KR102314105B1

KR102314105B1 - 신규한 돼지 써코바이러스 2형(pcv2) 바이러스 및 그의 이용

Info

Publication number: KR102314105B1
Application number: KR1020190119373A
Authority: KR
Inventors: 차상호; 강석진; 유수화; 현방훈
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2021-10-18
Also published as: KR20210037138A

Abstract

본 발명은 신규한 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주 KCTC 13839BP에 관한 것이다. 본 발명은 국내에서 최근 유행하는 돼지 써코바이러스 2형 야외주를 분리한 것으로, 상기 야외분리주는 현행 백신에 대한 중화효율이 낮을 뿐만 아니라, 서로 다른 PCV2 유전자형 바이러스를 효율적으로 중화시킬 수 있어 이를 바탕으로 최근 유행하는 야외바이러스에 대한 보다 효과적인 백신, 나아가 모든 유전자형의 PCV2에 적용할 수 있는 백신 조성물, 치료제, 진단제 등으로 다양하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 바이러스 및 그의 이용{Novel Porcine circovirus type 2 virus and uses thereof}

본 발명은 신규한 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주에 관한 것이다.

돼지써코바이러스(Porcine circovirus, PCV)는 단일 가닥 원형게놈을 가지고 게놈의 크기가 1767~1768개의 염기로 이루어진 비-외피 DNA 바이러스이다. 3개의 주요 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame, ORF)을 가지고 있으며, 이 중 바이러스의 캡시드(capsid) 단백질 유전자는 ORF2로 바이러스의 주요 혈청형 및 항원형을 나타낸다.

돼지써코바이러스는 비병원성인 PCV1과 병원성인 PCV2로 분류되는데, 상기 PCV2는 처음에는 이유자돈의 전신 소모성 증후군(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)을 일으키는 것으로 알려져 있었으나, 현재는 PMWS 뿐만 아니라 돼지호흡기복합감염증(porcine respiratory disease complex, PRDC), 돼지피부염신증증후군(porcine dermatopathy and nephropathy syndrome, PDNS), 번식장애, 소화기질병 등 다양한 질병의 발생에 관여함에 따라 이 바이러스와 관련되어 발생하는 질병들을 통틀어 돼지써코바이러스병(Porcine Circovirus Diseases, PCVD)라고 명명한다.

PCV2의 서브타입으로는 PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d 및 PCV2e가 공지되어 있고, 이들은 PCV2 유전자형(genotype)에 대한 통합 명명법에 따라 분류된다. 이러한 유전자형 간의 병원성은 아직 확실치 않으며, 인공감염을 통한 결과에서도 병원성의 차이에 대한 결론을 내리지 못하고 있다. PCV2의 감염 피해를 줄이기 위해 농장의 위생 및 방역 등의 관리가 우선되어야 하지만 근래에는 이러한 감염을 차단하기 위한 여러 종류의 백신이 개발되어 사용되고 있다.

한편, 2010년대에 들어서면서 PCV2는 PCV2a/2b 유전자형에서 PCV2b 변이주(mutant PCV2b 또는 PCV2d)로 유전자형의 변화가 급격히 진행되었다. 특히, PCV2d는 대한민국을 포함하여 미국, 네덜란드, 중국 등지에서 보고되었으며, 기존의 PCV2a, PCV2b에 비하여 상대적으로 강한 병원성을 가지므로 자돈에 감염 시 더욱 심각한 임상증상과 병변을 나타낸다. 최근 국내외에서 기존 PCV2 백신 접종 시 PCV2d에 대한 방어에 실패하여 PCVAD으로 이어지는 등(Chae CH. 2015, An emerging porcine circovirus type 2b mutant (mPCV2b) originally known as PCV2d. Vet J 203:6-9), 백신실패 의심사례가 지속적으로 보고되고 있다.

