JP2023093566A - Ｒｓｖ ｇを発現する組換えキメラウシ／ヒトパラインフルエンザウイルス３およびその使用法 - Google Patents

Abstract

【課題】呼吸器多核体ウイルス（RSV）Gタンパク質または組換えRSVGタンパク質を発現する組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）ベクター、その使用ならびに製造の方法を提供する。【解決手段】rB/HPIV3ベクターは、RSVGタンパク質または組換えRSVGタンパク質をコードする異種遺伝子を含むゲノムを含む。開示されたrB/HPIV3ベクターのゲノムまたはアンチゲノムの配列を含む核酸分子も提供される。開示されたrB/HPIV3ベクターは、例えば、対象におけるRSVおよびHPIV3に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる2017年5月29日に出願された米国仮出願第62/512,111号に基づく恩典を主張する。

分野
本開示は、呼吸器多核体ウイルス（RSV）Gタンパク質または組換えRSV Gタンパク質を発現する組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）ベクター、ならびに、例えば、対象におけるRSVおよびHPIV3に対する免疫応答を誘導するための、rB/HPIV3ベクターの使用に関する。

共同研究契約の当事者
本発明は、National Institute of Allergy and Infectious Disease at the National Institutes of HealthとSanofi Pasteur,Incとの間のPublic Health Service Cooperative Research and Development Agreement（PHS-CRADA）No.2013-0810の下で作成された。

背景
RSVは、ニューモウイルス（Pneumoviridae）科オルトニューモウイルス（Orthopneumovirus）属の、エンベロープを有する非分節型マイナス鎖RNAウイルスである。それは、生後1年未満の子供における細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。RSVは、重症下気道疾患を含む反復感染も引き起こし、それは、任意の年齢で起こり得るが、特に、高齢者、または心臓、肺、もしくは免疫系が損なわれた者において起こり得る。特に、早産児、気管支肺異形成症を有する乳児、または先天性心疾患を有する乳児において、RSV感染によって引き起こされる重症疾病を防止するため、受動免疫が現在使用されている。ある種の集団におけるRSV感染の負荷にも関わらず、有効なRSVワクチンの開発は、達成困難なままである。

パラインフルエンザウイルス（PIV）は、近縁のパラミクソウイルス科に属する近縁のエンベロープを有する非分節型マイナス鎖RNAウイルスである。PIVには、（PIV1、PIV3、センダイウイルスを含む）レスピロウイルス（Respirovirus）属および（PIV2、PIV4、PIV5を含む）ルブラウイルス（Rubulavirus）属のメンバーが含まれる。ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV、セロタイプ1、2、および3）は、世界中の乳児および子供における重症呼吸器感染のRSVに次ぐ原因であり、HPIV3が、疾患の影響に関して、HPIVの中で最も重要である。HPIV3ゲノムは、およそ15.5kbであり、3'-N-P-M-F-HN-Lという遺伝子の順序を有する。各遺伝子は、主要なタンパク質：N、核タンパク質；P、リン酸化タンパク質；M、マトリックスタンパク質；F、融合糖タンパク質；HN、赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク質；L、大きいポリメラーゼタンパク質をコードする別々のmRNAをコードしており、P遺伝子は、補助的なCタンパク質およびVタンパク質をコードする付加的なオープンリーディングフレームを含有している。RSVと同様に、有効なHPIVワクチンの開発は、達成困難なままである。

RSVおよびHPIV3に対する小児ワクチンの開発における主要な課題には、乳児期の免疫系の未熟さ、移行抗体による免疫抑制、気道の表層上皮における非効率的な免疫防御、ならびにウイルスによって感作されていないレシピエントにおけるRSVおよびHPIV3の不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンによる研究において観察された、ワクチンによって誘導される疾患の増強が含まれる。さらに、RSV抗原（RSV Fタンパク質）を発現する生弱毒化rB/HPIV3ベクターの過去の研究は、ワクチン使用のためには不十分であると見なされる、RSVに対する期待外れの免疫原性を明らかにした。

従って、実質的な努力にも関わらず、特に、小児対象において、RSVおよびHPIV3に対する防御免疫応答を誘導する安全かつ有効な免疫原が、未だに必要とされている。

概要
RSV Gまたはそのバリアントを発現する組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）ベクター（「rB/HPIV3-RSV G」ベクター）が、本明細書中に提供される。開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターは、3'から5'へ順に、3'リーダー領域、BPIV3 N遺伝子、異種遺伝子、BPIV3 P遺伝子およびM遺伝子、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、BPIV3 L遺伝子、ならびに5'トレーラー領域を含むゲノムを含む。異種遺伝子は、（a）RSV G外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む、RSV Gタンパク質；（b）RSV G外部ドメイン、BPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびBPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；（c）RSV G外部ドメイン、HPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；または（d）RSV G外部ドメイン、HPIV1 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV1 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質：のうちの一つをコードする。HPIV3 HN遺伝子は、263Tおよび370Pのアミノ酸割り当てを含むHPIV3 HNタンパク質をコードする。本明細書中に開示されたrB/HPIV3は、感染性であり、弱毒化されており、かつ自己複製性であり、RSVおよびHPIV3に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。

いくつかの態様において、野生型（wt）RSV Gタンパク質または組換えRSV Gタンパク質をコードする異種遺伝子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されていてよい。

開示されたウイルスの発現に関する方法および組成物も、本明細書中に提供される。例えば、記載されたウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子が、開示される。

rB/HPIV3-RSV Gを含む免疫原性組成物も、提供される。組成物は、アジュバントをさらに含んでいてもよい。有効量の開示されたrB/HPIV3-RSV Gを対象へ投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法も、開示される。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、例えば、1～6ヶ月齢または1～12ヶ月齢または1～18ヶ月齢またはそれ以上のヒト対象である。

本開示の上記およびその他の特色および利点は、添付の図面に関して進行する、いくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明白になるであろう。

rB/HPIV3-RSV GベクターのrB/HPIV3ゲノムおよび付加されたRSV G遺伝子のマップ、ならびにベクターに含まれる修飾型RSV Gタンパク質の図および特色。（図1A）rB/HPIV3遺伝子マップおよびGタンパク質の図。rB/HPIV3遺伝子マップが上に示され、2列目は、示されたAscI部位（下線）を使用してベクターのN遺伝子とP遺伝子との間の2番目の遺伝子の位置に挿入されたRSV A2株G遺伝子に隣接する配列の詳細を示す。N GE：BPIV3 N遺伝子由来の遺伝子終結シグナル：P GS：BPIV3 P遺伝子由来の遺伝子開始シグナル；M48：オルタナティブな翻訳開始部位として機能することができるRSV Gオープンリーディングフレーム（ORF）のAUGコドン48；CX3C（Gアミノ酸182～186）：RSV株の間で保存されているフラクタルカインモチーフ；G ORFのTGA終止コドンは、太字で示され、下線が引かれている。付加的なTAG終止コドンは、下に***が付けられており、***で示されたGタンパク質インサートに含まれていた：このトリヌクレオチドは、「ルールオブシックス（rule of six）」に適合するよう、配列の長さを調整する必要がある時に付加された（Kolakofsky Virology 498:94-98,2016を参照すること）。（i）wt G、未修飾野生型RSV G；（ii）分泌型G（sG）の発現を消失させるM48I変異のため、膜貫通型RSV G（mG）のみを発現するmG；（iii）ORFがM48コドンから開始するよう、最初の47コドンが欠失しているため、sGのみを発現するsG；（iv）RSV Gの細胞質テール（CT）がBPIV3 HNのCTに交換されたG_B3CT；（v）RSV Gの膜貫通ドメイン（TM）およびCTがBPIV3 HNのTMおよびCTに交換されたG_B3TMCT；（vi）（CX3Rを与える）CX3Cモチーフを消失させるC186R変異を有するG_dCX3C；（vii）（CX3ACを与える）CX3Cモチーフを消失させるためのA186の付加を有するG_wCX4C；（viii）CX3Cモチーフを消失させるC186R変異を有し、BPIV3 HNのCTを保持しているG_dCX3C_B3CT；（ix）CX3Cモチーフを消失させるC186R変異を有し、BPIV3 HNのTMおよびCTを保持しているG_dCX3C_B3TMCT；（x）wt G/GS-opt、GenScriptによってコドン最適化されたwt G：を含む、RSV Gタンパク質構造のいくつかの図が示される。（図1B）wt RSV Gタンパク質（上）；ならびにRSV Gの以下の修飾バージョン：mG、sG、G_B3CT、およびG_B3TMCT；ならびにwt BPIV3 HN（カンザス株）およびwt HPIV3 HN（JS株）のTMドメインおよびCTドメインのアミノ酸配列。配列は、アミノ酸66におけるG外部ドメインの開始によって整列化された。推定されるCT、TM、および外部ドメインは、破線によって境界が示され、BPIV3 HN配列は、四角で囲まれている。sGのN末端は、一次翻訳産物のものであり、それは、その後、タンパク質分解によってトリミングされ、優勢なN66におけるN末端、または副次的なI75におけるN末端を与えることに注意すること。（図1C）wt Gタンパク質の未修飾CX3Cモチーフ（1列目、タンパク質配列（SEQ ID NO:41）およびヌクレオチド配列（SEQ ID NO:42）を示す）、C186Rミスセンス変異によってCX3Cモチーフが破壊されているdCX3Cバージョン（中央列、タンパク質配列（SEQ ID NO:43）およびヌクレオチド配列（SEQ ID NO:44）を示す）、ならびにコドン185の後のアラニンコドンの付加によってCX3Cモチーフが破壊されているwCX4Cバージョン（最下列、タンパク質配列（SEQ ID NO:45）およびヌクレオチド配列（SEQ ID NO:46）を示す）の配列。保存されているシステイン残基は、太字で示され；dCX3CおよびwCX4Cの変異させられたヌクレオチドには、下線が引かれている。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図2A～2D。Vero細胞においてrB/HPIV3-RSV Gベクターから発現された修飾型RSV Gタンパク質のウエスタンブロット分析。Vero細胞に、それぞれ、1細胞当たり10 TCID₅₀または3 PFUのMOIで、示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターまたはwt RSVを感染させた。二つ組の培養物から、感染後24時間目（h.p.i.）に、細胞を分析のために採集し、48 h.p.i.において、上層の細胞培養培地上清を分析のために採集した。変性還元条件下でのゲル電気泳動、その後のRSVおよびHPIV3に対して別々に産生された抗血清、その後の赤外蛍光色素にコンジュゲートされた二次抗体によるウエスタンブロッティングによって、細胞および培養上清を別々に分析し、完全グリコシル化90～120kDa RSV Gタンパク質の大きい優勢なバンドの相対レベルを、Odysseyイメージングシステム（LiCor）を使用して、濃度測定分析によって定量化した。（図2A）感染細胞由来のタンパク質のウエスタンブロット。上パネル：左のバーは、RSV Gの完全グリコシル化型および部分グリコシル化型（それぞれ、上のバーおよび下のバー）を示し、レーン11は、wt RSVによって発現されたRSV Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質をさらに示す。中央パネル：BPIV3 Nタンパク質。下パネル：負荷対照として使用されたGAPDHタンパク質。（図2B）GAPDHシグナルを使用して較正され、1.0として設定されたwt G（レーン2）に対して正規化された、LiCor Image Studioソフトウェアを使用した濃度測定によってパートAにおける実験から定量化された完全グリコシル化（90～120kDa）RSV Gの相対レベル。（図2C）細胞培養培地上清におけるGタンパク質のウエスタンブロット。（図2D）wt Gに対して正規化された、図2Cからの完全グリコシル化Gタンパク質の相対レベル。 図3Aおよび3B。LLC-MK2細胞におけるrB/HPIV3-RSV GベクターからのRSV G発現のウエスタンブロット分析。LLC-MK2細胞に、図2Aにおいて記載されたように、示されたrB/HPIV3-RSV G構築物またはwt RSVを感染させた。図2Aおよび2Bにおいて記載されたように、細胞を24h.p.i.において採集し、RSVおよびHPIV3に対して別々に産生された抗血清によるウエスタンブロット分析に供した。（図3A）RSV G（上パネル）、BPIV3 N（中央パネル）、および負荷対照としてのGAPDH（下パネル）の発現を示すウエスタンブロット。（図3B）図3Aから定量化され、1.0としてのwt G（レーン2）に対して正規化された完全グリコシル化（90～120kDa）RSV Gの相対レベル。 図4Aおよび4B。rB/HPIV3-RSV Gからの修飾型RSV Gタンパク質の発現を特徴決定する二重染色プラークアッセイ。示された修飾型Gタンパク質を発現するrB/HPIV3構築物を、24穴プレートにおいてVero細胞単層上に10倍希釈系列で接種し、メチルセルロースを重層して6日間インキュベートした。単層を80％メタノールで固定し、示された一次抗体によって、続いて、赤外色素にコンジュゲートされた二次抗体によって分析した。（図4A）HPIV3およびRSVに対して別々に産生されたウサギ抗血清ならびにRSVに対するヤギ過免疫血清（ab20531、Abcam）によって探索されたプラークの画像：単独のHPIV3抗原は緑色として、単独のRSV Gタンパク質は赤色として、共発現は黄色として可視化された。（図4B）同一のHPIV3特異的ウサギ過免疫血清およびCX3Cドメインに特異的なRSV G mAb 131-2Gによって探索されたプラークの画像：単独のHPIV3抗原は緑色として、単独の131-2Gエピトープを含有しているRSV Gは赤色として、共発現は黄色として可視化された。 図5Aおよび5B。精製されたrB/HPIV3-RSV G粒子のウエスタンブロット分析によるRSV Gパッケージング効率の定量化。LLC-MK2細胞およびVero細胞に、それぞれ、0.01 TCID₅₀の示されたrB/HPIV3-RSV G構築物または0.1 PFUのwt RSVを感染させた。培養物を4日目に採集し、清澄化された細胞培養培地上清を、不連続30％/60％w/vショ糖勾配での遠心分離に供した。精製されたビリオンをショ糖界面から採集し、遠心分離によってペレット化した。およそ4μgの各ウイルスを、変性還元条件下でのゲル電気泳動に供した。ウエスタンブロットを調製し、RSVおよびHPIV3に対して別々に産生された抗血清によって分析した。（図5A）空のrB/HPIV3ベクター（レーン1）、wt RSV Gを発現するベクター（レーン2）、示された修飾型RSV Gを発現するベクター（レーン3～5）、およびwt RSV（レーン6）のウエスタンブロット。上パネルは、ポリクローナルRSV抗体によって探索され、レーン5において明白なGの完全グリコシル化90～120kDa型、ならびに以前に記載されたような（Corry et al.,J.Virol.90:1311-1320,2015）Vero細胞でしばしば観察されるGのより小さい広いバンド（およそ48～62kDa）を含む、RSV構造タンパク質Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、およびGタンパク質（レーン6）を示している。下パネルはBPIV3 Nタンパク質を示す。（図5B）図5Aの定量化に基づく、1.0としてのwt G（レーン2）に対して正規化されたRSV Gパッケージング効率。 図6A～6L。免疫金標識による透過型電子顕微鏡法（TEM）による、ビリオンにパッケージングされたRSV Gのイメージング。図5において記載された調製物から精製されたビリオンを、（CX3Cドメインに対して特異的な）G特異的マウスMAb 131-2Gおよび10nm金粒子にコンジュゲートされたポリクローナルヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。wt RSV（図6Aおよび6B）、wt RSV Gを発現するrB/HPIV3ベクター（図6Cおよび6D）、sGのみを発現するrB/HPIV3ベクター（図6Eおよび6F）、BPIV3 HNのCTを含むキメラRSV Gを発現するrB/HPIV3ベクター（図6Gおよび6H）、BPIV3 HNのTMおよびCTを含むキメラRSV Gを発現するrBHPIV3ベクター（図Iおよび6J）、ならびに空のrB/HPIV3ベクター（図6Kおよび6L）について、選択された代表的なビリオン画像が示される。 図6－１の説明を参照のこと。 図6－１の説明を参照のこと。 図6－１の説明を参照のこと。 図6－１の説明を参照のこと。 図6－１の説明を参照のこと。 図6－１の説明を参照のこと。 図7Aおよび7B。ハムスターの上気道および下気道におけるrB/HPIV3-RSV Gベクターの複製。6匹の群のハムスターに、10⁵ TCID₅₀のベクターまたは10⁶ PFUのwt RSVを鼻腔内（IN）感染させた。鼻甲介および肺を、免疫後5日目に収集し、均質化した。鼻甲介（図7A）および肺（図7B）におけるベクターの力価を、LLC-MK2細胞におけるTCID₅₀赤血球吸着アッセイによって決定した。TCID₅₀の検出限界は、破線として示される。平均力価および平均値の標準誤差（SEM）が、エラーバーと共に水平の線として示される。本研究において、全ての群の間の平均力価の差の統計的有意性が、一元配置のANOVA、その後のチューキー・クレーマー（Tukey-Kramer）検定を使用して分析された。同一の文字（AまたはB）によって示された2群の平均力価は、統計的に異なっていない。 図8A～8E。免疫されたハムスターにおけるrB/HPIV3-RSV Gベクターおよびwt RSVによって誘導されたRSVおよびHPIV3を中和する血清抗体の力価。6匹の群のハムスターに、10⁵ TCID₅₀の示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターまたは10⁶ PFUのwt RSVをIN感染させた。免疫後28日目に血清を収集した。血清中和力価をVero細胞単層における60％プラーク低下中和アッセイ（PRNT₆₀）によって決定した。比較のため、（本質的に同様に実施された別の実験からの）未修飾wt RSV Fを発現するベクターによって同一の用量で免疫されたハムスターの群からの血清を、RSV中和アッセイに含めた。wt RSV、補体あり（図8A）、HPIV3、補体あり（図8B）、サブグループBのRSV B1、補体あり（図8C）、RSV CX3C変異体（CWAIS）、補体あり（図8D）、およびwt RSV、補体なし（図8E）に対する中和力価が示される。検出限界は、破線によって示される。各ドットは、個々の動物の力価を表す。バーは、群の平均力価を示し；エラーバーはSEMを表す。各アッセイにおける全ての群の間の平均力価の差の統計的有意性は、一元配置のANOVA、その後のチューキー・クレーマー検定を使用して分析された。同一の文字（A、B、C、またはD）によって示された平均力価は、統計的に異なっていない。図8Aにおいては、スチューデントt検定が、2つの示された群（2および12）の間で実施され、差の有意性がP値として示される。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～9D。免疫されたハムスターのwt RSV A2チャレンジに対する防御。6匹の群のハムスターを、図8において記載されたように、10⁵ TCID₅₀の示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターまたは10⁶ PFUのwt RSVによってIN免疫し、31日後に、10⁶ PFUのwt RSVによってINチャレンジした。チャレンジ後3日目に、動物を屠殺し、Vero細胞におけるプラークアッセイによって、（図9A）鼻甲介（NT）および（図9B）肺のホモジネートにおいて、ウイルス力価を決定した。検出限界は、破線によって示される。各ドットは、個々の動物の力価を表す。平均力価は、短い水平のバーとして示される。全ての群の間の平均力価の差の統計的有意性は、一元配置のANOVA、その後のチューキー・クレーマー検定を使用して分析された。同一の文字（A、B、C、またはD）によって示された群の平均力価は、統計的に異なっていない。図9Cおよび9Dにおいては、鼻甲介（図9C）および肺（図9D）における個々の動物についてのRSVチャレンジウイルス力価が、（図8Aからの）ベクター免疫後28日目に収集された補体依存性血清RSV中和抗体の対応する力価に対してプロットされた。実線によって示された中和力価（Log2PRNT60）とウイルス力価（Log10PFU/g）との相関を示すため、ピアソンの線形回帰モデル（統計ソフトウェアPrism 7.0）が使用された。R2乗値は、NTについて0.45、肺について0.51であった：R2乗値は、データがモデルにどの程度適合するかを示す（値は0～1の範囲であり、より大きい値は、適合の増加を示す）。点線は95％信頼区間を示す。 図９－１の説明を参照のこと。 図10A～10D。ヒト翻訳のためにコドン最適化されたG ORFを保持するB/HPIV3ベクター（図1Aの構築物（x）またはwt G/GS-opt）からのGタンパク質の発現。wt GまたはwtG/GS-optを発現するrB/HPIV3ベクターに感染したLLC-MK2細胞およびVero細胞におけるGタンパク質の蓄積を、ウエスタンブロット分析によって評価した（図10Aおよび10B）。LLC-MK2細胞（10A）およびVero細胞（10B）に、それぞれ、1細胞当たり10 TCID₅₀または3 PFUのMOIで、示されたrB/HPIV3-RSV-Gベクターまたはwt RSVを感染させた。感染後24時間目に、細胞を採集し、溶解物を調製し、変性還元条件下でのゲル電気泳動、その後のRSVに対して産生された抗血清、その後の赤外蛍光色素にコンジュゲートされた二次抗体によるウエスタンブロットによって分析し、結合した抗体をOdysseyイメージングシステム（LiCor）を使用して可視化した。ウエスタンブロット分析におけるバンド強度の定量化は、RSV G発現が、コドン最適化によって、LLC-MK2細胞において2.3倍増加し（図10C）、Vero細胞において2.2倍増加することを示した（図10D）。 免疫されたハムスターにおけるコドン最適化されたG ORFまたは最適化されていないG ORFを発現するrB/HPIV3-RSVGベクターによって誘導されたRSV中和血清抗体力価。9匹の群のハムスターに、10⁴ TCID₅₀の示されたrB/HPIV3-RSV Gベクター（レーン1～4）または10⁶ PFUのwt RSV（レーン5）をIN感染させた。血清を免疫後28日目に収集した。血清中和力価を、添加された補体の存在下で、Vero細胞単層における60％プラーク低下中和アッセイ（PRNT₆₀）によって決定した。補体が添加された場合のwt RSVに対する中和力価が示される。レーン1、空のrB/HPIV3ベクター；レーン2、wt F、未修飾の野生型RSV F、具体的には、特許出願（PCT/US2016/014154）および以前の公開（Lian,et al.,J.Virol.89:9499-9510,2015）に記載された「非HEK/非opt」構築物；レーン3、wt G、A2株の野生型RSV G；レーン4、wt G/GS-opt、レーン3のwt G構築物と同一のアミノ酸配列を有するGenScriptによって最適化されたA2株の野生型G；レーン5、wt RSV、対照としての野生型RSV A2。検出限界は、破線によって示される。各ドットは、個々の動物の力価を表す。水平の線は、群の平均力価を示す。各アッセイにおける全ての群の間の平均力価の差の統計的有意性は、独立両側スチューデントt検定を使用して分析された：*は、P＜0.05を示す；ns＝非有意。 図12A～12B。示されたrB/HPIV3-RSV-GベクターまたはRSV-Fベクターまたはwt RSVを以前に感染させたハムスターにおけるwt RSVチャレンジの複製。図11の感染ハムスターを、30日後に、両方の鼻孔において、100ulの全体積で、10⁶ PFUのwt RSVによって鼻腔内チャレンジした。鼻甲介（NT）および肺を、チャレンジ後3日目に収集し、均質化した。鼻甲介（図12A）および肺（図12B）におけるRSVの力価を、Vero単層におけるプラークアッセイによって決定した。水平の線は、その群における力価の平均値を示す。検出限界は、破線によって示される。 一次分化粘液線毛ヒト気道上皮（HAE）組織のインビトロモデルにおけるRSV-GFP感染を阻止する血清RSV中和抗体の能力の評価。RSV-GFPのアリコートを、図7および8に示された実験からの示されたハムスター血清と共に、添加された補体の非存在下で、37℃で30分間インキュベートし、次いで、HAE培養物に接種した（1試料当たり1ウェル）。37℃で60分の後、接種原を除去し、培養物を48時間インキュベートした。感染細胞のGFP焦点を画像化し、定量化し、二つ組の各セットの平均値を計算した。有意差を独立t検定によって同定した：**は、P＜0.01を示す；ns＝非有意。

