KR102168646B1 - PCV2d 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 (Porcine circovirus 2, PCV2) 예방용 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곤충세포에서 유전자 번역 효율을 높이기 위해, 재조합 단백질의 ORF2 (Open reading frame 2) 코돈을 최적화한 염기서열을 기반으로 제작한 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PCV2를 예방하는 돼지 써코바이러스 백신 조성물은 기존 백신의 문제점을 효과적으로 보완하여 PCV2a, PCV2b, PCV2c 및 PCV2d 네가지 타입의 돼지 써코바이러스에 모두 효과를 나타내며, 기존 PCV2의 ORF2 서열을 최적화함으로써 단백질 발현 수준을 현저히 높여 생산단가가 절감된 백신이기 때문에 가격 경쟁력 또한 우수하다.

Description

PCV2d 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 {Vaccine composition comprising PCV2d recombinant protein}

본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 (Porcine circovirus 2, PCV2) 예방용 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곤충세포에서 유전자 번역 효율을 높이기 위해, 재조합 단백질의 ORF2 (Open reading frame 2) 코돈을 최적화한 염기서열을 기반으로 제작한 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물에 관한 것이다.

PCV2(Porcine Circovirus type2)는 원형의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은(17 nm) 정이십면체 비외피형 바이러스로서 지금까지 알려진 가장 작은 동물 바이러스 중 하나이다. PCV2 게놈의 길이는 약 1768 bp이다. 돼지 써코바이러스 2형 (Porcine circovirus 2, PCV2)은 이유후전신성소모성증후군 (Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 원인체로 감염 돼지는 만성적으로 위축돈이 되고, 피부가 창백하며, 림프절이 커지는 것이 특징이다. 또한 호흡곤란, 만성폐렴 등의 호흡기 증상과 설사, 위궤양과 같은 소화기 증상을 나타내며, 이유자돈에서 높은 폐사율(~50%)을 나타내기 때문에 전세계적으로 높은 경제적 손실을 초래하고 있다. PMWS 외에도, PCV2는 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반한다. PCV2는 환경과 유기화합물에 대한 저항성이 매우 강하여 일반적인 소독제에 살균이 되지 않기 때문에 백신 접종만이 유일한 대안으로 알려져 있다. 그러나 PCV2 백신도입 후 유전형 변이 (PCV2a에서 PCV2b로 변이되고, PCV2d로 재변이)가 발생되었고, 현재는 PCV2d 유전형이 전세계적으로 유행하고 있다. 하지만, 현재 상용화 되어있는 PCV2 백신은 PCV2a형을 주형으로 제작되었기 때문에 최근 문제되고 있는 PCV2d형을 완전히 예방하기에는 현실적으로 한계가 있으며, 기존 백신의 방어율 또한 낮아지고 있는 추세이다. 따라서, 국내외 유행하는 유전형을 모두 효과적으로 방어할 수 있는 돼지 써코바이러스 백신 개발이 필요하다.

본 발명자들은 국내외 유행하는 유전형을 모두 효과적으로 방어할 수 있는 돼지 써코바이러스 백신 개발을 위해 노력하던 중, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d의 ORF2에 해당하는 염기서열을 최적화하여, 재조합 단백질의 수득률을 높이고 PCV2a, PCV2b, PCV2c 및 PCV2d형 돼지 써코바이러스에 모두 효과가 있는, 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 써코바이러스 2형을 예방할 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 형질도입한 베큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 베큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 PCV2를 예방하는 돼지 써코바이러스 백신 조성물은 기존 백신의 문제점을 효과적으로 보완하여 PCV2a, PCV2b, PCV2c 및 PCV2d 네가지 타입의 돼지 써코바이러스에 모두 효과를 나타내며, 기존 PCV2의 ORF2 서열을 최적화함으로써 단백질 발현 수준을 현저히 높여 생산단가가 절감된 백신으로 돼지 써코바이러스 감염성 질환 예방에 널리 사용될 수 있다.