따라서, 최근 유행하는 야외바이러스에 대한 보다 효과적인 백신, 나아가 모든 유전자형의 PCV2에 적용할 수 있는 신규 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 현재 유행하고 있는 국내 써코바이러스 2형의 분리 및 변이분석을 통해 다수의 국내 고역가 분리주를 확보한 후, 확보한 분리주의 ORF2 아미노산 염기서열의 계통분석 및 단클론 항체와의 반응성을 통한 항원적 특성을 확인하여 신규한 PCV2d 유전자형 분리주를 확보하고, 상기 분리주가 현행 백신에 대한 중화효율이 현저히 낮고, 모든 유전자형의 PCV2에 적용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 13839BP로 수탁된, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 유전자로부터 발현된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 써코바이러스 2형 백신후보물질을 돼지에 투여하는 단계; 상기 백신후보물질이 투여된 돼지에 제1항의 국내 분리주를 공격접종하는 단계; 및 상기 공격접종한 돼지의 증상을 조사하는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 바이러스 백신후보물질의 면역원성에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13839BP로 수탁된, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 유전자로부터 발현된 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 백신후보물질을 돼지에 투여하는 단계; 상기 백신후보물질이 투여된 돼지에 제1항의 국내 분리주를 공격접종하는 단계; 및 상기 공격접종한 돼지의 증상을 조사하는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 바이러스 백신후보물질의 면역원성에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 국내에서 최근 유행하는 돼지 써코바이러스 2형 야외주를 분리한 것으로, 상기 야외분리주는 현행 백신에 대한 중화효율이 낮을 뿐만 아니라, 서로 다른 PCV2 유전자형 바이러스를 효율적으로 중화시킬 수 있어 이를 바탕으로 최근 유행하는 야외바이러스에 대한 보다 효과적인 백신, 나아가 모든 유전자형의 PCV2에 적용할 수 있는 백신 조성물, 치료제, 진단제 등으로 다양하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 국내 양돈농가(2016~2018년)에서 분리한 PCV2 ORF2의 유전적 분석 결과를 나타낸 도이다. (A) 134개 PCV2 분리주의 ORF2 서열을 47개 PCV2 레퍼런스를 참조로 하여 분석한 결과로, PCV2a는 파란색, PCV2b는 녹색, PCV2d는 빨간 원으로 표시하였다. PCV2c 및 PCV2e는 최근 국내에서 검출되지 않음을 알 수 있다. (B) 134개 PCV2 분리주의 검출율을 연도별로 나타낸 것으로, 현재 PCV2d 유전자형이 국내에서 가장 유행하는 유전자형임을 알 수 있다. (C) 각 유전자형 별 PCV2 분리주 ORF2의 뉴클레오티드, 아미노산 동정 결과를 나타낸 도이다. (D) PCV2d 분리주로서 QIA169를 PK15 세포에 감염시키고 감염 5일차에 mAb-2를 사용하여 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 서로 다른 PCV2 유전자형에 대한 mAb의 항원 반응성을 확인한 도이다. (A) 6개 mAb가 PK15 세포에 감염된 PCV2a 분리주(QIA215), PCV2b 분리주(QIA418) 및 2개 PCV2d 분리주(QIA169 및 QIA244)(200 TCID₅₀)와 반응함을 확인한 도이다. 그래프 위 a, b 표시는 통계적 유의성을 나타낸다(p<0.05). (B) FITC에 대한 동일한 노출 시간에서의 형광 이미지를 (A)의 평균 형광 강도와 비교한 도이다(Scale bar = 12.5μm).
도 3은 mAb 및 PCV2의 중화실험 결과를 나타낸 도이다. 각 mAb 희석액(200~3200배)을 사용하여 각각 QIA215(○), QIA418(□), QIA169(●)및 QIA244(■)로 중화시킨 결과를 나타내었다. 모든 PCV2 유전자형에 대하여 보편적인 반응성을 가지고 있는 mAb-2를 사용한 면역염색을 통해, 감염 5일차의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 대조군에 대한 %로 나타내었다(A-F). * 표시는 통계적 유의성을 나타낸다(p<0.05). (G) mAb-2에 따른 PCV2-양성 세포의 감소를 나타낸 도이다. 이미지는 100x 배율로 확대된 것이다.
도 4는 혈청 중화실험 결과를 나타낸 도이다. (A) Ingelvac CircoFLEX로 백신 접종된 SPF 돼지로부터 항-혈청을 확보하고 QIA215로 적정하였다. 백신접종 전(0 week) 및 접종 후(12 week) 혈청 희석액(32~512배)을 200 TCID₅₀/ml QIA215로 배양한 결과를 나타내었다. PCV2a 바이러스는 12주차에 64배까지 완전히 중화됨을 알 수 있다. (B) 각 PCV2(10^4.5TCID₅₀/ml)를 1:64로 희석된 혈청 희석액으로 1시간 동안 배양하고 2시간 동안 PK15 세포에 감염시킨 결과를 나타낸 도이다. 바이러스 역가는 감염 24시간 후 RT-PCR로 측정하였다. 혈청희석액(1:64)은 QIA215 및 QIA418를 완전히 중화시킨 반면(각각 99.9%, 85.1%), PCV2d는 중화효율에 큰 차이를 나타냄을 알 수 있다(42.9 내지 90.5%). (C) PCV2d 분리주 간 중화효율의 큰 차이를 형광분석을 통하여 재확인한 결과를 나타낸 도이다. qPCR 및 형광분석 간 VN(%)이 유사한 경향을 나타냄을 알 수 있다. (D) 상기 결과를 1 x 10⁴ 세포 당 계수한 PCV2-양성 세포로 환산한 결과를 나타내었다. 이미지는 100x 배율로 확대된 것이다.
도 5는 서로 다른 PCV2 유전자형 간 교차방어능을 평가한 결과를 나타낸 도이다. Ingelvac CircoFLEX(A), QIA215(B), QIA418(C), QIA169(D) 및 QIA244 (E)로 백신 접종한 기니피그에서 혈청을 확보하고 QIA215(○), QIA418(□), QIA169(●) 및 QIA244(■)로 각각 중화시킨 결과를 나타내었다. SN 역가(SN titer)는 VNT90에 의해 동종 PCV2에 대한 각 혈청 희석배수(2ⁿ)로 결정되었다. SN 역가 2배, 4배, 8배에서 평가한 교차방어능을 나타내었다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KCTC 13839BP로 수탁된, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus) 국내 분리주를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 분리주는 PCV2d 유전자형에 속하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 분리주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 전장게놈 DNA를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 분리주는 돼지 써코바이러스 2형 국내 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 유전자를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 2로 표시되는 염기서열은 하기 표 1과 같다.