配列表
添付の配列表にリストされた核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R.1.822において定義される標準的なヌクレオチド塩基のための文字略語およびアミノ酸のための3文字コードを使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、示された鎖の言及によって、相補鎖も含まれるものと理解される。配列表は、参照によって本明細書中に組み入れられる、2018年5月5日に作成された「Sequence.txt」という名前のファイル（およそ256kb）の形態でASCIIテキストファイルとして提出される。

詳細な説明
RSVおよびHPIV3に対する小児ワクチンの開発における主要な課題は、乳児期の免疫系の未熟さ、移行抗体による免疫抑制、気道の表層上皮における非効率的な免疫防御、ならびにウイルスによって感作されていないレシピエントにおけるRSVおよびHPIV3の不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンによる研究において観察された、ワクチンによって誘導される疾患の増強が含まれる（Kim et al.,Amer.J.Epidemiol.89:422-434,1969；Ottolini et al.,Viral Immunol.13:231-236,2000；Schneider-Ohrum et al.,J.Virol.91:e02180-16,2017）。さらに、RSV抗原（未修飾のRSV Fタンパク質）を発現する生弱毒化rB/HPIV3ベクターによる免疫は、ワクチンによって誘導される疾患の増強をプライムしなかったが、臨床試験における査定は、期待外れのRSVの免疫原性を明らかにした（Bernstein,et al.2012.Pediatric Infectious Disease Journal 31:109-114）。従って、実質的な努力にも関わらず、RSVおよび/またはHPIV3に対する防御免疫応答を誘導する有効な免疫原が、未だに必要とされている。

本開示は、前述の必要を満たすRSV Gまたはそのバリアントを発現する組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）ベクター（「rB/HPIV3-RSV G」ベクター）を提供する。例えば、実施例に記載されるように、9種の異なるrB/HPIV3-RSV Gベクターのうち、1種のベクター（wt RSV Gをコードする異種遺伝子を含むrB/HPIV3）は、RSVが10倍高い用量で投与され、弱毒化されておらず、F中和抗原およびG中和抗原の両方を保持していたにも関わらず、wt RSV感染によって誘導されたものと有意に異ならない、補体の存在下でアッセイされた血清RSV中和抗体の力価を提供する、RSVに対する免疫応答を、動物モデルにおいて生じた。

I.用語の概要
他に注記されない限り、技術用語は、慣習的な用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes X,published by Jones & Bartlett Publishers,2009；およびMeyers et al.(eds.),The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,published by Wiley-VCH in 16 volumes,2008；およびその他の類似の参照に見出され得る。

本明細書中で使用されるように、「含む（comprises）」という用語は、「含む（includes）」を意味する。本明細書中に記載されたものと類似しているかまたは等価である多くの方法および材料が使用され得るが、具体的な適当な方法および材料が本明細書中に記載される。矛盾するケースにおいては、用語の説明を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。様々な態様の概説を容易にするため、用語の説明が以下に提供される。

アジュバント： 抗原性を増強するために使用される媒体。アジュバントには、抗原が吸着される鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、もしくはリン酸）の懸濁物；または、例えば、抗原溶液が鉱油中に乳化される油中水型乳濁液（フロイント不完全アジュバント）、時には、抗原性をさらに増強するため（抗原の分解を阻害しかつ/もしくはマクロファージの流入を引き起こすため）、死滅したマイコバクテリウムを含めたもの（フロイント完全アジュバント）が含まれる。（CpGモチーフを含むもののような）免疫刺激性オリゴヌクレオチドも、アジュバントとして使用され得る。アジュバントには、共刺激分子のような生物学的分子（「生物学的アジュバント」）が含まれる。例示的なアジュバントには、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNFα、IFNγ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、免疫刺激複合体（ISCOM）マトリックス、およびTLR-9アゴニストのようなトール様受容体（TLR）アゴニスト、ポリI:C、またはポリICLCが含まれる。アジュバントは、例えば、Singh(ed.)Vaccine Adjuvants and Delivery Systems.Wiley-Interscience,2007に記載されている。

投与： 選ばれた経路による組成物の対象への導入。投与は局所的または全身的であり得る。例えば、選ばれた経路が鼻腔内である場合、（開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターを含む組成物のような）組成物は、組成物を対象の鼻腔へ導入することによって投与される。例示的な投与経路には、経口、（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内のような）注射、舌下、直腸、経皮（例えば、外用）、鼻腔内、膣、ならびに吸入の経路が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

アミノ酸置換： ポリペプチド内のあるアミノ酸の、異なるアミノ酸への交換。

弱毒化された： 「弱毒化された」または「弱毒化された表現型を有する」ウイルスとは、類似した感染条件の下で、参照ウイルスと比較して減少した病原性を有するウイルスをさす。弱毒化は、一般的には、類似した感染条件の下での参照野生型ウイルスの複製と比較して減少したウイルス複製に関連しており、従って、「弱毒化」および「制限された複製」は、しばしば、同義的に使用される。一部の宿主（典型的には、実験動物を含む非天然宿主）においては、問題の参照ウイルスによる感染中に疾患が明白でなく、ウイルス複製の制限が、弱毒化の代理マーカーとして使用され得る。いくつかの態様において、弱毒化されている開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターは、同一の感染条件の下での、同一種の哺乳動物の、それぞれ、上気道または下気道における非弱毒化野生型ウイルスの力価と比較して、哺乳動物の上気道または下気道におけるウイルス力価の少なくとも約10倍以上の減少、例えば、少なくとも約100倍以上の減少を示す。哺乳動物の例には、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、例えば、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）のようなハムスター、および、例えば、サバンナモンキー（Ceropithiecus aethiops）のような非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。弱毒化されたrB/HPIV3-RSV Gベクターは、非限定的に、変更された成長、温度感受性の成長、宿主範囲が制限された成長、またはプラークサイズの変更を含む、異なる表現型を示し得る。

細胞質テール（CT）： タンパク質の末端（N末端またはC末端のいずれか）を含み、細胞膜またはウイルスエンベロープの細胞質表面から、細胞またはエンベロープを有するウイルスの細胞質に伸びる膜貫通タンパク質の連続領域。I型膜貫通タンパク質のケースにおいて、CTは、タンパク質のC末端を含む。II型膜貫通タンパク質のケースにおいて、CTは、タンパク質のN末端を含む。

縮重バリアント： 本開示の状況において、「縮重バリアント」とは、遺伝暗号の結果として縮重している配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさす。20種の天然アミノ酸が存在し、その大部分が、複数のコドンによって指定される。従って、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が不変である限り、ペプチドをコードする全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。

遺伝子： mRNAであるか否かに関わらず、RNAの転写のために必要な調節配列およびコード配列を含む核酸配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、1種または複数種のエンハンサーまたはサイレンサー、RNAおよび/またはポリペプチドをコードする核酸配列、下流制御配列を含んでいてよく、mRNAの発現の制御に関与するその他の核酸配列を含んでいてもよい。

本明細書中に記載されるrB/HPIV3ベクターの「遺伝子」とは、mRNAをコードするrB/HPIV3ゲノムの一部分をさし、典型的には、遺伝子開始（GS）シグナルによって上流（3'）末端で開始し、遺伝子終結（GE）シグナルによって下流（5'）末端で終結する。これに関して、特に、Cのようなタンパク質が、唯一のmRNAからではなく付加的なORFから発現されるケースにおいて、遺伝子という用語には、「翻訳オープンリーディングフレーム」またはORFと呼ばれるものも包含される。開示されたrB/HPIV3ベクターを構築するため、1種または複数種の遺伝子またはゲノムセグメントを、完全にまたは部分的に、欠失させるか、挿入するか、または置換することができる。

異種： 異なる遺伝子起源に由来すること。組換えゲノムに含まれる異種遺伝子とは、そのゲノムに由来しない遺伝子である。一つの具体的な非限定的な例において、RSV Gタンパク質の外部ドメインをコードする異種遺伝子が、本明細書中に記載されるrB/HPIV3ベクターのゲノムに含まれる。

宿主細胞： ベクターが増えることができ、その核酸が発現され得る細胞。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。その用語には、元の宿主細胞の子孫も含まれる。複製中に起こる変異が存在し得るため、全ての子孫が親細胞と同一であるとは限らないことが理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用される時、そのような子孫が含まれる。

感染性自己複製性ウイルス： 培養細胞または動物もしくはヒト宿主の細胞に侵入し、複製して、同一の活性を有する子孫ウイルスを産生することができるウイルス。

免疫応答： B細胞、T細胞、または単球のような免疫系の細胞の、刺激に対する応答。一つの態様において、応答は、特定の抗原に対して特異的である（「抗原特異的応答」）。一つの態様において、免疫応答は、CD4+応答またはCD8+応答のようなT細胞応答である。別の態様において、応答は、B細胞応答であり、特異的な抗体の産生をもたらす。

免疫原性組成物： いくつかの例において、感染性疾患またはその他の型の疾患の防止、寛解、または処置のために投与され得る、免疫応答を刺激することができる免疫原性材料の調製物。免疫原性材料には、弱毒化されたもしくは死滅した（細菌もしくはウイルスのような）微生物、またはそれらに由来する抗原性のタンパク質、ペプチド、もしくはDNAが含まれ得る。免疫原性組成物は、抗原に対する測定可能なT細胞応答を誘導するか、または抗原に対する（抗体の産生のような）測定可能なB細胞応答を誘導する（ウイルスのような）抗原を含む。一例において、免疫原性組成物は、対象へ投与された時に、RSVおよびHPIV3に対する測定可能なCTL応答を誘導するか、またはRSVおよびHPIV3に対する（抗体の産生のような）測定可能なB細胞応答を誘導する開示されたrB/HPIV3-RSV Gを含む。インビボの使用のため、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体の中に組換えウイルスを含み、アジュバントのような他の薬剤を含んでいてもよい。

単離された： 「単離された」生物学的成分は、他の染色体および染色体外のDNA、RNA、およびタンパク質のような、その成分が天然に存在する他の生物学的成分のような他の生物学的成分から、実質的に分離されているかまたは精製されている。「単離された」タンパク質、ペプチド、核酸、およびウイルスには、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。単離された、とは、絶対的な純度を必要とせず、少なくとも50％純粋、例えば、少なくとも75％、80％、90％、95％、98％、99％、またはさらには99.9％純粋であるタンパク質、ペプチド、核酸、またはウイルス分子を含むことができる。

リンカー： 2個の分子を1個の連続する分子へ連結するために使用され得る二官能性分子。ペプチドリンカーの非限定的な例には、グリシンセリンリンカーが含まれる。

核酸分子： RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー型、ならびにそれらの合成型および混合ポリマー。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型をさす。「核酸分子」という用語は、本明細書中で使用されるように、「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、他に特記されない限り、一般的に、少なくとも10塩基長である。その用語には、DNAの一本鎖型および二本鎖型が含まれる。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド結合および/または天然に存在しないヌクレオチド結合によって共に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾型ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでいてよい。

機能的に連結された： 第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的な関係に置かれている時、その第1の核酸配列は、その第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響する場合、そのプロモーターは、そのコード配列と機能的に連結されている。一般に、機能的に連結された核酸配列は、連続しており、2個のタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。

パラインフルエンザウイルス（PIV）： 記述的に共に分類される、パラミクソウイルス科由来の、エンベロープを有する多数の非分節型マイナスセンス一本鎖RNAウイルス。これには、レスピロウイルス属のメンバー（例えば、HPIV1、HPIV3）およびルブラウイルス属の多数のメンバー（例えば、HPIV2、HPIV4、PIV5）の全てが含まれる。PIVは、2種の構造モジュールから作成されている：（1）ウイルスゲノムを含有している内側のリボ核タンパク質コアまたはヌクレオカプシド、および（2）外側のほぼ球状のリポタンパク質エンベロープ。PIVゲノムは、およそ15,000ヌクレオチド長であり、少なくとも8種のポリペプチドをコードする。これらのタンパク質には、ヌクレオカプシド構造タンパク質（属に依って、NP、NC、またはN）、リン酸化タンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、融合糖タンパク質（F）、赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク質（HN）、大きいポリメラーゼタンパク質（L）、Cタンパク質、およびDタンパク質が含まれる。遺伝子の順序は、3'-N-P-M-F-HN-L-5'であり、各遺伝子は、別々のタンパク質をコードするmRNAをコードし、P遺伝子は、補助的なタンパク質をコードする1個または複数個の付加的なオープンリーディングフレーム（ORF）を含有している。

薬学的に許容される担体： 有用な薬学的に許容される担体は、慣習的なものである。Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19th Edition,1995は、開示された免疫原の薬学的送達のために適当な組成物および製剤を記載している。

一般に、担体の性質は、利用される具体的な投与モードに依るであろう。例えば、非経口製剤は、一般的に、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等のような薬学的かつ生理学的に許容される液体を媒体として含む注射可能な液体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態）のための慣習的な非毒性の固体担体には、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤、乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートのような微量の非毒性の補助物質を含有していてよい。具体的な態様において、対象への投与のために適当な担体は、無菌であって、かつ/または所望の免疫応答を誘導するために適当な組成物の1個もしくは複数個の測定された用量を含有している単位剤形に懸濁しているかもしくは他の方法で含有されていてよい。それは、処置目的のために使用するための薬物治療を伴っていてもよい。単位剤形は、例えば、無菌の内容物を含有している密封されたバイアルもしくは対象への注射のための注射器に存在してもよいし、または後の可溶化および投与のために凍結乾燥されていてもよいし、または固体もしくは放出制御型の剤形であってもよい。

ポリペプチド： 長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関わらないアミノ酸の鎖。「ポリペプチド」とは、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーを含むアミノ酸ポリマー、ならびに1個または複数個のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるものに当てはまる。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣体によってポリペプチドに組み入れられたアミノ酸またはアミノ酸模倣体をさす。ポリペプチドは、アミノ末端（N末端）およびカルボキシ末端（C末端）を有する。「ポリペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質と交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをさすために本明細書中で使用される。

組換え： 組換えの核酸分子またはタンパク質とは、天然に存在しない配列を有するもの：例えば、1個もしくは複数個の核酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み、かつ/またはそうでなければ分離されている2個の配列セグメントの人工の組み合わせによって作成された配列を有するものである。この人工の組み合わせは、例えば、化学合成、天然に存在する核酸分子もしくはタンパク質の標的変異、または単離された核酸セグメントの人工操作、例えば、遺伝子工学技術によって、達成され得る。組換えウイルスとは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むものである。

組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）： PIV3ゲノム内のPIV3遺伝子の全部（N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子、およびL遺伝子）を共に構成する、BPIV3遺伝子およびHPIV3遺伝子の組み合わせを含むゲノムを含むキメラPIV3。開示されたrB/HPIV3ベクターは、F遺伝子およびHN遺伝子がHPIV3由来の対応する遺伝子に交換されているBPIV3ゲノムに基づく（その一例は、Schmidt AC et al.,J.Virol.74:8922-8929,2000に記述されている）。遺伝子開始配列および遺伝子終結配列、ならびにゲノムおよびアンチゲノムのプロモーターのような、遺伝子発現を調節する構造的遺伝要素および機能的遺伝要素が、BPIV3の構造的遺伝要素および機能的遺伝要素である。本明細書中に記載されたrB/HPIV3ベクターは、感染性であり、自己複製性であり、弱毒化されている。

いくつかの態様において、「rB/HPIV3-RSV G」ベクターを生成するため、RSV Gタンパク質またはそのバリアントをコードする異種遺伝子は、rB/HPIV3ゲノムのN遺伝子とP遺伝子との間に挿入される。開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターは、感染性であり、自己複製性であり、弱毒化されており、対象におけるRSVおよびHPIV3に対する二価免疫応答を誘導するために使用され得る。

呼吸器多核体ウイルス（RSV）： ニューモウイルス科オルトニューモウイルス属のエンベロープを有する非分節型マイナスセンス一本鎖RNAウイルス。RSVゲノムは、およそ15,000ヌクレオチド長であり、糖タンパク質SH、G、およびFを含む11種のタンパク質をコードする10種の遺伝子を含む。Fタンパク質は、融合を媒介して、細胞質へのウイルスの侵入を可能にし、多核体の形成も促進する。主として、G糖タンパク質の抗原性の違いに基づく、ヒトRSV株の2種の抗原性のサブグループ、AサブグループおよびBサブグループが記載されている。ウシRSVを含む、他の種のRSV株も、公知である。ヒトRSVに感染したモデル生物、およびウシにおけるbRSV感染の使用のような種特異的RSVに感染したモデル生物を含む、ヒトRSVおよび近縁の動物カウンターパートによる感染のいくつかの動物モデルが、入手可能である（例えば、Bern et al.,Am J,Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,301:L148-L156,2011；およびNam and Kun(Eds.).Respiratory Syncytial Virus:Prevention,Diagnosis and Treatment.Nova Biomedical Nova Science Publisher,2011；およびCane(Ed.)Respiratory Syncytial Virus.Elsevier Science,2007.を参照すること）。

RSV Gタンパク質： II型膜タンパク質であり、RSVの宿主細胞膜への接着を容易にするRSVエンベロープ糖タンパク質。

RSV Gタンパク質は、RSV感染中に2種の型で発現される。一方は、細胞表面に発現され、ウイルス粒子へパッケージングされる全長膜貫通型（mG）である。他方の型は、N末端が短縮された分泌型sGである。全長Gタンパク質（mG）は、N末端細胞質テール（A2株においてアミノ酸1～37を含むと予測されるCT、図1Bを参照すること）、疎水性の膜貫通ドメイン（およそアミノ酸38～65を含むTM、図1Bを参照すること）、および外部ドメイン（およそアミノ酸66～298を含む）を有するII型タンパク質である。sG型は、RSV感染細胞培養物中に比較的豊富に存在し、ORF内の第2のAUGコドン（M48）におけるオルタナティブな翻訳開始によって産生され、タンパク質におけるその対応する位置は、TMドメイン内に存在する（図1Bを参照すること）。次いで、N末端が、N66における新しいN末端を作る、細胞内タンパク質分解トリミングを受ける（図1B）。

RSV Gタンパク質の外部ドメインは、アミノ酸164～186の短い中心の保存された領域に隣接する2個の大きい分岐ドメインを含む。分岐ドメインは、プロリン、アラニン、トレオニン、およびセリンアミノ酸の高い含量を有し、（A2株の場合）推定される4個のN結合型炭水化物側鎖および24～25個のO結合型炭水化物側鎖を有する。中心の保存されたドメインは、保存されたCX3Cモチーフ（CWAIC、A2株のアミノ酸182～186）を保持するシステインヌース（noose）（即ち、2個のジスルフィド結合によって安定された緊密なターン）を含有している。mG型およびsG型は、mGがおそらく三量体または四量体である多量体を形成し、sGが単量体のままであることを除き、グリコシル化およびタンパク質構造に関して本質的に同一であると考えられる。

例示的なRSV Gタンパク質配列は、SEQ ID NO:22として本明細書中に提供される。

配列同一性： アミノ酸配列間の類似性は、配列同一性とも呼ばれる、配列間の類似性によって表される。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）の百分率によって測定されることが多く；百分率が高いほど、2種の配列は類似している。ポリペプチドの相同体、オルソログ、またはバリアントは、標準的な方法を使用して整列化された時、比較的高度の配列同一性を保有するであろう。

2種の配列の間の配列同一性を決定する時、典型的には、一方の配列が参照配列として機能し、試験配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する時、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要であれば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988の類似性検索法（search for similarity method）によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI）内のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または手動の整列化および視覚的検査によって実施され得る（例えば、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012)およびAusubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,through supplement 104,2013)を参照すること）。

配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適当なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990およびAltschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1977に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（ncbi.nlm.nih.gov）を通して公に利用可能である。（ヌクレオチド配列のための）BLASTNプログラムは、11のワード長（W）、50のアライメント（B）、10の期待値（E）、M＝5、N＝-4、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。（アミノ酸配列のための）BLASTPプログラムは、3のワード長（W）、および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989を参照すること）。