도 1은 국내 양돈농가(2016~2018년)에서 분리한 PCV2 ORF2의 유전적 분석 결과를 나타낸 도이다. (A) 134개 PCV2 분리주의 ORF2 서열을 47개 PCV2 레퍼런스를 참조로 하여 분석한 결과로, PCV2a는 파란색, PCV2b는 녹색, PCV2d는 빨간 원으로 표시하였다. PCV2c 및 PCV2e는 최근 국내에서 검출되지 않음을 알 수 있다. (B) 134개 PCV2 분리주의 검출율을 연도별로 나타낸 것으로, 현재 PCV2d 유전자형이 국내에서 가장 유행하는 유전자형임을 알 수 있다. (C) 각 유전자형 별 PCV2 분리주 ORF2의 뉴클레오티드, 아미노산 동정 결과를 나타낸 도이다. (D) PCV2d 분리주로서 QIA169를 PK15 세포에 감염시키고 감염 5일차에 mAb-2를 사용하여 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 서로 다른 PCV2 유전자형에 대한 mAb의 항원 반응성을 확인한 도이다. (A) 6개 mAb가 PK15 세포에 감염된 PCV2a 분리주(QIA215), PCV2b 분리주(QIA418) 및 2개 PCV2d 분리주(QIA169 및 QIA244)(200 TCID₅₀)와 반응함을 확인한 도이다. 그래프 위 a, b 표시는 통계적 유의성을 나타낸다(p<0.05). (B) FITC에 대한 동일한 노출 시간에서의 형광 이미지를 (A)의 평균 형광 강도와 비교한 도이다(Scale bar = 12.5μm).
도 3은 mAb 및 PCV2의 중화실험 결과를 나타낸 도이다. 각 mAb 희석액(200~3200배)을 사용하여 각각 QIA215(○), QIA418(□), QIA169(●)및 QIA244(■)로 중화시킨 결과를 나타내었다. 모든 PCV2 유전자형에 대하여 보편적인 반응성을 가지고 있는 mAb-2를 사용한 면역염색을 통해, 감염 5일차의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 대조군에 대한 %로 나타내었다(A-F). * 표시는 통계적 유의성을 나타낸다(p<0.05). (G) mAb-2에 따른 PCV2-양성 세포의 감소를 나타낸 도이다. 이미지는 100x 배율로 확대된 것이다.
도 4는 혈청 중화실험 결과를 나타낸 도이다. (A) Ingelvac CircoFLEX로 백신 접종된 SPF 돼지로부터 항-혈청을 확보하고 QIA215로 적정하였다. 백신접종 전(0 week) 및 접종 후(12 week) 혈청 희석액(32~512배)을 200 TCID₅₀/ml QIA215로 배양한 결과를 나타내었다. PCV2a 바이러스는 12주차에 64배까지 완전히 중화됨을 알 수 있다. (B) 각 PCV2(10^4.5 TCID₅₀/ml)를 1:64로 희석된 혈청 희석액으로 1시간 동안 배양하고 2시간 동안 PK15 세포에 감염시킨 결과를 나타낸 도이다. 바이러스 역가는 감염 24시간 후 RT-PCR로 측정하였다. 혈청희석액(1:64)은 QIA215 및 QIA418를 완전히 중화시킨 반면(각각 99.9%, 85.1%), PCV2d는 중화효율에 큰 차이를 나타냄을 알 수 있다(42.9 내지 90.5%). (C) PCV2d 분리주 간 중화효율의 큰 차이를 형광분석을 통하여 재확인한 결과를 나타낸 도이다. qPCR 및 형광분석 간 VN(%)이 유사한 경향을 나타냄을 알 수 있다. (D) 상기 결과를 1 x 10⁴ 세포 당 계수한 PCV2-양성 세포로 환산한 결과를 나타내었다. 이미지는 100x 배율로 확대된 것이다.
도 5는 서로 다른 PCV2 유전자형 간 교차방어능을 평가한 결과를 나타낸 도이다. Ingelvac CircoFLEX(A), QIA215(B), QIA418(C), QIA169(D) 및 QIA244 (E)로 백신 접종한 기니피그에서 혈청을 확보하고 QIA215(○), QIA418(□), QIA169(●) 및 QIA244(■)로 각각 중화시킨 결과를 나타내었다. SN 역가(SN titer)는 VNT90에 의해 동종 PCV2에 대한 각 혈청 희석배수(2ⁿ)로 결정되었다. SN 역가 2배, 4배, 8배에서 평가한 교차방어능을 나타내었다.
도 6은 PCV2 ORF2 유전자를 삽입한 전달 벡터를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 7은 재조합 베큘로바이러스를 접종한 세포로부터 추출한 DNA로부터 재조합 베큘로바이러스의 증폭 여부를 확인한 도이다.
도 8은 재조합 베큘로바이러스를 sf9 세포에 접종하고, 배양하여 PCV2 재조합 캡시드 단백질을 생산한 것을 확인한 도이다.
도 9는 PCV2a, PCV2b, PCV2d 시험 백신을 검증하기 위해, 마우스를 대상으로 한 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 PCV2a, PCV2b, PCV2d 시험 백신을 검증하기 위해 마우스를 대상으로 한 중화 시험결과를 나타낸 도이다.
도 11 PCV2d 시험 백신을 검증하기 위해 돼지를 대상으로 한 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 12 PCV2d 시험 백신을 검증하기 위해 돼지를 대상으로 한 중화 시험결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, PCV2는 PCV2a, PCV2b, PCV2c 및 PCV2d 타입으로 분류되며, PCV2의 OFR2(Open Reading Frame 2) 유전자는 캡시드 단백질(capsid protein)을 암호화하는 것으로, 상기 ORF2에 의해 생성된 캡시드 단백질은 바이러스 유사 입자(virus like particle)을 형성한다.

본 발명의 'PCV2a의 ORF2 재조합 유전자'는 NCBI에 등록된 PCV2a ORF2 유전자(NCBI accession number: KF871067.1)가 암호화하는 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 'PCV2a의 ORF2 유전자'가 암호화하는 아미노산 서열과 NCBI에 등록된 PCV2a ORF2 유전자(NCBI accession number: KF871067.1)가 암호화하는 캡시드 단백질 아미노산 서열은 동일하나, 본 발명의 'PCV2a의 ORF2 유전자'는 재조합 단백질 제작에 최적화된 것으로, 상기 PCV2a ORF2 유전자(NCBI accession number: KF871067.1)와 염기서열이 상이한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체일 수 있다.

본 발명의 'PCV2b의 ORF2 재조합 유전자'는 NCBI에 등록된 PCV2b ORF2 유전자(NCBI accession number: AY099500.1)가 암호화하는 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 'PCV2b의 ORF2 유전자'가 암호화하는 아미노산 서열과 NCBI에 등록된 PCV2b ORF2 유전자(NCBI accession number: AY099500.1)가 암호화하는 캡시드 단백질 아미노산 서열은 동일하나, 본 발명의 'PCV2b의 ORF2 유전자'는 재조합 단백질 제작에 최적화된 것으로, 상기 PCV2b ORF2 유전자(NCBI accession number: AY099500.1)와 염기서열이 상이한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체일 수 있다.

