一方面，本发明涉及分离的多肽，所述多肽包含选自以下群组中的氨基酸序列：

a)SEQ ID No.1、2或3；

c)由a)中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，限制条件是该序列中不超过30个氨基酸被改变。

其他野生型GtxA多肽可从其他卡氏杆菌以及其他鸡卡氏杆菌分离株中分离出来。如图6中的片段比对所示，预期这些GtxA与SEQ ID NO 1、2和/或3享有高度序列同一性。

在优选的实施方式中，本发明涉及SEQ ID No.1及GtxA序列变异体，该GtxA序列变异体包含与SEQ ID No.1至少70％的序列同一性，更优选为包含与GtxA序列75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性，例如至少99.5％的序列同一性，诸如至少99.9％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及GtxA多肽的C-末端域，其以SEQID No.2定义，并涉及序列变异体，该序列变异体包含与SEQ ID No.2至少70％的序列同一性，更优选为包含与GtxA序列的C-末端域75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及GtxA多肽的N-末端域，其以SEQID No.3定义，并涉及序列变异体，该序列变异体包含与SEQ ID No.3至少70％的序列同一性，更优选为包含与GtxA序列的N-末端域75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。

除全长GtxA之外，本发明还涉及GtxA的片段，例如C-末端GtxA域以及涉及N-末端GtxA域。此外，本发明涉及这些多肽的片段。在优选的实施方式中，所述片段由至少150个连续氨基酸组成，优选为至少200个氨基酸，更优选为至少300个氨基酸，更优选为至少500个氨基酸，更优选为至少750个氨基酸，更优选为至少1000个氨基酸，更优选为1250个氨基酸，更优选为至少1500个氨基酸，更优选为至少1750个氨基酸，更优选为至少2000个氨基酸。

GtxA片段可与野生型GtxA序列在一个或多个位置上不同。在优选的实施方式中，所述片段可含有至多30个氨基酸取代，更优选至多25个取代，更优选至多20个取代，更优选至多15个取代，更优选至多10个取代，更优选至多5个取代，诸如4、3、2或1个取代。

本发明所涵盖的其他变异体是指SEQ ID No.1、2和3的多肽的变异体，其中发生了保守氨基酸取代。在优选的实施方式中，本发明涉及包含SEQ ID No.1、2或3的任何多肽，其中多肽序列中的任何氨基酸已经由另一氨基酸保守取代。

在另一优选的实施方式中，所述序列变异体及片段具免疫原性。在再一优选的实施方式中，所述序列变异体及片段保留生物活性，诸如毒性，其中所述毒性包含在接受体的细胞膜中形成孔，例如细胞毒性，诸如细胞溶解性细胞毒性，例如溶血性细胞毒性。本发明也涉及SEQ ID No.1、2和3的多肽，其中所述多肽为了去除诸如毒性的生物活性，而经特别修饰，但保留诸如免疫原性的活性。因此，在优选的实施方式中，SEQ ID No.1、2和3的多肽已优选通过热或辐射，更优选通过以非酰化形式表达，更优选通过暴露于诸如甲醛的化学物质，而失活。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及包含SEQ ID No.1、2或3的任何多肽，其中信号肽已被异源信号肽替代。

出于纯化的目的，可标记本发明。在优选的实施方式中，SEQ ID No.1、2和3可用亲和性标签来标记，优选可切割标签诸如聚组氨酸(polyHis)标签，例如HA标签，诸如FLAG标签，例如C-myc标签，诸如HSV标签，例如V5标签，诸如麦芽糖结合蛋白标签，例如纤维素结合域标签，诸如BCCP标签，例如钙调蛋白标签，诸如Nus标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶标签，诸如绿色荧光蛋白标签，例如硫氧还蛋白标签，诸如S标签，例如Strep标签。

优选地，标签位于蛋白质的C-末端部分，诸如位于C-端最末端处。更优选地，通过在标签与RTX多肽之间插入蛋白酶位点，可从GtxA多肽上切割标签。

GtxA多核苷酸

本发明提供SEQ ID No.4、5和6的特定多核苷酸序列。

本发明涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下群组中的核酸序列：

a)SEQ ID No.4、5或6；

b)选自由SEQ ID No.4、5和6所构成的组的多核苷酸的序列变异体，其中该变异体与所述SEQ ID No.具有至少60％的序列同一性；

c)由a)中的任一者的至少450个连续核苷酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一核苷酸改变为不同核苷酸，限制条件是该序列中不超过90个核苷酸被如此改变；

e)编码SEQ ID No.1、2或3的多肽的多核苷酸；

g)编码由SEQ ID No.1、2或3中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段的多核苷酸，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，限制条件是该序列中不超过30个氨基酸被如此改变。

适用于测定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列间杂交的实验条件涉及将含有待杂交的DNA片段或RNA的过滤膜预浸泡于5×SSC[氯化钠/柠檬酸钠；参见Sambrook et al.；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY 1989]中10分钟，且在5×SSC、5×Denhardt溶液[参见Sambrook等人；同上]、0.5％SDS和100μg/ml变性的经超声处理的鲑鱼精子DNA[参见Sambrook等人；同上]的溶液中将过滤膜预杂交，继而在大约45℃下于含有浓度为10ng/ml的随机引物的[Feinberg A P & Vogelstein B；Anal.Biochem.1983 132 6-13]经32P-dCTP标记(比活性＞1×109cpm/μg)的探针的相同溶液中杂交12小时。随后在至少60℃(中严格条件)，优选至少65℃(中/高严格条件)，更优选在至少70℃(高严格条件)，且甚至更优选在至少75℃(极高严格条件)的温度下，于0.1×SSC、0.5％SDS中洗涤过滤膜两次，持续30分钟。可使用X-射线薄膜来检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。

在一个实施方式中，核酸分子与选自由SEQ ID No.4、5和6构成的组的核酸序列的差别单个核苷酸。单取代可为沉默突变或可产生保守氨基酸取代。单取代或缺失也可产生移码突变。在更优选的实施方式中，本发明涉及与SEQ ID No.4的多核苷酸具有至少60％的序列同一性的多核苷酸序列，更优选为与SEQ IDNo.4至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少96％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及与SEQ ID No.5的多核苷酸具有至少60％的序列同一性的多核苷酸序列，更优选为与SEQ ID No.5至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少96％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及与SEQ ID No.6的多核苷酸具有至少60％的序列同一性的多核苷酸序列，更优选为与SEQ ID No.6至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少96％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％的序列同一性。

本发明也涉及SEQ ID No.1、2和3的多核苷酸的片段，在优选的实施方式中，该片段由至少450个连续核苷酸组成，更优选由至少500个连续核苷酸，更优选由至少600个连续核苷酸，更优选由至少750个连续核苷酸，更优选由至少1000个连续核苷酸，更优选由至少1500个连续核苷酸，更优选由至少2000个连续核苷酸，更优选由至少2500个连续核苷酸，更优选由至少3000个连续核苷酸，更优选由至少3500个连续核苷酸，更优选由至少4000个连续核苷酸，更优选由至少4500个连续核苷酸，更优选由至少5000个连续核苷酸，更优选由至少5500个连续核苷酸，更优选由至少6000个连续核苷酸组成。

多核苷酸片段可在一个或多个位置上不同于该片段所源自的野生型GtxA多核苷酸序列。在优选的实施方式中，该片段可含有至多90个核苷酸取代，更优选至多80个取代，更优选至多70个取代，更优选至多60个取代，更优选至多50个取代，更优选至多40个取代，更优选至多30个取代，更优选至多20个取代，更优选至多10个取代，更优选至多5个取代，诸如4、3、2或1个取代。

本发明涉及能够与具有SEQ ID No.4、5和6的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选在高严格杂交条件下进行。

本发明的多核苷酸可包含天然存在的等位的核酸变异体的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸也可包含SEQ ID No.4、5和6的变异体，其中单独多核苷酸已被优化以在大肠杆菌中表达。

表达载体

本发明的多核苷酸可包含在任何合适载体中，诸如表达载体或克隆载体。有多种载体可用，且可选择适合于特定目的的任何载体。可通过多种方法将适当的核酸序列插入载体中，例如，可采用本领域熟知的技术将DNA插入适当的限制性酶切位点处。除与本发明有关的核酸序列之外，载体还可进一步包含信号序列，复制起始位点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子以及转录终止序列中的一种或多种。载体也可包含其他序列，诸如增强子、聚腺苷酸(poly-A)尾、接头、多接头、可操作接头、多克隆位点(MCS)、终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)以及用于整合的宿主同源序列或其他限定的元件。载体优选为表达载体，包含有效连接到调控核酸序列的核酸，调控核酸序列引导该核酸在合适细胞中表达。

在优选的实施方式中，本发明的载体为质粒载体，诸如真核质粒载体，更优选为原核质粒载体。在另一优选的实施方式中，载体也可为病毒载体，优选为源自逆转录病毒科(Retroviridae)，诸如慢病毒，例如HIV，诸如SIV，例如EAIV，诸如CIV。

在又一优选的实施方式中，载体可选自，但不限于，包含α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV的群组，优选为腺相关病毒。

在另一优选实施方式中，本发明的载体包含启动子，更优选其中所述启动子优选连接至本发明的多核苷酸。

在优选的实施方式中，所述启动子选自，但不限于，原核启动子，优选其中原核启动子包含其他元件，诸如RNA聚合酶结合位点，例如Pribnow盒或其部分，诸如-35元件或其部分。本发明的原核载体可以用于使失活的GtxA在例如大肠杆菌中重组表达。由于大肠杆菌不含有GtxC基因，所以在大肠杆菌中表达的GtxA未经适当酰化且因此无毒性。

在另一优选的实施方式中，所述启动子选自，但不限于，真核启动子，优选其中的真核启动子包含其他元件，诸如RNA聚合酶结合位点，例如TATA盒或其部分，诸如至少一个用于任一真核转录因子的结合位点。

本发明载体的优选实施方式是裸DNA疫苗，其包含有效连接至本发明的多核苷酸的真核启动子。

疫苗

一般而言，疫苗是能够在具有功能性免疫系统的活标本中诱导免疫反应的物质或组合物。组合物可包含以下一种或多种：“活性成分”，诸如抗原(例如蛋白质、多肽、肽、核酸及其类似物)、除了其他元件外还包含一种或多种抗原的核酸构建体、细胞、(例如负载APC、继承性转移的T细胞)、复合物分子(抗体、TCR及MHC复合物等)、运载体、佐剂以及药物运载体。本发明涉及疫苗组合物，其包含来自鸡卡氏杆菌的本发明的分离的多肽，优选包含多肽的失活形式，或其免疫原性变异体或片段。本文所用术语“疫苗”是指用于诱导针对源自鸡卡氏杆菌的特异性免疫目的的兽用医学疫苗。

本发明涉及疫苗组合物，其包含SEQ ID No.1、2或3的多肽、所述多肽的失活形式、其功能性同系物、具有至少70％的序列同一性的多肽或所述多肽的免疫原性活性片段。将所述疫苗称为类毒素疫苗。类毒素疫苗是使用丧失毒性但保留免疫原性的毒素激发目标生物体的免疫反应，以使所述目标生物体对将来由源自相同或相似细菌物种的毒素或相似毒素所致的感染具有抵抗力的疫苗。

在优选的实施方式中，所述疫苗包含失活的多肽，所述多肽就毒性而言是失活的，但保留免疫原性，其优选通过热，更优选通过暴露于化学品诸如甲醛，更优选通过表达呈未酰化形式的SEQ ID No.1多肽而失活。

在另一优选的实施方式中，疫苗进一步包含失活或活减毒鸡卡氏杆菌。

在又一优选的实施方式中，本发明进一步涉及至少一种来自对禽类物种具有病原性的病毒或微生物的其他抗原，其中所述病毒或微生物是选自但不限于由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、鸡新城疫病毒(NewcastleDisease Virus)、传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)、鸡贫血因子(Chicken Anaemia agent)、禽类呼肠孤病毒(Avian Reovirus)、禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、鸡痘病毒(Chicken Poxvirus)、禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)、多杀性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和大肠杆菌(Eschericia coli)构成的组。

当将诸如毒素的抗原引入宿主生物体中时，通常使用其他组分来增强免疫反应。这些组分通常称作佐剂。本发明的疫苗组合物优选包含佐剂和/或载体。佐剂是混合在疫苗组合物中增强或以别的方式改良对GtxA多肽或其免疫原性片段的免疫反应的任何物质。运载体是能够与GtxA多肽或其免疫原性片段缔合且有助于呈递抗原的骨架结构，例如多肽或多糖。

因此，在优选的实施方式中，本发明的疫苗组合物包含选自但不限于由弗氏完全佐剂和不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、quilA、矿物油及非矿物油、植物油及聚羰乙烯构成的组中的佐剂和/或运载体。

本发明的疫苗组合物可通过若干途径施用，例如通过肌肉内或皮下注射，透过例如食物或水口服，诸如通过气雾剂，例如通过例如在足部或翼部划痕，诸如通过滴眼剂，例如通过卵内投药来施用。