一つの例において、整列化された後、両方の配列に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を計数することによって、マッチの数が決定される。配列同一性のパーセントは、同定された配列において示された配列の長さまたは（同定された配列において示された配列に由来する100個の連続するヌクレオチドもしくはアミノ酸残基のような）明確な長さのいずれかによって、マッチの数を割り、その後、得られた値に100を掛けることによって決定される。例えば、1554アミノ酸を有する試験配列と整列化された時、1166のマッチを有するペプチド配列は、試験配列と75.0パーセント同一である（1166÷1554*100＝75.0）。配列同一性のパーセント値は、最も近い小数第一位に四捨五入される。例えば、75.11、75.12、75.13、および75.14は、75.1に四捨五入され、75.15、75.16、75.17、75.18、および75.19は、75.2に四捨五入される。長さの値は、常に整数であろう。

（RSV G外部ドメインのような）ポリペプチドの相同体およびバリアントは、典型的には、関心対象のアミノ酸配列との全長アライメントにおいて計数された少なくとも約75％、例えば、少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を保有することを特徴とする。本明細書中で使用されるように、「少なくとも90％の同一性」または類似の語の言及は、指定された参照配列との「少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはさらには100％の同一性」をさす。

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。一例において、対象はヒトである。具体的な例において、対象は新生児である。付加的な例において、RSV感染および/またはHPIV3感染の阻害を必要とする対象が選択される。例えば、処置を必要とする対象は、感染しておらず、RSV感染および/もしくはHPIV3感染のリスクを有するか、または感染している。

膜貫通ドメイン（TM）：細胞またはウイルスまたはウイルス様粒子の脂質二重層のような脂質二重層にかかるアミノ酸配列。

ワクチン：感染性疾患またはその他の型の疾患の防止、寛解、または処置のために投与される、免疫応答を刺激することができる免疫原性材料の調製物。免疫原性材料には、弱毒化されたもしくは死滅した（細菌もしくはウイルスのような）微生物、またはそれらに由来する抗原性のタンパク質、ペプチド、もしくはDNAが含まれ得る。弱毒化ワクチンとは、病原性が低い型を作製するために修飾されているにも関わらず、病原性の型に対する抗体および細胞性免疫を誘発する能力を保持している病原性生物である。不活化（死滅）ワクチンとは、化学物質、熱、またはその他の処理によって不活化されているが、生物に対する抗体を誘発する、以前に病原性であった生物である。ワクチンは、予防的応答（防止または防御）および治療的応答の両方を誘発することができる。投与の方法は、ワクチンによって変動するが、接種、摂取、吸入、または投与のその他の型を含み得る。ワクチンは、免疫応答をブーストするため、アジュバントと共に投与され得る。

ベクター：関心対象の抗原のコード配列に機能的に連結されたプロモーターを保持しており、コード配列を発現することができるDNA分子またはRNA分子を含有しているエンティティ。非限定的な例には、裸のもしくはパッケージングされた（脂質および/もしくはタンパク質）DNA、裸のもしくはパッケージングされたRNA、複製不可能であり得るウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物、または複製可能であり得るウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物の小成分が含まれ得る。ベクターは、時に、構築物とも呼ばれる。組換えDNAベクターとは、組換えDNAを有するベクターである。ベクターは、複製開始点のような、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含んでいてよい。ベクターは、1種または複数種の選択可能マーカー遺伝子、および当技術分野において公知のその他の遺伝要素を含んでいてもよい。ウイルスベクターは、1種または複数種のウイルスに由来する何らかの核酸配列を少なくとも有する組換え核酸ベクターである。

II.rB/HPIV3-RSV Gベクター
BPIV3 HN遺伝子およびF遺伝子のコード配列が、対応するHPIV3 HN遺伝子およびF遺伝子に交換されており、（野生型RSV Gタンパク質のような）RSV Gタンパク質またはそのバリアントをコードする異種遺伝子をさらに含むBPIV3ゲノムを含む組換えキメラウイルスベクターが、本明細書中に提供される。これらの組換えキメラウイルスベクターは、「rB/HPIV3-RSV G」ベクターと呼ばれる。

rB/HPIV3-RSV Gゲノムは、PIV3遺伝子の全部を含有している。従って、rB/HPIV3-RSV Gベクターは、感染性であり、複製能を有するが、BPIV3骨格および異種遺伝子の存在のため、アカゲザルおよびヒトにおいて弱毒化されている。

rB/HPIV3-RSV Gベクターのゲノムは、3'リーダー領域 - BPIV3 N、異種遺伝子、BPIV3 P、BPIV3 M、HPIV3 F、HPIV3 HN、BPIV3 L - 5'トレーラーの順に、RSV Gまたはそのバリアントをコードする異種遺伝子、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、BPIV3 N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、およびL遺伝子、ならびにBPIV3ゲノムのプロモーター（3'リーダー領域）および5'トレーラー領域を含む。これらの遺伝子の例示的な核酸配列およびそれらによってコードされるタンパク質が、本明細書中に提供され、遺伝子開始配列および遺伝子終結配列、ならびにゲノムおよびアンチゲノムのプロモーターのような遺伝子発現を調節する構造的遺伝要素および機能的遺伝要素も、本明細書中に提供される。

例示的なBPIV3遺伝子配列（カンザス株）は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるGenBankアクセッション番号AF178654.1として提供される。例示的なHPIV3 JS株ゲノム配列は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるGenBankアクセッション番号Z11575.1として提供される。いくつかの態様において、例えば、Schmidtら（J.Virol.74:8922-8929,2000）に記載されるように、これらの株由来の配列を、rB/HPIV3-RSV GベクターのrB/HPIV3局面を構築するために使用することができる。いくつかのそのような態様において、HPIV3 HN遺伝子によってコードされるHNタンパク質は、263位および370位に、それぞれ、トレオニン残基およびプロリン残基を有するよう修飾され得る。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gベクターは、以下に示されるHPIV3 Fタンパク質およびHNタンパク質、ならびにBPIV3 Nタンパク質、Pタンパク質、Cタンパク質、Vタンパク質、Mタンパク質、およびLタンパク質をコードするか、または以下に示される対応するHPIV3 Fタンパク質およびHNタンパク質、もしくはBPIV3 Nタンパク質、Pタンパク質、Cタンパク質、Vタンパク質、Mタンパク質、およびLタンパク質との少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）の配列同一性を個々に有するHPIV3 Fタンパク質およびHNタンパク質、ならびにBPIV3 Nタンパク質、Pタンパク質、Cタンパク質、Vタンパク質、Mタンパク質、およびLタンパク質をコードする、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、ならびにBPIV3 N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、およびL遺伝子を含むゲノムを含む。

BPIV3 N（GenBankアクセッション番号：AAF28254.1、GenBankアクセッション番号AF178654.1のヌクレオチド111～1658によってコードされる）

BPIV3 P（GenBankアクセッション番号：AAF28255、GenBankアクセッション番号AF178654のヌクレオチド1784～3574によってコードされる）

BPIV3 C（GenBankアクセッション番号AF178654のヌクレオチド1794～2399によってコードされる）

BPIV3 V（GenBankアクセッション番号AF178654のヌクレオチド1784～3018によってコードされ、ヌクレオチド2500～2507に位置する遺伝子編集部位においてヌクレオチド2505～2506の間にヌクレオチドgが挿入されている）

BPIV3 M（GenBankアクセッション番号：AAF28256、GenBankアクセッション番号AF178654のヌクレオチド3735～4790によってコードされる）

HPIV3 F（GenBankアクセッション番号Z11575のヌクレオチド5072～6691によってコードされる）

HPIV3 wt HN（GenBankアクセッション番号Z11575のヌクレオチド6806-8524によってコードされる）

いくつかの態様において、rB/HPIV3ベクター内のHPIV3 HN遺伝子は、

として示されるアミノ酸配列を含むHPIV3 HNタンパク質をコードする。

SEQ ID NO:7として示されるHNタンパク質は、263Tおよび370Pのアミノ酸割り当てを含む。実施例において記述されるように、263Tおよび370Pのアミノ酸割り当てを含むHNタンパク質を含むrB/HPIV3-RSV Gは、偶発的な変異の実質的に低下した発生率で回収され継代され得、そのことは、ウイルスの作製、分析、および製造の効率を増加させる。本明細書中に提供されるrB/HPIV3-RSV Gベクターのいずれかは、（例えば、I263TおよびT370Pのアミノ酸置換によってHNタンパク質へ導入された）263Tおよび370Pのアミノ酸割り当てを含むHNタンパク質をコードするHPIV3 HN遺伝子を含んでいてよい。SEQ ID NO:7をコードする例示的なDNA配列は、以下のように提供される。

BPIV3 L（GenBankアクセッション番号：AAF28259、GenBankアクセッション番号AF178654のヌクレオチド8640～15341によってコードされる）

rB/HPIV3-RSV Gベクター内のHPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、ならびにBPIV3 N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、およびL遺伝子のコード配列には、ウイルスゲノムからの発現を容易にするため、適切な遺伝子開始配列および遺伝子終結配列が隣接している。例えば、いくつかの態様において、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、ならびにBPIV3 N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、およびL遺伝子のコード配列には、以下のようなBPIV3の遺伝子開始配列および遺伝子終結配列が隣接していてよい。

さらに、rB/HPIV3-RSV Gベクターは、ヌクレオチド1-96としてのゲノムプロモーター、およびヌクレオチド15361-15456としてのアンチゲノムプロモーターを提供する、GenBankアクセッション番号AF178654に示されるBPIV3カンザス株のもののような適切なゲノムプロモーターおよびアンチゲノムプロモーターを含む。

rB/HPIV3-RSV Gのゲノムは、ネイティブRSV Gタンパク質、またはネイティブRSV Gの膜貫通配列および/もしくは細胞質テール配列の代わりに、BPIV3 HNの膜貫通配列および/もしくは細胞質テール配列を含む組換えRSV Gタンパク質のようなそのバリアントをコードする異種遺伝子を含む。ヒトRSVは、二つのグループ：AおよびBに分類され得る。グループAおよびBは、主に、接着タンパク質（G）および融合タンパク質（F）の配列可変性に基づくサブグループA1、A2、B1、およびB2を含む。rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、（グループAもしくはグループBのような）ヒトRSVのグループ、または（サブグループA1、A2、B1、もしくはB2のような）ヒトRSVのサブグループからの（に由来する）RSV Gタンパク質および/またはRSV G外部ドメインをコードしていてよい。

サブグループA2由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、SEQ ID NO:22として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:22と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV Gタンパク質をコードする。

サブグループA2由来の例示的なヒトRSV G外部ドメイン配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:23として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:23と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV G外部ドメインをコードする。外部ドメインは、本明細書中に記載されるもののような適切な膜貫通ドメイン配列および細胞質テール配列に連結されている。

RSV A/メリーランド/001/11由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、SEQ ID NO:47として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:47と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV Gタンパク質をコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来の例示的なヒトRSV G外部ドメイン配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:48として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:48と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV G外部ドメインをコードする。外部ドメインは、本明細書中に記載されるもののような適切な膜貫通ドメイン配列および細胞質テール配列に連結されている。

サブグループB（B1、AAB82435.1、Karron et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,13961-6,1997を参照すること）由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、SEQ ID NO:49として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:49と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV Gタンパク質をコードする。

サブグループB（B1、AAB82435.1）由来の例示的なヒトRSV G外部ドメイン配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:50として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:50と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV G外部ドメインをコードする。外部ドメインは、本明細書中に記載されるもののような適切な膜貫通ドメイン配列および細胞質テール配列に連結されている。

サブグループA（遺伝子型ON1；ON67-1210A、AEQ98758.1、Eshagi A.et al.,Plos One 7(3):e32807,2012）由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、SEQ ID NO:51として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:51と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV Gタンパク質をコードする。

サブグループA（遺伝子型ON1；ON67-1210A、AEQ98758.1、Eshagi A.et al.,Plos One 7(3):e32807,2012）由来の例示的なヒトRSV G外部ドメイン配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:52として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:52と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV G外部ドメインをコードする。外部ドメインは、本明細書中に記載されるもののような適切な膜貫通ドメイン配列および細胞質テール配列に連結されている。

サブグループB（遺伝子型BA1；BA4128/99B、AAQ16179.1、Trento A.et al.,J.Gen.Virol.84,3115-3120,2003）由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gのゲノムに含まれる異種遺伝子は、SEQ ID NO:53として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:53と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるRSV Gタンパク質をコードする。

サブグループB（遺伝子型BA1；BA4128/99B、AAQ16179.1、Trento A.et al.,J.Gen.Virol.84,3115-20,2003）由来の例示的なヒトRSV Gタンパク質配列は、以下に示される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:54として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:54と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV G外部ドメインをコードする。外部ドメインは、本明細書中に記載されるもののような適切な膜貫通ドメイン配列および細胞質テール配列に連結されている。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、BPIV3 HNタンパク質、HPIV3 HNタンパク質、またはHPIV1 HNタンパク質の細胞質テールに連結されたRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含む組換えRSV Gタンパク質をコードする。いくつかの態様において、異種遺伝子は、BPIV3 HNタンパク質、HPIV3 HNタンパク質、またはHPIV1 HNタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質テールに連結されたRSV G外部ドメインを含む組換えRSV Gタンパク質をコードする。実施例において記述されるように、PIV HNの膜貫通配列および細胞質テールタンパク質配列と、RSV Gの膜貫通配列および細胞質テールタンパク質配列との取り替えは、II型膜タンパク質のビリオンエンベロープへの膜挿入およびパッケージングを促進する。ビリオンエンベロープの表面に露出したRSV G外部ドメインの量の増加は、RSV G外部ドメインに対する免疫応答の対応する増加をもたらすと考えられる。

RSV A2由来の例示的なRSV G配列の膜貫通ドメインおよび細胞質テールは、以下のように示される。

さらに、例示的なBPIV3 HNタンパク質の細胞質テールおよび膜貫通ドメインは、以下のように示される。

さらに、例示的なHPIV3 HNタンパク質の細胞質テールおよび膜貫通ドメインは、以下のように示される。

さらに、例示的なHPIV1 HNタンパク質の細胞質テールおよび膜貫通ドメインは、以下のように示される。

ヒトRSV Gタンパク質、BPIV3 HNタンパク質、HPIV3 HNタンパク質、およびHPIV1 HNタンパク質は、対応するウイルスサブグループの間で著しい配列保存を示す。従って、rB/HPIV3-RSV Gベクターに含まれる異種遺伝子を構築する時、RSV Gタンパク質の細胞質テール配列および膜貫通ドメイン配列を、容易に同定し、必要とされるBPIV3、HPIV3、またはHPIV1のHNタンパク質の対応する配列と入れ替えることができる。

RSV A2由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:30として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:30と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A2由来のRSV G外部ドメイン、ならびにBPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:31として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:31と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:61として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:61と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメイン、ならびにBPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:62として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:62と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:63として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:63と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメイン、ならびにBPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:64として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:64と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:65として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:65と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにBPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:66として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:66と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:67として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:67と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにBPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:68として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:68と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A2由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:69として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:69と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A2由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:70として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:70と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:71として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:71と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:72として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:72と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:73として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:73と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:74として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:74と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:75として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:75と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:76として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:76と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:77として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:77と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV3 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:78として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:78と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A2由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:79として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:79と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A2由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV1 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:80として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:80と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:81として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:81と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV B（B1、GenBank AAB82435.1）由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV1 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:82として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:82と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:83として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:83と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV A/メリーランド/001/11由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV1 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:84として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:84と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:85として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:85と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV ON1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV1 HN膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:86として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:86と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:87として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:87と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

RSV BA1由来のRSV G外部ドメイン、ならびにHPIV1 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含む組換えRSV Gの例示的なアミノ酸配列が、以下に提供される。

いくつかの態様において、異種遺伝子は、SEQ ID NO:88として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:88と少なくとも90％（例えば、少なくとも95％もしくは少なくとも98％）同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる組換えRSV Gをコードする。

付加的な態様において、rB/HPIV3-RSV Gの異種遺伝子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された野生型RSV Gまたはそのバリアントをコードする配列を含む。例えば、異種遺伝子のコード配列は、GeneArt（GA）、DNA2.0（D2）、またはGenScript（GS）最適化アルゴリズムを使用して、ヒト発現のためにコドン最適化され得る。ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたRSV Gタンパク質をコードする核酸配列の非限定的な例は、以下のように提供される。

RSV A2由来のwt Gの配列をコードする「GS」コドン最適化DNA：

RSV A/メリーランド/001/11由来のwt Gの配列をコードするコドン最適化（Biobasic）DNA：

RSV B1由来のwt Gの配列をコードするコドン最適化（Biobasic）DNA：

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gベクターのゲノムは、SEQ ID NO:85～88のいずれかとして示されるアンチゲノムcDNA配列を含む。

異種遺伝子を含む（rB/HPIV3のような）組換えパラインフルエンザウイルスを生成する方法、（例えば、組換えまたは化学的手段によって）ウイルスを弱毒化する方法、ならびにそのような方法において使用するためのウイルス配列および試薬の非限定的な例は、各々参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許公開2012/0045471、2010/0119547、2009/0263883、2009/0017517、7632508、7622123、7250171、7208161、7201907、7192593、PCT公開番号WO 2016/118642、Liangら（J.Virol,88(8):4237-4250,2014）、およびTangら（J Virol,77(20):10819-10828,2003）に提供される。いくつかの態様において、これらの方法は、開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターを構築するため、本明細書中に提供される説明を使用して必要に応じて修飾され得る。

rB/HPIV3-RSV Gベクターのゲノムは、得られたrB/HPIV3-RSV Gが、弱毒化または免疫原性のレベルのような所望の生物学的機能を保持している限り、1個または複数個の変動（例えば、アミノ酸の欠失、置換、または挿入を引き起こす変異）を含んでいてよい。配列のこれらの変動は、天然に存在する変動であってもよいし、または遺伝子工学技術の使用を通して改変されたものであってもよい。

他の変異には、RNAの複製および転写の変化に関連している、ゲノムの3'末端の、アンチゲノム由来のカウンターパートとの交換が含まれる。さらに、本明細書中に記載された方法によって、遺伝子間領域（Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4594-4598(1986)）が、短縮されてもよいし、または延長されてもよいし、または配列含量について変化させられてもよく、天然に存在する遺伝子オーバーラップ（Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5134-5138(1987)）が、除去されてもよいし、または異なる遺伝子間領域に変化させられてもよい。

別の態様において、翻訳のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを指定することによって、遺伝子発現をモジュレートするため、選択されたウイルス遺伝子の（好ましくは、-3位のヌクレオチドを含む）翻訳開始部位周辺の配列が、単独で、または上流開始コドンの導入と組み合わせて、修飾される。

あるいは、または本明細書中に開示された他の修飾と組み合わせて、ウイルスの選択された遺伝子の転写GSシグナルを変更することによって、遺伝子発現がモジュレートされてもよい。付加的な態様において、転写GEシグナルに対する修飾が、ウイルスゲノムに組み入れられてもよい。

rB/HPIV3-RSV Gに対する前記の修飾に加えて、様々な遺伝子間領域またはその他の場所への唯一の制限部位（例えば、N遺伝子とP遺伝子との間への唯一のAsc I部位）の挿入のような、ゲノムに対する異なるまたは付加的な修飾が、操作を容易にするために行われてもよい。外来配列を挿入するための容量を増加させるため、非翻訳遺伝子配列が除去されてもよい。

rB/HPIV3-RSV Gへの上記の修飾の導入は、多様な周知の方法によって達成され得る。そのような技術の例は、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4^th ed.,Cold Spring Harbor,New York,2012）およびAusubelら（In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,through supplement 104,2013）に見出される。従って、定義された変異は、慣習的な技術（例えば、部位特異的変異誘発）によって、ゲノムまたはアンチゲノムのcDNAコピーに導入され得る。完全なアンチゲノムまたはゲノムのcDNAを組み立てるためのアンチゲノムまたはゲノムのcDNA小断片の使用は、各領域を別々に操作することができ（小さいcDNAの方が大きいものより操作するのが容易である）、次いで、完全なcDNAへ容易に組み立てることができるという利点を有する。従って、完全なアンチゲノムもしくはゲノムのcDNAまたはそれらの小断片を、オリゴヌクレオチド指定変異誘発のための鋳型として使用することができる。次いで、変異させられた小断片を、完全なアンチゲノムまたはゲノムのcDNAへ組み立てることができる。変異は、1ヌクレオチドの変化から、1個または複数個の遺伝子またはゲノム領域を含有している大きいcDNA片の交換まで、変動し得る。

rB/HPIV3-RSV Gの開示された態様は、自己複製性であり、即ち、適切な宿主細胞の感染後に複製することができ、かつ、例えば、ヒト対象へ投与された時、弱毒化された表現型を有する。好ましくは、rB/HPIV3-RSV Gは、対照HPIV3と比較して、哺乳動物の上気道において約3～500倍またはそれ以上、下気道において約100～5000倍またはそれ以上、弱毒化されている。いくつかの態様において、インビトロのウイルス複製のレベルは、広範なスケールでの使用のため、ウイルスの作製を提供するために十分であることが好ましい。いくつかの態様において、インビトロの弱毒化パラミクソウイルスのウイルス複製のレベルは、少なくとも1ml当たり10⁶であることが好ましく、より好ましくは、少なくとも10⁷、最も好ましくは、少なくとも10⁸である。

いくつかの態様において、rB/HPIV3-RSV Gベクターは、逆遺伝学組換えDNAに基づく技術を使用して作製され得る（Collins,et al.1995.Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567）。この系は、定義された条件の下で、適格細胞基質におけるcDNAからの感染性ウイルスの完全なデノボ回収を可能にする。逆遺伝学は、cDNA中間体を介して、予定された変異をrB/HPIV3-RSV Gゲノムへ導入する手段を提供する。具体的な弱毒化変異は、前臨床研究において特徴決定され、弱毒化の所望のレベルを達成するために組み合わせられた。cDNAからのワクチンウイルスの誘導は、偶発的な薬剤の混入のリスクを最小化し、継代履歴を簡潔に、十分に立証されたものにしておくのを支援する。回収された後、改変されたウイルス株は、生物学的に得られたウイルスと同様に繁殖する。継代および増幅の結果として、ウイルスは、最初の回収からの組換えDNAを含有していない。