본 발명의 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'는 PCV2d 야외분리주(PCV2d : QIA244)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 'PCV2d의 ORF2 유전자'가 암호화하는 아미노산 서열과 PCV2d 야외분리주(PCV2d : QIA244)의 캡시드 단백질 아미노산 서열은 동일하나, 본 발명의 'PCV2d의 ORF2 유전자'는 재조합 단백질 제작에 최적화된 것으로, 상기 PCV2d 야외분리주(PCV2d : QIA244)의 OFR2 유전자(서열번호 4)와 염기서열이 상이한 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체일 수 있으며, 코돈 최적화에 의해 재조합 단백질의 생산량이 현저히 증대된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 형질도입한 재조합 베큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명에서 용어 '벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있고, 바람직하게는 베큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 pOET1(Oxford Expression Technologies)일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 유전자 전달을 위해 사용될 수 있는 통상적인 유전자 전달 방법에 의해 형질도입될 수 있으며, 바람직하게는 베큘로바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 벡시니아로 이루어진 군에서 선택된 바이러스를 이용한 유전자 전달 시스템으로 형질도입되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 베큘로바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 형질도입되는 것 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 막대 모양의 바이러스로서 인간 세포에서 곤충-특이 프로모터로부터 자신의 유전자를 발현하지 않으며, 곤충 세포에서 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 상기 재조합 베큘로 바이러스에 의해 형질도입되어, 형질도입된 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 제한없이 포함할수 있으며, 바람직하게는 곤충세포일 수 있고, 가장 바람직하게는 Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 개체에 접종되어 PCV2d 바이러스로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것일 수 있으며, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 바이러스로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터, 재조합 베큘로바이러스, 재조합 단백질을 이용하면, PCV2a, PCV2b 및/또는 PCV2d를 예방할 수 있는 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 PCV2d 야외분리주(PCV2d : QIA244)의 캡시드 단백질 서열일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 QIA244 바이러스 주의 다양한 PCV 혈청형에 대한 교차반응능에 기초하여, 개체에 접종되면 다양한 혈청형의 PCV로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있으며, 특히, PCV2d형으로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 ‘백신'은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, PCV2에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.

본 발명의 ‘돼지 써코바이러스의 감염성 질환’에는 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome), 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 백신 조성물은 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 바이러스에 교차반응을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 유효 성분인 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 또는 바이러스 유사 입자 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에의 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.

본 발명에서 개체에 백신 조성물을 투여하는 방법은 일반적인 백신 투여 방법에 의할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 장내 또는 비경구 경로, 경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 투여를 수행할 수 있고, 바람직하게는 근육 내, 피내, 피하에 투여된다.

본 발명에서 상기 백신 접종의 대상은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이 및 토끼로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 가장 바람직하게는 돼지일 수 있다.

본 발명에서 상기 개체에게 백신 조성물 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 ‘면역학적 유효량'이란 PCV2 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백신 제작을 위한 바이러스주의 선별

1.1 실험 방법

1.1.1 시료 준비

2016년부터 2018 년까지 국내 돼지 농장에서 총 803개의 혈청과 389개의 조직 샘플(폐 322개, 림프절 45개)을 수집하였다. 임상 샘플을 채취한 돼지 농장들은 호흡기 질환으로 인한 질병 진단이 필요한 농장에 해당하였다. 조직 샘플(300-500 mg)을 MagNA Lyser Green Beads(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 및 Precellys 24 균질기(Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PBS 내에서 균질화시켰다. 균질화된 조직샘플을 13,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하고 상층액을 회수하여 멸균 튜브로 옮긴 후, 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다.

1.1.2 임상 샘플 유래 PCV2의 서열 및 계통 분석

상기 기술된 바와 같이 준비된 조직 균질액 및 혈청에서 제조사의 지침에 따라 DNeasy blood & Tissue Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 바이러스 게놈 DNA를 추출하였다. PCV2를 검출하기 위해 HotStarTaq Plus Master Mix Kit 및 ORF2 특이적 정방향 프라이머(5'-CACGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3') 및 역방향 프라이머(5'-GCACCTTCGGATATACTG-3')를 사용하여 ORF2 유전자의 전장을 증폭시켰다. PCR 증폭 산물을 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)로 정제하고 DNA 뉴클레오티드 시퀀싱(Macrogen, Seoul, Korea)을 통해 확인하였다.

국내 돼지농장에서 검출된 다른 PCV2 바이러스와의 유전적 연관성을 분석하기 위해 본 발명자들은 CLC Main Workbench(Qiagen, Version 7.0.3)를 사용하여 다중서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였다. MEGA(Version 7.0)를 이용하여 이웃 결합 트리(Neighbor-joining tree)를 구성하고, 부트스트랩(Bootstrap)을 1,000으로 설정하여 구축된 트리의 신뢰성을 평가하였다.

1.1.3 qPCR 분석

상기 기술된 바와 같이 준비된 상층액과 세포로부터 DNeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 총 DNA를 분리하였다. qPCR은 LightCycler 480 II(Roche Diagnostics) 및 SYBER green script premix(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR은 95℃ 10초 변성, 64℃ 10초 어닐링, 72℃ 20초 변이 조건으로 40사이클을 수행하였다. 바이러스 역가(titer)는 표준 곡선에 의해 추정하였다.

1.1.4 면역세포화학(Immunocytochemistry)

6종의 단클론 항체(mAb) mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6을 사용하였다. 면역 염색을 위해, 형질감염된 PK15 세포를 80% 아세톤으로 -20℃에서 10분간 고정시켰다. 1X PBS로 세척한 후, 1차 항체로서 mAb(1:200)를 실온(RT)에서 1시간 동안 항온 처리하여 반응시켰다. 상층액을 버리고, 1x PBS로 3회 세척 후, 2차 항체로 마우스 유래 항-마우스 Alexa fluorTM 488 goat anti-mouse IgG(1:200)를 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 핵은 1X PBS(1:1,000)로 희석된 Hoechst33258(Invitrogen)로 5분 동안 염색하였다. 형광 현미경(Olympus)을 사용하여 면역 형광을 검출하고 ArrayScan VTI HCS(Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 타겟의 형광 강도 또는 PCV2 양성 세포의 수를 측정하였다.