	염기서열 (5'-3')	서열번호
KCTC 13839BP 전체 염기서열	ACCAGCGCACTTCGGCAGCGGCAGCACCTCGGCAGCACCTCAGCAGCAACATGCCCAGCAAAAAGAATGGAAGAAGCGGACCCCAACCACACAAAAGGTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCGAAGACGAGCGCAAGAAAATACGGGAGCTTCCAATCTCCCTTTTTGATTATTTTATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCCCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCAAACATTTAATAAAGTGAAATGGTATTTCGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCGAAAGGAACGGATCAGCAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATCGAATGTGGAGCTCCTAGATCTCAAGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGCTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACCAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGCAAAAGTAAATGGGCTGCTAATTTTGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCCTGGGATGATCTACTGAGACTGTGTGATCGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAGTATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGCTACAGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCCCCCCCATGCCCTGAATTTCCATATGAAATAAATTACTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTATACGGATATTGTAGTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAATGCAGTGCCGAGGCCTACATGGTCTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCAGAGTTGATTTCTTTTGTTATTGGGTTGGAAGTAATCGATTGTCCTATCAAGGACAGGTTTCGGGGTAAAGTACCGGGAGTGGTAGGAGAAGGGCTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAGGGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCACTCCCCTGTCACCCTGGGTGATTGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTCCTTATTCTGTAGTATTCAAAGGGCACAGTGAGGGGGTTTGAGCCCCCTCCTGGGGGAAGAAAATCATTAATATTAAATCTCATCATGTCCACATTCCAGGAGGGCGTTCTGACTGTGGTTTTCTTGACAGTATAACCGATGGTGCGGGAGAGGCGGGTGTTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAGCGGTAACGGTGGCGGGGGTGGACGAGCCAGGGGCGGCGGCGGAGGATTTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGGTGTCTTCGTCTGCGGAAACGCCTCCTTGGATACGTCATCGCTGAAAACGAAAGAAGTGCGCTGTAAGTATT	1
ORF2 유전자	ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAAATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAAACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAACTCTGGCTGAGACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCATTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAGTGA	2