免疫およびその他の目的のためにrB/HPIV3-RSV Gベクターを繁殖させるため、ウイルス成長を可能にする多数の細胞株が使用され得る。パラインフルエンザウイルスは、多様なヒト細胞および動物細胞において成長する。免疫のための弱毒化rB/HPIV3-RSV Gウイルスを繁殖させるための好ましい細胞株には、HEp-2細胞、FRhL-DBS2細胞、LLC-MK2細胞、MRC-5細胞、およびVero細胞が含まれる。最も高いウイルス収率は、一般的には、Vero細胞のような上皮細胞株によって達成される。細胞は、典型的には、約0.001～1.0またはそれ以上の範囲の感染多重度でウイルスを接種され、ウイルスの複製を許容する条件の下で、例えば、約30～37℃で、約3～10日間、またはウイルスが十分な力価に到達するために必要なだけ、培養される。温度感受性ウイルスは、しばしば、「許容温度」として32℃を使用して培養される。ウイルスは、典型的には、標準的な清澄化手法、例えば、遠心分離によって、細胞培養物から取り出され、細胞成分から分離され、所望により、公知の手法を使用してさらに精製されてもよい。

rB/HPIV3-RSV Gベクターは、十分な弱毒化、表現型復帰に対する抵抗性、および免疫原性を確認するため、様々な周知の一般に受け入れられているインビトロおよびインビボのモデルにおいて試験され得る。インビトロアッセイにおいて、修飾型ウイルスは、ウイルス複製の温度感受性または「ts表現型」および小プラーク表現型について試験される。修飾型ウイルスは、非ヒト霊長類およびヒトにおける相対的な弱毒化の順序でウイルスを順位付ける手段を提供すると考えられるインビトロヒト気道上皮（HAE）モデルにおいて評価されてもよい（Zhang et al.,2002 J Virol 76:5654-5666；Schaap-Nutt et al.,2010 Vaccine 28:2788-2798；Ilyushina et al.,2012 J Virol 86:11725-11734）。修飾型ウイルスは、HPIV3感染またはRSV感染の動物モデルにおいてさらに試験される。多様な動物モデル（例えば、マウス、コットンラット、および霊長類）が、入手可能である。

rB/HPIV3-RSV Gベクターの免疫原性は、（非ヒト霊長類、例えば、アフリカミドリザルのような）動物モデルにおいて、例えば、1回の免疫および2回目の免疫の後にRSVおよびHPIV3に対する抗体を形成する動物の数を決定することによって、そしてその応答の大きさを測定することによって、査定され得る。いくつかの態様において、初回免疫の後に動物の約60～80％が抗体を発達させ、2回目の免疫の後に動物の約80～100％が抗体を発達させる場合、そのrB/HPIV3-RSV Gは、十分な免疫原性を有する。好ましくは、免疫応答は、RSVおよびHPIV3の両方による感染に対して防御する。

開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターのゲノムまたはアンチゲノムを含むまたはそれからなる単離されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、およびポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も、提供される。

IV.免疫原性組成物
開示されたrB/HPIV3-RSV Gベクターと薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物も、提供される。そのような組成物は、多様なモードによって、例えば、鼻腔内経路によって、対象へ投与され得る。投与可能な免疫原性組成物を調製するための標準的な方法は、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences,19^th Ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,1995のような刊行物に記載されている。

可能性のある担体には、生理学的平衡培養培地、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳濁液（例えば、油/水型もしくは水/油型の乳濁液）、様々な型の湿潤剤、タンパク質、ペプチド、もしくは加水分解産物（例えば、アルブミン、ゼラチン）のような凍結保護添加剤もしくは安定剤、糖（例えば、ショ糖、乳糖、ソルビトール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウム）、またはその他の保護剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。得られた水性溶液は、そのまま使用するためにパッケージングされてもよいしまたは凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥調製物は、単回投与または複数回投与のため、投与の前に無菌の溶液と組み合わせられる。

免疫原性組成物は、有効な濃度（一般的には、≦1％w/v）のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および/またはプロピルパラベンを含むが、これらに限定されるわけではない静菌剤を、保管中の分解を防止するかまたは最小化するため、含有していてもよい。静菌剤は、一部の患者に禁忌となり得；従って、凍結乾燥製剤は、そのような成分を含有しているかまたは含有していない溶液において再生され得る。

免疫原性組成物は、pH調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、およびトリエタノールアミンオレイン酸塩のような、生理学的条件に近似するために必要とされる物質を、薬学的に許容される媒体として含有していてもよい。

免疫原性組成物は、任意で、宿主の免疫応答を増強するためのアジュバントを含んでいてもよい。適当なアジュバントは、例えば、トール様受容体アゴニスト、ミョウバン、AlPO4、アルハイドロゲル、リピドAおよびその誘導体またはバリアント、油乳濁液、サポニン、中性リポソーム、組換えウイルスを含有しているリポソーム、ならびにサイトカイン、非イオン性ブロックコポリマー、ならびにケモカインである。当技術分野において周知の数多くの適当なアジュバントの中でも、とりわけ、POE-POP-POEブロックコポリマーのようなポリオキシエチレン（POE）およびポリオキシプロピレン（POP）を含有している非イオン性ブロックポリマー、MPL（商標）（3-O-脱アシルモノホスホリルリピドA；Corixa,Hamilton,IN）、ならびにIL-12（Genetics Institute,Cambridge,MA）が、アジュバントとして使用され得る（Newman et al.,1998,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142）。これらのアジュバントは、免疫系を非特異的に刺激するのを支援し、従って、薬学的生成物に対する免疫応答を増強するという利点を有する。

いくつかの態様において、免疫原性組成物は、ある特定のRSVのサブグループまたは株に由来するRSV G外部ドメインをコードするrB/HPIV3-RSV Gを含み、異なるRSVのサブグループまたは株に由来するRSV G外部ドメインをコードする組換えrB/HPIV3-RSV Gも含んでいてよい。例えば、組成物は、サブタイプAおよびサブタイプBのRSVに由来する組換えRSV Gタンパク質を含むrB/HPIV3-RSV Gを含んでいてよい。異なるウイルスは、混合され、同時に投与されてもよいし、または別々に投与されてもよい。RSVのある種の株における交差防御の現象のため、第1の株に由来するRSV G外部ドメインをコードする1種のrB/HPIV3-RSV Gによる免疫は、同一のまたは異なるサブグループのいくつかの異なる株に対しても防御する場合がある。

いくつかの状況において、rB/HPIV3-RSV Gを含む免疫原性組成物を、他のウイルス性病原体、特に、他の小児疾病を引き起こすものに対する防御応答を誘導する他の薬学的生成物（例えば、ワクチン）と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、本明細書中に記載されるrB/HPIV3-RSV Gを含む組成物は、標的とされた年齢群（例えば、およそ1～6ヶ月齢の乳児）のためのAdvisory Committee on Immunization Practices（ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html）によって推薦された他のワクチンも含んでいてよい。これらの付加的なワクチンには、IN投与されるワクチンが含まれるが、これに限定されるわけではない。従って、本明細書中に記載されるrB/HPIV3-RSV Gは、例えば、B型肝炎（HepB）、ジフテリア・破傷風・百日咳（DTaP）、肺炎球菌（PCV）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b型（Hib）、ポリオ、インフルエンザ、およびロタウイルスに対するワクチンと同時に投与され得る。

いくつかの態様において、免疫原性組成物は、対象における免疫応答を誘導するため、例えば、対象におけるHPIV3感染および/またはRSV感染を防止するために使用するため、単位剤形で提供され得る。単位剤形は、対象へ投与するための適当な単一の予め選択された投薬量、もしくは2種以上の予め選択された単位投薬量の適当なマークされたもしくは測定された倍数、および/または単位用量もしくはその倍数を投与するための計量機序を含有している。

V.免疫応答を誘発する方法
開示されたrB/HPIV3-RSV Gを含有している免疫原性組成物を対象へ投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法が、本明細書中に提供される。免疫された時、対象は、RSV Gタンパク質ならびにHPIV3 HNタンパク質およびFタンパク質のうちの1種または複数種に対して特異的な抗体を産生することによって応答する。さらに、抗ウイルス性エフェクターを提供することができ、免疫応答を制御することもできる、自然免疫応答および細胞性免疫応答が誘導される。免疫の結果として、宿主は、少なくとも部分的にもしくは完全にHPIV3感染および/もしくはRSV感染に対する免疫を有するようになるか、または中等度もしくは重度のHPIV3疾患および/もしくはRSV疾患、特に、下気道の疾患の発症に対して抵抗性になる。

ほぼ全てのヒトが、5歳までにRSVおよびHPIV3に感染するため、出生コホート全体が免疫のための関連する集団として含まれる。これは、例えば、免疫計画を、出生～6ヶ月齢、6ヶ月齢～5歳の任意の時点で開始するか、抗体の受動伝達によって乳児を防御するため、妊婦（または出産適齢期の女性）において開始するか、新生児または胎児の家族において開始するか、50歳を超える対象において開始することによって実施され得る。本開示の範囲は、母子免疫を含むものとする。いくつかの態様において、対象は、RSV、HPIV3、および/またはHPIV1に特異的な抗体について血清反応陰性のヒト対象である。付加的な態様において、対象は、1歳以下、例えば、6ヶ月齢以下、3ヶ月齢以下、または1ヶ月齢以下である。

重度の症状を有する（例えば、入院を必要とする）RSV感染および/またはHPIV感染の最大のリスクを有する対象には、重度の疾患に最も感受性である、早産児、気管支肺異形成症を有する子供、および先天性心疾患を有する子供が含まれる。小児期および成年期における疾患は、より軽症であるが、下気道疾患に関連している場合があり、一般的に、副鼻腔炎を併発する。疾患の重症度は、施設に収容された高齢者（例えば、65歳を超えるヒト）において増加する。重度の疾患は、重症複合免疫不全症を有する者、または骨髄もしくは肺の移植後の者においても起こる。いくつかの態様において、これらの対象は、開示されたrB/HPIV3-RSV Gの投与のために選択され得る。

rB/HPIV3-RSV Gを含有している免疫原性組成物は、個体のRSVおよび/またはHPIV3に対する免疫応答能力を誘導するかまたは増強するために十分である「有効量」で、RSV感染および/もしくはHPIV3感染に感受性であるかまたは他の方法でそのリスクを有する対象へ投与される。免疫原性組成物は、注射、エアロゾル送達、鼻スプレー、点鼻薬、経口接種、または局所適用を含むが、これらに限定されるわけではない、任意の適当な方法によって投与され得る。好ましい態様において、弱毒化されたウイルスは、（例えば、Karron et al.JID 191:1093-104,2005に記述されているような）確立されているヒト鼻腔内投与プロトコルに従って投与される。簡単に説明すると、成人または子供は、典型的には、0.5mlの体積の生理学的に許容される希釈剤または担体で、有効量のrB/HPIV3-RSV Gを、液滴を介して鼻腔内接種される。これは、非複製性ウイルスの非経口免疫と比較して単純かつ安全であるという利点を有する。それは、RSVおよびHPIV3に対する抵抗性において主要な役割を果たす局所的な気道免疫の直接刺激も提供する。さらに、予防接種のこのモードは、極めて低月齢の者において典型的に見出される、HPIV3およびRSVに特異的な母系血清抗体の免疫抑制効果を効果的に回避する。また、RSV抗原の非経口投与は、免疫病理学的合併症に関連している場合があるが、これは生ウイルスでは観察されていない。

全ての対象において、投与される免疫原の正確な量ならびに投与のタイミングおよび反復は、患者の健康状態および体重、投与のモード、製剤の性質等を含む様々な因子によって決定されるであろう。投薬量は、一般に、患者1人当たり約3.0 log₁₀～約6.0 log₁₀プラーク形成単位（「PFU」）またはそれ以上のウイルス、より一般的には、患者1人当たり約4.0 log₁₀～5.0 log₁₀ PFUのウイルスであろう。一つの態様において、患者1人当たり約5.0 log₁₀～6.0 log₁₀ PFUを、乳児期に、例えば、1～6ヶ月齢で投与し、1回または複数回の付加的なブースター用量を、2～6ヶ月またはそれ以上後に与えることができる。別の態様において、低月齢の乳児に、多数の他の小児ワクチンの推奨される投与の時期である、およそ2ヶ月齢、4ヶ月齢、および6ヶ月齢で、患者1人当たり約5.0 log₁₀～6.0 log₁₀ PFUの用量を与えることができる。さらに別の態様において、付加的なブースター用量を、およそ10～15ヶ月齢で投与することができる。

本明細書中に記載されたrB/HPIV3-RSV Gおよびその免疫原性組成物の態様は、対象におけるrB/HPIV3-RSV Gに含まれるHPIV3抗原およびRSV抗原に対する免疫応答を誘導するかまたは増強するために有効な量で、対象へ投与される。有効量は、所望の免疫応答を生じるため、ウイルスのある程度の成長および増殖を可能にするが、ウイルスに関連した症状または疾病は生じないであろう。本明細書中に提供される案内および当技術分野における知識に基づき、免疫に使用するためのrB/HPIV3-RSV Gの適正量を決定することができる。

所望の免疫応答は、RSVおよび/またはHPIV3によるその後の感染の阻害である。方法が有効であるために、RSV感染および/またはHPIV3感染が完全に阻害される必要はない。例えば、有効量の開示されたrB/HPIV3-RSV Gの投与は、適当な対照と比較して、所望の量だけ、例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはさらには少なくとも100％（検出可能なRSV感染および/またはHPIV3感染の防止）、（細胞の感染、またはRSVおよび/もしくはHPIV3に感染した対象の数もしくは百分率によって測定される）その後のRSV感染および/またはHPIV3感染を減少させることができる。

有効量の決定は、典型的には、動物モデル研究に基づき、それが、ヒト臨床試験によって追跡調査され、対象における標的疾患の症状もしくは状態の発生もしくは重症度を有意に低下させるか、または（中和免疫応答のような）対象における所望の応答を誘導する投与プロトコルによって案内される。これに関して適当なモデルには、例えば、マウス、ラット、ハムスター、コットンラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、フェレット、非ヒト霊長類、および当技術分野において公知のその他の認められている動物モデル対象が含まれる。あるいは、有効量は、インビトロモデル（例えば、免疫学的アッセイおよび組織病理学的アッセイ）を使用して決定されてもよい。そのようなモデルを使用した場合、組成物の治療的に有効な量（例えば、所望の免疫応答を誘発するかまたは標的疾患の一つもしくは複数の症状を軽減するために有効な量）を投与するために適切な濃度および用量を決定するため、通常の計算および補正のみが必要とされる。

rB/HPIV3-RSV Gの対象への投与は、その後、対象が野生型のRSVまたはHPIV3に感染または再感染した時、肺炎および細気管支炎またはクループのような重症下気道疾患に対して防御的な免疫応答の生成を誘発することができる。天然に循環しているウイルスは、特に、上気道において、感染を引き起こすことができるが、免疫の結果として、そして、おそらく、野生型ウイルスによるその後の感染による抵抗性のブースティングの結果として、鼻炎の可能性は低下している。免疫後には、インビトロおよびインビボで相同の（同一のサブグループの）野生型ウイルスを中和することができる、宿主によって産生された血清および分泌型抗体が、検出可能なレベルで存在する。多くの状況において、宿主抗体は、異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和するであろう。例えば、別のサブグループの異種の株に対して、より高いレベルの交差防御を達成するためには、RSVサブグループAおよびBの両方の少なくとも1種の優勢な株に由来するRSV Gタンパク質をコードするゲノムを含むrB/HPIV3-RSV Gを合わせて含む複数の免疫原性組成物によって対象を免疫することができる。

1種または複数種の開示されたrB/HPIV3-RSV Gウイルスを含む免疫原性組成物は、コーディネート（またはプライム-ブースト）免疫プロトコルまたはコンビナトリアル製剤において使用され得る。数回のブーストが行われてよく、各ブーストは、異なる開示された免疫原であり得ることが企図される。いくつかの例において、ブーストは、他のブーストまたはプライムと同一の免疫原であり得ることも企図される。ある種の態様において、新規のコンビナトリアル免疫原性組成物およびコーディネート免疫プロトコルは、各々、RSVタンパク質およびHPIV3タンパク質に対する免疫応答のような抗ウイルス免疫応答の誘発に差し向けられている、別々の免疫原または製剤を利用する。抗ウイルス免疫応答を誘発する別々の免疫原性組成物を、1回の免疫工程において対象へ投与される多価免疫原性組成物として組み合わせてもよいし、またはコーディネート（もしくはプライム-ブースト）免疫プロトコルにおいて別々に（1価免疫原性組成物として）投与してもよい。

得られた免疫応答は、多様な方法によって特徴決定され得る。これらには、補体固定、プラーク中和、酵素結合免疫吸着アッセイ、ルシフェラーゼ免疫沈降アッセイ、およびフローサイトメトリー分析を含むが、これらに限定されるわけではない試験によって検出され得る、RSV特異的抗体の分析のための鼻洗浄液または血清の試料の採取が含まれる。さらに、免疫応答は、鼻洗浄液または血清におけるサイトカインのアッセイ、いずれかの起源由来の免疫細胞のELISPOT、鼻洗浄液または血清の試料の定量的RT-PCRまたはマイクロアレイ分析、ならびにインビトロのウイルス抗原への再曝露による鼻洗浄液または血清に由来する免疫細胞の再刺激、およびフローサイトメトリーによって測定されるサイトカイン、表面マーカー、もしくはその他の免疫相関物の生成もしくは呈示についての分析、またはRSV抗原を呈示する指標標的細胞に対する細胞傷害活性についての分析によって検出され得る。これに関して、個体も、上気道疾病の兆候および症状についてモニタリングされる。

以下の実施例は、ある種の態様の具体的な特色を例示するために提供されるが、特許請求の範囲の範囲は、例証されたそれらの特色に限定されるべきではない。

実施例1
RSVおよびHPIV3に対する防御免疫応答の誘導のためのRSV Gまたはそのバリアントを発現するrB/HPIV3ベクターの同定
この実施例は、ベクターのN遺伝子とP遺伝子との間の2番目の遺伝子の位置から、RSV A2株のwt Gタンパク質およびそのバリアントを発現するためのrB/HPIV3ベクターの開発、作製、および評価を記載する。

この実施例において使用されたベクター骨格は、rB/HPIV3と呼ばれるウシPIV3（カンザス株）とヒトPIV3（JS株）とのキメラである（Schmidt et al.,2000,J.Virol.74:8922-8929）。このベクターは、F糖タンパク質およびHN糖タンパク質（2種のPIV3中和抗原および主要防御抗原）をコードする遺伝子が、HPIV3由来のカウンターパートに交換されているBPIV3からなる。HPIV3およびBPIV3は、極めて近縁のウイルスであり、rB/HPIV3キメラは、PIV3遺伝子の全部を含有しており、完全な複製能を有するが、BPIV3骨格のため、アカゲザルおよびヒトにおいて弱毒化されている（Karron et al.,2012,Vaccine 30:3975-3981）。

MEDI-534と呼ばれる2番目の遺伝子の位置（N-P）に挿入された野生型（wt）RSV F遺伝子を含むrB/HPIV3のバージョンは、HPIV3およびRSVについて血清反応陰性の乳児および子供において以前に評価された（Bernstein et al.,Ped.Infect.Dis.,J.31:109-114,2012）。MEDI-534は、血清反応陰性の子供における異なる研究（Karron et al.,2012,Vaccine 30:3975-3981）において、空のrB/HPIV3ベクターと同様に、弱毒化されており、耐容性が高かった。しかしながら、全てのワクチンレシピエントが、HPIV3に対する血清変換を示したが、補体の添加の非存在下でマイクロ中和アッセイによって分析された検出可能な血清RSV中和抗体を発達させたのは、半数のみであった。予防接種を受けた者に由来する鼻洗浄液中に回収されたベクターの相当の割合による、RSV Fタンパク質発現の喪失も存在した（Yang et al.,Vaccine 31:2822-2827,2013）。rB/HPIV3ベクター系の利点は、RSV wt Fタンパク質を発現するrB/HPIV3が、前述のように、血清反応陰性の子供において安全であり、耐容性が高いことが示されたため（Bernstein et al.,2012,Pediatr.Infect.Dis.J.31:109-114）、改善されたRSVインサートを含むバージョンも、同様に耐容性が高く、臨床開発へと速やかに進展すると期待され得る点である。

rB/HPIV3-RSV Gベクターは、N遺伝子からコピーされた遺伝子終結（GE）シグナル、P遺伝子からコピーされた遺伝子開始（GS）シグナル、およびCTTトリヌクレオチド遺伝子間領域を含むBPIV3転写制御要素が、RSV G遺伝子に隣接するように設計された（図1A）。さらに、rB/HPIV3のHN遺伝子は、ウイルスの作製、分析、および製造の効率を増加させるため、偶発的な変異の実質的に低下した出現率で回収され継代され得るウイルスをもたらす、263Tおよび370Pのアミノ酸割り当てを含む。

RSV GおよびRSV Gバリアント
RSV Gタンパク質は、RSV感染中に2種の型で発現される。一方は、細胞表面に発現され、ウイルス粒子へパッケージングされる全長膜貫通型（mG）である。他方の型は、N末端が短縮された分泌型sGである。全長Gタンパク質（mG）は、N末端細胞質テール（A2株においてアミノ酸1～37を含むと予測されるCT、図1Bを参照すること）、疎水性膜貫通ドメイン（およそアミノ酸38～65を含むTM、図1Bを参照すること）、および外部ドメイン（およそアミノ酸66～298を含む）を有するII型タンパク質である。sG型は、ORF内の第2のAUGコドン（M48）におけるオルタナティブな翻訳開始によって産生され、タンパク質におけるその対応する位置は、TMドメイン内に存在する（図1Bを参照すること）。次いで、N末端は、N66における新しいN末端を作る、細胞内タンパク質分解トリミングを受ける（図1B）。