禽类

巴斯德杆菌科(Pasteurellaceae)的大部分成员以共生菌形式在恒温动物，优选在禽类的粘膜中存活。卡氏杆菌(Gallibacterium)属的成员包括共生及病原性菌株，其中病原性菌株主要引起禽类宿主呼吸道及生殖道的疾病。在优选的实施方式中，本发明涉及本发明的多肽、本发明的多核苷酸以及本发明的载体，其用于治疗恒温动物，优选为禽类物种诸如鸭属(Anas)，例如雁属(Anser)，诸如潜鸭属(Aythya)，例如麝鸭属(Biziura)，诸如黑雁属(Branta)，例如天鹅属(Cygnus)，诸如燕尾鸥属(Creagrus)，例如噪鸥属(Gelochelidon)，诸如鸥属(Larus)，例如白鸥属(Pagophila)，诸如叉尾鸥属(Xemaes)，例如鹳科(Ciconiidae)，诸如鸽属(Columba)，例如地鸠属(Columbina)，诸如黄鸠属(Ducula)，例如鸡鸠属(Gallicolumba)，诸如姬地鸠属(Geopelia)，例如鹑鸠属(Geotrygon)，诸如凤冠鸠属(Goura)，例如山鸠属(Gymnophaps)，诸如新西兰鸠属(Hemiphaga)，例如棕翅鸠属(Leptotila)，诸如巨地鸠属(Leucosarcia)，例如鹃鸠属(Macropygia)，诸如裸脸原鸠属(Metriopelia)，例如冠鸠属(Ocyphaps)，诸如小长尾鸠属(Oena)，例如斑尾鸽属(Patagioenas)，诸如褐果鸠属(Phapitreron)，例如果鸠属(Ptilinopus)，诸如印加地鸠属(Scardafella)，例如斑鸠属(Streptopelia)，诸如绿鸠属(Treron)，例如森鸠属(Turtur)，诸如哀鸽属(Zenaida)，例如冠冢雉属(Aepypodius)，诸如丛冢雉(Alectura)，例如雉科(Phasianidae)，诸如松鸡亚科(Tetraoninae)，例如鹈鹕科(Pelecanidae)，诸如红鹳科(Phoenicopteridae)，例如凤头鹦鹉科(Cacatuidae)，诸如吸蜜鹦鹉科(Loriidae)，例如鹦鹉科(Psittacidae)，诸如鸸鹋科(Dromaiidae)，例如小美洲鸵属(Pterocnemia)，诸如大美洲鸵属(Rhea)，例如鸵鸟科(Struthionidae)的细菌感染。

在更优选的实施方式中，本发明的多肽、本发明的多核苷酸以及本发明的载体可用于治疗选自由鸭、火鸡和鸡，优选产蛋母鸡构成的组的禽类物种的细菌感染。

抗体

为了检测本发明的多肽或其免疫原性片段的存在，产生能够特异性结合至所述多肽或其免疫原性片段的抗体是有用的。所述抗体可结合至单独多肽上的任一表位。

在优选的实施方式中，所述抗体可以是源自血清的多克隆抗体或单克隆或重组抗体，其中抗体包含抗体的抗原结合片段诸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F(ab)₂，多聚形式诸如二聚IgA分子或五价IgM，亲和抗体或双价抗体。

在优选的实施方式中，本发明涉及IgA抗体，最优选为鸡IgA抗体。

因此，在优选的实施方式中，本发明涉及能够特异性结合至SEQ ID No.1、2或3的多肽的抗体。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及能够结合至包含与SEQ ID No.1至少70％的序列同一性的多肽的抗体，更优选与SEQ ID No.1有75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。

在又一优选实施方式中，本发明涉及能够结合至包含与SEQ ID No.2至少70％的序列同一性的多肽的抗体，更优选与SEQ ID No.2有75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。

在另一优选实施方式中，本发明涉及能够结合至包含与SEQ ID No.3至少70％的序列同一性的多肽的抗体，更优选与SEQ ID No.3有75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明涉及能够结合至包含SEQ ID No.1、2和3中任一多肽的免疫原性片段的多肽的抗体，该片段由至少150个连续氨基酸组成，优选由至少200个连续氨基酸，更优选由至少300个连续氨基酸，更优选由至少500个连续氨基酸，更优选由至少750个连续氨基酸，更优选由至少1000个连续氨基酸，更优选由至少1250个连续氨基酸，更优选由至少1500个连续氨基酸，更优选由至少1750个连续氨基酸，更优选由至少2000个连续氨基酸组成。

在又一优选的实施方式中，本发明涉及能够结合至包含免疫原性片段的多肽的抗体，其中该片段可含有至多30个氨基酸取代，更优选至多25个取代，更优选至多20个取代，更优选至多15个取代，更优选至多10个取代，更优选至多5个取代，诸如4、3、2或1个取代。

诊断

诊断性检测试剂盒是实施与本发明相关的诊断方法的所有组分的集合。

在优选的实施方式中，本发明涉及检测试剂盒，其中在生物样本中检测到由卡氏杆菌属的细菌物种的存在所引起的细菌感染的指示。所述指示可以是SEQID No.1、2或3中任一多肽或其功能性变异体，或针对任一所述多肽的抗体的存在。

在优选的实施方式中，可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测所述多肽或抗体的存在。ELISA是用于检测样本中蛋白质或任何其他抗原的存在的定量技术。在ELISA中，将未知量的抗原固定至表面，随后用特异性抗体冲刷表面，以便特异性抗体可结合至抗原。将此抗体连接至酶，且在最终步骤中，添加用该酶可以使其转化为某些可检测信号的物质。

存在有如下几种类型的ELISA：

间接ELISA

夹心ELISA

竞争ELISA

反向ELISA

其他基于免疫的分析法也可用于检测样本中的所述多肽或抗体，诸如化学发光免疫检测及解离增强镧系免疫分析法。

本发明进一步涉及诊断检测试剂盒，其用于检测本发明的任一多核苷酸或对鸡卡氏杆菌GtxA具有特异性的其他特定DNA或RNA序列的存在。

因此，在优选的实施方式中，本发明涉及用于检测所述多核苷酸的聚合酶链反应(PCR)或实时(RT)-PCR法。PCR是在若干数量级上扩增一段DNA并进而最终检测出其单个或少量副本，从而产生特定DNA序列的数千个至数百万个副本的技术。该方法依赖于热循环、其由反复加热及冷却反应物以使DNA熔融以及进行DNA酶促复制的循环组成。含有与目标区域互补的序列的引物(短DNA片段)以及DNA聚合酶是使得选择性及重复扩增成为可能的关键组分。随着PCR进行，所产生的DNA本身可作为复制模板，从而开始使DNA模板呈指数扩增的链式反应。

多肽、多核苷酸及表达载体的医学用途

作为类毒素疫苗的失活毒素通常用于治疗和/或预防性治疗细菌感染，主要用于兽医应用，优选用于治疗家禽群体。

采用类毒素疫苗的目的在于调节免疫系统，以使其不对抗侵入的细菌而对抗由侵入的细菌产生的毒素。

因此，本发明的GtxA多肽、编码GtxA多肽的多核苷酸或表达载体可用于产生类毒素疫苗，其可用作治疗和/或预防性治疗由分泌GtxA毒素和/或类似毒素的细菌引起的病原性病况。

在特定的实施方式中，对禽类提供被动免疫的剂量为每剂约0.25ml疫苗。在另一实施方式中，剂量为每剂约0.4ml疫苗。在再一实施方式中，剂量为每剂约0.6ml疫苗。在一实施方式中，剂量为每剂约0.5ml疫苗。在一个实施方式中，禽类是选自，但不限于，由鸭、火鸡和鸡所构成的组。在另一优选的实施方式中，禽类为产蛋母鸡。

本发明也提供对禽类施用本发明的疫苗，以保护禽类免受多种疾病侵袭的方法，这是通过将其他疫苗纳入组合物中来完成的。

本发明包括对禽类，优选为鸭、火鸡或鸡，更优选为产蛋母鸡，接种疫苗以提供针对GtxA毒素的主动免疫。小鸡和/或幼禽在生命早期接受疫苗接种，在约1天大或稍微更大些时(在出生第一周内)经单剂或两剂疫苗接种。实现主动免疫的适当疫苗剂量可以在约0.05ml至约0.5ml范围内变化。在特定实施方式中，疫苗剂量为约0.05ml至约0.1ml。

预期各禽类需要接受疫苗接种一次以上，诸如在1-3个月内接受两次疫苗接种。为了终身保护例如产蛋母鸡，可能需要每年再接种。

在进一步的实施方式中，可以对禽类施用本发明的毒素或其免疫原性片段。同样地，用作本发明的疫苗的GtxA毒素或其免疫原性片段的剂量范围可为每剂每千克体重约1μg至每千克体重约1000μg，示例性范围是每只动物每剂每公斤体重约10μg至每公斤体重约100μg。

表I.引物列表。用于构建及验证gtxA突变体的引物。下划线为限制性位点。

表II.用于在大肠杆菌中表达的构建体的引物列表。

下划线为限制性位点。粗体指示通过重叠延伸来拼接的重叠区域。

实施例

实施例1：来自鸡卡氏杆菌的GtxA，一种具有新型结构域构造的细胞溶解性RTX-毒素

摘要

鸡卡氏杆菌是鸡及其他禽类物种体内的病原体，其为输卵管炎及腹膜炎的重要原因。发现来自溶血性鸡卡氏杆菌生物变种溶血型的细菌细胞及无细菌且经过滤除菌的培养物上清液对源自禽类的巨噬细胞样细胞(HD11)具有高度细胞毒性。获得了鸡卡氏杆菌12656-12的基因组序列，并使用合理途径来识别经预测编码被称作GtxA(卡氏杆菌毒素)的具有2026个氨基酸的RTX-毒素的基因。gtxA敲除突变体的构建显示了gtxA负责鸡卡氏杆菌的溶血性及白血球毒性活性。此外，表达gtxA及相邻酰基转移酶gtxC的大肠杆菌变得具有细胞溶解性。GtxA在体外生长期间表达且以生长期依赖性方式集中于细胞外蛋白质部分中。GtxA具有不同寻常的分子结构；GtxA C-末端的1000个氨基酸与巴斯德杆菌科其他成员的典型成孔RTX-毒素同源。与此相反，N-末端约950个氨基酸在序列数据库中几乎无显著匹配物。截短型GtxA蛋白质的表达证实C-末端RTX-域的溶血活性低于全长毒素，这表明N-末端域是最大溶血活性所需。仅用C-末端未检测出对HD11细胞的细胞毒性，这表明N-末端域对白细胞毒性起关键作用。

材料与方法

细菌菌株及生长条件

在本研究中使用鸡卡氏杆菌生物变种溶血型菌株12656-12肝脏型(称为12656-12)，该菌株最初是从败血病的鸡的肝脏中分离出来[Bojesen A.M.，Torpdahl M.，Christensen H.，Olsen J.E.，Bisgaard M.，Genetic diversity of Gallibacteriumanatis isolates from different chicken flocks，J.Clin.Microbiol.(2003)41：2737-2740]。鸡卡氏杆菌12656-12在37℃下，在封闭塑料袋中于补充有5％含柠檬酸盐的牛血的脑心浸液(BHI)(Oxoid)琼脂上或在通气下于BHI培养液中生长。使用Anaerogen(Oxoid)在培养箱中产生厌氧条件。大肠杆菌菌株在LB培养液(Luria-Bertani broth)和琼脂中生长，适当时在培养基中补充50μg/ml卡那霉素及20μg/ml氯霉素。所有化学品均购自Sigma。

生物信息学分析

采用了基于焦磷酸测序的方法[Margulies M.，Egholm M.，Altman W.E.，Attiya S.，Bader J.S.，Bemben L.A.，et al.，Genome sequencing in microfabricated high-densitypicolitre reactors，Nature(2005)437：376-380]从454 Life Sciences获得了鸡卡氏杆菌生物变种溶血型12656-12肝脏型的基因组序列草图形式(115个序列重叠群)(A.M.Bojesen，未发表数据)。使用由Victorian Bioinfomatics Consortium，MonashUniversity，Australia提供的基于网络的原核生物注释系统Wasabi进行基因注释[Bulach D.M.，Zuerner R.L.，Wilson P.，Seemann T.，McGrath A.，Cullen P.A.，Davis J.，Johnson M.，Kuczek E.，Alt D.P.，Peterson-Burch B.，Coppel R.L.，Rood J.I.，Davies J.K.，Adler B.，Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmissionpotential，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103：14560-14565]。采用BLASTP[AltschulS.F.，Madden T.L.，Schaffer A.A.，Zhang J.H.，Zhang Z.，Miller W.，Lipman D.J.，GappedBLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs，NucleicAcids Res.(1997)25：3389-3402](数据库：非冗余蛋白质序列(GenBank)和SwissProt)、FASTA[Pearson W.R.，Lipman D.J.，Improved tools for biologicalsequence comparison，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：2444-2448]和SSEARCH(数据库：UniProtKB和SwissProt)，以及HHpred[Soding J.，Biegert A.，LupasA.N.，The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction，Nucleic Acids Res.(2005)33：W244-W248](数据库：Interpro(2009))进行序列相似性检索。所有检索在2009年3月进行。采用Transterm[Kingsford C.L.，AyanbuleK.，Salzberg S.L.，Rapid，accurate，computational discovery of Rho-independenttranscription terminators illuminates their relationship to DNA uptake，Genome Biol.(2007)8：R22]来预测转录终止子。

溶血检定

如上文所述来检定溶血活性[Rowe G.E.，Welch R.A.，Assays of Hemolytic Toxins，Methods Enzymol.(1994)235：657-667]；在TN缓冲液(10mM Tris-HCl、0.9％NaCl，pH 7.5)中反复洗涤牛血直至上层相表现为无色为止。在补充了10mMCaCl₂的TN缓冲液中制备2％(体积/体积)的红血球溶液。除非另有说明，否则在37℃下，将红血球与经过滤除菌的细菌培养物上清液或细菌以1∶1比例一起培养1小时。通过离心收集未裂解的红血球及细胞碎片，并在培养板读数器中于540nm下测量释放的血红素的量。将1％triton-X设为100％裂解，并在计算溶血活性之前减去本底溶解值。通过在溶血检定之前将上清液在60℃下培养30分钟来研究热的影响。通过在溶血检定之前将上清液与4μg/ml蛋白酶K一起在37℃下培养30分钟来研究蛋白酶K的影响。