본 발명에 있어서, 상기 분리주는 국내 유행 써코바이러스 2형(PCV2)에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 분리주는 현행 백신에 대한 중화효율이 낮은 신규한 PCV2d 유전자형 분리주로, 현재 국내에서 가장 유행하는 써코바이러스 2형(PCV2)에 대한 효과적인 방어가 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 분리주는 PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d 및 PCV2e로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 PCV2 유전형에 대하여 높은 교차 방어능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 호흡기 질환으로 인한 질병 진단이 필요한 국내 돼지 농장에서 수집한 조직 샘플로부터 PCV2의 분리 및 변이분석을 통해 다수의 국내 고역가 분리주를 확보한 후, 확보한 분리주의 ORF2 아미노산 염기서열의 계통분석 및 단클론 항체와의 반응성을 통한 항원적 특성을 확인하여 신규한 PCV2d 유전자형 분리주를 확보하였다. 나아가, 상기 PCV2d 유전자형 분리주는 현행 백신에 대한 중화효율이 현저히 낮으면서도, 서로 다른 유전자형의 PCV2 바이러스를 효율적으로 중화시킬 수 있음을 확인하고, 2019년 04월 17일자로 한국생명공학연구원(KCTC 13839BP)에 기탁하였다.

본 발명에 있어서, 상기 ORF2 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 공격접종한 돼지의 증상을 조사하는 단계는 구체적으로 PCV2에 대한 면역력 증진, 바이러스혈증(viremia), 체중감소, 기침, 호흡곤란, 황달, 설사, 신경증상, 관절염 등의 임상 징후들의 정도 완화, 생존율 등을 조사하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주 KCTC 13839BP(QIA244)의 경우 현행 백신에 대하여 매우 낮은 중화효율을 나타내며, 나아가 모든 PCV2 유전자형을 방어할 수 있음을 확인하여, 최근 국내에서 가장 유행하는 PCV2d를 비롯한 다양한 유전자형(genotype)의 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)을 효과적으로 방어하고, 양돈농가의 생산성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 QIA244는 PCV2d의 유전자형에 속하는 QIA17-244를 의미한다(도 1 중 A 참고).

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 돼지써코바이러스 2형 국내 분리주 KCTC 13839BP는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 바이러스 백신후보물질의 면역원성에 대한 정보 제공이 가능하고, 이를 통해 신규 백신 개발에 활용될 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료 및 방법

1-1. 시료 준비

2016년부터 2018 년까지 국내 돼지 농장에서 총 803개의 혈청과 389개의 조직 샘플(폐 322개, 림프절 45개)을 수집하였다. 임상 샘플을 채취한 돼지 농장들은 호흡기 질환으로 인한 질병 진단이 필요한 농장에 해당하였다. 조직 샘플(300-500 mg)을 MagNA Lyser Green Beads(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 및 Precellys 24 균질기(Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PBS 내에서 균질화시켰다. 균질화된 조직샘플을 13,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하고 상층액을 회수하여 멸균 튜브로 옮긴 후, 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다.

1-2. 임상 샘플 유래 PCV2의 서열 및 계통 분석

상기 기술된 바와 같이 준비된 조직 균질액 및 혈청에서 제조사의 지침에 따라 DNeasy blood & Tissue Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 바이러스 게놈 DNA를 추출하였다. PCV2를 검출하기 위해 HotStarTaq Plus Master Mix Kit 및 ORF2 특이적 정방향 프라이머(5'-CACGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3') 및 역방향 프라이머(5'-GCACCTTCGGATATACTG-3')를 사용하여 ORF2 유전자의 전장을 증폭시켰다. PCR 증폭 산물을 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)로 정제하고 DNA 뉴클레오티드 시퀀싱(Macrogen, Seoul, Korea)을 통해 확인하였다.