Gの外部ドメインは、アミノ酸164～186の短い中心の保存された領域に隣接する2個の大きい分岐ドメインからなる。分岐ドメインは、プロリン、アラニン、トレオニン、およびセリンアミノ酸の高い含量を有し、（A2株の場合）推定される4個のN結合型炭水化物側鎖および24～25個のO結合型炭水化物側鎖を有する。中心の保存されたドメインは、保存されたCX3Cモチーフ（CWAIC、A2株の182～186aa）を保持するシステインヌース（即ち、2個のジスルフィド結合によって安定化された緊密なターン）を含有している。mG型およびsG型は、mGがおそらく三量体または四量体である多量体を形成し、sGが単量体のままであることを除き、グリコシル化およびタンパク質構造に関して本質的に同一であると考えられる。

CX3Cドメインは、フラクタルカインと呼ばれるケモカインにも存在し（図1C）、RSV G内のCX3Cドメインに隣接する配列およびフラクタルカインは、配列関連性も共有している（Tripp et al.,Nature Immunol.2:732-738m 2001）。Gタンパク質は、インビトロで白血球走化性を誘導する能力に関してフラクタルカインと類似していることが示されており（Tripp et al.,2001,Nature Immunol 2:732-738）、RSV感染を開始することができるフラクタルカイン受容体CX3CR1にも結合する（Tripp et al.,2001,Nature Immunol 2:732-738；Johnson et al.,2015,PLoS Pathog.11:e1005318）。Gタンパク質と同様に、フラクタルカインは、全長膜貫通型および短縮分泌型として発現される。フラクタルカインについて、全長膜貫通型は、T細胞、NK細胞、および単球において発現されたフラクタルカイン受容体CX3CR1と相互作用する接着分子として作用し；分泌型は、同一の細胞型のために走化性因子として作用する。RSV接着におけるCX3Cドメインの役割は、単純である（即ち、ウイルスがCX3CR1を発現する細胞に結合することを可能にする）と考えられるが、宿主免疫に対するCX3CドメインおよびsGの効果は、不明なままである。原則として、CX3Cドメインの消失および/またはsGの発現は、免疫細胞の走化流入を低下させると予想され、疾患を低下させる可能性があり、このことは、変異体RSVによるいくつかの研究によって支持されているが（例えば、Maher et al.,2004,Microbes Infect.6:1049-1055；Boyoglu-Barnum et al.,2017,J.Virol.,91(10):e02059-16）、矛盾するデータも存在する（例えば、Harcourt et al.,2006,J.Immunol.176:1600-1608）。Gのその他の効果も記載されており：例えば、sGは、抗体による中和を低下させる抗原デコイとして作用することが示され、マクロファージおよび補体によるRSVのクリアランスにも干渉するようであった（Bukreyev et al.,J.Virol.,86(19):10880-4,2012）。別の例として、インビトロで、Gタンパク質は、ヒト樹状細胞活性化に干渉した（Johnson et al.,2012,J.Virol.86:1339-1347）。さらに、ヒト新生児制御性B細胞に発現されたCX3CR1とのRSVの結合は、Th2偏向応答をもたらす（Zhivaki et al.,2017,Immunity 46:301-314）。従って、sG型およびCX3Cモチーフを含むGタンパク質の宿主免疫に対する効果は、完全には理解されておらず、複雑である可能性が高い。

RSV Gおよびその9種の誘導体が、図1Aに示され（構築物（i）～（x））、以下に説明される。

構築物（i）は、wt RSV Gである。この実施例において使用されたwt RSV Gは、サブグループA2に由来し、

として示されるアミノ酸配列を有する。

図1Aの構築物（ii）および（iii）は、Gタンパク質のmG型およびsG型をコードする。mG構築物は、M48I変異によってsGの発現を消失させることによって作成され（図1B）、sG構築物は、コドンM48がORFを開始するよう、G ORFの最初の47コドンの欠失によって作成された（図1B）；以前に記載されたように、タンパク質は、その後、N66のN末端を有する主要な生成物へ細胞内でトリミングされる（Roberts et al.,J.Virol.,68(7):4538-4546,1994、Teng et al.,J.Virol.289:283-296,2001）。

図1Aの構築物（iv）および（v）（G_B3CTおよびG_B3TMCT）は、RSV Gのベクター粒子への効率的なパッケージングを促進するため、wt GのCTおよびTMCTが、ベクターBPIV3 HNタンパク質のものに交換されているキメラタンパク質である（図1Bを参照すること）。ベクターHNタンパク質由来のCTドメインまたはTMCTドメインのRSV G内の存在は、RSV Gのウイルス粒子への組み入れを容易にするため、MおよびNのような内部ベクタータンパク質との相同相互作用を促進すると考えられる。BPIV3 HNのTMおよびCTの配列の境界の同定は、検査およびHPIV3 HNとの整列化によって決定された（図1B）。

図1Aの構築物（vi）および（vii）（G_dCX3CおよびG_wCX4C）は、Gタンパク質内のCX3Cモチーフを消失させる変異を有する：具体的には、G_dCX3Cは、CX3Cモチーフ内の第2のシステイン残基の割り当てを変化させるC186R変異を有し（図1C）、G_wCX4Cは、モチーフのスペーシングを破壊する185位と186位との間へのアラニン残基の挿入を有する（図1C）。

図1Aの構築物（viii）および（ix）においては、B3CTおよびB3TMCTの置換と組み合わせて、C186R変異も作成された（G_dCX3C_B3CTおよびG_dCX3C_B3TMCT）。

さらに、wt Gをコードする構築物は、GenScriptによってヒト発現のためにコドン最適化された（wt G/GS-opt、図1A、x型）。

一連のRSV Gバリアントは、sG、CX3Cモチーフ、CT変異、TMCT変異、およびコドン最適化の、RSV Gタンパク質の免疫原性に対する効果の査定を可能にした。さらに、rB/HPIV3ベクターに対する免疫応答に対する可能性のある効果も、査定することができた。これに関して、PIV3は、疫学、組織指向性、および疾患において全般的な類似性を有する関連する呼吸器ウイルスであるため、RSVの適当な代理である。さらに、RSV Gインサートは、PIVベクターの複製のために必要とされず、この交絡因子を除去する。従って、ベクターの免疫原性に対する効果を査定し、ベクター複製の免疫学的制限の可能な変化も査定した。

rB/HPIV3-RSV wtG（構築物（i））、rB/HPIV3-RSV wt G/GS-opt（構築物（x））、rB/HPIV3-RSV G_B3TMCT（構築物（v））、rB/HPIV3-RSV G_B3CT（構築物（iv））の完全アンチゲノムcDNA配列は、以下の例示的な配列セクションに提供される。

ウイルス複製およびRSV G発現
RSV Gの様々な型を発現するrB/HPIV3ベクターは、LLC-MK2細胞において効率的に複製された（7.6～8.6 log₁₀TCID₅₀/ml）。成長障害は、いずれの構築物でも観察されなかった。

様々な構築物によるRSV Gの細胞内発現を、ウエスタンブロット分析によって、Vero細胞（図2Aおよび2B）ならびにLLC-MK2細胞（図3）において評価した。細胞に、1細胞当たり10 TCID₅₀（50％組織培養感染用量）の感染多重度（MOI）で、各ベクターを感染させ、1細胞当たり3プラーク形成単位（PFU）のMOIで、wt RSVを感染させた。細胞を、感染後（p.i.）24時間目に採集し、細胞溶解物を調製し、変性還元条件下でのゲル電気泳動に供し、RSVおよびHPIV3に対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した。

wt RSV Gを発現するrB/HPIV3ベクター（図2A、レーン2）およびwt RSV（レーン11）によって発現された細胞内RSV Gは、完全グリコシル化型に相当する90～120kD（図2A）の優勢な広いバンドおよび不完全なO-グリコシル化を有するGタンパク質のプロセシング中間体を表す35～50kDのより少量のバンドとして検出された。mG構築物による前記の様々なGタンパク質種の発現は、wt Gと本質的に同一であった（図2Aおよび2B、レーン4対2）。対照的に、sG構築物は、効率的な分泌と一致して、大きい広いバンドを微量にしか有していなかった。sG構築物は、N末端短縮のためにサイズが低下したGタンパク質の不完全グリコシル化バージョンのバンドも有していた。CTおよびTMCTの置換は、大きいGバンドの発現を50～80％増加させたが、この効果の理由は不明である（図2Aおよび2B、レーン5および6対2）。対照的に、CX3C消失は、大きいGバンドの蓄積を20～50％パーセント低下させ、それは、少なくとも一部分、35～50kDの不完全グリコシル化型の蓄積の増加によるようであった（図2Aおよび2B、レーン7および8対2）。CX3C変異に関連した大きいGバンドの蓄積の低下は、B3CTおよびB3TMCTの置換と組み合わせられた時、補償された（図2Aおよび2B、レーン9および10）。空のベクターを含め、構築物の間に、BPIV3 Nタンパク質の発現の有意差は存在せず（図2A）、このことから、RSV Gのいずれの型も、インビトロでのベクター遺伝子発現に対して多くの効果を有しないことが示唆された。LLC-MK2細胞におけるRSV Gタンパク質およびBPIV3 Nタンパク質の細胞内発現（図3Aおよび3B）は、Vero細胞における発現と類似したパターンに従った。

前記のように平行して感染させ、48時間インキュベートしたVero細胞培養物からのRSV Gの分泌を評価した（図2C、2D）。上層の培地を収集し、小片およびrB/HPIV3ビリオンを除去するため、60分間10,000×gでの遠心分離によって清澄化した。次いで、清澄化された上清を、RSVおよびHPIV3に対するポリクローナル抗体によるウエスタンブロット分析に供した。wt Gを発現するrB/HPIV3に感染した細胞（図2C、レーン2）またはRSVに感染した細胞（レーン11）のケースにおいて、清澄化されたウイルス枯渇培地に検出されたGタンパク質の型は、大きく広い90～120kD種のみであり、このことから、Gの完全グリコシル化型のみが培地中に分泌されたことが示された（図2C、レーン2および11）。予想通り、mG構築物に感染した細胞からの培地には、Gタンパク質がほとんど検出されず（図2Cおよび2D、レーン4）、sG構築物によって産生されたsGタンパク質は、wt G構築物によるものより70％豊富であった（図2Cおよび2D、レーン3対2）。いずれかの変異によるCX3Cの消失は、sGタンパク質の発現をわずかに減少させるようであり（図2Cおよび2D、レーン7および8）、それは、全体の発現の低下による可能性が高かった（図2Aおよび2B、レーン7および8）。B3CTおよびB3TMCTの置換は、sGタンパク質の発現を完全に抑止した（図2Cおよび2D、レーン5～6および9～10）。sGタンパク質の合成を開始するために通常使用されるネイティブのM48コドンが、HPIV3 HNタンパク質由来のTMドメインに交換されたGのTMドメインに位置するため、B3TMCTのケースにおいては、これは驚くべきことではなかった（2個の他のAUGコドンがHPIV3 HN TMドメインに存在するが、それらは明らかに利用されなった、図1B）。B3CT置換のケースにおいては、そのM48コドンを含むネイティブのTMが存在しており、それが利用されなかった理由は不明である。一つの可能性は、この領域の上流のヌクレオチド配列が、M48コドンにおける開始に影響したというものである。

インビトロ継代後のrB/HPIV3構築物によるRSV G発現の安定性を、RSV Fタンパク質を発現するrB/HPIV3構築物について以前に記載されたアッセイ（Liang et al.,J.Virol.,89(18):9499-9510,2015）に類似した二重染色プラークアッセイによって決定した（図4A）。簡単に説明すると、Vero細胞に10倍段階希釈ウイルスストックを感染させ、プラークが形成されるまで、メチルセルロースオーバーレイの下でインキュベートした。プラークを固定し、ウサギ抗HPIV3またはヤギ抗RSVの一次抗体によって染色し、続いて、赤外色素（PIV3、緑；RSV、赤）にコンジュゲートされた種特異的二次抗体によって染色した（図4A）。単一のPFUによるHPIV3抗原およびRSV Gの共発現は、黄色として可視化された。RSV Gを発現するベクターストックは、全て、RSV Gを発現するPFUのほぼ100％を有することが見出されたが、例外として、sG構築物のケースにおいては、Gの培地への迅速な分泌が、このタンパク質についてのプラークの染色を排除したため、これを決定することができなかった（図4A、カラム3）。

さらに、CX3Cドメインに対して特異的であるRSV G MAb（131-2G）を使用して、二重プラークアッセイを実施した（図4B）。この抗体は、sG（レーン3）を除き、CX3Cモチーフが完全であったGの全てのバージョンについて、プラークに結合したが（図4B、レーン2、4、5、および6）、CX3Cモチーフに変異を有するバージョンには結合しなかった（図4B、レーン7～10）。これは、CX3Cモチーフの消失が、RSV G上の131-2G結合エピトープを破壊することを示し、これらの変異体における完全なCX3Cモチーフの欠如の確認となった。

RSV Gパッケージング
RSV GのrB/HPIV3ビリオンへのパッケージング効率を評価するため、空のベクターおよびRSV Gのバージョンを発現する様々なベクターを、LLC-MK2において繁殖させ、wt RSVを、Vero細胞において繁殖させた。細胞の上層の培地を採集し、低速遠心分離によって清澄化し、30％～60％不連続ショ糖勾配での遠心分離に供した。各構築物について、4マイクログラムの精製されたウイルスを、ウエスタンブロットによって分析し（図5A）、定量化し、1.0としてのwt Gに対して正規化した。これは、未修飾のwt Gが、極めて弱いバンドとしてベクタービリオンに検出可能であり（図5A、レーン2）、そのパッケージング効率が、wt RSVのビリオンタンパク質1μg当たりの5％未満であることを示した（図5Aおよび5B、レーン2および6）。Vero細胞において成長したRSVビリオンにパッケージングされたGタンパク質の大部分が、通常優勢である90～120kD型より低い分子量（50～60kD）を有していたことに注意すること。これは、その特定の細胞株において、長いインキュベーション中に、細胞プロテアーゼカテプシンLによる切断のため、発生することが以前に示された（Corry et al.,2015,J.Virol.90:1311-1320）。図5Bに示される定量化において、両方の型がwt RSVについて定量化された。BPIV3 HNタンパク質からのTMCT置換は、RSV Gのパッケージング効率を8.3倍増強し（図5AおよびB、レーン2および5）、効果の同一の大きさが、G_dCX3C_B3TMCT構築物についても観察された。BPIV3 HN CT置換は、単独では、RSV Gのベクタービリオンへのパッケージングをわずかにしか増加させなかった（図5Aおよび5B、レーン2および4）。予想通り、sGタンパク質は、ベクターにパッケージングされなかった（図5A、レーン3）。

RSV Gのパッケージングを、免疫金標識および透過型電子顕微鏡法（TEM、図6）によっても可視化した。前記（図5）のように調製された精製されたビリオンを、MAb 131-2Gと共にインキュベートし、続いて、金粒子にコンジュゲートされた抗マウスIgGと共にインキュベートすることによって標識した。標本を、以前に記載されたような（Liang et al.,J.Virol.,90(21):10022-10038,2016）TEMによって画像化した。結果は、wt RSVビリオンが、RSV Gタンパク質の高密度のパッケージングを示す、広範な抗体染色を有することを示した（図6Aおよび6B）。対照的に、rB/HPIV3-wt Gのビリオンは、散発性の標識のみを有し（図6Cおよび6D）、多くのビリオンが検出可能なGを有していなかった。sGタンパク質を発現するベクターのビリオンに結合する抗体は、本質的に存在しなかった（図6Eおよび6F）。B3CT置換は、抗体結合をわずかに増加させるようであったが（図6Gおよび6H）、B3TMCT置換は、抗体結合の効率を大いに改善した（図6Iおよび6J）。空のベクタービリオンは、免疫金粒子によって標識されなかった（図6Kおよび6L）。従って、TEM分析において示されたRSV Gの密度は、ウエスタンブロットによって定量化されたGパッケージングの効率と一致していた。

インビボの複製、免疫原性、および防御
ベクターの複製、免疫原性、および防御効率を、ハムスターモデルにおいて評価した（それぞれ、図7～9）。複製を評価するため、6匹の群のハムスターを、10⁵ TCID₅₀の示されたベクターまたは10⁶ PFUのwt RSVによってIN免疫した。肺および鼻甲介を免疫後5日目に収集し、rB/HPIV3ベクターの力価をLLC-MK2細胞単層におけるTCID₅₀赤血球吸着アッセイによって決定し、RSVの力価をVero単層におけるプラークアッセイによって決定した。鼻甲介においては、RSV Gインサートを保持するベクターの全てが、空のrB/HPIV3ベクターと類似した力価に複製され（図7A）、肺において、RSV Gインサートを保持するベクターは、全て、空のベクターよりわずかに弱毒化されていたが、その差は有意ではなかった（図7B）。RSV Gの様々な型を発現する様々なベクターの複製に、有意差はなかった。従って、例えば、sGの発現、またはsGの発現の欠如、またはCX3Cモチーフの存在、またはこのモチーフの欠如は、RSVと同一の組織指向性を有し（Zhang et al.,J.Virol.76:5654-5666,2002；Zhang et al.,J.Virol.79：1113-1124,2005）、生物学的に多くの類似性を共有しているrB/HPIV3ベクターの複製に影響するために十分な衝撃を、ハムスター肺の免疫生物学的環境に対して有していなかった。

免疫原性を評価するため、ハムスターを前記のようにベクターおよびwt RSVによって免疫し、血清を免疫後0日目および28日目に収集し、インビトロ60％プラーク低下中和アッセイを、血清中のRSV中和抗体およびHPIV3中和抗体の力価を定量化するために実施した（図8）。

血清RSV中和抗体の力価は、緑色蛍光タンパク質を発現する組換えRSV（RSV-GFP、Munir et al.,J.Virol.82:8780-8796,2008）を使用した60％プラーク低下中和力価（PRNT₆₀）アッセイによって、Vero細胞においてインビトロで決定された。アッセイは、補体の添加の存在下または非存在下で行われた。補体の存在は、そうでなければ非中和性である抗体に中和活性を与え、不十分に中和性の抗体の中和活性を増強することができる、ウイルス溶解能力および立体障害能力を付与することができ、補体の非存在下での中和は、抗体の直接の能力に依る（Yoder et al.2004,J.Med.Virol.72:688-694）。従って、補体なしで行われたアッセイは、よりストリンジェントな評価を提供し、RSVを直接中和することができる抗体のみを検出する（Liang et al.,J.Virol.,89(18):9499-9510,2015）。

血清RSV中和抗体力価を、補体を添加して実施された中和アッセイによって評価した時、wt G、mG、G_B3CT、およびG_B3TMCTを発現するベクターは、10倍多い（10⁶ PFU）wt（即ち、非弱毒化）RSVによって誘導されたものと統計的に異ならない、同様に高い力価（＞1：1024）を誘導することが示された（図8A、レーン2、4～6対11）。対照的に、sG構築物は、頑強な分泌型発現（図2C、レーン3）にも関わらず、検出可能な血清RSV中和抗体を誘導しなかった（図8A、レーン3）。興味深いことに、CX3C消失は、RSV血清中和力価を強烈に低下させ（図8A、レーン7～10）、このことから、RSV中和抗体の誘導のためのCX3Cモチーフの役割が示された。従って、sGの発現の消失またはCX3Cモチーフの消失は、これらの特色が宿主免疫に有意に干渉する場合に予想されるように、Gタンパク質の免疫原性を増加させなかった。反対に、CX3Cモチーフは、強力なRSV中和抗体応答の誘導に実質的に寄与した。Gによって誘導される中和活性とFによって誘導される中和活性とを比較するため、以前の研究（Liang et al.,J.Virol.,89(18):9499-9510,2015）からの未修飾の野生型（wt）RSV Fを発現する同一の用量のrB/HPIV3によって免疫されたハムスターの血清を、平行してアッセイした（図8A、レーン12）。wt Gは、wt Fよりわずかに低いRSV血清中和抗体の力価を誘導したが、その差は統計的に有意ではなかった（図8A、レーン2および12）。

（即ち、ベクターに対する）血清HPIV3中和抗体力価を、補体が添加されたアッセイによって評価した時、RSV Gの様々な型を発現するベクターは、全て、類似の免疫原性を有したが（図8B、レーン2～10）、例外として、G_B3TMCT構築物は、空のベクターよりわずかであるが有意に低いレベルの血清HPIV3中和抗体を誘導した（図8B、レーン1および6）。G_B3TMCT構築物によって誘導された、より低い力価は、TMCT置換によって増強されたRSV Gのパッケージングが、おそらく、ベクターHNタンパク質のパッケージングを低下させることによって、インビボのベクター複製効率に干渉することを示唆した。従って、sGタンパク質または発現されたGタンパク質の中のCX3Cモチーフの存在または欠如は、ベクターに対する抗体応答に対して有意な効果を有しなかった。

ハムスター血清を、RSVのサブグループB株（B1）に対する中和血清抗体についてもアッセイした。B1株に対する中和活性は、wt RSVおよびwt F血清について同様に高いままであったが（図8C、レーン11～12）、RSV G構築物によって誘導されたB1交差中和活性は、実質的に低下し（図8C、レーン2および4～6）、CX3Cモチーフの破壊は、中和活性をほぼ完全に消滅させた（図8C、レーン7～10）。これは、RSV G A2のGタンパク質がサブグループ間交差中和抗体の中程度の力価を誘導したこと；さらに、これがCX3Cモチーフの存在に高度に依存していたことを示す。

RSV中和抗体の誘導におけるCX3Cモチーフの役割をさらに特徴決定するため、Gの変異型CX3C（CWAIS）を保持するA2 RSV株を、添加された補体の存在下で、血清RSV中和力価を分析するために使用した（図8D）。4種のCX3C消失変異体によって誘導されたCX3C変異型RSVに対する血清中和活性（図8D、レーン7～10）は、wt RSVおよびwt Fを発現するベクター（図8D、レーン11および12）と比較して比較的低いままであり、このCWAIS変異体に対するwt G、mG、G_B3CT、およびG_B3TMCTの血清における中和活性も、等しく低かった（図8D、レーン2および4～6）。これは、CX3CドメインがGタンパク質の主要な中和エピトープであることのさらなる確認であった。

wt RSV A2（図8A）、wt RSV B1（図8C）、およびRSV A2 CWAIS（図8D）に対する、補体の存在下で測定された血清中和抗体の力価は、表1に示される。これは、（mGをもたらす）sGの消失が、増加した免疫原性をもたらさなかったこと；ベクター粒子へのGのパッケージングが免疫原性を増加させなかったこと；CX3Cモチーフの消失が免疫原性を強く低下させたことをさらに例示する。