HD11细胞的培养及LDH细胞毒性检定

将从鸡骨髓细胞的MC29转化获得的巨噬细胞样细胞系HD11[Beug H.，Vonkirchbach A.，Doderlein G.，Conscience J.F.，Graf T.，Chicken Hematopoietic-CellsTransformed by 7 Strains of Defective Avian Leukemia Viruses Display 3 DistinctPhenotypes of Differentiation，Cell(1979)18：375-390]维持在Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养基+GlutaMAX^TM-I+25mM HEPES(Gibco)中。培养基补充了2.5％鸡血清、7.5％胎牛血清(FBS)，以及25μg/mL庆大霉素。将细胞在37℃下，于5％CO₂空气中培养成贴壁细胞系并每二天或三天进行传代培养。在细胞毒性检定中，将细胞以2×10⁴个细胞接种于96孔培养板中添加有5％FBS的RPMI中，总体积为100μL。细胞过夜培养，且更换培养基。将重悬于盐水(0.9％NaCl)中经过滤除菌的培养物上清液或细菌添加到细胞中，并培养1小时。对于大肠杆菌，如章节2.7中所述诱导重组蛋白的表达，并将OD₆₀₀值(600nm下的光密度)调整为1，对应约6×10⁸CFU/mL。收获处于对数生长晚期的鸡卡氏杆菌细胞及上清液(OD₆₀₀＝1)。将鸡卡氏杆菌悬浮液的OD₆₀₀值调整为1，对应约4×10⁸CFU/mL。将经过滤除菌的培养物上清液储存于在冰上，且在收获后30分钟内添加到细胞中。按制造商所述来用LDH细胞毒性检定(Promega)测定细胞毒性。以三重重复孔来检定每个样品，且本实验重复至少三次。

鸡卡氏杆菌gtxA突变体的构建

用引物4240和4242对由gtxA第140至1648核苷酸所组成的1508bp的片段进行PCR扩增，并用引物4243和4245对由第3995至5478核苷酸所组成的1483bp的片段进行扩增(在表I中列出了引物序列)。用限制酶消化两个片段且连接至质粒pWSK129的相应限制位点处[Wang R.F.，Kushner S.R.，Construction ofversatile low-copy-number vectors for cloning，sequencing and gene expression inEscherichia coli，Gene(1991)100：195-199]。将经凝胶纯化的来自经EcoRI消化的pUC4-KISS的卡那霉素-盒(Tn903)[Barany F.，2-Codon Insertion Mutagenesis ofPlasmid Genes by Using Single-Stranded Hexameric Oligonucleotides，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：4202-4206]连接到两个PCR片段之间的EcoRI位点处。沿与gtxA相同的转录方向插入卡那霉素抗性基因。通过用XhoI和SalI消化来使质粒DNA线性化并经柱纯化。通过如上文所述的用于流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的MIV法[Poje G.，Redfield R.J.，Transformation of Haemophilus influenzae，Methods Mol.Med.(2003)71：57-70]诱导鸡卡氏杆菌12656-12的天然能力；鸡卡氏杆菌在BHI中生长至OD₆₀₀值为0.2，在MIV中洗涤1次并在MIV中培养100分钟。将线性DNA以0.5μg DNA/mL的浓度添加到细胞中。20分钟后，添加2体积BHI并培养细菌1小时，随后在含5μg/mL卡那霉素的血琼脂培养板上选择转化子。重划线接种菌落，并用引物对39F+kanR、kanF+5334R和2871F+3270R验证缺失。将该菌株命名为ΔgtxA。

表达质粒的构建

通过将PCR片段连接至表达载体pET28a(Novagen)来构建编码全长GtxA、GtxA的N-末端域(氨基酸1-949)以及带有及不带有GtxC的GtxA的RTX-域(氨基酸931-2026)的质粒。用pfx50聚合酶(Invitrogen)扩增PCR片段，经柱纯化，用NcoI及XhoI进行双重消化，并再经柱纯化或经凝胶纯化(片段＞6kb)。表II列出了用于各构建体的引物。通过重叠延伸拼接[Horton R.M.，Cai Z.L.，Ho S.N.，Pease L.R.，Gene-Splicing by Overlap Extension-Tailor-Made GenesUsing the Polymerase Chain-Reaction，Biotechniques(1990)8：528-535]制得构建体Nterm+C，gtxA的第1-2847核苷酸与gtxC共用操纵子，其中在第二轮PCR中使用引物GtxUP-Ncol和gtxC-r-Xhol。用NcoI及XhoI双重消化质粒pET28a，用南极磷酸酶(NEB)脱磷酸化且进行凝胶纯化。将载体与PCR片段以1∶3的摩尔比连接，转化至化学感受态大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)，并在含有卡那霉素的LB琼脂培养板上进行筛选。通过DNA测序(Macrogen，Korea)验证各质粒中插入物的序列。将质粒转化至大肠杆菌表达菌株ER2566(New England Biolabs)中。质粒pLG575编码大肠杆菌的hlyB和hlyD，其为分泌HlyA的T1SS的组分[Mackman N.，Nicaud J.M.，Gray L，Holland I.B.，Genetical and functional organisation ofthe Escherichia coli haemolysin determinant 2001，Mol.Gen.Genet.(1985)201：282-288]，Mol.Gen.Genet.(1985)201：282-288]，且将其引入以促进所表达的蛋白质的分泌。

重组GtxA蛋白质在大肠杆菌中的表达

在30℃培养的含0.1mM IPTG的琼脂培养板上诱导蛋白表达。为了在培养液中进行诱导，将过夜培养物按1∶50稀释，并在37℃摇培至培养物OD₆₀₀值达到0.6。接着，添加IPTG(0.2mM)并在30℃下维持诱导2小时。为了从细胞释放重组蛋白，通过离心沉淀细胞，将其以原始体积的1/25重悬于0.1MTris/0.9％NaCl中，通过微珠破碎(FastPrep)裂解45秒，并在4℃短暂离心，且上清液立即用于液体溶血检定及LDH细胞毒性检定。

SDS PAGE及蛋白印迹分析

通过收获500μL培养物并在收获时将细胞沉淀以500μL/每OD单位重悬于10mM Tris中来获得全部细胞蛋白质。从经过滤除菌的培养物上清液(低蛋白结合过滤器(0.22μm)(Millex

GP(Millipore))中制备细胞外蛋白质。通过添加1体积冰冷的96％乙醇使蛋白质沉淀过夜，通过离心(在0℃，13000g离心30分钟)收集，并将其重悬于10mM Tris(原始体积的1/100)中。通过在NuPAGE

Novex凝胶(Invitrogen)中进行SDS-PAGE来分离蛋白质。在蛋白印迹分析中，将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜(Invitrogen)。以1∶1333稀释度来使用一抗，针对来自胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)的ApxI产生的兔抗血清[Schaller A.，Kuhn R.，Kuhnert P.，Nicolet J.，Anderson T.J.，Maclnnes J.I.，SegerR.P.A.M.，Frey J.，Characterization of apxIVA，a new RTX determinant of Actinobacilluspleuropneumoniae，Microbiology(1999)145：2105-21 16]，并按照制造商所述来采用Westernbreeze Chemiluminiscent Western Blot Immunodetection Kit(Invitrogen)进行检测。

RNA纯化

在BHI中按1∶100稀释过夜培养物，并在通气下于37℃培养。在OD₆₀₀值为0.17、0.6、2、3时，并在停止生长后1小时及在培养24小时后收获细胞。用RNeasy protect Mini Kit(Qiagen)分离总RNA，如制造商(Qiagen)所述进行柱上DNAse处理。

Northern印迹法

基本上如[Frees D.，Chastanet A.，Qazi S.，Sorensen K.，Hill P.，Msadek T.，Ingmer H.，Clp ATPases are required for stress tolerance，intracellular replication and biofilm formationin Staphylococcus aureus，Mol.Microbiol.(2004)54：1445-1462]所述来进行RNA的印迹分析、探针标记(采用[α-³²P]-dCTP)及杂交。用引物3487F 5’-GCCTCTACCGCCGTTTCTG-3’及3874R 5’-GGCTGGCTAATAATTCATCACCTTG-3’对gtxA的RTX-半部内的384bp片段进行PCR扩增，并将其在探针标记反应中作为模板。

结果

鸡卡氏杆菌的细胞溶解活性

鸡卡氏杆菌生物变种溶血型在牛血琼脂培养板上是β-溶血性的[ChristensenH.，Bisgaard M.，Bojesen A.M.，Mutters R.，Olsen J.E.，Genetic relationships among avianisolates classified as Pasteurella haemolytica，′Actinobacillus salpingitidis′or Pasteurellaanatis with proposal of Gallibacterium anatis gen.nov.，comb，nov and description ofadditional genomospecles within Gallibacterium gen.nov，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.(2003)53：275-287]。为了测试目标范围，研究了菌株12656-12在含来自不同物种的血液的琼脂培养板上的溶血，且当在含有马、母牛、猪或鸡血的琼脂培养板上生长时，细菌产生β-溶血的清亮区(未显示数据)，这证实了由Greenham和Hill所报道的宽目标范围[Greenham L.W.，Hill T.J.，Observations on an Avian Strain ofPasteurella haemolytica，Vet.Rec.(1962)74：861-863]。细菌在需氧及厌氧培养条件下皆具有溶血性。

研究已表明这溶血活性来源于分泌的溶血素[Greenham L.W.，Hill T.J.，Observations on an Avian Strain of Pasteurella haemolytica，Vet.Rec.(1962)74：861-863]。为了测试这活性，进行了液体溶血检定，其中将不同生长期收获的无鸡卡氏杆菌12656-12细胞的培养物上清液与牛红血球悬浮液共培养且测量所释放的血红素的量。对数生长中期至晚期的鸡卡氏杆菌上清液可高效溶解红血球(图1A)。这活性可通过热(60℃)及蛋白酶K来失活，并可用钙螯合物EGTA来降低(未显示数据)，这证实了鸡卡氏杆菌产生钙依赖性分泌的溶血性蛋白质。

红血球的溶解可在宿主铁采集方面起作用，然而，与其他类型的细胞，例如白血球的相互作用可能在自然感染期间起更为重要的作用。因此使用源自禽类的巨噬细胞样细胞系HD11测试了鸡卡氏杆菌对白血球的细胞毒性活性。HD11细胞在暴露于鸡卡氏杆菌后显示为变圆且从表面脱离(图2B)。使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检定法来定量细胞毒性，其显示出显著的细胞死亡(图2C)。鸡卡氏杆菌的白血球毒性活性很可能是细菌发病机制所必需，且因此预期负责白血球毒性活性的蛋白质是重要的毒性因子。

鸡卡氏杆菌基因组序列中的RTX-毒素的识别

为了识别负责鸡卡氏杆菌细胞毒性表型的特定蛋白质，获得了鸡卡氏杆菌12656-12的基因组序列，并检索了编码可能毒素的序列。属于成孔RTX-毒素的群的蛋白质是重要毒性因子，并负责与卡氏杆菌相关的细菌的溶血性及白血球毒性活性[Frey J.，Kuhnert P.，RTX toxins in Pasteurellaceae，Int.J.Med.Microbiol.(2002)292：149-158]，使此类型的蛋白质成为检索的明显目标。用不同RTX-毒素(包括来自胸膜肺炎放线杆菌的Apxl及Apxll、来自放线共生放线杆菌的LtxA及来自大肠杆菌的HlyA)的氨基酸序列针对鸡卡氏杆菌12656-12基因组序列进行BLAST检索，识别出具有2026个氨基酸的假定的鸡卡氏杆菌RTX-毒素。将编码这种蛋白质的6081个核苷酸(nt)读码框(ORF)称为gtxA：gtx是卡氏杆菌毒素，A是依照其他RTX操纵子中的毒素基因命名类推[Frey J.，Kuhnert P.，RTXtoxins in Pasteurellaceae，Int.J.Med.Microbiol.(2002)292：149-158]。gtxA后面有极短的5个核苷酸(nt)的基因间的区域以及编码具有163个氨基酸的预测蛋白质的492nt ORF(图3A)。这种蛋白质与活化RTX-毒性所需的酰基转移酶蛋白同源，且显示与大肠杆菌的酰基转移酶HlyC具有38％的同一性和60％的相似性。以此类推，将该基因称为gtxC。在gtxC下游发现rho-独立转录终止子，且其可能标记包括gtxA及gtxC的转录单元末端。可预测侧翼gtxA-C操纵子的基因编码肌醇-1-单磷酸酶(gtxA的上游的suhB)以及甘露糖酸脱水酶基因(gtxC下游的uxuA)(图3A)，两者皆不可能涉及GtxAC功能。