국내 돼지농장에서 검출된 다른 PCV2 바이러스와의 유전적 연관성을 분석하기 위해 본 발명자들은 CLC Main Workbench(Qiagen, Version 7.0.3)를 사용하여 다중서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였다. MEGA(Version 7.0)를 이용하여 이웃 결합 트리(Neighbor-joining tree)를 구성하고, 부트스트랩(Bootstrap)을 1,000으로 설정하여 구축된 트리의 신뢰성을 평가하였다.

1-3. qPCR 분석

상기 기술된 바와 같이 준비된 상층액과 세포로부터 DNeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 총 DNA를 분리하였다. qPCR은 LightCycler 480 II(Roche Diagnostics) 및 SYBER green script premix(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR은 95℃ 10초 변성, 64℃ 10초 어닐링, 72℃ 20초 변이 조건으로 40사이클을 수행하였다. 바이러스 역가(titer)는 표준 곡선에 의해 추정하였다.

1-4. 면역세포화학( Immunocytochemistry )

6종의 단클론 항체(mAb) mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6을 사용하였다. 면역 염색을 위해, 형질감염된 PK15 세포를 80% 아세톤으로 -20℃에서 10분간 고정시켰다. 1X PBS로 세척한 후, 1차 항체로서 mAb(1:200)를 실온(RT)에서 1시간 동안 항온 처리하여 반응시켰다. 상층액을 버리고, 1x PBS로 3회 세척 후, 2차 항체로 마우스 유래 항-마우스 Alexa fluor^TM 488 goat anti-mouse IgG(1:200)를 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 핵은 1X PBS(1:1,000)로 희석된 Hoechst33258(Invitrogen)로 5분 동안 염색하였다. 형광 현미경(Olympus)을 사용하여 면역 형광을 검출하고 ArrayScan VTI HCS(Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 타겟의 형광 강도 또는 PCV2 양성 세포의 수를 측정하였다.

1-5. 동물 혈청

Ingelvac CircoFLEX(Boehringer Ingelheim Vetmedica)로 백신 접종된 특정 병원균이 없는 SPF 돼지의 항-혈청을 사용하였다. Freund's 아쥬번트(incomplete 및 complete)와 혼합한 QIA215, QIA418, QIA169 그리고 QIA244와 Ingelvac CircoFLEX로 각각 면역화한 기니 피그의 항-혈청을 사용하였다.

1-6. 바이러스 중화 시험

단클론 항체와 혈청의 중화작용을 검출하기 위해 Meerts et al.,(2005)의 방법을 적용하였다. 구체적으로, 100ul의 200 TCID₅₀ PCV2를 100ul의 mAb 또는 혈청 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 혼합물을 96-웰 플레이트의 4개 웰에 도포된 PK15 세포(5 × 10³)에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포 배양 배지를 1x PBS에서 2회 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 5일 후 세포를 고정하고, PCV2로 감염된 PK15 세포를 상기 기술된 바와 같이 염색하였다. ArrayScan VTI HCS를 사용하여 1 x 10⁴세포 당 감염된 세포의 수를 계수하고, 대조군에 대한 %(% control) 및 바이러스 중화율(% VN)으로 단클론 항체와 혈청의 중화 활성을 나타내었다.