（表１）ハムスターにおける10⁶ PFUのwt RSV A2によって誘導されたものと比較された10⁵ TCID₅₀のベクターによって誘導された相対平均RSV血清中和力価。全ての力価が、補体の存在下で決定された。

血清RSV中和抗体力価を、中和活性のよりストリンジェントな査定を提供する、添加された補体の非存在下で実施される中和アッセイによっても評価した（図8E）。補体非依存性アッセイは、wt RSVおよびベクターによって発現されたwt Fの両方が、補体非依存性の血清RSV中和抗体の中程度の力価を誘導し（図8E、レーン11および12）、G構築物が、インビトロの補体の非存在下でRSVを中和することができる血清抗体の比較的低い力価を誘導することを示した（図8E、レーン2～10）。インビボの接着において有意な役割を果たし得るCX3CR1受容体が、Vero細胞には欠損しており、従って、このVeroに基づくアッセイは、G特異的な中和抗体を検出し得ない可能性があるという但し書きと共に、この結果は提示される（Johnson SM et al.,2015,PLoS Pathog.,11:e1005318）。これは、CX3CR1受容体を発現する粘液線毛ヒト気道上皮（HAE）のインビトロモデルを使用した中和アッセイによって解決され得るが（Johnson SM et al.,2015,PLoS Pathog.,11:e1005318）、HAE培養物はインビトロ中和アッセイを受け入れにくい。

防御効率を測定するため、図8の実験において免疫されたハムスターを、免疫後31日目に10⁶ PFUのwt RSVによってINチャレンジした。ハムスターを3日後に屠殺した。鼻甲介および肺を収集し、RSVプラークアッセイ滴定のために均質化した（図9）。鼻甲介において、wt Gを発現するベクター（図9A、レーン2）は、他のG構築物（レーン3～10）より有意に防御的であった。対照的に、sG構築物は、RSV中和抗体を誘導する能力の欠如（図9A、レーン3）と相関して防御的でなかった（図9A、レーン3）。構築物mG、G_B3CT、およびG_B3TMCTは、実質的な防御を誘導し（図9A、レーン4～6）；CX3C消失（レーン7および8）は、未修飾のwt G（レーン2）と比較して強烈に、sGおよび空のベクター（レーン1および3）と統計的に異ならないレベルにまで、防御を低下させた。B3CTおよびB3TMCT（図9A、レーン9および10）によるdCX3C変異体の増強されたパッケージングは、sGおよび空のベクター（レーン1および3）より有意に高いレベルにまで、防御効率をわずかに改善するようであった。wt RSV接種のみが、鼻甲介における完全な防御を達成した（図9A、レーン11）。wt RSVは、10倍高い用量で投与され、弱毒化されておらず、F中和抗原およびG中和抗原の両方を保持しており、ウイルス抗原の全てを発現し、従って、より広い細胞性免疫反応を誘導すると考えられるため、wt RSVによる優れた防御は、予想外ではなかった。ハムスターにおけるPIVによる研究において、キメラウイルスの内部タンパク質は、短期（1～2ヶ月）チャレンジにおいて防御を誘導するが、これは、4ヶ月までに減少することが示された（Tao T et al.,2000,Vaccine 18:1359-1366）。

RSVに対するベクターによって誘導された防御は、鼻甲介より肺において、はるかに高かった。wt G、mG、G_B3CT、およびB_B3TMCTを発現するベクターは、ほぼ完全な防御を付与した（図9B、レーン2および4～6）。しかし、4種のCXC3消失変異体のいずれかを発現するベクターは、防御性が低く、各群1～3匹のハムスターが完全には防御されなかった（図9B、レーン7～10）。鼻甲介において観察されたように、TMCT置換は、dCX3C構築物による防御のある程度の改善を示した（図9B、レーン10）。

（図8Aからの添加された補体の存在下で個々の動物について測定された）初回免疫後28日目の血清RSV中和抗体の力価を、同一の個体の鼻甲介（図9A）および肺（図9B）におけるチャレンジRSVの力価に対してプロットし、それぞれ、図9Cおよび9Dに示されるプロットを得た。これは、チャレンジウイルス力価の低下によって示された、鼻甲介または肺のいずれかにおけるチャレンジRSV複製に対する防御が、血清補体依存性RSV中和抗体の力価と強く相関することを示した（それぞれ、図9CおよびD）。

コドン最適化G ORF（wtG/GS-opt）
アミノ酸コードを変化させることなく、ヒト発現のためにコドン最適化（GenScript）されたRSV G ORFを発現するrB/HPIV3構築物（wtG/GS-opt、図1Aの構築物（x））は、他のベクターのものと類似した高レベルの効率で、Vero細胞およびLLCMK-2細胞において複製された。LLC-MK2細胞およびVero細胞における構築物wtG/GS-optによるGタンパク質の細胞内発現を、ウエスタンブロット分析によって評価した。LLC-MK2細胞およびVero細胞に、1細胞当たり10 TCID₅₀のMOIで、wtG/GS-optもしくはwtGを発現するrB/HPIV3を感染させるか、または1細胞当たり3 PFUのMOIで、wt RSVを感染させた。細胞を感染後24時間目に採集し、細胞溶解物を調製し、変性還元条件下でのゲル電気泳動に供し、RSVに対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した（図10AおよびB）。これは、コドン最適化バージョンが、最適化されていないwt ORFより、およそ2.2～2.3倍効率的に発現されることを示した（図10CおよびD）。

コドン最適化されたG ORFを発現するrB/HPIV3のインビボの複製および免疫原性を、未修飾のwt G ORFを発現するrB/HPIV3と平行して評価した。図7に記載された方法に従って、9匹の群のハムスターを、10⁴ TCID₅₀の示されたベクターまたは10⁶ PFUのwt RSVによってIN免疫した。血清を免疫後28日目に収集した。ハムスターを、10⁶ PFUのwt RSVによって30日目に鼻腔内チャレンジした。肺および鼻甲介を、チャレンジ後3日目に収集した。チャレンジRSV複製の力価を、Vero単層におけるプラークアッセイによって決定した。血清RSV中和抗体力価を、補体の存在下でプラーク低下中和によって評価した（図11）。野生型G（wt G）によって誘導された血清RSV中和抗体力価は、野生型F（wt F）によって誘導されたものよりわずかに高かったが、その差は有意ではなかった（図11、レーン2および3）。しかし、コドン最適化された野生型G（wtG/GS-opt）は、統計的に有意である、wt Fより2倍高い血清RSV中和抗体の力価を誘導した（図11、レーン2および4））。これは、RSV GのGSコドン最適化が、rB/HPIV3-RSV Gベクターの免疫原性を増強することを示した。血清RSV中和抗体の誘導における傾向と類似して、wt Gおよびwt G/GS-optは、鼻甲介においてRSVチャレンジに対してwt Fと比較して増加した防御を付与した（図12A）。肺において、wt Gおよびwt G/GS-optは、wt RSVと同様に、完全な防御を付与し（図12B、レーン3～5）、wt Fは、部分的にしか防御的でなかった（図12B、レーン2）。これらの結果は、wt Gを発現するrB/HPIV3が、ハムスターにおいて、wt Fを発現するrB/HPIV3より免疫原性であり、防御的であること；RSV GのGenScriptによるコドン最適化が、その免疫原性および防御効率を増強することを示した。

RSV Gによって誘導された血清抗体による線毛気道上皮細胞のRSV感染の阻止
インビボのGによって媒介される接着のための主要な受容体として同定されているCX3CR1表面タンパク質が、Vero細胞には欠損していることが公知である（Johnson SM et al.,2015,PLoS Pathog.,11:e1005318）。従って、Gによって誘導された抗体によるウイルス中和の重要な成分が、Vero細胞における中和アッセイによって見落とされる可能性がある。Gによって誘導される血清抗体の中和活性をよりよく評価するため、本発明者らは、インビボHAEを忠実に模倣することが示されており、CX3CR1を発現する、分化粘液線毛ヒト気道上皮（HAE）のインビトロモデルを使用して、血清中和アッセイを実施した（Johnson SM et al.,2015,PLoS Pathog.,11:e1005318）。HAE細胞を、培養物中の気液界面において分化させた。完全な分化が、共焦点顕微鏡法によって画像化された線毛細胞および密着結合の形成によって確認された。図8に示される実験からの免疫されたハムスターの血清を、HAEモデルにおいてRSV感染を阻止する能力について試験した。RSV-GFP（A2株）の等しいアリコートを、添加された補体の非存在下でハムスター血清と共にプレインキュベートし、次いで、HAE培養物を感染させるために使用した。接種物を感染後に除去し、細胞を気液界面において培養した。感染後48時間目に、感染細胞のGFP焦点を可視化し、定量化した（図13）。未感染培養物においては、自己蛍光細胞によるものである可能性が高い、培養物インサート1個当たりおよそ6個の焦点のバックグラウンドが存在した（図13、レーン1）。RSV-GFP感染培養物においては、平均およそ200（53～518の範囲）のGFP蛍光焦点が検出された（図13、レーン2）。空のベクターに感染したハムスター由来の血清とのRSV-GFPのプレインキュベーションは、HAE細胞におけるRSV感染に対する効果を有しなかった（図13、レーン3）。注目すべきことに、wt Gまたはwt RSVによって免疫されたハムスター由来の血清は、感染をほぼ完全に防止した（図13、レーン4および6）。驚くべきことに、wt RSV Fを発現するベクターによって免疫されたハムスター由来の血清は、このモデルにおいて阻害活性をほとんど示さなかった；しかし、（以前の研究からの、高品質中和抗体応答の陽性対照としてここで使用された）安定化された融合前（prefusion）Fを発現するベクターによって免疫されたハムスター由来の血清は、RSV感染を完全に阻止した（図13、レーン8）。興味深いことに、G_dCX3C構築物に感染したハムスターの血清は、wt Gによる血清と比較して、部分的にしか防御的でなかった（図13、レーン4および5）。これらの結果は、wt RSV Gが、添加された補体の非存在下でHAEにおけるRSV感染を効果的に防止することができる高品質中和抗体を誘導することを示した。さらに、CX3Cモチーフの完全性が、RSV Gによる血清中和抗体の誘導のために重要であった。予想外に、このアッセイにおいて、wt Gに対して産生された血清の中和活性は、wt Fに対するものより大きく、それは、接着に対する効果を反映している可能性が高い。これらの結果は、RSV Gに対する抗体が、真のHAEに密接に類似しているHAEのインビトロモデルにおけるRSVの中和において特に有効であり、従って、Gタンパク質が、RSVワクチンに含めるべき有効な抗原であり得ることを示している。

結論
RSV Gタンパク質内のCX3Cモチーフ、および可溶型のRSV G（sG）の発現が、RSV感染に対する宿主免疫応答に対して様々な有害な効果を有することを示すデータを、多数の研究が提供している。これには、数ある活性の中でもとりわけ、樹状細胞活性化の低下（Johnson et al.,2012,J.Virol.86:1339-1347）、炎症応答の強化（Johnson et al.,1998,J.Virol.72:2871-2880）、自然免疫の阻害（Shingai et al.,2008,Int.Immunol.20:1169-1180；Polack et al2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:8996-9001）、および免疫細胞応答の阻害（Chirkova et al.,2013,J.Virol.87:13466-13479）が含まれることが報告されている。これらの研究に基づき、CX3Cモチーフおよび/またはsGの消失は、より安全であり、より免疫原性であるワクチンを作成すると予想された（例えば、Boyoglu-Barnum et al.,"Mutating the CX3C Motif in the G Protein Should Make a Live Respiratory Syncytial Virus Vaccine Safer and More Effective," J.Virol.,91(10):e02059-16,2017；Chirskova et al.,2013,J.Virol.87:13466-13479）。

驚くべきことに、本実施例において提供されたデータは、sGの発現を消失させたmG構築物（構築物（ii）、図1A）が、rB/HPIV3ベクターから発現された時、wt Gタンパク質より中程度に低い免疫原性および防御性を有していたことを示している。sGタンパク質の発現の消失が免疫原性および防御を増加させなかったという所見は、免疫応答の障害におけるsGの仮定された役割に反していた。さらに、sGの増強された発現は、単独では、ベクターの複製またはベクターの免疫原性に影響しなかった。これは、（sGを発現する）wtGを（発現しない）mGと比較し、単独のsGタンパク質（構築物（iii）、図1A）の発現の効果を評価したところ、いずれも、ベクターの複製または免疫原性に影響しなかったことから明白であった。従って、sGが、RSV Gの免疫原性および防御効率またはベクターの複製および免疫原性に有意に影響するよう、宿主免疫応答に影響するという証拠は存在しなかった。

さらに、CX3Cモチーフの消失は、（補体ありでアッセイするか、なしでアッセイするかに関わらず）RSV Gの免疫原性およびRSVに対する防御効率を大いに低下させた。従って、前述の研究に反して、RSV Gのこの領域は、RSVの免疫原性および防御効率に対する正の効果を提供する。CX3Cドメインの消失は、ベクターの複製または免疫原性にも有意に影響しなかった。従って、このモチーフは、ベクターの複製または免疫原性に影響するために十分な肺免疫環境を変更しなかった。

この実施例は、sGタンパク質およびCX3CモチーフのようなRSV Gタンパク質の特色が、rB/HPIV3ベクターから発現されたGタンパク質の免疫原性および防御効率を損なわないことを示す。wt G外部ドメインを発現するrB/HPIV3に基づく免疫原が、RSV Gに対する免疫応答を誘導するために好ましいことが同定された。驚くべきことに、wt G構築物は、RSVが10倍高い用量で投与され、弱毒化されておらず、F中和抗原およびG中和抗原の両方を保持しているにも関わらず、wt RSVによって誘導されたものと有意に異ならない、補体の存在下でアッセイされた血清RSV中和抗体の力価を誘導した。さらに、HAEアッセイ（図13）は、wt Gによって誘導された抗体が、インビボのRSV複製の優勢な部位であるインビボHAEに密接に類似しているモデルにおいて、感染を完全に阻止し、wt Fによって誘導された抗体は、そうでないことを示した。RSV Gタンパク質は、しばしば、Fと比較して、二次的な中和および防御の抗原であると見なされる。本発明のデータは、この見解を改訂し、Gタンパク質が、中和を改善することができる（防御も改善することができる可能性が高い）ことを示す。これは、RSV Gを発現するベクターをRSV免疫プロトコルに含めることによって、中和および防御が改善されたことを示唆しており、この寄与は、RSVのためのCX3CR受容体を含んでいない従来の中和アッセイによっては理解されない。

例示的なアンチゲノムcDNA配列：
rB/HPIV3-RSV wt G（SEQ ID NO:91）：

rB/HPIV3-RSV wt G/GS-opt（SEQ ID NO:92）：

rB/HPIV3-RSV G_B3TMCT（SEQ ID NO:93）：

rB/HPIV3-RSV G_B3CT（SEQ ID NO:94）：

記載された方法または組成物の正確な詳細が、記載された態様の本旨から逸脱することなく、多様化されてもよいし、または修飾されてもよいことは、明白であろう。本発明者らは、下記の特許請求の範囲の範囲および本旨に含まれるそのような修飾および多様化を全て主張する。

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> The United States of America, as represented by the
Secretary, Department of Health and Human Services
<120> RECOMBINANT CHIMERIC BOVINE/HUMAN PARAINFLUENZA VIRUS 3
EXPRESSING RSV G AND ITS USE
<150> US 62/512,111
<151> 2017-05-29
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 515
<212> PRT
<213> bovine parainfluenza virus 3
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Gly Thr Leu Ala Phe Tyr Thr Pro Asn Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser
435 440 445
Val Ala Leu Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys
450 455 460
Ser Asp Leu Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys
465 470 475 480
Leu Asp Ser Ile Gly Asn Trp His Gln Ser Ser Thr Thr Ile Ile Ile
485 490 495
Ile Leu Ile Met Ile Ile Ile Leu Phe Ile Ile Asn Ile Thr Ile Ile
500 505 510
Thr Ile Ala Ile Lys Tyr Tyr Arg Ile Gln Lys Arg Asn Arg Val Asp
515 520 525
Gln Asn Asp Lys Pro Tyr Val Leu Thr Asn Lys
530 535

<210> 7
<211> 572
<212> PRT
<213> human parainfluenza virus 3
<400> 7
Met Glu Tyr Trp Lys His Thr Asn His Gly Lys Asp Ala Gly Asn Glu
1 5 10 15
Leu Glu Thr Ser Met Ala Thr His Gly Asn Lys Leu Thr Asn Lys Ile
20 25 30
Ile Tyr Ile Leu Trp Thr Ile Ile Leu Val Leu Leu Ser Ile Val Phe
35 40 45
Ile Ile Val Leu Ile Asn Ser Ile Lys Ser Glu Lys Ala His Glu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Gly Leu Pro Ser Leu Met Lys Thr Pro Lys Ile Arg Leu Met Pro
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275 280 285
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Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys Ser Cys Ser
565 570

<210> 8
<211> 572
<212> PRT
<213> human parainfluenza virus 3
<400> 8
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Ile Ile Val Leu Ile Asn Ser Ile Lys Ser Glu Lys Ala His Glu Ser
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130 135 140
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145 150 155 160
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Ser Leu Ala Leu Leu Asn Ile Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro
260 265 270
Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Glu Asp Ile
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Val Leu Asp Ile Val Asn Tyr Asp Gly Ser Ile Ser Thr Thr Arg Phe
290 295 300
Lys Asn Asn Asn Ile Ser Phe Asp Gln Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro
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Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Gly Lys Ile Ile Phe Leu Gly
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Gln Leu Gly Ile Ile Asp Ile Thr Asp Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Lys
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<210> 9
<211> 1719
<212> DNA
<213> human parainfluenza virus 3
<400> 9
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atggctactc atggcaacaa gctcactaat aagataatat acatattatg gacaataatc 120
ctggtgttat tatcaatagt cttcatcata gtgctaatta attccatcaa aagtgaaaag 180
gcccacgaat cattgctgca agacataaat aatgagttta tggaaattac agaaaagatc 240
caaatggcat cggataatac caatgatcta atacagtcag gagtgaatac aaggcttctt 300
acaattcaga gtcatgtcca gaattacata ccaatatcat tgacacaaca gatgtcagat 360
cttaggaaat tcattagtga aattacaatt agaaatgata atcaagaagt gctgccacaa 420
agaataacac atgatgtagg tataaaacct ttaaatccag atgatttttg gagatgcacg 480
tctggtcttc catctttaat gaaaactcca aaaataaggt taatgccagg gccgggatta 540
ttagctatgc caacgactgt tgatggctgt gttagaactc cgtctttagt tataaatgat 600
ctgatttatg cttatacctc aaatctaatt actcgaggtt gtcaggatat aggaaaatca 660
tatcaagtct tacagatagg gataataact gtaaactcag acttggtacc tgacttaaat 720
cctaggatct ctcatacctt taacataaat gacaatagga agtcatgttc tctagcactc 780
ctaaatatag atgtatatca actgtgttca actcccaaag ttgatgaaag atcagattat 840
gcatcatcag gcatagaaga tattgtactt gatattgtca attatgatgg ttcaatctca 900
acaacaagat ttaagaataa taacataagc tttgatcaac catatgctgc actataccca 960
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gaacatccaa taaatgagaa tgtaatctgc aacacaactg ggtgccccgg gaaaacacag 1080
agagactgta atcaagcatc tcatagtact tggttttcag ataggaggat ggtcaactcc 1140
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atatatacaa gatctacaag ttggcatagc aagttacaat taggaataat tgatattact 1320
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aatgaatgtc catggggaca ttcatgtcca gatggatgta taacaggagt atatactgat 1440
gcatatccac tcaatcccac agggagcatt gtgtcatctg tcatattaga ctcacaaaaa 1500
tcgagagtga acccagtcat aacttactca acagcaaccg aaagagtaaa cgagctggcc 1560
atcctaaaca gaacactctc agctggatat acaacaacaa gctgcattac acactataac 1620
aaaggatatt gttttcatat agtagaaata aatcataaaa gcttaaacac atttcaaccc 1680
atgttgttca aaacagagat tccaaaaagc tgcagttaa 1719