有趣的是，GtxA(2026aa)的尺寸是如[Frey J.，Kuhnert P.，RTX toxins inPasteurellaceae，Int.J.Med.Microbiol.(2002)292：149-158]所述的来自巴斯德杆菌科的其他成员的“典型”RTX-毒素(约1000aa)及来自大肠杆菌(E.coli)的HlyA的两倍。GtxA的C-末端处的1000个氨基酸与这些RTX-毒素同源，该区域与这些RTX-毒素共有约20％的序列同一性及35％的序列相似性。这C-末端域也含有RTX-毒素的若干个保守特征。来自大肠杆菌的HlyA在Lys564及Lys690处酰化[Stanley P.，Packman L.C.，Koronakis V.，Hughes C，Fatty Acylation of 2 InternalLysine Residues Required for the Toxic Activity of Escherichia coli Hemolysin，Science(1994)266：1992-1996]；由于在GtxA中这些赖氨酸及前面的甘氨酸残基是保守的(Lys1484和Lys1607(图3B))，所以这些位点很可能是GtxA中由GtxC介导的酰化位点。在预测酰化位点(aa 1640-1830)下游，GtxA具有富含甘氨酸及天冬氨酸的区域，其也是RTX-毒素的保守特征。相反地，N-末端域(aa 1至大约950)与可用序列的相似性有限，且通过针对GenBank数据库进行BLASTP搜索未发现显著同系物。然而，aa 520至879的区域与来自预测膜蛋白的具有未知功能的保守域(COG1511)具有相似性(E值为0.007)。与RTX-域相比，N-末端域的酸性较低，且含有较大比例的疏水性氨基酸，尤其是丝氨酸。预测二级结构主要由α-螺旋组成。

为了了解N-末端域的功能，通过采用更为灵敏的用于序列相似性及同源性预测的检索工具来对其氨基酸序列进行生物信息学分析。使用FASTA及SSearch进行同源性检索，发现与来自阿米巴盘基网柄菌属(amoeba Dictyosteliumdiscoide)的真核细胞骨架蛋白踝蛋白-A和踝蛋白-B(E值分别为3.4×10^-7和0.0061)及来自鸡(原鸡属(Gallus gallus))的踝蛋白(E值为0.0087)的序列相似性。此外，同源性检测服务器HHpred预测了与踝蛋白的同源性(概率＝100％)。踝蛋白结合至一系列其他蛋白质，包括肌动蛋白、粘着斑蛋白和整联蛋白的细胞溶质部分。大蛋白质常常由通过复制产生的重复单元组成，且用重复单元发现雷达[16]对N-末端域进行研究，发现有15个具有57个氨基酸的重复单元(图3C)。

GtxA因此由两个域组成：N-末端重复单元域及C-末端RTX/细胞溶解素域。

GtxA具有依赖于GtxC的细胞溶解活性

为了研究GtxA是否是细胞溶解性蛋白，将gtxA连同预测的酰基转移酶基因gtxC一起克隆，并引入非溶血性表达菌株大肠杆菌(E.coli)ER2566中。在gtxA及gtxC表达后，这一菌株在血琼脂培养板上且在液体溶血性检定中展现溶血性表型(图4)，这显示了GtxAC具有溶血活性。RTX-毒素通常是由特定的T1SS输出的细胞外蛋白质。引入表达由大肠杆菌hlyBD编码的T1SS的质粒(pLG575)会增大溶血区域(图4A)，且免疫印迹分析显示GtxA的较大部分存在于细胞外蛋白质部分中(图5)，表明大肠杆菌分泌系统可分泌鸡卡氏杆菌GtxA。通过LDH释放检定来检测GtxA对HD11细胞的细胞毒性活性，且表达gtxAC的大肠杆菌ER2566对HD11细胞有毒性。含有无插入物的载体的大肠杆菌(阴性对照)在培养1小时后未显示毒性(图4B)。需要翻译后酰化是RTX-毒素的一个标志。为了解对非典型GtxA是否也如此，研究了在无GtxA的预测酰基转移酶GtxC下所表达的GtxA的活性。图4显示了当GtxA在不存在GtxC下表达时，其针对红血球或白血球不具有细胞溶解活性。因此，未酰化的毒素原无活性，且翻译后酰化是其溶血性及白血球毒性活性所必需的。GtxA的分泌不因缺少酰化而受到阻碍，因为在培养物上清液中检测到量类似于酰化毒素的未酰化GtxA(图5)。

GtxA负责鸡卡氏杆菌的细胞毒性活性

为确定鸡卡氏杆菌的溶血性及白血球毒性活性是否来源于GtxA，构建了gtxA敲除突变体。先前未描述可用于卡氏杆菌的基因操作的分子工具，但发现鸡卡氏杆菌12656-12具有天然能力，可利用该特性，通过天然转化来构建稳定的gtxA突变体。在所得突变体中，gtxA中位置1648与3995之间的2347个核苷酸缺失且置换为卡那霉素抗性盒。

与野生型相反，ΔgtxA突变体在血琼脂培养板上(图2A)或在液体溶血检定(未显示数据)中不具溶血性。此外，ΔgtxA对HD11细胞不显示细胞毒性(图2B及2C)。从两个独立构建的gtxA突变体获得了相同的结果。因此，gtxA负责鸡卡氏杆菌的溶血性及白血球毒性活性。

GtxA的生长期依赖性程度及其活性

鸡卡氏杆菌上清液的溶血活性具有生长期依赖性：活性在对数生长晚期达到峰值，在转变为生长稳定期时降低，并在过夜培养物的上清液中较低(图1A)。这促使了对于GtxA的表达同样具有生长期依赖性的猜测。为了研究此猜测，并确定GtxA的定位，采用免疫印迹法用ApxI-抗血清在整个生长期间的不同时间测定GtxA在培养物上清液(细胞外蛋白质)及全细胞裂解物中的量(图1B)。ApxI-抗血清在细胞外蛋白质部分中识别出若干蛋白质，包括对应于全长GtxA的预测分子质量(215kDa)的尺寸的条带。这条带在ΔgtxA中不存在，证实了该条带为GtxA。类似于溶血活性，GtxA在上清液中的存在及量具有生长期依赖性(图1B)：GtxA的量在转变至生长稳定期时达到峰值，且在全体培养物(24小时)中未检测到该蛋白质，其类似于对于胸腺肺炎放线杆菌ApxI及ApxII[Jarma E.，Regassa L.B.，Growth phase mediated regulation of the Actinobacilluspleuropneumoniae Apxl and Apxll toxins，Microb.Pathog.(2004)36：197-203]及溶血性曼氏杆菌LktA[Strathdee C.A.，Lo R.Y.，Regulation of expression of the Pasteurellahaemolytica leukotoxin determinant，J.Bacteriol.(1989)171：5955-5962]所报道的模式。第二条带(＞215kDa)也存在于野生型中，但不存在于ΔgtxA中，这表明GtxA可能由于翻译后修饰而存在有两种不同形式。在野生型及突变体中检测到两个其他条带(分别为65kDa及＞215kDa)，且其很可能与GtxA无关。任何时间点均未在全细胞裂解物中检测到具有GtxA尺寸的蛋白质，这结果与预测的细胞外定位相符，并证明了在合成后或伴随合成而立即分泌了GtxA。为了研究gtxA的转录，对来自整个生长期期间收获的细胞的RNA进行northern印迹分析。印迹显示了gtxA的转录发生在对数生长期间及生长稳定期开始时，但在进入生长稳定期2小时时以及在过夜培养物中未检测到转录物，指示gtxA的转录在生长稳定期期间停止。总之，GtxA在体外生长期间表达，其为生长期依赖性细胞外蛋白质，且生长期依赖性受转录调节以及分泌的GtxA累积与其后续降解之间平衡的影响。

GtxA的N-末端域是完全细胞溶解活性所需

生物信息学分析显示GtxA与其他成孔RTX-毒素相比具有非典型构造，其由两个部分，RTX-域及N-末端域组成(图3B)。为研究N-末端域对GtxA的细胞溶解活性的作用，分别在大肠杆菌中表达N-末端域(氨基酸1-949)及RTX-域(氨基酸931-2026)，并研究其溶血性及白血球毒性活性，且将其与全长蛋白质的活性相比较(图4)。表达RTX-域和GtxC的大肠杆菌(E.coli)在血琼脂培养板上及液体溶血检定中显示了溶血活性，因此，RTX-域本身是功能性溶血性蛋白质，而N-末端域并非是红血球溶解所必需的。然而，RTX-域所展现的溶血活性明显低于完整毒素，这表明N-末端域是完全溶血活性所需的。未从RTX-域与HD11细胞之间的相互作用中检测出细胞毒性活性，这表明N-末端域对白细胞毒性起关键作用。免疫印迹(图5)显示表达了RTX-域并输出；因此活性差异并非因表达水平的主要差异所致。

仅表达N-末端域的大肠杆菌无溶血性或细胞毒性活性(图4)。然而，SDS-PAGE显示这重组蛋白主要存在于全细胞部分中且仅以微小量存在于细胞外蛋白质部分中(未显示数据)。因此测试了表达N-末端域的细胞的裂解产物(由FastPrep微珠破碎或溶菌酶/超声处理产生)的活性，且尽管延长培养时间，这些裂解产物在液体溶血检定中或对禽类巨噬细胞不显示任何活性。这些结果指示N-末端域本身无细胞溶解活性。

实施例2：检测卡氏杆菌(Gallibacterium)中的gtxA

材料与方法

采用DNeasy试剂盒(Invitrogen)从卡氏杆菌菌株中纯化出染色体DNA。以染色体DNA作为模板(50ng/50μl反应物)，以rtxA3368F 5’-CAAACCTAATTCAATCGGATG-3’(SEQ ID NO：24)和rtxA4625R 5’-TGCTTCAATAATTTTCCATTTTC-3’(SEQ ID NO：25)为引物进行标准PCR，扩增gtxA的第3332至4589核苷酸。PCR条件为；94℃4分钟，94℃30秒、51℃30秒及72℃105秒35个循环。通过凝胶电泳及溴化乙锭染色来显示产物。通过BigDye循环测序(Macrogen，Korea)来对PCR产物进行测序。翻译核苷酸序列并用CLC工作台比对。

结果

图6显示了来自不同卡氏杆菌菌株的GtxA毒素的对比结果。

实施例3：序列

下文所列的序列涉及本申请所提及的氨基酸及核苷酸的序列。

SEQ ID No.1

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的全长GtxA(氨基酸1-2026)

＞GtxA aal-2026

MLSLKEKVTGIDFDAIKDKVVSLKNTVSNIDFNLVKEDISSLKSNALSIAASDFKNKPVLFK

DSLDLLTDATNTLRKITNQMSSISEISNKSLDLLDSLFEAAKDIVNIAYSKGGVEITKSATEL

AAKAALIVDKSIILANKDNTISEAVYHSINNSLQNIQKTAINIATHSHNEDKAEIAKASFELLS

QVSDVISNALKNSGDIGIESQLLADINQFSHSILNTAKTVTDIATMDMNDKTSIAKNSISLIA

NVNDVISDILVMTDKDTELLNAIHNVTAKNLQNIEESAVNLANADVLSQEGKVSIAINSLT

LISQTNKIVAQVLNEANLSTDKTQFVGELTDVLLNTAKSITLLATGNNATTAGKEQLAVAS

TNLIGNVNDLIQSITSFKGKEDIGNALHSAVDGQLSQIKQLAVALSNSNLDSSQGKTAIAITS

FGLIAQANNIINKFLDNMSLSTNVSKSVHSLTNSALDAAKILTNVVQVDANNNQGKVVIA

NSSLELSKTASDIVSTVLKSTSISTQHIDIIHNAVNKTLTEMKDSAVAIALASSENNSAEIATH

SLSLLSDASNMLKDIMQGMSPNNVIAPKTLELFNSLFATAQNIVQLADAKSSENIAKASVD

LVQSATIILNNVLTLANVDSSLSKAFHQSFDASVSQIKEVAAQLATASSASNKAEIAKLSFD

FISQVSDLATNTLTTAKTGLDSTLLNNVNGLSHSVLNAAKSVTDIIVSDNPANTASLSVSLV

NNANEIVSNILTLSGKQNTLSTAVHDVTAKHLAPIEKIAINLANADNSSSDGKVAIALNSLT

LIAQSNHLIEEVLKEAKLDNAKSAFAHNLTDLVLDTAKTITALASADTSKVDGKQQIASAS

THLVGQINEIVKSITTITNSETKVGNAAYQALKTHLEQVETIAVKLAAANASTAEGRTEIAIE

SFNLIAKTNGIMTDFLNQIGIKEELTKPIQGLSNSILDTAKTLTYVVQIDPTTDKGKLSIADSS

FELAKSANQIVSYIMDLSGSSSELSHNIANTAHQILSISQDRLLSIGNNISALANADKLTKEG

VKIIVDSSFAITSDVNGFITDVVKTVGKDGNPKVGSALSLSNSIIDMGHSIANLIQSDVNTSS

GKAAIAEGSIKLIGNINGLVSDVLSLSNASTAVSEAISSSAGGILTNLSSLIGSSIKLHNWSNM

TQADQIAVGFDIGLKAVSTIATGVGTTAQSIAKIIGTTTMLPQIGAAVSGIALAASPLEIKGL

VDEHKYVKQIDSLASETKTYGYQGDELLASLLNEKFALNTAYTATDIALNLATTAISVAAT

ASVIGAPIAAIAGVVRGAIGGIMSAIKQPALEHIAKRYVDQIEKYGDIQKYFDQNTEATLNK

FYASQEVIQSFKQLQKLYNVDNIITLDGVASSDSAIELAAITKLVEQMNKANNYAQLIRNG

EIDKALSAQYLSMDAKTGVLEITAPGNSLIKFNSPLFAPGVEEARRKAVGKNNFYTDLIING

PNEHTINDGAGNNIFISNDKYASVLYDENGKLLKHINLNINAGDGNDTYIADNGHSLFNGG

NGTDSVSYNNEHIHGIVVHGRDAGTYSVTKHIADAEVTVENIKVKNHQYGKRQERVEYR

ELHIETKSYDASDMLYNVEVISASDYDDVMYGSKGNDYFLAQNGNDLVYGKEGDDIIFG

GAGDDKLYGETGNDTLNGGLGKDLIYGGEGNDTIIQDDALSSDTIFGDEGIDTLDLRHLVI

NDEGLGVVADLQSEKLYKGTIFDHIYDIENIIGTSGNDNLIGNHKDNILIGNDGDDILEGYSG

NDVLAGGSGINKLYGGQGADIYLLSTNATNYIFDLTKNNLAKLENSEDLNLQFTKDSDDN

VTLSFNKDGNTIGKTIIEKSSQFGTFSIGDGYYLDLNDGKFKYILSGESSNADLAQNTLHFN

KGEELQVHAAAKDNQIILDHEHQHYINTYSNTQTNIKGFEVGKDKLQLSLLSNNLSSDTKL

KFSGYDIEGGDVNITSGNTYITLSGAGHTDYASKTFNELVTMYLV

SEQ ID No.2

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的GtxA C-末端部分(氨基酸950-2026)