1.1.5 동물 혈청

Ingelvac CircoFLEX(Boehringer Ingelheim Vetmedica)로 백신 접종된 특정 병원균이 없는 SPF 돼지의 항-혈청을 사용하였다. Freund's 아쥬번트(incomplete 및 complete)와 혼합한 QIA215, QIA418, QIA169 그리고 QIA244와 Ingelvac CircoFLEX로 각각 면역화한 기니 피그의 항-혈청을 사용하였다.

1.1.6 바이러스 중화 시험

단클론 항체와 혈청의 중화작용을 검출하기 위해 Meerts et al.,(2005)의 방법을 적용하였다. 구체적으로, 100ul의 200 TCID₅₀ PCV2를 100ul의 mAb 또는 혈청 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 혼합물을 96-웰 플레이트의 4개 웰에 도포된 PK15 세포(5 × 10³)에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포 배양 배지를 1x PBS에서 2회 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 5일 후 세포를 고정하고, PCV2로 감염된 PK15 세포를 상기 기술된 바와 같이 염색하였다. ArrayScan VTI HCS를 사용하여 1 x 10⁴ 세포 당 감염된 세포의 수를 계수하고, 대조군에 대한 %(% control) 및 바이러스 중화율(% VN)으로 단클론 항체와 혈청의 중화 활성을 나타내었다.

1.1.7 통계적 분석

모든 결과는 3회 반복으로 수행하여(n=3)에 평균±표준 오차(SE)로 나타내었다. Statistica5.5(StatSoft, OK, USA) 및 분산분석(ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였고, Duncan의 다중 비교 실험을 통해 대조군과 각 치료군 간 사후분석(post-hoc comparisons)을 수행하였다. p<0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

1.2 실험 결과

1.2.1 PCV2의 분리 및 유전자형 분석

총 741개의 국내 돼지 농장(2016~2018)에서 채취한 폐 및 림프절 조직 중 폐 조직 샘플 489개, 혈청 741개에서 PCV2 감염이 확인되었다. ORF2 PCR을 시행한 결과 양성 판정은 조직 샘플이 57.9%(283/489), 혈청이 24%(175/717)로 확인되었다. 계통 발생 분석 및 서열 상동성 분석에서, 모든 한국 분리주(n=134)는 PCV2a, 2b 및 2d로 분류되었다(도 1A). 최근 국내 유행 PCV2를 고려하여, 각 분리주를 PCV2a(n=4), PCV2b(n=26) 및 PCV2d(n=104)로 분류하였고, 각 분리주의 감염 빈도는 각각 3%(4/134), 19.4%(26/134) 및 77.6%(194/143)로 나타났다. 한편, PCV2c 및 2e는 검출되지 않았다. 유전자형 분석 결과, 현재 한국에서 가장 흔한 유전자형은 PCV2d임을 확인하였다(도 1B). 짝비교(pair-wise comparison) 수행 결과, 분리주의 ORF2 유전자 염기서열, PCV2a(97.29 내지 99.43%), PCV2b(97.86 내지 100%) 및 PCV2d(97.73 내지 100%), ORF2 아미노산 염기서열, PCV2a(97.01 내지 99.57%), PCV2b(98.29 내지 100%) 및 PCV2d(97.01 내지 100%)는 대응하는 공지된 뉴클레오티드 서열과 88.37 내지 100% 및 아미노산 서열과 87.66 내지 100% 일치함을 확인하였다(도 1C). 국내 PCV2d 분리주 QIA169를 PK15 세포에 감염시키고 감염 5일차에 mAb-2를 사용하여 면역염색을 수행한 결과, 감염 5일 차에 PCV2d 분리주는 PK15 세포의 핵에 국한되어 발견됨을 확인하였다(도 1D).

1.2.2 PCV2 유전자형에 따른 항원 다양성 평가

PCV2a 바이러스 백신 접종 후 생산 된 6개의 마우스 단클론 항체를 사용하여 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 유전자형의 항원 다양성을 평가하였다. 먼저, 각 PCV2에 대한 단클론 항체의 항원 반응성을 측정하기 위해, PK15 세포에 QIA215, QIA418, QIA169 및 QIA244를 각각 200 TCID₅₀으로 감염시켰다. 상기 QIA169, QIA244 분리주는 PCV2d 분리주로, 본 발명자들의 예비 연구를 통해 ORF2 아미노산 서열 유사도 및 계통 발생 분석에 따라 선정하여 실험에 사용하였다. ArrayScan VNT HCS를 이용하여 각 단클론 항체와 반응한 후의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 측정하고, 결과값은 총 강도의 평균으로 나타내었다(도 2A). 또한, FITC에 대한 동일한 노출 시간에서의 형광 이미지를 (A)의 평균 형광 강도와 비교하였다(도 2B) 그 결과, mAb-1 및 mAb-3은 항원 간에 유사한 반응성을 나타낸 반면, mAb-2, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6은 그렇지 않음을 확인하였다. mAb-2의 경우, QIA169에 대하여 특히 낮은 친화도를 나타냄을 확인하였다. mAb-5는 QIA215 및 QIA418와 강한 반응성을 보인 반면, PCV2d 분리주와는 약한 반응성을 나타냄을 확인하였다.