1-7. 통계적 분석

모든 결과는 3회 반복으로 수행하여(n=3)에 평균±표준 오차(SE)로 나타내었다. Statistica5.5(StatSoft, OK, USA) 및 분산분석(ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였고, Duncan의 다중 비교 실험을 통해 대조군과 각 치료군 간 사후분석(post-hoc comparisons)을 수행하였다. p<0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

실시예 2. 실험 결과

2-1. PCV2의 분리 및 유전자형 분석

총 741개의 국내 돼지 농장(2016~2018)에서 채취한 폐 및 림프절 조직 중 폐 조직 샘플 489개, 혈청 741개에서 PCV2 감염이 확인되었다. ORF2 PCR을 시행한 결과 양성 판정은 조직 샘플이 57.9%(283/489), 혈청이 24%(175/717)로 확인되었다. 계통 발생 분석 및 서열 상동성 분석에서, 모든 한국 분리주(n=134)는 PCV2a, 2b 및 2d로 분류되었다(도 1A). 최근 국내 유행 PCV2를 고려하여, 각 분리주를 PCV2a(n=4), PCV2b(n=26) 및 PCV2d(n=104)로 분류하였고, 각 분리주의 감염 빈도는 각각 3%(4/134), 19.4%(26/134) 및 77.6%(194/143)로 나타났다. 한편, PCV2c 및 2e는 검출되지 않았다. 유전자형 분석 결과, 현재 한국에서 가장 흔한 유전자형은 PCV2d임을 확인하였다(그림 1B). 짝비교(pair-wise comparison) 수행 결과, 분리주의 ORF2 유전자 염기서열, PCV2a(97.29 내지 99.43%), PCV2b(97.86 내지 100%) 및 PCV2d(97.73 내지 100%), ORF2 아미노산 염기서열, PCV2a(97.01 내지 99.57%), PCV2b(98.29 내지 100%) 및 PCV2d(97.01 내지 100%)는 대응하는 공지된 뉴클레오티드 서열과 88.37 내지 100% 및 아미노산 서열과 87.66 내지 100% 일치함을 확인하였다(도 1C). 국내 PCV2d 분리주 QIA169를 PK15 세포에 감염시키고 감염 5일차에 mAb-2를 사용하여 면역염색을 수행한 결과, 감염 5일 차에 PCV2d 분리주는 PK15 세포의 핵에 국한되어 발견됨을 확인하였다(도 1D).

2-2. PCV2 유전자형에 따른 항원 다양성 평가

PCV2a 바이러스 백신 접종 후 생산 된 6개의 마우스 단클론 항체를 사용하여 PCV2a, PCV2b 및 PCV2d 유전자형의 항원 다양성을 평가하였다. 먼저, 각 PCV2에 대한 단클론 항체의 항원 반응성을 측정하기 위해, PK15 세포에 QIA215, QIA418, QIA169 및 QIA244를 각각 200 TCID₅₀으로 감염시켰다. 상기 QIA169, QIA244 분리주는 PCV2d 분리주로, 본 발명자들의 예비 연구를 통해 ORF2 아미노산 서열 유사도 및 계통 발생 분석에 따라 선정하여 실험에 사용하였다. ArrayScan VNT HCS를 이용하여 각 단클론 항체와 반응한 후의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 측정하고, 결과값은 총 강도의 평균으로 나타내었다(도 2A). 또한, FITC에 대한 동일한 노출 시간에서의 형광 이미지를 (A)의 평균 형광 강도와 비교하였다(도 2B) 그 결과, mAb-1 및 mAb-3은 항원 간에 유사한 반응성을 나타낸 반면, mAb-2, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6은 그렇지 않음을 확인하였다. mAb-2의 경우, QIA169에 대하여 특히 낮은 친화도를 나타냄을 확인하였다. mAb-5는 QIA215 및 QIA418와 강한 반응성을 보인 반면, PCV2d 분리주와는 약한 반응성을 나타냄을 확인하였다.