＞GtxA aa950-2026

QIGIKEELTKPIQGLSNSILDTAKTLTYVVQIDPTTDKGKLSIADSSFELAKSANQIVSYIMDL

SGSSSELSHNIANTAHQILSISQDRLLSIGNNISALANADKLTKEGVKIIVDSSFAITSDVNGFI

TDVVKTVGKDGNPKVGSALSLSNSIIDMGHSIANLIQSDVNTSSGKAAIAEGSIKLIGNINGL

VSDVLSLSNASTAVSEAISSSAGGILTNLSSLIGSSIKLHNWSNMTQADQIAVGFDIGLKAVS

TIATGVGTTAQSIAKIIGTTMLPQIGAAVSGIALAASPLEIKGLVDEHKYVKQIDSLASETK

TYGYQGDELLASLLNEKFALNTAYTATDIALNLATTAISVAATASVIGAPIAAIAGVVRGAI

GGIMSAIKQPALEHIAKRYVDQIEKYGDIQKYFDQNTEATLNKFYASQEVIQSFKQLQKLY

NVDNIITLDGVASSDSAIELAAITKLVEQMNKANNYAQLIRNGEIDKALSAQYLSMDAKTG

VLEITAPGNSLIKFNSPLFAPGVEEARRKAVGKNNFYTDLIINGPNEHTINDGAGNNIFISND

KYASVLYDENGKLLKHINLNINAGDGNDTYIADNGHSLFNGGNGTDSVSYNNEHIHGIVV

HGRDAGTYSVTKHIADAEVTVENIKVKNHQYGKRQERVEYRELHIETKSYDASDMLYNV

EVISASDYDDVMYGSKGNDYFLAQNGNDLVYGKEGDDIIFGGAGDDKLYGETGNDTLNG

GLGKDLIYGGEGNDTIIQDDALSSDTIFGDEGIDTLDLRHLVINDEGLGVVADLQSEKLYKG

TIFDHIYDIENIIGTSGNDNLIGNHKDNILIGNDGDDILEGYSGNDVLAGGSGINKLYGGQGA

DIYLLSTNATNYIFDLTKNNLAKLENSEDLNLQFTKDSDDNVTLSFNKDGNTIGKTIIEKSS

QFGTFSIGDGYYLDLNDGKFKYILSGESSNADLAQNTLHFNKGEELQVHAAAKDNQIILDH

EHQHYINIYSNTQTNIKGFEVGKDKLQLSLLSNNLSSDTKLKFSGYDIEGGDVNITSGNTYIT

LSGAGHTDYASKTFNELVTMYLV

SEQ ID No.3

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的GtxA N-末端部分(氨基酸1-949)

＞GtxA aa1-949

MLSLKEKVTGIDFDAIKDKVVSLKNTVSNIDFNLVKEDISSLKSNALSIAASDFKNKPVLFK

DSLDLLTDATNTLRKITNQMSSISEISNKSLDLLDSLFEAAKDIVNIAYSKGGVEITKSATEL

AAKAALIVDKSIILANKDNTISEAVYHSINNSLQNIQKTAINIATHSHNEDKAEIAKASFELLS

QVSDVISNALKNSGDIGIESQLLADINQFSHSILNTAKTVTDIATMDMNDKTSIAKNSISLIA

NVNDVISDILVMTDKDTELLNAIHNVTAKNLQNIEESAVNLANADVLSQEGKVSIAINSLT

LISQTNKIVAQVLNEANLSTDKTQFVGELTDVLLNTAKSITLLATGNNATTAGKEQLAVAS

TNLIGNVNDLIQSITSFKGKEDIGNALHSAVDGQLSQIKQLAVALSNSNLDSSQGKTAIAITS

FGLIAQANNIINKFLDNMSLSTNVSKSVHSLTNSALDAAKILTNVVQVDANNNQGKVVIA

NSSLELSKTASDIVSTVLKSTSISTQHIDIIHNAVNKTLTEMKDSAVAIALASSENNSAEIATH

SLSLLSDASNMLKDIMQGMSPNNVIAPKTLELFNSLFATAQNIVQLADAKSSENIAKASVD

LVQSATIILNNVLTLANVDSSLSKAFHQSFDASVSQIKEVAAQLATASSASNKAEIAKLSFD

FISQVSDLATNTLTTAKTGLDSTLLNNVNGLSHSVLNAAKSVTDIIVSDNPANTASLSVSLV

NNANEIVSNILTLSGKQNTLSTAVHDVTAKHLAPIEKIAINLANADNSSSDGKVIALNSLT

LIAQSNHLIEEVLKEAKLDNAKSAFAHNLTDLVLDTAKTITALASADTSKVDGKQQIASAS

THLVGQINEIVKSITTITNSETKVGNAAYQALKTHLEQVETIAVKLAAANASTAEGRTEIAIE

SFNLIAKTNGIMTDFLN

SEQ ID No.4

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的全长gtxA(核苷酸1-6078)