단클론 항체의 중화 활성을 검출하기 위해, 각 단클론 항체의 연속 희석액 (200 내지 3200배)을 4개의 PCV2(200 TCID₅₀)로 중화시키고 PK15 세포에 감염시켰다. 모든 PCV2 유전자형에 대하여 보편적인 반응성을 가지고 있는 mAb-2를 사용한 면역염색을 통해, 감염 5일차의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 대조군에 대한 %로 나타내었다. 그 결과, 형광 강도의 변화는 mAb-2를 제외한 모든 단클론 항체에서 검출되지 않았다(도 3A 내지 3F). mAb-2의 경우, PCV2-양성 세포의 형광 강도는 QIA215의 800배 희석에 의해 대조군에 비해 현저하게 감소되었다(도 3B). mAb-2 및 QIA215의 중화에서의 유의한 차이(p<0.05)는 단클론 항체의 희석 정도와 무관하게 유지되었다(도 3G).

1.2.3. PCV2 유전자형 간 혈청 중화능 평가

PCV2 유전자형 간의 혈청 중화능을 평가하기 위해 현행 PCV2a 기반 백신인 Ingelvac CircoFLEX로 접종한 돼지의 항-혈청을 사용하였다. 접종 후 12주차 돼지 혈청의 연속 희석액(32 내지 512배)을 동종 유전자형인 QIA215(200 TCID₅₀)로 중화시켰다. 항원은 64배 희석액에서 완전히 중화되었다(도 4A). 한편, 접종 전 돼지 혈청(0 week)은 QIA215를 중화시키지 않았다. PCV2a 기반 백신의 교차방어능을 평가하기 위해, QIA215, QIA418 및 2개 PCV2d 분리주(QIA169 및 QIA244)를 SN 역가(SN titer)가 1:64인 12주차 돼지 혈청으로 중화시키고, 접종 1일 후(day 1) qPCR을 통해 바이러스 정량화를 수행하였다(도 4B). 그 결과, 모든 PCV2d 분리주는 QIA215 바이러스(99.9%)에 비해 상대적으로 적게 중화된 것을 확인하였다. 특히, PCV2d 분리주 간에도 48.5% 내지 76.7%로 바이러스 중화효율에서 큰 차이를 나타내었다. 이는 접종 5일 후 분리주 간 수행한 형광 분석을 통하여도 확인할 수 있었는데, 대조군(혈청 없음, 200 TCID₅₀)과 비교하여 QIA215는 128배 및 64배 희석 시 중화효율이 95.4 내지 95.6%로 나타난 반면, QIA169는 69.9 내지 85.1%, QIA244는 0.3 내지 29.3%로 나타남을 확인하였다(도 4C). 상기 결과는 1 × 10⁴ 세포 당 PCV2-양성 세포의 수를 세어 측정하였다(도 4D).

1.2.4. PCV2 유전자형 간 교차방어능 평가

다음으로, PCV2 유전자형 간의 교차방어능을 분석하기 위해, QIA215, QIA418, QIA169, QIA244 및 Ingelvac CircoFLEX로 각각 백신 접종한 기니피그로부터 수집한 항-혈청을 동종 유전자형의 PCV2(200 TCID₅₀)로 중화시켰다. 혈청 중화 역가는 VNT90(최대 90% 중화율)에 의해 결정되었다. 동종 PCV2로 결정된 SN 역가에 기초하여, 2배, 4배 및 8배 SN 역가에서 상이한 PCV2 유전자형 간 교차방어능을 확인하였다(도 5). 그 결과, Ingelvac CircoFLEX, QIA215, QIA418 및 QIA169에 의해 면역유도된 기니픽 항-혈청은 서로 다른 유전형의 바이러스를 비교적 효율적으로 중화하는 반면, QIA244 분리주는 Ingelvac CircoFLEX, QIA215, QIA418 및 QIA169 항-혈청에 대하여 다른 PCV2 분리주보다 상대적으로 낮은 중화 효율을 나타냄을 확인하였다(도 5A 내지 5D). 그러나, QIA244는 QIA244의 항-혈청에 의해 완전히 중화되었으며, 이는 다른 유전자형의 PCV2 분리주에서도 유사하게 나타남을 확인하였다(도 5E). 상기 결과를 통해, QIA244에 의해 면역유도된 기니픽 항-혈청은 국내에서 가장 유행하는 PCV2d 유전자형뿐만 아니라, 모든 PCV2 유전자형을 효율적으로 방어할 수 있음을 확인하였다.

이상의 실험을 통해, 신규 PCV2d 분리주인 QIA244는 현행 백신에 대한 중화효율이 현저히 낮아 최근 유행하는 야외바이러스를 효율적으로 제어할 수 있는 백신 개발이 가능하고, 나아가 QIA244에 의해 면역유도된 항-혈청은 다른 유전자형의 PCV2 바이러스 간에도 높은 교차중화능을 나타낼 수 있어 적은 비용으로 치료효율을 극대화할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. PCV2 ORF2(open reading frame 2, ORF2) 서열의 최적화 및 합성

본 발명에 사용된 PCV2의 ORF2 유전자 염기서열 정보를 바탕으로 동물 및 곤충세포에서 유전자의 변역(translation) 효율을 높여, 보다 많은 재조합 단백질을 수확하기 위하여, 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF2) 코돈을 최적화(optimization)하였다. 구체적으로, 야외분리주(PCV2d : QIA244) 및 NCBI에 등록된 ORF2 유전자 (PCV2a NCBI accession number: KF871067.1, PCV2b NCBI accession number:: AY099500.1)가 코딩하는 235개의 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 각 아미노산별로 목적하는 곤충세포에 가장 적합한 코돈 비율을 조정하고, 전체 염기서열의 CG 비율의 평형화 및 헬릭스(helix) 구조의 염기서열 개수 및 길이의 단축을 통하여, 최종 최적화된 염기서열을 새로 작성하였다. 새로 작성된 코돈 최적화된 PCV2a ORF2 염기서열을 서열번호 1에 나타내었고, 코돈 최적화된 PCV2b ORF2 염기서열을 서열번호 2에 나타내었으며, 코돈 최적화된 PCV2d ORF2 염기서열을 서열번호 3에 나타내었다.