<210> 10
<211> 2233
<212> PRT
<213> bovine parainfluenza virus 3
<400> 10
Met Asp Thr Glu Ser His Ser Gly Thr Thr Ser Asp Ile Leu Tyr Pro
1 5 10 15
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Ile Leu Ile Ile Thr Arg Gln Lys Ile Lys Leu Asn Lys Leu Asp Lys
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Ser Asp Leu Gly Lys Tyr Thr Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Met Ser Ser
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1655 1660 1665
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Ile Arg Gly Ile Asn Pro Pro Glu Thr Ile Glu Asp Trp Asp Pro
1685 1690 1695
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1790 1795 1800
Arg Leu Phe Leu Gly Glu Gly Ala Gly Ala Met Leu Ala Cys Tyr
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1820 1825 1830
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Ser Glu Val Ser Leu Val Gly Lys Lys Leu Gly Asn Val Thr Gln
1850 1855 1860
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ccacaacagt caagaccaaa aacacaacaa caactcaaac acaacccagc aagcccacca 2160
caaaacaacg ccaaaacaaa ccaccaagca aacccaataa tgattttcac tttgaagtgt 2220
tcaactttgt accctgcagc atatgcagca acaatccaac ctgctgggct atctgcaaaa 2280
gaataccaaa caaaaaacca ggaaagaaaa ccactaccaa gcccacaaaa aaaccaaccc 2340
tcaagacaac caaaaaagat cccaaacctc aaaccactaa atcaaaggaa gtacccacca 2400
ccaagcccac agaagagcca accatcaaca ccaccaaaac aaacatcata actacactac 2460
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catggattct tgggaagagg gatcaggaga taaatcatct gacatctcat cggccctcga 2820
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<210> 92
<211> 16386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant rB/HPIV3 sequence
<400> 92
accaaacaag agaagagact ggtttgggaa tattaattca aataaaaatt aacttaggat 60
taaagaactt taccgaaagg taaggggaaa gaaatcctaa gagcttagcc atgttgagtc 120
tattcgacac attcagtgcg cgtaggcagg agaacataac gaaatcagct ggtggggctg 180
ttattcccgg gcaaaaaaac actgtgtcta tatttgctct tggaccatca ataacagatg 240
acaatgataa aatgacattg gctcttctct ttttgtctca ttctttagac aatgaaaagc 300
agcatgcgca aagagctgga tttttagttt ctctgttatc aatggcttat gccaacccag 360
aattatattt aacatcaaat ggtagtaatg cagatgttaa atatgttatc tacatgatag 420
agaaagaccc aggaagacag aaatatggtg ggtttgtcgt caagactaga gagatggttt 480
atgaaaagac aactgattgg atgttcggga gtgatcttga gtatgatcaa gacaatatgt 540
tgcaaaatgg tagaagcact tctacaatcg aggatcttgt tcatactttt ggatatccat 600
cgtgtcttgg agcccttata atccaagttt ggataatact tgttaaggct ataaccagta 660
tatcaggatt gaggaaagga ttctttactc ggttagaagc atttcgacaa gatggaacag 720
ttaaatccag tctagtgttg agcggtgatg cagtagaaca aattggatca attatgaggt 780
cccaacagag cttggtaaca ctcatggttg aaacactgat aacaatgaac acaggcagga 840
atgatctgac aacaatagaa aagaatatac agattgtagg aaactacatc agagatgcag 900
gtcttgcttc atttttcaac acaatcagat atggcattga gactagaatg gcagctctaa 960
ctctgtctac ccttagaccg gatatcaaca gactcaaggc actgatcgag ttatatctat 1020
caaaggggcc acgtgctcct tttatatgca ttttgagaga tcccgtgcat ggtgagtttg 1080
caccaggcaa ctatcctgcc ctctggagtt atgcgatggg tgtagcagtt gtacaaaaca 1140
aggccatgca acagtatgta acaggaaggt cttatctgga tattgaaatg ttccaacttg 1200
gtcaagcagt ggcacgtgat gccgagtcgc agatgagttc aatattagag gatgaactgg 1260
gggtcacaca agaagccaag caaagcttga agaaacacat gaagaacatc agcagttcag 1320
atacaacctt tcataagcct acagggggat cagccataga aatggcgata gatgaagaag 1380
cagggcagcc tgaatccaga ggagatcagg atcaaggaga tgagcctcgg tcatccatag 1440
ttccttatgc atgggcagac gaaaccggga atgacaatca aactgaatca actacagaaa 1500
ttgacagcat caaaactgaa caaagaaaca tcagagacag gctgaacaaa agactcaacg 1560
agaaaaggaa acagagtgac ccgagatcaa ctgacatcac aaacaacaca aatcaaactg 1620
aaatagatga tttgttcagt gcattcggaa gcaactagtc acaaagagat gaccaggcgc 1680
gccaagtaag aaaaacttag gattaatgga cctgcaggat gtcaaagaac aaggatcaga 1740
gaactgccaa gaccctggaa agaacctggg acaccctgaa ccacctgctg tttatctcaa 1800
gctgcctgta caagctgaat ctgaaaagtg tggcccagat caccctgtca attctggcta 1860
tgatcatttc aacaagcctg atcattgccg ctatcatttt catcgcaagc gccaaccaca 1920
aggtcacccc caccacagct atcattcagg acgcaacatc ccagattaag aacactaccc 1980
ccacctatct gacacagaat cctcagctgg gaatctcccc atctaacccc tcagagatta 2040
ccagccagat cacaactatt ctggcctcca ccacacctgg cgtgaagtcc actctgcagt 2100
ctactaccgt caagaccaaa aatacaacta ccacacagac acagccttct aagccaacta 2160
ccaaacagcg gcagaataag ccccctagta aaccaaacaa tgacttccat tttgaggtgt 2220
tcaactttgt cccatgcagc atctgttcca acaatcccac ctgctgggcc atctgtaaga 2280
gaattccaaa caagaaaccc ggcaagaaga ccactaccaa acctactaag aaaccaaccc 2340
tgaagacaac taagaaagat cctaaaccac agaccacaaa gtctaaagaa gtgcccacta 2400
ccaagcctac agaggaacca actatcaaca caactaagac taacatcatc accacactgc 2460
tgacaagcaa cactaccggc aatcccgagc tgaccagcca gatggaaacc tttcactcca 2520
caagctccga ggggaatccc agtccttcac aggtgtctac aactagtgaa taccccagcc 2580
agccttctag tccacccaac acccctaggc agtgatagct agcggcgcgc cagcaacaag 2640
taagaaaaac ttaggattaa tggaaattat ccaatccaga gacggaagga caaatccaga 2700
atccaaccac aactcaatca accaaagatt catggaagac aatgttcaaa acaatcaaat 2760
catggattct tgggaagagg gatcaggaga taaatcatct gacatctcat cggccctcga 2820
catcattgaa ttcatactca gcaccgactc ccaagagaac acggcagaca gcaatgaaat 2880
caacacagga accacaagac ttagcacgac aatctaccaa cctgaatcca aaacaacaga 2940
aacaagcaag gaaaatagtg gaccagctaa caaaaatcga cagtttgggg catcacacga 3000
acgtgccaca gagacaaaag atagaaatgt taatcaggag actgtacagg gaggatatag 3060
gagaggaagc agcccagata gtagaactga gactatggtc actcgaagaa tctccagaag 3120
cagcccagat cctaacaatg gaacccaaat ccaggaagat attgattaca atgaagttgg 3180
agagatggat aaggactcta ctaagaggga aatgcgacaa tttaaagatg ttccagtcaa 3240
ggtatcagga agtgatgcca ttcctccaac aaaacaagat ggagacggtg atgatggaag 3300
aggcctggaa tctatcagta catttgattc aggatatacc agtatagtga ctgccgcaac 3360
actagatgac gaagaagaac tccttatgaa gaacaacagg ccaagaaagt atcaatcaac 3420
accccagaac agtgacaagg gaattaaaaa aggggttgga aggccaaaag acacagacaa 3480
acaatcatca atattggact acgaactcaa cttcaaagga tcgaagaaga gccagaaaat 3540
cctcaaagcc agcacgaata caggagaacc aacaagacca cagaatggat cccaggggaa 3600
gagaatcaca tcctggaaca tcctcaacag cgagagcggc aatcgaacag aatcaacaaa 3660
ccaaacccat cagacatcaa cctcgggaca gaaccacaca atgggaccaa gcagaacaac 3720
ctccgaacca aggatcaaga cacaaaagac ggatggaaag gaaagagagg acacagaaga 3780
gagcactcga tttacagaaa gggcgattac attattacag aatcttggtg taatccaatc 3840
tgcagcaaaa ttagacctat accaagacaa gagagttgtg tgtgtggcga atgtcctaaa 3900
caatgcagat actgcatcaa agatagactt cctagcaggt ttgatgatag gagtgtcaat 3960
ggatcatgat accaaattaa atcagattca gaacgagata ttaagtttga aaactgatct 4020
taaaaagatg gatgaatcac atagaagact aattgagaat caaaaagaac aattatcact 4080
gatcacatca ttaatctcaa atcttaaaat tatgacagag agaggaggga agaaggacca 4140
accagaacct agcgggagga catccatgat caagacaaaa gcaaaagaag agaaaataaa 4200
gaaagtcagg tttgaccctc ttatggaaac acagggcatc gagaaaaaca tccctgacct 4260
ctatagatca atagagaaaa caccagaaaa cgacacacag atcaaatcag aaataaacag 4320
attgaatgat gaatccaatg ccactagatt agtacctaga agaataagca gtacaatgag 4380
atcattaata ataatcatta acaacagcaa tttatcatca aaagcaaagc aatcatacat 4440
caacgaactc aagctctgca agagtgacga ggaagtgtct gagttgatgg acatgttcaa 4500
tgaggatgtc agctcccagt aaaccgccaa ccaagggtca acaccaagaa aaccaatagc 4560
acaaaacagc caatcagaga ccaccccaat acaccaaacc aatcaacaca taacaaagat 4620
cgcggccgca tagatgatta agaaaaactt aggatgaaag gactaatcaa tcctccgaaa 4680
caatgagcat caccaactcc acaatctaca cattcccaga atcctctttc tccgagaatg 4740
gcaacataga gccgttacca ctcaaggtca atgaacagag aaaggccata cctcatatta 4800
gggttgtcaa gataggagat ccgcccaaac atggatccag atatctggat gtctttttac 4860
tgggcttctt tgagatggaa aggtcaaaag acaggtatgg gagcataagt gatctagatg 4920
atgatccaag ttacaaggtt tgtggctctg gatcattgcc acttgggttg gctagataca 4980
ccggaaatga tcaggaactc ctacaggctg caaccaagct cgatatagaa gtaagaagaa 5040
ctgtaaaggc tacggagatg atagtttaca ctgtacaaaa catcaaacct gaactatatc 5100
catggtccag tagattaaga aaagggatgt tatttgacgc taataaggtt gcacttgctc 5160
ctcaatgtct tccactagat agagggataa aattcagggt gatatttgtg aactgcacag 5220
caattggatc aataactcta ttcaaaatcc ctaagtccat ggcattgtta tcattgccta 5280
atacaatatc aataaatcta caagtacata tcaaaacagg agttcagaca gattccaaag 5340
gagtagttca gattctagat gaaaaaggtg aaaaatcact aaatttcatg gttcatctcg 5400
ggttgatcaa aaggaagatg ggcagaatgt actcagttga atattgtaag cagaagatcg 5460
agaagatgag attattattc tcattgggat tagttggagg gatcagcttc cacgtcaacg 5520
caactggctc tatatcaaag acattagcaa gtcaattagc attcaaaaga gaaatctgct 5580
atcccctaat ggatctgaat ccacacttaa attcagttat atgggcatca tcagttgaaa 5640
ttacaagggt agatgcagtt ctccagcctt cattacctgg cgaattcaga tactacccaa 5700
acatcatagc aaaaggggtc gggaaaatca gacagtaaaa tcaacaaccc tgatatccac 5760
cggtgtatta agccgaagca aataaaggat aatcaaaaac ttaggacaaa agaggtcaat 5820
accaacaact attagcagtc acactcgcaa gaataagaga gaagggacca aaaaagtcaa 5880
ataggagaaa tcaaaacaaa aggtacagaa caccagaaca acaaaatcaa aacatccaac 5940
tcactcaaaa caaaaattcc aaaagagacc ggcaacacaa caagcactga acacaatgcc 6000
aacttcaata ctgctaatta ttacaaccat gatcatggca tctttctgcc aaatagatat 6060
cacaaaacta cagcacgtag gtgtattggt caacagtccc aaagggatga agatatcaca 6120
aaactttgaa acaagatatc taattttgag cctcatacca aaaatagaag actctaactc 6180
ttgtggtgac caacagatca agcaatacaa gaagttattg gatagactga tcatcccttt 6240
atatgatgga ttaagattac agaaagatgt gatagtaacc aatcaagaat ccaatgaaaa 6300
cactgatccc agaacaaaac gattctttgg aggggtaatt ggaaccattg ctctgggagt 6360
agcaacctca gcacaaatta cagcggcagt tgctctggtt gaagccaagc aggcaagatc 6420
agacatcgaa aaactcaaag aagcaattag ggacacaaac aaagcagtgc agtcagttca 6480
gagctccata ggaaatttaa tagtagcaat taaatcagtc caggattatg ttaacaaaga 6540
aatcgtgcca tcgattgcga ggctaggttg tgaagcagca ggacttcaat taggaattgc 6600
attaacacag cattactcag aattaacaaa catatttggt gataacatag gatcgttaca 6660
agaaaaagga ataaaattac aaggtatagc atcattatac cgcacaaata tcacagaaat 6720
attcacaaca tcaacagttg ataaatatga tatctatgat ctgttattta cagaatcaat 6780
aaaggtgaga gttatagatg ttgacttgaa tgattactca atcaccctcc aagtcagact 6840
ccctttatta actaggctgc tgaacactca gatctacaaa gtagattcca tatcatataa 6900
catccaaaac agagaatggt atatccctct tcccagccat atcatgacga aaggggcatt 6960
tctaggtgga gcagacgtca aagaatgtat agaagcattc agcagctata tatgcccttc 7020
tgatccagga tttgtattaa accatgaaat agagagctgc ttatcaggaa acatatccca 7080
atgtccaaga acaacggtca catcagacat tgttccaaga tatgcatttg tcaatggagg 7140
agtggttgca aactgtataa caaccacctg tacatgcaac ggaattggta atagaatcaa 7200
tcaaccacct gatcaaggag taaaaattat aacacataaa gaatgtagta caataggtat 7260
caacggaatg ctgttcaata caaataaaga aggaactctt gcattctata caccaaatga 7320
tataacacta aacaattctg ttgcacttga tccaattgac atatcaatcg agctcaacaa 7380
ggccaaatca gatctagaag aatcaaaaga atggataaga aggtcaaatc aaaaactaga 7440
ttctattgga aattggcatc aatctagcac tacaatcata attattttga taatgatcat 7500
tatattgttt ataattaata taacgataat tacaattgca attaagtatt acagaattca 7560
aaagagaaat cgagtggatc aaaatgacaa gccatatgta ctaacaaaca aataacatat 7620
ctacagatca ttagatatta aaattataaa aaacttagga gtaaagttac gcaatccaac 7680
tctactcata taattgagga aggacccaat agacaaatcc aaattcgaga tggaatactg 7740
gaagcatacc aatcacggaa aggatgctgg taatgagctg gagacgtcta tggctactca 7800
tggcaacaag ctcactaata agataatata catattatgg acaataatcc tggtgttatt 7860
atcaatagtc ttcatcatag tgctaattaa ttccatcaaa agtgaaaagg cccacgaatc 7920
attgctgcaa gacataaata atgagtttat ggaaattaca gaaaagatcc aaatggcatc 7980
ggataatacc aatgatctaa tacagtcagg agtgaataca aggcttctta caattcagag 8040
tcatgtccag aattacatac caatatcatt gacacaacag atgtcagatc ttaggaaatt 8100
cattagtgaa attacaatta gaaatgataa tcaagaagtg ctgccacaaa gaataacaca 8160
tgatgtaggt ataaaacctt taaatccaga tgatttttgg agatgcacgt ctggtcttcc 8220
atctttaatg aaaactccaa aaataaggtt aatgccaggg ccgggattat tagctatgcc 8280
aacgactgtt gatggctgtg ttagaactcc gtctttagtt ataaatgatc tgatttatgc 8340
ttatacctca aatctaatta ctcgaggttg tcaggatata ggaaaatcat atcaagtctt 8400
acagataggg ataataactg taaactcaga cttggtacct gacttaaatc ctaggatctc 8460
tcataccttt aacataaatg acaataggaa gtcatgttct ctagcactcc taaatacaga 8520
tgtatatcaa ctgtgttcaa ctcccaaagt tgatgaaaga tcagattatg catcatcagg 8580
catagaagat attgtacttg atattgtcaa ttatgatggt tcaatctcaa caacaagatt 8640
taagaataat aacataagct ttgatcaacc atatgctgca ctatacccat ctgttggacc 8700
agggatatac tacaaaggca aaataatatt tctcgggtat ggaggtcttg aacatccaat 8760
aaatgagaat gtaatctgca acacaactgg gtgccccggg aaaacacaga gagactgtaa 8820
tcaagcatct catagtccat ggttttcaga taggaggatg gtcaactcca tcattgttgt 8880
tgacaaaggc ttaaactcaa ttccaaaatt gaaagtatgg acgatatcta tgcgacaaaa 8940
ttactggggg tcagaaggaa ggttacttct actaggtaac aagatctata tatatacaag 9000
atctacaagt tggcatagca agttacaatt aggaataatt gatattactg attacagtga 9060
tataaggata aaatggacat ggcataatgt gctatcaaga ccaggaaaca atgaatgtcc 9120
atggggacat tcatgtccag atggatgtat aacaggagta tatactgatg catatccact 9180
caatcccaca gggagcattg tgtcatctgt catattagac tcacaaaaat cgagagtgaa 9240
cccagtcata acttactcaa cagcaaccga aagagtaaac gagctggcca tcctaaacag 9300
aacactctca gctggatata caacaacaag ctgcattaca cactataaca aaggatattg 9360
ttttcatata gtagaaataa atcataaaag cttaaacaca tttcaaccca tgttgttcaa 9420
aacagagatt ccaaaaagct gcagttaatc ataattaacc ataatatgca tcaatctatc 9480
tataatacaa gtatatgata agtaatcagc aatcagacaa tagacgtacg gaaataataa 9540
aaaacttagg agaaaagtgt gcaagaaaaa tggacaccga gtcccacagc ggcacaacat 9600
ctgacattct gtaccctgaa tgtcacctca attctcctat agttaaagga aagatagcac 9660
aactgcatac aataatgagt ttgcctcagc cctacgatat ggatgatgat tcaatactga 9720
ttattactag acaaaaaatt aaactcaata aattagataa aagacaacgg tcaattagga 9780
aattaagatc agtcttaatg gaaagagtaa gtgatctagg taaatatacc tttatcagat 9840
atccagagat gtctagtgaa atgttccaat tatgtatacc cggaattaat aataaaataa 9900
atgaattgct aagtaaagca agtaaaacat ataatcaaat gactgatgga ttaagagatc 9960
tatgggttac tatactatcg aagttagcat cgaaaaatga tggaagtaat tatgatatca 10020
atgaagatat tagcaatata tcaaatgttc acatgactta tcaatcagac aaatggtata 10080
atccattcaa gacatggttt actattaagt atgacatgag aagattacaa aaagccaaaa 10140
atgagattac attcaatagg cataaagatt ataatctatt agaagaccaa aagaatatat 10200
tgctgataca tccagaactc gtcttaatat tagataaaca aaattacaat gggtatataa 10260
tgactcctga attggtacta atgtattgtg atgtagttga agggaggtgg aatataagtt 10320
catgtgcaaa attggatcct aagttacaat caatgtatta taagggtaac aatttatggg 10380
aaataataga tggactattc tcgaccttag gagaaagaac atttgacata atatcactat 10440
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cttttttaaa tcacgtgtta tcagaaatgg aattaatatt tgcagctgag tgtacaacag 10560
aggaaatacc taatgtggat tatatagata aaattttaga tgtgttcaaa gaatcaacaa 10620
tagatgaaat agcagaaatt ttctctttct tccgaacttt tggacaccct ccattagagg 10680
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atgcatacgg atcaaattct gccatatcat atgagaatgc tgtagattat tataagagct 10920
tcataggaat aaaatttgac aagtttatag agcctcaatt ggatgaagac ttaactattt 10980
atatgaaaga taaagcatta tccccaaaga aatcaaactg ggacacagtc tatccagctt 11040
caaacctgtt ataccgcact aatgtgtctc atgattcacg aagattggtt gaagtattta 11100
tagcagatag taaatttgat ccccaccaag tattagatta cgtagaatca ggatattggc 11160
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attgcccgcc atcagatatt gaacatttac cacttgatga ccatcctgat tcaggatttt 11760
atgttcataa tcctaaagga ggaatagaag ggttttgcca aaagttatgg acactcatat 11820
ctatcagtgc aatacattta gcagctgtca aaatcggtgt aagagttact gcaatggttc 11880
aaggggataa tcaagccata gctgttacca caagagtacc taataattat gattataaag 11940
ttaagaaaga gattgtttat aaagatgtgg taagattttt tgattccttg agagaggtga 12000
tggatgatct gggtcatgag ctcaaactaa atgaaactat aataagtagt aaaatgttta 12060
tatatagcaa aaggatatac tatgacggaa gaatccttcc tcaggcatta aaagcattgt 12120
ctagatgtgt tttttggtct gaaacaatca tagatgagac aagatcagca tcctcaaatc 12180
tggctacatc gtttgcaaag gccattgaga atggctactc acctgtattg ggatatgtat 12240
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ttttagactg ggcctcagat ccctattcat gtaacttacc acaatctcaa aatataacca 12600
ccatgataaa gaatataact gcaagaaatg tactacagga ctcaccaaac ccattactat 12660
ctggattatt tacaagtaca atgatagaag aggatgagga attagctgag ttcctaatgg 12720
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gcagaggagg attaacctat aacttattaa gaaagataag caactatgat cttgtacaat 12900
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tgtgctcagt agacctagcc atatcattaa gacaaaaaat gtggatgcat ttatcaggag 13020
gaagaatgat aaatggactt gaaactccag atcctttaga gttactgtct ggagtaataa 13080
taacaggatc tgaacattgt aggatatgtt attcaactga aggtgaaagc ccatatacat 13140
ggatgtattt accaggcaat cttaatatag gatcagctga gacaggaata gcatcattaa 13200
gggtccctta ctttggatca gttacagatg agagatctga agcacaatta gggtatatca 13260
aaaatctaag caaaccagct aaggctgcta taagaatagc aatgatatat acttgggcat 13320
ttgggaatga cgaaatatct tggatggaag catcacagat tgcacaaaca cgtgcaaact 13380
ttacattgga tagcttaaag attttgacac cagtgacaac atcaacaaat ctatcacaca 13440
ggttaaaaga tactgctact cagatgaaat tttctagtac atcacttatt agagtaagca 13500
ggttcatcac aatatctaat gataatatgt ctattaaaga agcaaatgaa actaaagata 13560
caaatcttat ttatcaacag gtaatgttaa caggattaag tgtatttgaa tatctattta 13620
ggttagagga gagtacagga cataacccta tggtcatgca tctacatata gaggatggat 13680
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tcaaataccc tgagagtaat gaatttatat atgataagga ccctttaaag gatatagatc 13800
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acacagatat tgtacatgca atatcaatat gtactgcagt tacaatagca gatacaatgt 13920
cgcagctaga tcgggataat cttaaggagc tggttgtgat tgcaaatgat gatgatatta 13980
acagtctgat aactgaattt ctgaccctag atatactagt gtttctcaaa acatttggag 14040
ggttactcgt gaatcaattt gcatataccc tttatggatt gaaaatagaa ggaagggatc 14100
ccatttggga ttatataatg agaacattaa aagacacctc acattcagta cttaaagtat 14160
tatctaatgc actatctcat ccaaaagtgt ttaagagatt ttgggattgt ggagttttga 14220
atcctattta tggtcctaat actgctagtc aagatcaagt taagcttgct ctctcgattt 14280
gcgagtactc cttggatcta tttatgagag aatggttgaa tggagcatca cttgagatct 14340
atatctgtga tagtgacatg gaaatagcaa atgacagaag acaagcattt ctctcaagac 14400
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taacatatct agagagactt gatgaattaa aacaatactt agatctgaac atcaaagaag 14520
atcctactct taaatatgtg caagtatcag gactgttaat taaatcattc ccctcaactg 14580
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aaacgattga agattgggat cccatagaag atgagaatat cttagacaat attgttaaaa 14700
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aagttagaaa gtatatgtat actgagaaat gcttgaaatt tgatactatc aataaatgtc 10740
atgctatttt ttgtacaata attataaatg gatatagaga aagacatggt ggtcaatggc 10800
ctccagttac attacctgtc catgcacatg aatttatcat aaatgcatac ggatcaaatt 10860
ctgccatatc atatgagaat gctgtagatt attataagag cttcatagga ataaaatttg 10920
acaagtttat agagcctcaa ttggatgaag acttaactat ttatatgaaa gataaagcat 10980
tatccccaaa gaaatcaaac tgggacacag tctatccagc ttcaaacctg ttataccgca 11040
ctaatgtgtc tcatgattca cgaagattgg ttgaagtatt tatagcagat agtaaatttg 11100
atccccacca agtattagat tacgtagaat caggatattg gctggatgat cctgaattta 11160
atatctcata tagtttaaaa gagaaagaaa taaaacaaga aggtagactt tttgcaaaaa 11220
tgacatacaa gatgagggct acacaagtat tatcagaaac attattggcg aataatatag 11280
ggaaattctt ccaagagaat gggatggtta aaggagaaat tgaattactc aagagactaa 11340
caacaatatc tatgtctgga gttccgcggt ataatgaggt atacaataat tcaaaaagtc 11400
acacagaaga acttcaagct tataatgcaa ttagcagttc caatttatct tctaatcaga 11460
agtcaaagaa gtttgaattt aaatctacag atatatacaa tgatggatac gaaaccgtaa 11520
gctgcttctt aacgacagat cttaaaaaat attgtttaaa ttggaggtat gaatcaacag 11580
ctttattcgg tgatacttgt aatcagatat ttgggttaaa ggaattattt aattggctgc 11640
accctcgcct tgaaaagagt acaatatatg ttggagatcc ttattgcccg ccatcagata 11700
ttgaacattt accacttgat gaccatcctg attcaggatt ttatgttcat aatcctaaag 11760
gaggaataga agggttttgc caaaagttat ggacactcat atctatcagt gcaatacatt 11820
tagcagctgt caaaatcggt gtaagagtta ctgcaatggt tcaaggggat aatcaagcca 11880
tagctgttac cacaagagta cctaataatt atgattataa agttaagaaa gagattgttt 11940
ataaagatgt ggtaagattt tttgattcct tgagagaggt gatggatgat ctgggtcatg 12000
agctcaaact aaatgaaact ataataagta gtaaaatgtt tatatatagc aaaaggatat 12060
actatgacgg aagaatcctt cctcaggcat taaaagcatt gtctagatgt gttttttggt 12120
ctgaaacaat catagatgag acaagatcag catcctcaaa tctggctaca tcgtttgcaa 12180
aggccattga gaatggctac tcacctgtat tgggatatgt atgctcaatc ttcaaaaata 12240
tccaacagtt gtatatagcg cttggaatga atataaaccc aactataacc caaaatatta 12300
aagatcaata tttcaggaat attcattgga tgcaatatgc ctccttaatc cctgctagtg 12360
tcggaggatt taattatatg gccatgtcaa ggtgttttgt cagaaacatt ggagatccta 12420
cagtcgctgc gttagccgat attaaaagat ttataaaagc aaatttgtta gatcgaggtg 12480
tcctttacag aattatgaat caagaaccag gcgagtcttc ttttttagac tgggcctcag 12540
atccctattc atgtaactta ccacaatctc aaaatataac caccatgata aagaatataa 12600
ctgcaagaaa tgtactacag gactcaccaa acccattact atctggatta tttacaagta 12660
caatgataga agaggatgag gaattagctg agttcctaat ggacaggaga ataatcctcc 12720
caagagttgc acatgacatt ttagataatt ctcttactgg aattaggaat gctatagctg 12780
gtatgttgga tacaacaaaa tcactaattc gagtagggat aagcagagga ggattaacct 12840
ataacttatt aagaaagata agcaactatg atcttgtaca atatgagaca cttagtaaaa 12900
ctttaagact aatagtcagt gacaagatta agtatgaaga tatgtgctca gtagacctag 12960
ccatatcatt aagacaaaaa atgtggatgc atttatcagg aggaagaatg ataaatggac 13020
ttgaaactcc agatccttta gagttactgt ctggagtaat aataacagga tctgaacatt 13080
gtaggatatg ttattcaact gaaggtgaaa gcccatatac atggatgtat ttaccaggca 13140
atcttaatat aggatcagct gagacaggaa tagcatcatt aagggtccct tactttggat 13200
cagttacaga tgagagatct gaagcacaat tagggtatat caaaaatcta agcaaaccag 13260
ctaaggctgc tataagaata gcaatgatat atacttgggc atttgggaat gacgaaatat 13320
cttggatgga agcatcacag attgcacaaa cacgtgcaaa ctttacattg gatagcttaa 13380
agattttgac accagtgaca acatcaacaa atctatcaca caggttaaaa gatactgcta 13440
ctcagatgaa attttctagt acatcactta ttagagtaag caggttcatc acaatatcta 13500
atgataatat gtctattaaa gaagcaaatg aaactaaaga tacaaatctt atttatcaac 13560
aggtaatgtt aacaggatta agtgtatttg aatatctatt taggttagag gagagtacag 13620
gacataaccc tatggtcatg catctacata tagaggatgg atgttgtata aaagagagtt 13680
acaatgatga gcatatcaat ccggagtcta cattagagtt aatcaaatac cctgagagta 13740
atgaatttat atatgataag gaccctttaa aggatataga tctatcaaaa ttaatggtta 13800
taagagatca ttcttataca attgacatga attactggga tgacacagat attgtacatg 13860
caatatcaat atgtactgca gttacaatag cagatacaat gtcgcagcta gatcgggata 13920
atcttaagga gctggttgtg attgcaaatg atgatgatat taacagtctg ataactgaat 13980
ttctgaccct agatatacta gtgtttctca aaacatttgg agggttactc gtgaatcaat 14040
ttgcatatac cctttatgga ttgaaaatag aaggaaggga tcccatttgg gattatataa 14100
tgagaacatt aaaagacacc tcacattcag tacttaaagt attatctaat gcactatctc 14160
atccaaaagt gtttaagaga ttttgggatt gtggagtttt gaatcctatt tatggtccta 14220
atactgctag tcaagatcaa gttaagcttg ctctctcgat ttgcgagtac tccttggatc 14280
tatttatgag agaatggttg aatggagcat cacttgagat ctatatctgt gatagtgaca 14340
tggaaatagc aaatgacaga agacaagcat ttctctcaag acatcttgcc tttgtgtgtt 14400
gtttagcaga gatagcatct tttggaccaa atttattaaa tctaacatat ctagagagac 14460
ttgatgaatt aaaacaatac ttagatctga acatcaaaga agatcctact cttaaatatg 14520
tgcaagtatc aggactgtta attaaatcat tcccctcaac tgttacgtat gtaaggaaaa 14580
ctgcgattaa gtatctgagg attcgtggta ttaatccgcc tgaaacgatt gaagattggg 14640
atcccataga agatgagaat atcttagaca atattgttaa aactgtaaat gacaattgca 14700
gtgataatca aaagagaaat aaaagtagtt atttctgggg attagctcta aagaattatc 14760
aagtcgtgaa aataagatcc ataacgagtg attctgaagt taatgaagct tcgaatgtta 14820
ctacacatgg aatgacactt cctcagggag gaagttatct atcacatcag ctgaggttat 14880
ttggagtaaa cagtacaagt tgtcttaaag ctcttgaatt atcacaaatc ttaatgaggg 14940
aagttaaaaa agataaagat agactctttt taggagaagg agcaggagct atgttagcat 15000
gttatgatgc tacactcggt cctgcaataa attattataa ttctggttta aatattacag 15060
atgtaattgg tcaacgggaa ttaaaaatct tcccatcaga agtatcatta gtaggtaaaa 15120
aactaggaaa tgtaacacag attcttaatc gggtgagggt gttatttaat gggaatccca 15180
attcaacatg gataggaaat atggaatgtg agagtttaat atggagtgaa ttaaatgata 15240
agtcaattgg tttagtacat tgtgacatgg agggagcgat aggcaaatca gaagaaactg 15300
ttctacatga acattatagt attattagga ttacatattt aatcggggat gatgatgttg 15360
tcctagtatc aaaaattata ccaactatta ctccgaattg gtctaaaata ctctatctat 15420
acaagttgta ttggaaggat gtaagtgtag tgtcccttaa aacatccaat cctgcctcaa 15480
cagagcttta tttaatttca aaagatgctt actgtactgt aatggaaccc agtaatcttg 15540
ttttatcaaa acttaaaagg atatcatcaa tagaagaaaa taatctatta aagtggataa 15600
tcttatcaaa aaggaagaat aacgagtggt tacagcatga aatcaaagaa ggagaaaggg 15660
attatgggat aatgaggcca tatcatacag cactgcaaat ttttggattc caaattaact 15720
taaatcactt agctagagaa tttttatcaa ctcctgattt aaccaacatt aataatataa 15780
ttcaaagttt tacaagaaca attaaagatg ttatgttcga atgggtcaat atcactcatg 15840
acaataaaag acataaatta ggaggaagat ataatctatt cccgcttaaa aataagggga 15900
aattaagatt attatcacga agattagtac taagctggat atcattatcc ttatcaacca 15960
gattactgac gggccgtttt ccagatgaaa aatttgaaaa tagggcacag accggatatg 16020
tatcattggc tgatattgat ttagaatcct taaagttatt atcaagaaat attgtcaaaa 16080
attacaaaga acacatagga ttaatatcat actggttttt gaccaaagag gtcaaaatac 16140
taatgaagct tataggagga gtcaaactac taggaattcc taaacagtac aaagagttag 16200
aggatcgatc atctcagggt tatgaatatg ataatgaatt tgatattgat taatacataa 16260
aaacataaaa taaaacacct attcctcacc cattcacttc caacaaaatg aaaagtaaga 16320
aaaacatgta atatatatat accaaacaga gtttttctct tgtttggt 16368