＞gtxA nt1-6078

GTGCTTTCATTAAAAGAAAAAGTAACTGGAATAGATTTTGATGCAATCAAAGATAAA

GTCGTTTCATTAAAAAACACGGTTTCAAATATTGATTTTAATCTGGTTAAAGAAGATAT

TTCTTCTTTAAAAAGCAATGCGTTATCCATCGCGGCATCAGATTTTAAAAATAAACCG

GTGTTATTCAAAGACTCTTTAGACTTACTTACTGATGCTACAAATACACTCAGAAAGA

TTACCAATCAAATGTCATCAATTAGCGAAATTTCTAATAAGTCATTAGATTTGCTGGAT

TCTCTTTTTGAGGCTGCCAAAGATATTGTAAACATTGCCTATTCAAAAGGTGGTGTCGA

AATTACTAAGTCTGCGACAGAATTAGCGGCAAAAGCGGCATTAATTGTTGATAAAAGT

ATCATATTAGCAAATAAAGATAATACAATTAGTGAAGCTGTTTATCATTCTATTAACA

ACTCATTACAAAATATTCAAAAAACAGCTATCAATATTGCTACACATTCACATAATGA

AGATAAAGCTGAAATTGCTAAAGCCTCTTTTGAGCTGTTATCTCAAGTTAGTGATGTTA

TCAGTAATGCGTTAAAAAATTCAGGTGATATAGGTATCGAATCACAACTCTTAGCCGA

TATTAATCAGTTTTCTCATTCTATTTTGAACACAGCTAAAACAGTTACTGATATAGCTA

CTATGGATATGAATGATAAAACCTCAATCGCTAAAAATAGCATTTCATTAATAGCCAA

TGTGAATGATGTTATTTCCGATATTCTAGTAATGACGGATAAAGACACCGAATTATTA

AATGCAATTCATAATGTTCTGCGAAAAATCTACAGAATATCGAAGAGAGTGCGGTC

AATCTTGCAAATGCTGATGTGCTGTCTCAAGAAGGCAAAGTCAGTATTGCCATTAATT

CTTTAACTTTAATATCACAAACCAACAAAATTGTTGCGCAAGTGCTAAATGAAGCTAA

TTTAAGCACTGATAAAACCCAATTTGTTGGCGAATTAACCGATGTATTATTGAATACC

GCAAAAAGTATTACATTGTTAGCTACCGGTAATAATGCGACAACAGCAGGAAAGGAA

CAGCTGGCAGTTGCCTCAACCAATCTTATTGGTAACGTGAATGATCTCATTCAATCAAT

TACCAGCTTTAAAGGCAAAGAAGATATTGGTAACGCTTTACACAGTGCGGTGGACGG

ACAATTATCACAAATCAAACAACTTGCGGTCGCGTTATCAAACAGTAATCTTGATTCT

TCaCAAGGTAAAACTGCAATAGCCATCACCTCTTTCGGCTTGATTGCACAAGCAAATA

ATATTATCAATAAATTCTTGGATAATATGAGTTTAAGTACTAATGTGAGTAAATCGGTT

CATAGTTTGACTAATTCAGCGCTAGATGCAGCCAAAATTCTCACAAACGTAGTACAAG

TAGATGCTAATAACAATCAAGGAAAGGTCGTGATTGCCAATAGTTCATTAGAACTTTC

TAAAACAGCAAGTGATATTGTGTCTACTGTGTTAAAAAGCACATCTATTTCAACACAA

CATATTGATATAATTCATAATGCAGTAAATAAAACATTAACAGAAATGAAAGATAGT

GCGGTAGCAATAGCACTTGCTTCATCTGAAAATAATAGCGCTGAAATTGCAACGCATT

CATTAAGTCTGTTATCCGATGCAAGTAATATGTTGAAAGATATTATGCAAGGAATGAG

CCCTAATAATGTCATTGCTCCGAAAACATTAGAATTATTTAACTCACTATTTGCGACAG

CTCAAAATATCGTTCAATTAGCTGACGCAAAATCTTCAGAAAACATTGCTAAAGCTAG

TGTTGATTTGGTACAAAGCGCAACGATTATCCTCAATAACGTATTAACGTTGGCTAAC

GTTGATTCTTCTTTAAGTAAAGCTTTTCATCAATCATTTGATGCTTCAGTTTCTCAAATT

AAAGAGGTAGCAGCTCAATTAGCTACCGCGTCTTCTGCCTCTAATAAAGCTGAGATTG

CAAAACTCTCTTTTGATTTTATTAGTCAAGTAAGTGATTTAGCGACCAACACCTTAACA

ACAGCGAAAACCGGATTAGATAGCACGCTGCTGAATAACGTTAACGGTCTTTCTCATT

CCGTCTTAAATGCAGCAAAATCAGTAACCGATATTATTGTGAGTGATAACCCAGCGAA

TACCGCCAGTTTATCCGTTTCTTTGGTGAATAATGCCAATGAAATTGTTTCAAATATCT

TAACCTTATCCGGAAAACAAAATACGCTCTCCACGGCAGTACACGATGTAACCGCTAA

ACATTTAGCGCCGATTGAGAAAATAGCAATTAACCTTGCGAATGCCGATAACTCAAGC

AGTGATGGAAAAGTTGCTATTGCGTTAAACTCATTAACATTGATTGCACAAAGTAACC

ATTTAATCGAAGAAGTATTAAAAGAGGCTAAATTAGATAATGCGAAGAGCGCCTTTG

CTCACAATTTAACGGATTTAGTATTAGATACCGCCAAAACAATCACGGCATTAGCATC

AGCGGATACCAGTAAAGTAGACGGCAAGCAGCAGATTGCCTCTGCATCAACACATTT

AGTCGGACAAATTAATGAGATTGTCAAATCAATCACGACAATAACCAATTCAGAAAC

GAAAGTCGGCAATGCCGCATATCAAGCGTTAAAAACACATTTAGAGCAGGTAGAAAC

AATTGCGGTTAAACTTGCCGCCGCCAATGCATCAACAGCGGAAGGCAGAACAGAAAT

TGCGATTGAATCTTTCAATTTAATCGCAAAAACCAATGGCATAATGACCGATTTCCTA

AATCAAATCGGCATAAAAGAAGAGTTAACCAAACCAATCCAAGGTTTATCTAATTCTA

TTTTAGATACTGCCAAAACCTTAACTTATGTTGTACAAATTGACCCAACAACAGACAA

AGGTAAACTTTCTATCGCAGATAGCTCATTTGAATTGGCAAAATCTGCTAACCAAATT

GTCTCATATATTATGGATTTATCCGGCAGCTCAAGTGAACTAAGCCATAATATTGCGA

ATACGGCTCATCAAATCTTGTCTATATCCCAAGACAGACTATTAAGCATTGGAAATAA

TATTTCTGCATTGGCAAATGCCGATAAACTCACAAAAGAAGGCGTGAAAATTATTGTA

GACAGTTCATTTGCCATCACCAGCGATGTAAATGGCTTTATCACTGATGTGGTGAAAA

CAGTAGGCAAAGACGGCAATCCTAAAGTGGGGTCAGCCCTATCATTATCCAACTCCAT

TATTGATATGGGACATTCTATCGCAAACCTAATTCAATCGGATGTTAATACAAGTAGC

GGGAAAGCGGCTATTGCAGAAGGATCAATTAAATTAATTGGCAATATTAACGGATTA

GTCAGCGATGTGTTAAGCCTTTCTAATGCCTCTACCGCCGTTTCTGAAGCTATAAGTTC

TTCTGCGGGAGGTATTTTAACTAATTTATCTTCTTTGATAGGTTCATCAATTAAACTTC

ATAATTGGTCTAATATGACCCAAGCCGATCAAATTGCAGTGGGGTTTGATATTGGATT

GAAAGCGGTAAGCACTATTGCGACAGGAGTTGGCACAACAGCACAATCCATTGCAAA

AATAATTGGTACTACTACGATGTTGCCACAAATTGGTGCTGCTGTATCAGGAATCGCT

CTGGCAGCAAGTCCGTTAGAGATAAAAGGCTTAGTTGACGAACATAAATATGTAAAA

CAAATTGATTCTCTTGCATCAGAAACAAAAACTTATGGTTATCAAGGTGATGAATTAT

TAGCCAGCCTTTTAAATGAAAAATTTGCACTTAATACCGCATATACAGCTACAGACAT

TGCTTTAAATTTAGCAACTACAGCGATCTCTGTGGCAGCAACAGCAAGTGTCATTGGT

GCACCGATTGCGGCAATTGCAGGTGTAGTGAGAGGAGCTATCGGCGGTATTATGTCGG

CGATCAAACAACCAGCATTGGAACATATTGCTAAACGTTATGTCGATCAAATTGAAAA

GTATGGTGATATTCAAAAATACTTTGATCAAAATACTGAGGCAACATTAAATAAATTC

TATGCGAGTCAGGAAGTCATTCAATCATTTTAAGCAATTACAGAAATTATATAATGTTG

ACAACATTATCACCCTTGATGGCGTTGCCAGCTCAGACAGTGCGATAGAATTAGCCGC

TATTACCAAATTAGTTGAGCAAATGAATAAAGCAAATAATTATGCTCAACTTATTCGT

AACGGTGAAATCGATAAAGCTCTCAGCGCTCAATATTTGAGTATGGATGCTAAAACGG

GCGTGTTGGAAATTACCGCACCAGGCAATTCATTAATAAAATTTAATAGTCCTCTGTTT

GCGCCGGGTGTTGAAGAAGCGCGCAGAAAAGCGGTTGGCAAAAATAATTTTTATACC

GATCTTATTATTAATGGTCCAAATGAACATACTATTAATGACGGCGCAGGTAATAATA

TTTTTATTTCTAATGATAAATATGCCTCTGTTTTATATGACGAAAATGGaAAATTATTGA

AGCATATTAACCTCAATATCAATGCCGGCGATGGAAATGATACTTATATTGCTGATAA

CGGACATTCTCTATTTAATGGAGGTAATGGAACAGATAGTGTAAGTTATAATAATGAA

CATATTCACGGCATTGTTGTTCATgGGCGAGATGCCGGTACTTATTCTGTAACaAAACA

TATTGCTGATGCAGAAGTAACTGTTGAAAATATTAAAGTGAAAAATCATCAATACGGT

AAACGACAAGAACGAGTTGAGTATAGAGAGTTACATATTGAAACAAAATCTTATGAT

GCAAGCGATATGCTTTACAACGTCGAAGTTATCAGTGCCAGTGACTATGATGATGTTA

TGTATGGTAGTAAAGGTAATGATTACTTCCTCGCACAAAATGGTAATGATCTTGTTTAT

GGTAAAGAGGGTGATGACATTATTTTCGGTGGTGCTGGTGATGATAAACTTTATGGAG

AAACCGGTAACGACACCTTAAATGGCGGTTTAGGCAAAGATTTAAtTTATGGTGGCGA

AGGAAATGATACCATTATTCAAGATGATGCTCTTAGTTCCGACACTATCTTCGGCGAT

GAAGGGATTGATACATTAGATCTTCGTCATTTAGTGATTAATGATGAAGGACTCGGTG

TTGTTGCTGATCTCCAGTCCGAGAAGCTTTATAAAGGAACCATCTTTGATCATATCTAT

GATATAGAGAATATTATAGGTACATCAGGAAATGATAACCTTATTGGAAATCATAAA

GATAATATCTTAATCGGTAATGATGGTGATGATATTTTAGAAGGCTATAGCGGTAATG

ATGTACTTGCCGGAGGAAGTGGCATAAATAAACTTTATGGCGGACAGGGAGCAGATA

TTTATCTCTTATCCACCAACGCCACAAATTATATCTTCGATCTGACAAAAAATAATTTA

GCAAAATTAGAGAATTCAGAAGATCTTAACCTTCAATTCACTAAAGATAGCGATGACA

ATGTTACCTTATCTTTCAATAAAGATGGCAATACTATCGGTAAAACCATTATAGAAAA

ATCGAGCCAATTTGGCACATTCTCAATAGGTGATGGATATTACTTAGATCTTAATGAT

GGCAAATTTAAGTATATTTTATCCGGAGAAAGCTCCAATGCCGATTTAGCTCAAAATA

CATTACAtTTTAATAAAgGTGAAGAACTTCAAGTTCATGCTGCTGCCAAGGATAACCAA

ATTATATTAGATCACGAACATCAGCATTACATTAATATTTATAGTAATACACAGACTA

ATATTAAAGGCTTTGAAGTTGGTAAAGATAAGCTGCAATTATCACTGCTCAGTAATAA

TTTAAGCTCAGACACCAAATTAAAATTCAGCGGTTATGATATTGAAGGAGGCGATGTT

AATATTACTTCCGGCAATACCTATATTACGTTGTCCGGTGCGGGGCATACAGATTATG

CGAGCAAAACATTTAATGAACTGGTCACTATGTATCTTGTT

SEQ ID No.5

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的截短型gtxA(核苷酸2848-6078)

＞gtxA nt2848-6078

CAAATCGGCATAAAAGAAGAGTTAACCAAACCAATCCAAGGTTTATCTAATTCTATTT

TAGATACTGCCAAAACCTTAACTTATGTTGTACAAATTGACCCAACAACAGACAAAGG

TAAACTTTCTATCGCAGATAGCTCATTTGAATTGGCAAAATCTGCTAACCAAATTGTCT

CATATATTATGGATTTATCCGGCAGCTCAAGTGAACTAAGCCATAATATTGCGAATAC

GGCTCATCAAATCTTGTCTATATCCCAAGACAGACTATTAAGCATTGGAAATAATATT

TCTGCATTGGCAAATGCCGATAAACTCACAAAAGAAGGCGTGAAAATTATTGTAGAC

AGTTCATTTGCCATCACCAGCGATGTAAATGGCTTTATCACTGATGTGGTGAAAACAG

TAGGCAAAGACGGCAATCCTAAAGTGGGGTCAGCCCTATCATTATCCAACTCCATTAT

TGATATGGGACATTCTATCGCAAACCTAATTCAATCGGATGTTAATACAAGTAGCGGG

AAAGCGGCTATTGCAGAAGGATCAATTAAATTAATTGGCAATATTAACGGATTAGTCA

GCGATGTGTTAAGCCTTTCTAATGCCTCTACCGCCGTTTCTGAAGCTATAAGTTCTTCT

GCGGGAGGTATTTTAACTAATTTATCTTCTTTGATAGGTTCATCAATTAAACTTCATAA

TTGGTCTAATATGACCCAAGCCGATCAAATTGCAGTGGGGTTTGATATTGGATTGAAA

GCGGTAAGCACTATTGCGACAGGAGTTGGCACAACAGCACAATCCATTGCAAAAATA

ATTGGTACTACTACGATGTTGCCACAAATTGGTGCTGCTGTATCAGGAATCGCTCTGG

CAGCAAGTCCGTTAGAGATAAAAGGCTTAGTTGACGAACATAAATATGTAAAACAAA

TTGATTCTCTTGCATCAGAAACAAAAACTTATGGTTATCAAGGTGATGAATTATTAGC

CAGCCTTTTAAATGAAAAATTTGCACTTAATACCGCATATACAGCTACAGACATTGCT

TTAAATTTAGCAACTACAGCGATCTCTGTGGCAGCAACAGCAAGTGTCATTGGTGCAC

CGATTGCGGCAATTGCAGGTGTAGTGAGAGGAGCTATCGGCGGTATTATGTCGGCGAT

CAAACAACCAGCATTGGAACATATTGCTAAACGTTATGTCGATCAAATTGAAAAGTAT

GGTGATATTCAAAAATACTTTGATCAAAATACTGAGGCAACATTAAATAAATTCTATG

CGAGTCAGGAAGTCATTCAATCATTTAAGCAATTACAGAAATTATATAATGTTGACAA

CATTATCACCCTTGATGGCGTTGCCAGCTCAGACAGTGCGATAGAATTAGCCGCTATT

ACCAAATTAGTTGAGCAAATGAATAAAGCAAATAATTATGCTCAACTTATTCGTAACG

GTGAAATCGATAAAGCTCTCAGCGCTCAATATTTGAGTATGGATGCTAAAACGGGCGT

GTTGGAAATTACCGCACCAGGCAATTCATTAATAAAATTTAATAGTCCTCTGTTTGCGC

CGGGTGTTGAAGAAGCGCGCAGAAAAGCGGTTGGCAAAAATAATTTTTATACCGATC

TTATTATTAATGGTCCAAATGAACATACTATTAATGACGGCGCAGGTAATAATATTTTT

ATTTCTAATGATAAATATGCCTCTGTTTTATATGACGAAAATGGaAAATTATTGAAGCA

TATTAACCTCAATATCAATGCCGGCGATGGAAATGATACTTATATTGCTGATAACGGA

CATTCTCTATTTAATGGAGGTAATGGAACAGATAGTGTAAGTTATAATAATGAACATA

TTCACGGCATTGTTGTTCATgGGCGAGATGCCGGTACTTATTCTGTAACaAAACATATT

GCTGATGCAGAAGTAACTGTTGAAAATATTAAAGTGAAAAATCATCAATACGGTAAA

CGACAAGAACGAGTTGAGTATAGAGAGTTACATATTGAAACAAAATCTTATGATGCA

AGCGATATGCTTTACAACGTCGAAGTTATCAGTGCCAGTGACTATGATGATGTTATGT

ATGGTAGTAAAGGTAATGATTACTTCCTCGCACAAAATGGTAATGATCTTGTTTATGG

TAAAGAGGGTGATGACATTATTTTCGGTGGTGCTGGTGATGATAAACTTTATGGAGAA

ACCGGTAACGACACCTTAAATGGCGGTTTAGGCAAAGATTTAAtTTATGGTGGCGAAG

GAAATGATACCATTATTCAAGATGATGCTCTTAGTTCCGACACTATCTTCGGCGATGA

AGGGATTGATACATTAGATCTTCGTCATTTAGTGATTAATGATGAAGGACTCGGTGTT

GTTGCTGATCTCCAGTCCGAGAAGCTTTATAAAGGAACCATCTTTGATCATATCTATGA

TATAGAGAATATTATAGGTACATCAGGAAATGATAACCTTATTGGAAATCATAAAGAT

AATATCTTAATCGGTAATGATGGTGATGATATTTTAGAAGGCTATAGCGGTAATGATG

TACTTGCCGGAGGAAGTGGCATAAATAAACTTTATGGCGGACAGGGAGCAGATATTT

ATCTCTTATCCACCAACGCCACAAATTATATCTTCGATCTGACAAAAAATAATTTAGC

AAAATTAGAGAATTCAGAAGATCTTAACCTTCAATTCACTAAAGATAGCGATGACAAT

GTTACCTTATCTTTCAATAAAGATGGCAATACTATCGGTAAAACCATTATAGAAAAAT

CGAGCCAATTTGGCACATTCTCAATAGGTGATGGATATTACTTAGATCTTAATGATGG

CAAATTTAAGTATATTTTATCCGGAGAAAGCTCCAATGCCGATTTAGCTCAAAATACA

TTACAtTTTAATAAAgGTGAAGAACTTCAAGTTCATGCTGCTGCCAAGGATAACCAAAT

TATATTAGATCACGAACATCAGCATTACATTAATATTTATAGTAATACACAGACTAAT

ATTAAAGGCTTTGAAGTTGGTAAAGATAAGCTGCAATTATCACTGCTCAGTAATAATT

TAAGCTCAGACACCAAATTAAAATTCAGCGGTTATGATATTGAAGGAGGCGATGTTAA

TATTACTTCCGGCAATACCTATATTACGTTGTCCGGTGCGGGGCATACAGATTATGCG

AGCAAAACATTTAATGAACTGGTCACTATGTATCTTGTT

SEQ ID No.6

来自鸡卡氏杆菌，菌株12656-12的全长gtxA(核苷酸1-2847)