상기 코돈 최적화된 PCV2d ORF2의 합성 유전자 양 말단에 클로닝에 사용할 제한효소 NdeI과 HindIII 서열을 추가하여 714bp의 뉴클레오타이드를 합성하였다.

실시예 3. PCV2의 ORF2 유전자의 전달벡터 삽입

배큘로바이러스 발현시스템을 이용한 PCV2의 캡시드 단백질 발현을 위해 PCV2d ORF2, PCV2a ORF2 및 PCV2b ORF2 유전자가 삽입된 벡터와 전달벡터인 pOET1(Oxford Expression Technologies)을 제한효소 NdeI과 HindIII을 사용하여 절단하였다. 아가로스겔상에서 삽입된 유전자만을 추출, 정제하였으며, 절단된 전달벡터는 알칼린 포스파테이즈(Alkaline phosphatase)에 처리하였다. 유전자와 전달벡터에 T4 리가아제를 첨가하여 실온에서 하룻밤 반응시켜 접합(ligation)시켰다. 상기 접합된 플라스미드는 대장균(DH5a)에 형질전환하고, 암피실린(50ug/ml)이 첨가된 LB 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pOET1-PCVd, pOET1-PCVa 및 pOET1-PCVb 대장균(DH5a)을 선별하고, 다시 PCR (중합효소연쇄반응)을 수행하여 최종 선발하였다.

도 6a에 pOET1-PCVd 클로닝된 전달 벡터 지도를 도식화하여 나타내었고, 도 6b에 pOET1-PCVb 클로닝된 전달 벡터 지도를 도식화하여 나타내었으며, 도 6c에 pOET1-PCVa 클로닝 된 전달 벡터 지도를 도식화하여 나타내었다.

실시예 4. PCV2 ORF2 유전자를 형질도입한 재조합 베큘로바이러스의 제작

PCV2 ORF2 유전자를 형질도입한 재조합 베큘로바이러스를 제작하였다. 혈청 무첨가 Sf-900 II 배지(Invitrogen)에 배양된 곤충세포(Spodoptera frugiperda, Sf9)를 5x10⁶ cells/ml로 부유하여 세포배양용 6웰 플레이트에 1ml씩 분주하여 27℃에서 1시간 정치시켰다. 형질도입(Transfection)을 위해, 실시예 3에서 제조한 PCV2d, PCV2b, PCV2a의 ORF2 유전자가 삽입된 전달벡터인 pOET1-PCV2d, pOET1-PCV2b 및 pOET1-PCV2a를 정제하여 최종 농도가 100ng/μl가 되도록 조정하였다. 별도의 튜브에 상기 전달벡터를 각각 5 μl씩 분주하고, 100μl의 항생제와 혈청이 첨가되지 않은 배지와 100 ng의 FlashBAC prime(Oxford Expression Technologies)을 각각 5μl 첨가하고, baculoFECTIN II(Oxford Expression Technologies) 1.2μl 를 각각 첨가하여 가볍게 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치시켰다. 15분 후에 각 혼합액을 세포에 한 방울씩 조심스럽게 분주하였다. 형질도입된 플레이트는 27℃에서 1일간 배양한 후, 신선 배지 1ml을 추가하여, 7일간 배양하였다. 배양기간에 현미경으로 재조합 배큘로바이러스의 증식을 확인하였다. 최종 배양액을 수거한 후, 새로운 곤충세포에 재접종하여 배양하면서 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 확인하였다. 수거된 바이러스 배양액은 소분하여 -70℃와 4℃에 각각 보관하였다.

실시예 5. PCV2 재조합 베큘로바이러스의 확인

실시예 4에서 제조한 각각의 재조합 바이러스를 접종한 세포로부터 DNA를 추출하였다. PCV2d-ORF2, PCV2b-ORF2 및 PCV2a-ORF2 유전자가 삽입된 재조합 배큘로바이러스인 rAc-PCV2d-ORF2, rAc-PCV2b-ORF2 및 rAc-PCV2a-ORF2의 확인을 위하여, 추출한 DNA를 서열번호 5의 정방향 프라이머(5’-CAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATC-3’)와 서열번호 6의 역방향 프라이머(5’- TACAACAATTGTCTGTAAATCAACAACGC-3’)를 사용하여 PCR을 실시하였으며, PCR 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이 PCR 증폭 결과, rAc-PCV2d-ORF2, rAc-PCV2b-ORF2 및 rAc-PCV2a-ORF2가 증폭된 것을 확인하였다. 최종 확인된 바이러스 클론을 대량 증식배양하여, 역가를 확인한 후 -70℃와 4℃에 각각 보관하였다.

실시예 6. PCV2 재조합 캡시드 단백질의 확인

PCV2 재조합 캡시드 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 실시예 5에서 최종 선발한 재조합 배큘로바이러스인 rAc-PCV2d-ORF2, rAc-PCV2b-ORF2 및 rAc-PCV2a-ORF2의 역가를 측정하고, 125ml Erlenmeyer flask에 배양한 Sf9 세포에 5 MOI 역가의 바이러스를 각각 접종하고, 배양하였다. 그 후, PCV2d, PCV2b 및 PCV2a의 캡시드 단백질의 확인을 위하여 배양 7일째에 세포 배양액을 수거하였다. 수거한 세포 배양액을 초음파 분쇄 후 그 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액을 단백질 전기영동으로 확인하였으며, 전기영동 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이 약 27 kDa의 위치에서 PCV2 재조합 캡시드 단백질이 확인되었다.