<210> 95
<211> 897
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant RSV G protein
<400> 95
atgtctaaga caaaggatca gcggacagcc aaaacactgg aacggacatg ggataccctg 60
aatcacctcc tcttcatcag cagttgcctg tacaagctca atctgaagtc catcgcccag 120
atcactctct ccatccttgc catgatcatc tctacaagcc tcatcattgc cgcaattatc 180
ttcatcgcca gcgctaacca caaggtcacc cttaccacag ccattattca ggatgccacc 240
aaccagatca agaacacaac ccctacctac ctgacacaga accctcagct tggaatttca 300
ctgagcaacc tgtccgaaac cacatctaaa cctacaacca tcttggctct gaccacacca 360
aacgccgagt ccaccccaca aagtaccaca gtgaagacca aaaacaccac aaccacacag 420
attcagccaa gcaagcctac aactaagcaa aggcagaaca agccacagaa caaacccaac 480
aacgactttc actttgaggt gttcaacttt gtgccctgct ccatttgctc caacaaccct 540
acctgttggg ctatctgcaa gaggatcccc aacaagaagc ccggcaggaa gactactact 600
aagcctacta aacagccagc cattaagacc actaagaagg acccaaagcc acagacaacc 660
aagccaaagg aggtgctcac taccaagccc actgagaagc ccaccattaa caccactaaa 720
accaacatcc gcacaacatt gctgacatca aacattacag agaaccagga gcacacaagc 780
cagaaggaga cactgcatag cactacatcc gaaggcaatc ccagcccaag ccaggtctat 840
actacctcag agtacctgtc ccagagcctg agccctagca acactactag atggtag 897

本開示の上記およびその他の特色および利点は、添付の図面に関して進行する、いくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明白になるであろう。
[本発明1001]
3'から5'へ順に、3'リーダー領域、BPIV3 N遺伝子、異種遺伝子、BPIV3 P遺伝子およびM遺伝子、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、BPIV3 L遺伝子、ならびに5'トレーラー領域を含むゲノムを含む、組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）であって、
該異種遺伝子が、以下：
（a）RSV G外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む、RSV Gタンパク質；
（b）RSV G外部ドメイン、BPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびBPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；
（c）RSV G外部ドメイン、HPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；または
（d）RSV G外部ドメイン、HPIV1 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV1 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質
のうちの1つをコードし；
該HPIV3 HN遺伝子が263位および370位にトレオニン残基およびプロリン残基を含むHPIV3 HNタンパク質をコードし、
該組換えB/HPIV3が、感染性であり、弱毒化されており、かつ自己複製性である、rB/HPIV3。
[本発明1002]
RSV G外部ドメインが、SEQ ID NO:23、48、50、52、もしくは54のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1003]
BPIV3 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:29として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001または本発明1002のrB/HPIV3。
[本発明1004]
HPIV3 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:57として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001または本発明1002のrB/HPIV3。
[本発明1005]
HPIV1 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:60として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001または本発明1002のrB/HPIV3。
[本発明1006]
RSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:22、47、49、51、53のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1007]
RSV G外部ドメイン、BPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:31、62、64、66、もしくは68のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1008]
RSV G外部ドメイン、HPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:70、72、74、76、もしくは78のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1009]
RSV G外部ドメイン、HPIV1 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:80、82、84、86、もしくは88のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1010]
RSV G外部ドメインが、ヒトサブタイプA RSVまたはヒトサブタイプB RSVに由来する、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1011]
RSV Gタンパク質が、ヒトサブタイプA RSVまたはヒトサブタイプB RSVに由来する野生型RSV Gタンパク質である、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1012]
BPIV3 N遺伝子が、SEQ ID NO:1として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるNタンパク質をコードし；
BPIV3 P遺伝子が、それぞれ、SEQ ID NO:2、3、および4として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるPタンパク質、Cタンパク質、およびVタンパク質をコードし；
BPIV3 M遺伝子が、SEQ ID NO:5として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるMタンパク質をコードし；
HPIV3 F遺伝子が、SEQ ID NO:6として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるFタンパク質をコードし；
HPIV3 HN遺伝子が、SEQ ID NO:7として示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるHNタンパク質をコードし；かつ/または
BPIV3 L遺伝子が、SEQ ID NO:10として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるLタンパク質をコードする、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1013]
異種遺伝子がヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1014]
ヒト発現のためにコドン最適化された異種遺伝子が、SEQ ID NO:89、90、または95として示されるアンチゲノムcDNA配列を含む、本発明1013のrB/HPIV3。
[本発明1015]
ゲノムが、SEQ ID NO:91～94のいずれか1つとして示されるアンチゲノムcDNA配列を含む、本発明1001のrB/HPIV3。
[本発明1016]
RSV Gタンパク質、HPIV3 Fタンパク質、およびHPIV3 HNタンパク質に対する免疫応答を誘導する、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1017]
RSVおよびHPIV3を中和する免疫応答を誘導する、前記本発明のいずれかのrB/HPIV3。
[本発明1018]
前記本発明のいずれかのrB/HPIV3のゲノムのヌクレオチド配列、またはゲノムのアンチゲノムのcDNA配列もしくはRNA配列を含む、核酸分子。
[本発明1019]
本発明1018の単離された核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1020]
本発明1018または本発明1019の核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1021]
本発明1019のベクターを許容細胞培養物にトランスフェクトする工程；
ウイルス複製を可能にするために十分な期間、該細胞培養物をインキュベートする工程；および
rB/HPIV3を作製するため、複製されたウイルスを精製する工程：
を含む、rB/HPIV3を作製する方法。
[本発明1022]
本発明1021の方法によって作製された、rB/HPIV3。
[本発明1023]
本発明1001～1017または1022のいずれかのrB/HPIV3と薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
[本発明1024]
免疫応答を生成するために本発明1023の免疫原性組成物を対象へ投与する工程を含む、対象における呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルス3に対する免疫応答を誘発する方法。
[本発明1025]
免疫原性組成物の鼻腔内投与を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
対象がヒトである、本発明1024または本発明1025の方法。
[本発明1027]
対象が1歳未満である、本発明1024～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
免疫応答が防御免疫応答である、本発明1024～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
対象におけるRSVおよびHPIV3に対する免疫応答を誘発するための、本発明1001～1017または1022のいずれかのrB/HPIV3の使用。

Claims (29)

1. 3'から5'へ順に、3'リーダー領域、BPIV3 N遺伝子、異種遺伝子、BPIV3 P遺伝子およびM遺伝子、HPIV3 F遺伝子およびHN遺伝子、BPIV3 L遺伝子、ならびに5'トレーラー領域を含むゲノムを含む、組換えキメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3（rB/HPIV3）であって、
   該異種遺伝子が、以下：
   （a）RSV G外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む、RSV Gタンパク質；
   （b）RSV G外部ドメイン、BPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびBPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；
   （c）RSV G外部ドメイン、HPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV3 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質；または
   （d）RSV G外部ドメイン、HPIV1 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV1 HN細胞質テールを含む、組換えRSV Gタンパク質
   のうちの１つをコードし；
   該HPIV3 HN遺伝子が263位および370位にトレオニン残基およびプロリン残基を含むHPIV3 HNタンパク質をコードし、
   該組換えB/HPIV3が、感染性であり、弱毒化されており、かつ自己複製性である、rB/HPIV3。
2. RSV G外部ドメインが、SEQ ID NO:23、48、50、52、もしくは54のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1記載のrB/HPIV3。
3. BPIV3 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:29として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1または請求項2記載のrB/HPIV3。
4. HPIV3 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:57として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1または請求項2記載のrB/HPIV3。
5. HPIV1 HNの膜貫通ドメインおよび細胞質テールが、SEQ ID NO:60として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1または請求項2記載のrB/HPIV3。
6. RSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:22、47、49、51、53のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1記載のrB/HPIV3。
7. RSV G外部ドメイン、BPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびBPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:31、62、64、66、もしくは68のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1記載のrB/HPIV3。
8. RSV G外部ドメイン、HPIV3 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV3 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:70、72、74、76、もしくは78のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1記載のrB/HPIV3。
9. RSV G外部ドメイン、HPIV1 HN膜貫通ドメイン、およびHPIV1 HN細胞質テールを含む組換えRSV Gタンパク質が、SEQ ID NO:80、82、84、86、もしくは88のいずれか1つとして示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1記載のrB/HPIV3。
10. RSV G外部ドメインが、ヒトサブタイプA RSVまたはヒトサブタイプB RSVに由来する、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
11. RSV Gタンパク質が、ヒトサブタイプA RSVまたはヒトサブタイプB RSVに由来する野生型RSV Gタンパク質である、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
12. BPIV3 N遺伝子が、SEQ ID NO:1として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるNタンパク質をコードし；
    BPIV3 P遺伝子が、それぞれ、SEQ ID NO:2、3、および4として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるPタンパク質、Cタンパク質、およびVタンパク質をコードし；
    BPIV3 M遺伝子が、SEQ ID NO:5として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるMタンパク質をコードし；
    HPIV3 F遺伝子が、SEQ ID NO:6として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるFタンパク質をコードし；
    HPIV3 HN遺伝子が、SEQ ID NO:7として示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるHNタンパク質をコードし；かつ/または
    BPIV3 L遺伝子が、SEQ ID NO:10として示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるLタンパク質をコードする、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
13. 異種遺伝子がヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
14. ヒト発現のためにコドン最適化された異種遺伝子が、SEQ ID NO:89、90、または95として示されるアンチゲノムcDNA配列を含む、請求項13記載のrB/HPIV3。
15. ゲノムが、SEQ ID NO:91～94のいずれか1つとして示されるアンチゲノムcDNA配列を含む、請求項1記載のrB/HPIV3。
16. RSV Gタンパク質、HPIV3 Fタンパク質、およびHPIV3 HNタンパク質に対する免疫応答を誘導する、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
17. RSVおよびHPIV3を中和する免疫応答を誘導する、前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3。
18. 前記請求項のいずれか一項記載のrB/HPIV3のゲノムのヌクレオチド配列、またはゲノムのアンチゲノムのcDNA配列もしくはRNA配列を含む、核酸分子。
19. 請求項18記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
20. 請求項18または請求項19記載の核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞。
21. 請求項19記載のベクターを許容細胞培養物にトランスフェクトする工程；
    ウイルス複製を可能にするために十分な期間、該細胞培養物をインキュベートする工程；および
    rB/HPIV3を作製するため、複製されたウイルスを精製する工程：
    を含む、rB/HPIV3を作製する方法。
22. 請求項21記載の方法によって作製された、rB/HPIV3。
23. 請求項1～17または22のいずれか一項記載のrB/HPIV3と薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
24. 免疫応答を生成するために請求項23記載の免疫原性組成物を対象へ投与する工程を含む、対象における呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルス3に対する免疫応答を誘発する方法。
25. 免疫原性組成物の鼻腔内投与を含む、請求項24記載の方法。
26. 対象がヒトである、請求項24または請求項25記載の方法。
27. 対象が1歳未満である、請求項24～26のいずれか一項記載の方法。
28. 免疫応答が防御免疫応答である、請求項24～27のいずれか一項記載の方法。
29. 対象におけるRSVおよびHPIV3に対する免疫応答を誘発するための、請求項1～17または22のいずれか一項記載のrB/HPIV3の使用。

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