＞gtxA nt1-2847

GTGCTTTCATTAAAAGAAAAAGTAACTGGAATAGATTTTGATGCAATCAAAGATAAA

GTCGTTTCATTAAAAAACACGGTTTCAAATATTGATTTTAATCTGGTTAAAGAAGATAT

TTCTTCTTTAAAAAGCAATGCGTTATCCATCGCGGCATCAGATTTTAAAAATAAACCG

GTGTTATTCAAAGACTCTTTAGACTTACTTACTGATGCTACAAATACACTCAGAAAGA

TTACCAATCAAATGTCATCAATTAGCGAAATTTCTAATAAGTCATTAGATTTGCTGGAT

TCTCTTTTTGAGGCTGCCAAAGATATTGTAAACATTGCCTATTCAAAAGGTGGTGTCGA

AATTACTAAGTCTGCGACAGAATTAGCGGCAAAAGCGGCATTAATTGTTGATAAAAGT

ATCATATTAGCAAATAAAGATAATACAATTAGTGAAGCTGTTTATCATTCTATTAACA

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AATGCAATTCATAATGTTACTGCGAAAAATCTACAGAATATCGAAGAGAGTGCGGTC

AATCTTGCAAATGCTGATGTGCTGTCTCAAGAAGGCAAAGTCAGTATTGCCATTAATT

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CATTAAGTCTGTTATCCGATGCAAGTAATATGTTGAAAGATATTATGCAAGGAATGAG

CCCTAATAATGTCATTGCTCCGAAAACATTAGAATTATTTAACTCACTATTTGCGACAG

CTCAAAATATCGTTCAATTAGCTGACGCAAAATCTTCAGAAAACATTGCTAAAGCTAG

TGTTGATTTGGTACAAAGCGCAACGATTATCCTCAATAACGTATTAACGTTGGCTAAC

GTTGATTCTTCTTTAAGTAAAGCTTTTCATCAATCATTTGATGCTTCAGTTTCTCAAATT

AAAGAGGTAGCAGCTCAATTAGCTACCGCGTCTTCTGCCTCTAATAAAGCTGAGATTG

CAAAACTCTCTTTTGATTTTATTAGTCAAGTAAGTGATTTAGCGACCAACACCTTAACA

ACAGCGAAAACCGGATTAGATAGCACGCTGCTGAATAACGTTAACGGTCTTTCTCATT

CCGTCTTAAATGCAGCAAAATCAGTAACCGATATTATTGTGAGTGATAACCCAGCGAA

TACCGCCAGTTTATCCGTTTCTTTGGTGAATAATGCCAATGAAATTGTTTCAAATATCT

TAACCTTATCCGGAAAACAAAATACGCTCTCCACGGCAGTACACGATGTAACCGCTAA

ACATTTAGCGCCGATTGAGAAAATAGCAATTAACCTTGCGAATGCCGATAACTCAAGC

AGTGATGGAAAAGTTGCTATTGCGTTAAACTCATTAACATTGATTGCACAAAGTAACC

ATTTAATCGAAGAAGTATTAAAAGAGGCTAAATTAGATAATGCGAAGAGCGCCTTTG

CTCACAATTTAACGGATTTAGTATTAGATACCGCCAAAACAATCACGGCATTAGCATC

AGCGGATACCAGTAAAGTAGACGGCAAGCAGCAGATTGCCTCTGCATCAACACATTTT

AGTCGGACAAATTAATGAGATTGTCAAATCAATCACGACAATAACCAATTCAGAAAC

GAAAGTCGGGCAATGCCGCATATCAAGCGTTAAAAACACATTTAGAGCAGGTAGAAAC

AATTGCGGTTAAACTTGCCGCCGCCAATGCATCAACAGCGGAAGGCAGAACAGAAAT

TGCGATTGAATCTTTCAATTTAATCGCAAAAACCAATGGCATAATGACCGATTTCCTA

AAT

实施例4：在溶血性卡氏杆菌间gtxA序列及功能是保守的

卡氏杆菌菌株间gtxA第1-950核苷酸的序列保守性

以来自菌株12656-12的gtxA nt 1-950，针对其他卡氏杆菌菌株的基因组序列草图进行BlastN。

由溶血性卡氏杆菌表达和分泌的GtxA

材料与方法

当培养细胞用于分离蛋白质时，按约1∶100稀释过夜培养物(16小时)，将OD₆₀₀值调节至0.03，且在适度通气(120rpm)下在100mL锥形瓶中于30mLBHI培养液中培养细菌。在OD₆₀₀＝0.6(±0.1)时收获处于对数生长晚期的细胞及上清液。从经过滤除菌的培养物上清液(低蛋白结合过滤器(0.22μm)(Millex

GP(Millipore))中制备细胞外蛋白质。通过添加1体积冰冷的96％乙醇使蛋白质沉淀过夜(-20℃)，通过离心(在0℃，13000g离心30分钟)收集，并将其重悬于10mM Tris(原始体积的1/100)中。通过在NuPAGE

Novex3-8％Tris-乙酸迷你凝胶(Tris-Acetate Mini Gel)中于Tris-乙酸SDS电泳缓冲液(Invitrogen)中进行SDS-PAGE来分离蛋白质(13μl)。在蛋白印迹中，将蛋白质在聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)上形成印迹。使用ApxI抗血清[24]作为一抗，并用WesternBreeze化学发光试剂盒(抗兔)(Invitrogen)检测结合的ApxI-抗体。用Geliance 600成像系统(Perkin Elmer Elmer)捕捉化学发光信号。

GtxA是鸡卡氏杆菌中的主要细胞溶解毒素

通过如上文所述(Kristensen等人，2010)的突变使基因不同的八种鸡卡氏杆菌生物变种溶血型菌株(10672-6、10T4、21K2、24T10、4895、07990和Avicor)的gtxA失活。所有突变体经证明不具有溶血性(未显示数据)，表明GtxA负责这些菌株的溶血活性。这一结果证实了GtxA在鸡卡氏杆菌中作为主要细胞溶解性毒素的作用。

gtxA负责卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因种2的溶血活性。

gtxA在卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因种2中的存在表明gtxA也负责卡氏杆菌基因种1及2的溶血活性。在卡氏杆菌基因种1和2典型菌株(CCM5974和CCM5976)中构建了gtxA突变体，且这些突变体不具有溶血性(未显示数据)，表明GtxA也负责这些种类的溶血活性。

实施例5：输出GtxA所需的I型分泌基因座(gtxEBD)的识别及表征

GtxA是细胞外蛋白质，但不同于巴斯德杆菌科的大部分RTX-毒素，其不与同源的I型分泌系统(T1SS)的组分共转录(图9)。T1SS由三种蛋白质，内膜ATP酶、内膜通道蛋白及外膜蛋白的多聚体构成，且在大肠杆菌中，分泌原型RTX-毒素α-溶血素的T1SS蛋白质分别命名为HlyB、HlyD和TolC(Holland et al.，Mol Membr Biol 2005，22：29-39)。为了识别负责输出GtxA的T1SS，用大肠杆菌HlyB及HlyD的氨基酸序列作为查询序列来搜索菌株12656-12的基因组序列。通过这方法，识别出了无明显基底的预测T1SS-操纵子，并认为其是可能用于GtxA分泌的候选者。这操纵子含有三个基因，称为gtxE、gtxB和gtxD(图9)。预测编码的蛋白质GtxE、GtxB和GtxC分别为外膜蛋白、内膜ATP酶及内膜蛋白，对应构成I型分泌系统所需的三种组分。

为了测试操纵子是否是排出GtxA所需，通过使鸡卡氏杆菌12656-12中大部分gtxB(从核苷酸位置92开始)及gtxD的开端(前123nt)缺失来构建突变体(ΔgtxBD)。

ΔgtxBD构建

为构建ΔgtxBD，产生了两个PCR片段，一个片段(951bp)用引物2870F-Xbal(5’-CTGATCTAGACGCCGTAAATCGCATAATCA-3’)(SEQ ID NO：26)和3821R-EcoRI(5’-CGAATTCCCGGCAGAAAAGGTCAACA-3’)(SEQ ID NO：27)产生，而另一片段(1233nt)用6044-SOE(TTTCTGCCGGGAATTCGGCGAATGGTGTGAGAAG-5’)(SEQ ID NO：28)和7267R-Sall(TCAAGTCGACAAGCCAAAGCCAATACGA-3’)(SEQ ID NO：29)产生。下划线标明了引物中的限制性位点。通过重叠延伸拼接PCR，用引物2870f-Xbal和7267R-Sall来连接两个PCR-片段。用SalI及XbaI消化所得的2184nt片段，用南极磷酸酶(Fermentas)进行磷酸酶-处理，经凝胶纯化，并连接至经XbaI/SalI-双重消化且经凝胶纯化的pBluescript中。经凝胶纯化来自经EcoRI-消化的pUC4-KISS的卡那霉素盒(Tn903)，并将其连接至重叠延伸拼接-片段(SOEing-fragment)中的EcoRI位点处。沿着与gtxB相同的转录放下插入卡那霉素抗性基因。通过用SalI及XbaI消化来将质粒DNA线性化并经柱纯化(GFX，Amersham)。通过如上文所述的用于流感嗜血杆菌的MIV法(Poje &Redfield，2003)诱导鸡卡氏杆菌12656-12的天然能力；简言之，使鸡卡氏杆菌12656-12在BHI中生长至OD₆₀₀值为0.2，在MIV中洗涤1次并在MIV中培养100分钟。将线性DNA以0.5μg DNA/mL的浓度添加到细胞中。在37℃培养20分钟后，添加2体积BHI并培养细菌1小时(37℃)，随后在血琼脂培养板上用4μg/mL卡那霉素选择转化子。将转化子重划线接种于含4μg/mL卡那霉素的培养板上，并通过用引物对TISS2607F(5’-TTTCCTGTAATGCCTGCT-3’)(SEQID NO：30)和TISS7572R(5’-TTTTGATCGTTCGGGCTT-3’)(SEQ ID NO：31)进行PCR并对PCR产物测序来验证缺失。

实施例6：GtxA可能不是基于完整细胞抗原的疫苗的一部分

GtxA不以可检测的量存在于细胞裂解物中，且不存在I型分泌gtxEBD时不在细胞中累积。

识别出分泌GtxA所需的I型分泌系统基因座(gtxEBD)。

在分泌突变体ΔgtxEBD(如实施例5所述构建)中，ΔgtxEBD的溶血活性与野生型相比大幅降低(参见图8A)。蛋白印迹分析显示gtxEBD缺失会造成上清液中缺少GtxA(图8B)。这些观察结果证实gtxEBD负责GtxA的输出。在野生型或ΔgtxEBD的全细胞蛋白质中未检测到GtxA，例如，不存在分泌系统时，GtxA不在细胞内测累积。在放线共生放线杆菌(白血球毒素LtxA)及大肠杆菌(α-溶血素HlyA)中对RTX-毒素分泌缺陷型突变体得到类似观察结果。在这些物种中，毒素缺少细胞内积累并非由转录改变所致，而是可能由于毒素在细胞质中快速降解所致。

实施例7：用不能表达GtxA的鸡卡氏杆菌gtxA突变体进行的感染实验

引言

已经提出细胞溶解性RTX毒素GtxA是鸡卡氏杆菌在家禽感染期间的关键毒性因子。为了证实，对产蛋鸡进行了感染实验，目的在于特性化GtxA对在感染野生型(wt)菌株及其同基因突变体ΔgtxA期间所观测到的病变的影响。

材料与方法

研究中包括总共24只禽。通过腹膜内途径试图在卵巢根部深度沉积等量的鸡卡氏杆菌来使所有禽类感染。16只禽感染鸡卡氏杆菌12656-12野生型，而16只禽感染其同基因但非溶血性且不能表达RTX GtxA的ΔgtxA突变体(Kristensen等人，2010)。

结果

从感染实验得到的结果概要。

感染野生型的禽类一般显现涉及生殖道及腹膜的散播性及化脓性炎症，这与在野外从自然鸡卡氏杆菌感染所观察到的病变相当。

感染ΔgtxA突变体的禽类一般显现局限于卵巢的较轻度炎症。在少数动物(2/8)中，接种后第48小时局限性炎症较剧烈并具有化脓性，而在接种后第6天，8只动物中有2只观察到有化脓性卵巢炎及腹膜炎。

因此可总结出GtxA在鸡中实质上促成了鸡卡氏杆菌的发病机制。

Claims

1.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下群组中的氨基酸序列

a)SEQ ID No.1、2或3；

b)选自由SEQ ID No.1、2和3构成的组的氨基酸序列的序列变异体，其中所述变异体与所述SEQ ID No.具有至少70％的序列同一性；以及

c)由a)中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，限制条件是所述序列中不超过30个所述氨基酸被如此改变。

2.如权利要求1所述的多肽，其为选自由SEQ ID No.1、2和3构成的组的序列的天然存在的等位基因变异体。

3.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含源自巴斯德杆菌科，更优选为源自卡氏杆菌属，更优选选自由鸡卡氏杆菌、卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因组2构成的组的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的多肽，其为在此描述的变异多肽，其中所选序列中指定的任一氨基酸被改变以提供保守性取代。

5.如权利要求1所述的多肽，其中所述信号肽由异源信号肽置换。

6.如权利要求1所述的多肽，其与SEQ ID No.1具有至少70％的序列同一性，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.1的序列的多肽。

7.如权利要求1所述的多肽，其与SEQ ID No.2具有至少70％的序列同一性，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.2的序列的多肽。

8.如权利要求1所述的多肽，其与SEQ ID No.3具有至少70％的序列同一性，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.3的序列的多肽。

9.如权利要求1所述的多肽，或其片段，其中所述片段包含至少150个氨基酸，优选为至少200个氨基酸，更优选为至少300个氨基酸，更优选为至少500个氨基酸，更优选为至少750个氨基酸，更优选为至少1000个氨基酸，更优选为1250个氨基酸，更优选为1500个氨基酸，更优选为1750个氨基酸，最优选为2000个氨基酸。

10.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽已经过特定修饰而移除毒性活性。

11.如权利要求1所述的多肽，其中所述变异体是具有生物活性的。

12.如权利要求11所述的多肽，其中生物活性为毒性，其中所述毒性包含在接受体内形成孔，更优选为细胞毒性，更优选为细胞溶解性细胞毒性，甚至更优选为溶血性细胞毒性。

13.如权利要求9至11所述的多肽，其中所述变异体具有免疫原性。

14.如权利要求9所述的多肽，其中所述片段与SEQ ID NO 1相比含有不超过30个氨基酸取代，更优选为不超过25个，更优选为不超过20个，更优选为不超过15个，更优选为不超过10个，更优选为不超过5个，更优选为不含氨基酸取代。