실시예 7. 시험백신 검증(마우스)

암컷 마우스 BALb/c 6주령 10마리의 복강에 본원 발명의 PCV2 재조합 캡시드 단백질을 포함하는 PCV2a, PCV2b, PCV2d 시험백신 또는 상용화 백신인 Circo Flex 백신 0.2 ㎖를 접종하였다. 대조군으로서 동일 일령의 마우스 10 마리를 이용하였다. 접종 4 주 후 채혈하여 돼지 써코바이러스에 대하여 Synbiotics ELISA (Blocking ELISA)를 실시하였다. 상기 Synbiotics ELISA는 SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking 키트 (Synbiotics corp. 미국)를 이용하여 실시하였다. 먼저, 검사하고자하는 샘플을 100배 희석하여 웰 (well)에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 인큐베이션 (incubation)하였다. 1시간 후 키트의 워싱 버퍼로 4회 세척하였다. 세척 후 콘쥬게이트(conjugate)를 100배 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 인큐이션하였다. 1시간 후 워싱 버퍼로 4회 세척하였다. 세척된 웰에 기질 (substrate)를 100 ㎕씩 분주한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응한 후 stop 솔루션을 50 ㎕씩 웰에 넣고 반응을 정지하여 흡광도 값을 측정하였다. S/N 값의 평균이 0.4보다 작은 경우 양성으로 판정하였으며, 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, PCV2a, PCV2b, PCV2d 시험 백신 모두 S/N 값의 평균이 0.3이하로 나타났으며, 상용 백신인 circo flex 백신보다 S/N 값이 낮게 측정된 것을 확인하였다.

실시예 8. 바이러스 중화 시험 (마우스)

혈청의 중화작용 시험을 하기 위해 실시예 7에서 채혈한 시험 혈청을 2배 단계 희석하여 준비하고 100μl의 200 FFU PCV2를 100μl의 혈청 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 혼합물을 96-웰 플레이트에 PK15 세포(5 × 10³)에 첨가하였다. 37℃ 에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포 배양 배지를 1x PBS에서 2회 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 중화효과는 감염 5일 후 PCV2 면역염색을 통해 세포내 바이러스 감염수준을 확인하였다. 면역염색 결과 단계희석별 PCV2 양성세포 수를 확인한 후 VNT90 (90% 이상 바이러스 중화되는 수준)를 기준으로 양·음성을 판정하였으며, 바이러스 중화시험 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PCV2d를 이용한 마우스 시험 혈청의 경우, PCV2d 바이러스에 대해 우수한 중화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 9. 시험백신 검증 (돼지)

3주령 자돈 3마리의 근육에 PCV2d 재조합 캡시드 단백질을 포함하는 PCV2d 시험백신 2ml를 접종하였다. 대조군으로 동일 일령의 자돈 3마리를 이용하였다. 접종 6주 후 채혈하여 돼지 써코바이러스는 ELISA와 바이러스 중화 시험을 실시하였다. 메디안에서 판매중인 VDPro® PCV2 AB ELISA키트를 이용하여 ELISA를 실시하였다. PCV2 항체가 코팅된 플레이트에 검사하고자하는 샘플을 100배 희석하여 100 μl씩 넣고 laboratory temperature 에서 30분간 인큐베이션(incubation)하였다. 워싱 버퍼로 3번 세척 하였다. 세척 후 HRPO Anti-Swine IgG Conjugate를 100 μl씩 각 웰에 분주하였다. laboratory temperature에서 30분간 반응 후에 워싱 버퍼로 3번 세척하고, TMB 용액을 100 μl 분주하고, 15분 후 stop 솔루션을 50 μl 분주하여 ELISA 리더기(450 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플을 음성대조 흡광도로 나누어 S/P 비율로 다른 검출법과 비교하였으며, S/P 값을 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, PCV2d 시험백신의 S/P 값이 0.79로 측정되어 상용화 백신인 circo flex 백신과 유사한 정도로 측정되었다.

실시예 10. 바이러스 중화 시험 (돼지)

혈청의 중화작용 시험을 하기 위해 실시예 9에서 준비한 시험 혈청을 2배 단계 희석하여 준비하고 100μl의 200 FFU PCV2를 100μl의 혈청 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 혼합물을 96-웰 플레이트에 PK15 세포(5 × 10³)에 첨가하였다. 37℃ 에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포 배양 배지를 1x PBS에서 2회 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 중화효과는 감염 5일 후 PCV2 면역염색을 통해 세포내 바이러스 감염수준을 확인하였다. 면역염색 결과 단계희석별 PCV2 양성세포 수를 확인한 후 VNT90 (90% 이상 바이러스 중화되는 수준)를 기준으로 양·음성을 판정하였으며, 바이러스 중화시험 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PCV2d를 이용한 시험 혈청의 경우, PCV2a, PCV2b, PCV2d에 모두 우수한 중화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

제제예 1. 산제의 제조

PCV2d의 ORF2 10mg

유당 100mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 주사제의 제조

PCV2d의 ORF2 100μg

주사용 멸균 증류수 적량

조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 3. 액제의 제조

PCV2d의 ORF2 10mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

<110> KBNP, INC. REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Vaccine composition comprising PCV2d recombinant protein <130> KBNP 1-2P <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2a optimized sequence <400> 1 atgacatacc cccgcagaag ataccgtaga agaagacata gacctcgtag cgacctcggc 60 caaatcctcc gtagaagacc atggctggtg caccctaggc acagataccg ctggcgccgt 120 aagaacggca tcttcaacac tagactgtcc cgcactttcg gatacaccgt gaaggctacc 180 actgtcagaa ccccaagctg ggccgtggac atgatgcgct tcaacatcga cgacttcgtc 240 cctcccggtg gcggaactaa caagatctcc atccctttcg agtactaccg tatcaggaag 300 gtgaaggtcg agttctggcc ttgctccccc atcacacaag gtgaccgcgg tgtgggcagc 360 accgctgtca tcctggacga caacttcgtg accaaggcta ctgccctgac ctacgacccc 420 tacgtcaact actccagccg tcacaccatc ccacagcctt tctcttacca ctcaaggtac 480 ttcactccca agccagtcct ggactctacc atcgactact tccagccaaa caacaagaga 540 aaccagctgt ggctgcgtct gcaaacttct aggaacgtgg accacgtcgg actgggcacc 600 gccttcgaga actcaaagta cgaccaggac tacaacatcc gtgtgactat gtacgtccag 660 ttcagagagt tcaacctcaa agacccaccc ctcaacccct aa 702 <210> 2 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2b optimized sequence <400> 2 atgacttacc ctaggcgtag gtatcgtcgt cgccgccacc gtcctcgctc tcacctgggc 60 caaatcttga ggcgcagacc atggttggtc cacccacgtc accgctaccg ctggaggagg 120 aaaaacggta tctttaatac tcgcttgtcc cgtaccttcg gttacacggt aaaaaggaca 180 acggtcacta ccccatcctg ggcggttgat atgatgcgct tcaagttgga tgactttgtt 240 ccacctggcg gtggaacgaa caagatctca atacctttcg agtactacag aataagaaag 300 gttaaagtcg agttctggcc ctgttctcct atcacacagg gagacagggg agtcggttca 360 acagctgtaa tcctggacga caacttcgta cccaaagcga ctgctctcac gtatgaccct 420 tacgtcaact attcctcgcg tcacactatc cctcaacctt tttcatacca ctcacgttac 480 ttcaccccga agcctgtgct ggactcaact atagactatt tccagccaaa taacaaacgt 540 aatcaactct ggttgcgctt gcagacttcc cgcaacgttg accacgtagg cttgggtaca 600 gctttcgaga atagtaagta cgaccaagac tacaacatca gggtgacgat gtacgtccag 660 ttccgtgagt ttaacctcaa ggacccccct ctgaagcctt aa 702 <210> 3 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2d optimized sequence <400> 3 atgacttatc cacgtcgtag attccgacgc cgccgtcacc gccctcgttc ccacctgggt 60 cagatcctcc gcaggcgtcc ttggctggta caccctagac atcgatacag atggcgcaga 120 aagaacggca tcttcaatac tcgcttgagc cgcactattg gatataccgt caaaaagacc 180 actgtaagaa cacccagttg gaacgtcgat atgatgcgtt tcaacatcaa tgatttcttg 240 ccaccaggtg gcggaagcaa ccccttgacc gtgccttttg agtattacag gattcgcaag 300 gtaaaggtcg aattctggcc ttgctcccca atcacccaag gcgaccgcgg agttggttca 360 acagccgtga tactcgatga caacttcgtg accaaggcta acgctctgac atacgaccct 420 tacgtcaact actcatctag gcatacgata acgcagccgt tttcttacca cagtaggtat 480 ttcacgccca agcccgttct cgatcgcaca attgactact ttcaacccaa taataaacgg 540 aaccaacttt ggctgcgctt acagacaacc ggtaacgttg accacgtggg tctgggcacg 600 gctttcgaaa actcgattta cgatcaggac tacaacatca gaatcactat gtacgtgcag 660 ttccgtgagt tcaacctcaa agacccgcct ctaaatccaa aa 702 <210> 4 <211> 704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2d QIA 244 ORF2 sequence <400> 4 tgacgtatcc aaggaggcgt ttccgcagac gaagacaccg cccccgcagc catcttggcc 60 aaatcctccg ccgccgcccc tggctcgtcc acccccgcca ccgttaccgc tggagaagga 120 aaaatggcat cttcaacacc cgcctctccc gcaccatcgg ttatactgtc aagaaaacca 180 cagtcagaac gccctcctgg aatgtggaca tgatgagatt taatattaat gattttcttc 240 ccccaggagg gggctcaaac cccctcactg tgccctttga atactacaga ataaggaagg 300 ttaaggttga attctggccc tgctccccaa tcacccaggg tgacagggga gtgggctcca 360 ctgctgttat tctagatgat aactttgtaa caaaggccaa tgccctaacc tatgacccct 420 atgtaaacta ctcctcccgc cataccataa cccagccctt ctcctaccac tcccggtact 480 ttaccccgaa acctgtcctt gataggacaa tcgattactt ccaacccaat aacaaaagaa 540 atcaactctg gctgagacta caaactactg gaaatgtaga ccatgtaggc ctcggcactg 600 cattcgaaaa cagtatatac gaccaggact acaatatccg tataaccatg tatgtacaat 660 tcagagaatt taatcttaaa gaccccccac ttaaccctaa gtga 704 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for rAc <400> 5 caaactaata tcacaaactg gaaatgtcta tc 32 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rAc <400> 6 tacaacaatt gtctgtaaat caacaacgc 29 <210> 7 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2d recombination protein sequence <400> 7 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys 225 230

Claims (13)

1. 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 바이러스에 교차반응을 나타내는 것인, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 암호화하는 아미노산 서열에 대한 코돈 최적화된 것인, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 베큘로바이러스에 형질도입하는 단계;
   상기 베큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계; 및
   상기 세포로부터 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 바이러스에 교차반응을 나타내는 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물 제조 방법.
   
6. 제5항의 제조방법에 의해 제조된, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 바이러스에 교차반응을 나타내는 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환은 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome), 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection)용 백신 조성물.
    
11. 삭제
12. 제9항의 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection) 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 개체는 돼지인, PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 감염성 질환의 교차 예방(cross protection) 방법.

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