15.如前所述的权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含亲和性标签，诸如polyHis标签、GST标签、HA标签、FLAG标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合域标签、BCCP标签、钙调蛋白标签、Nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、绿色荧光蛋白标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Strep标签。

16.如权利要求15所述的多肽，其中任一亲和性标签是可切割的。

17.如权利要求1至16中任一项所述的多肽，其为失活的。

18.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽通过热或辐射而失活。

19.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽为化学失活的，优选通过暴露于甲醛而化学失活。

20.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽是SEQ ID No.1的未酰化形式。

21.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽或其任一片段具有免疫原性。

22.如前所述权利要求中任一项所述的多肽，作为药物的应用。

23.如权利要求22所述的应用，其用于治疗和/或预防性治疗由细菌感染引起的疾病、失调或任何损伤。

24.如权利要求22或23所述的应用，其中所述细菌感染是在恒温动物中。

25.如权利要求22或23所述的应用，其中所述恒温动物为禽类物种。

26.如权利要求22或23所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭科，更优选为鸭属、雁属、潜鸭属、麝鸭属、黑雁属或天鹅属；鸻形目，更优选为燕尾鸥属、噪鸥属、鸥属、白鸥属或叉尾鸥属；鹳形目，更优选为鹳科；鸽形目，更优选为鸽属、地鸠属、黄鸠属、鸡鸠属、姬地鸠属、鹑鸠属、凤冠鸠属、山鸠属、新西兰鸠属、棕翅鸠属、巨地鸠属、鹃鸠属、裸脸原鸠属、冠鸠属、小长尾鸠属、斑尾鸽属、褐果鸠属、果鸠属、印加地鸠属、斑鸠属、绿鸠属、森鸠属或哀鸽属；鸡形目，更优选为冠冢雉属、丛冢雉、雉科或松鸡亚科；鹈形目，更优选为鹈鹕科；红鹳目，更优选为红鹳科；鹦形目，更优选为凤头鹦鹉科、吸蜜鹦鹉科或鹦鹉科；鹤鸵目，更优选为鸸鹋科；美洲鸵鸟目，更优选为小美洲鸵属或大美洲鸵属；鸵形目，更优选为鸵鸟科构成的组。

27.如权利要求22或23所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭、火鸡及鸡构成的组，优选为产蛋母鸡。

28.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下群组中的核酸序列

a)SEQ ID No.4、5或6；

b)选自由SEQ ID No.4、5和6所构成的组的核苷酸的序列变异体，其中所述变异体与所述SEQ ID No.具有至少60％的序列同一性；

c)由a)中的任一者的至少450个连续核苷酸所组成的片段，其中所选序列中指定的任一核苷酸改变为不同核苷酸，限制条件是所述序列中不超过90个所述核苷酸被如此改变；

e)编码SEQ ID No.1、2或3的多肽的多核苷酸；

f)编码选自由SEQ ID No.1、2和3构成的组的氨基酸序列的序列变异体的多核苷酸，其中所述变异体与所述SEQ ID No.具有至少70％的序列同一性；以及

g)编码由SEQ ID No.1、2或3中的任一者的至少150个连续氨基酸所组成的片段的多核苷酸，其中所选序列中指定的任一氨基酸改变为不同氨基酸，限制条件是所述序列中不超过30个所述氨基酸被如此改变。

29.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含天然存在的等位基因核酸变异体的核苷酸序列。

30.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码源自卡氏杆菌属，更优选为选自由鸡卡氏杆菌、卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因组2构成的组的氨基酸序列的核酸序列。

31.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述编码的多肽与SEQ ID No.4具有至少60％的序列同一性，更优选为至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少85％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.4序列的多核苷酸。

32.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述编码的多肽具有与SEQ IDNo.5具有至少60％的序列同一性，更优选为至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少85％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.5序列的多核苷酸。

33.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述编码的多肽具有与SEQ IDNo.6具有至少60％的序列同一性，更优选为至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少85％，更优选为至少98％，更优选为具有所述SEQ ID No.6序列的多核苷酸。

34.如权利要求28至33中任一项所述的多核苷酸，其经最优化以在大肠杆菌中表达。

35.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，作为药物的应用。

36.如权利要求35所述的应用，其用于治疗和/或预防性治疗由细菌感染引起的疾病、失调或任何损伤。

37.如权利要求35或36所述的应用，其中所述细菌感染是在恒温动物中。

38.如权利要求35或36所述的应用，其中所述恒温动物为禽类物种。

39.如权利要求35或36所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭科，更优选为鸭属、雁属、潜鸭属、麝鸭属、黑雁属或天鹅属；鸻形目，更优选为燕尾鸥属、噪鸥属、鸥属、白鸥属或叉尾鸥属；鹳形目，更优选为鹳科；鸽形目，更优选为鸽属、地鸠属、黄鸠属、鸡鸠属、姬地鸠属、鹑鸠属、凤冠鸠属、山鸠属、新西兰鸠属、棕翅鸠属、巨地鸠属、鹃鸠属、裸脸原鸠属、冠鸠属、小长尾鸠属、斑尾鸽属、褐果鸠属、果鸠属、印加地鸠属、斑鸠属、绿鸠属、森鸠属或哀鸽属；鸡形目，更优选为冠冢雉属、丛冢雉、雉科或松鸡亚科；鹈形目，更优选为鹈鹕科；红鹳目，更优选为红鹳科；鹦形目，更优选为凤头鹦鹉科、吸蜜鹦鹉科或鹦鹉科；鹤鸵目，更优选为鸸鹋科；美洲鸵鸟目，更优选为小美洲鸵属或大美洲鸵属；鸵形目，更优选为鸵鸟科构成的组。

40.如权利要求35或36所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭、火鸡及鸡构成的组，优选为产蛋母鸡。

41.包含权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸的载体。

42.如权利要求41所述的载体，其进一步包含有效连接至所述多核苷酸的启动子。

43.如权利要求41或42所述的载体，其中所述启动子选自由原核启动子所构成的组。

44.如权利要求43所述的载体，其中所述启动子包含转录起始位点及RNA聚合酶结合位点。

45.如权利要求43所述的载体，其中所述启动子包含Pribnow盒或其部分。

46.如权利要求43所述的载体，其中所述启动子包含-35元件或其部分。

47.如权利要求41或42所述的载体，其中所述启动子选自由真核启动子所构成的组。

48.如权利要求47所述的载体，其中所述启动子包含转录起始位点及RNA聚合酶结合位点。

49.如权利要求47所述的载体，其中所述启动子包含TATA盒。

50.如权利要求47所述的载体，其中所述启动子包含至少一个任一真核转录因子的结合位点。

51.如权利要求41或42所述的载体，所述载体为病毒载体或质粒载体。

52.如权利要求51所述的载体，所述质粒载体为真核质粒载体或原核质粒载体。

53.如权利要求41或42所述的载体，所述载体选自由源自包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV和CIV的逆转录病毒科的载体构成的组。

54.如权利要求41或42所述的载体，选自由α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV的载体构成的组，优选为腺相关病毒。

55.如权利要求41至54中任一项所述的载体，作为药物的应用。

56.如权利要求41至54中任一项所述的载体，其用于治疗和/或预防性治疗由细菌感染引起的疾病、失调或任何损伤。

57.如权利要求55或56所述的应用，其中所述细菌感染是在恒温动物中。

58.如权利要求55或56所述的应用，其中所述恒温动物为禽类物种。

59.如权利要求55或56所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭科，更优选为鸭属、雁属、潜鸭属、麝鸭属、黑雁属或天鹅属；鸻形目，更优选为燕尾鸥属、噪鸥属、鸥属、白鸥属或叉尾鸥属；鹳形目，更优选为鹳科；鸽形目，更优选为鸽属、地鸠属、黄鸠属、鸡鸠属、姬地鸠属、鹑鸠属、凤冠鸠属、山鸠属、新西兰鸠属、棕翅鸠属、巨地鸠属、鹃鸠属、裸脸原鸠属、冠鸠属、小长尾鸠属、斑尾鸽属、褐果鸠属、果鸠属、印加地鸠属、斑鸠属、绿鸠属、森鸠属或哀鸽属；鸡形目，更优选为冠冢雉属、丛冢雉、雉科或松鸡亚科；鹈形目，更优选为鹈鹕科；红鹳目，更优选为红鹳科；鹦形目，更优选为凤头鹦鹉科、吸蜜鹦鹉科或鹦鹉科；鹤鸵目，更优选为鸸鹋科；美洲鸵鸟目，更优选为小美洲鸵属或大美洲鸵属；鸵形目，更优选为鸵鸟科构成的组。

60.如权利要求55至56所述的应用，其中所述禽类物种选自由鸭、火鸡及鸡构成的组，优选为产蛋母鸡。

61.一种分离的宿主细胞，其经如所述权利要求41至54中任一项中的所述载体转化或转导。

62.如权利要求61所述的宿主细胞，选自由大肠杆菌、酵母菌属、毕赤酵母属、曲霉属、Sf9昆虫细胞构成的组；更优选为CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b或BHK细胞。

63.能够生产权利要求53或54中任一项的传染性病毒粒子的包装细胞系。

64.一种抗体，其能够特异性结合至具有选自以下群组中的氨基酸序列的分离的多肽

a)SEQ ID No.1、2或3；

65.如权利要求64所述的抗体，其中所述抗体为禽类抗体，优选为鸡抗体。

66.如权利要求64所述的抗体，其中所述抗体为多克隆、血清源性抗体或单克隆或重组抗体。

67.如权利要求64所述的抗体，其中抗体包含抗体的抗原结合片段诸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F(ab)₂，多聚形式诸如二聚IgA分子或五价IgM，亲和抗体或双价抗体。

68.一种使权利要求1至21中任一项所述的分离的多肽失活的方法，其中所述方法包含使用热或化学品，优选为甲醇，或其中所述方法包含以未酰化形式表达所述多肽。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述失活的多肽具有免疫原性。

70.一种疫苗组合物，包含权利要求1至21中任一项所述的分离的多肽。

71.一种疫苗组合物，包含权利要求28至34中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸以裸DNA或以载体形式使用。

72.如权利要求70和71所述的疫苗组合物，进一步包含一种或多种适合的佐剂、赋形剂、乳化剂或载体。

73.如权利要求70和71所述的疫苗组合物，进一步包含来自对权利要求26所述的禽类物种具病原性的病毒或微生物的至少一种其他抗原。

74.如权利要求73所述的疫苗组合物，其中所述病毒或微生物选自由传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡贫血因子、禽类呼肠孤病毒、禽肺炎病毒、鸡痘病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡败血支原体、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴斯德菌和大肠杆菌构成的组。

75.如权利要求70所述的疫苗组合物，其中所述多肽与SEQ ID No.1的未酰化形式相同。

76.如权利要求70所述的疫苗组合物，其中所述多肽或其任何片段具有免疫原性。

77.如权利要求70和71所述的疫苗组合物，进一步包含活的、减毒的鸡卡氏杆菌。

78.一种将权利要求70至77中任一项所述的疫苗施与权利要求26所述的禽类物种的方法，其中所述疫苗通过肌肉内或皮下注射，透过例如食物或水口服，气雾剂，在例如足或翼部划痕，滴眼剂或经卵内投药来施用。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述禽类物种接种疫苗至少一次，诸如至少两次，例如至少三次。

80.如权利要求78和79中任一项所述的方法，其中各疫苗剂量每剂含有每千克体重约1μg至每千克体重约1000μg的蛋白质，优选为每剂每公斤体重约10μg至每公斤体重约100μg。

81.如权利要求78和79中任一项所述的方法，其中，其中疫苗的各单位剂量为约0.1ml至约2ml，诸如约0.25ml至约1ml，例如约0.5ml。

82.如权利要求1至21所述的多肽，作为诊断性标记的应用。

83.一种诊断禽类物种的病原性细菌卡氏杆菌感染的方法，所述方法包含检测权利要求1至9中任一项所述的多肽，检测针对所述多肽的抗体，或检测权利要求28至33中任一项的多核苷酸。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述病原性细菌是来卡氏杆菌属，更优选为选自由鸡卡氏杆菌、卡氏杆菌基因种1及卡氏杆菌基因组2构成的组。

85.如权利要求83所述的方法，其中所述方法包含针对所述多肽的抗体的检测，优选其中所述抗体为IgA。

86.一种检测权利要求1至9所述的多肽的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种能够结合所述多肽的结合蛋白，所述结合蛋白连接至固体支持物。

87.如权利要求86所述的试剂盒，所述试剂盒包含另一结合蛋白，其中一种结合蛋白连接至可检测部分。

88.如权利要求86所述的试剂盒，其中所述固体支持物为微粒。

89.如权利要求86所述的试剂盒，其中所述结合蛋白是针对权利要求1至9中任一项所述的多肽的抗体。

90.如权利要求86所述的试剂盒，其中所述试剂盒能够检测所述多肽的量。

91.一种检测针对权利要求1至9中任一项所述的多肽的抗体的试剂盒，其中所述试剂盒包含已固定至固体表面的所述多肽。

92.如权利要求91所述的试剂盒，其中所述抗体为IgA型。

93.一种转基因敲除微生物，其中内源基因已被破坏而消除功能性gtxA的表达和/或分泌，且其中所述微生物所展现的致病性相对于同一种类的野生型微生物而言有所降低。

94.如权利要求93所述的微生物，其中所述微生物为鸡卡氏杆菌。

95.如权利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxA基因已被破坏。

96.如权利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxBD基因已被破坏。