단클론 항체의 중화 활성을 검출하기 위해, 각 단클론 항체의 연속 희석액 (200 내지 3200배)을 4개의 PCV2(200 TCID₅₀)로 중화시키고 PK15 세포에 감염시켰다. 모든 PCV2 유전자형에 대하여 보편적인 반응성을 가지고 있는 mAb-2를 사용한 면역염색을 통해, 감염 5일차의 PCV2-양성 세포의 형광 강도를 대조군에 대한 %로 나타내었다. 그 결과, 형광 강도의 변화는 mAb-2를 제외한 모든 단클론 항체에서 검출되지 않았다(도 3A 내지 3F). mAb-2의 경우, PCV2-양성 세포의 형광 강도는 QIA215의 800배 희석에 의해 대조군에 비해 현저하게 감소되었다(도 3B). mAb-2 및 QIA215의 중화에서의 유의한 차이(p<0.05)는 단클론 항체의 희석 정도와 무관하게 유지되었다(도 3G).

2-3. PCV2 유전자형 간 혈청 중화능 평가

PCV2 유전자형 간의 혈청 중화능을 평가하기 위해 현행 PCV2a 기반 백신인 Ingelvac CircoFLEX로 접종한 돼지의 항-혈청을 사용하였다. 접종 후 12주차 돼지 혈청의 연속 희석액(32 내지 512배)을 동종 유전자형인 QIA215(200 TCID₅₀)로 중화시켰다. 항원은 64배 희석액에서 완전히 중화되었다(도 4A). 한편, 접종 전 돼지 혈청(0 week)은 QIA215를 중화시키지 않았다. PCV2a 기반 백신의 교차방어능을 평가하기 위해, QIA215, QIA418 및 2개 PCV2d 분리주(QIA169 및 QIA244)를 SN 역가(SN titer)가 1:64인 12주차 돼지 혈청으로 중화시키고, 접종 1일 후(day 1) qPCR을 통해 바이러스 정량화를 수행하였다(도 4B). 그 결과, 모든 PCV2d 분리주는 QIA215 바이러스(99.9%)에 비해 상대적으로 적게 중화된 것을 확인하였다. 특히, PCV2d 분리주 간에도 48.5% 내지 76.7%로 바이러스 중화효율에서 큰 차이를 나타내었다. 이는 접종 5일 후 분리주 간 수행한 형광 분석을 통하여도 확인할 수 있었는데, 대조군(혈청 없음, 200 TCID₅₀)과 비교하여 QIA215는 128배 및 64배 희석 시 중화효율이 95.4 내지 95.6%로 나타난 반면, QIA169는 69.9 내지 85.1%, QIA244는 0.3 내지 29.3%로 나타남을 확인하였다(도 4C). 상기 결과는 1 × 10⁴ 세포 당 PCV2-양성 세포의 수를 세어 측정하였다(도 4D).

2-4. PCV2 유전자형 간 교차방어능 평가

다음으로, PCV2 유전자형 간의 교차방어능을 분석하기 위해, QIA215, QIA418, QIA169, QIA244 및 Ingelvac CircoFLEX로 각각 백신 접종한 기니피그로부터 수집한 항-혈청을 동종 유전자형의 PCV2(200 TCID₅₀)로 중화시켰다. 혈청 중화 역가는 VNT90(최대 90% 중화율)에 의해 결정되었다. 동종 PCV2로 결정된 SN 역가에 기초하여, 2배, 4배 및 8배 SN 역가에서 상이한 PCV2 유전자형 간 교차방어능을 확인하였다(도 5). 그 결과, Ingelvac CircoFLEX, QIA215, QIA418 및 QIA169에 의해 면역유도된 기니픽 항-혈청은 서로 다른 유전형의 바이러스를 비교적 효율적으로 중화하는 반면, QIA244 분리주는 Ingelvac CircoFLEX, QIA215, QIA418 및 QIA169 항-혈청에 대하여 다른 PCV2 분리주보다 상대적으로 낮은 중화 효율을 나타냄을 확인하였다(도 5A 내지 5D). 그러나, QIA244는 QIA244의 항-혈청에 의해 완전히 중화되었으며, 이는 다른 유전자형의 PCV2 분리주에서도 유사하게 나타남을 확인하였다(도 5E). 상기 결과를 통해, QIA244에 의해 면역유도된 기니픽 항-혈청은 국내에서 가장 유행하는 PCV2d 유전자형뿐만 아니라, 모든 PCV2 유전자형을 효율적으로 방어할 수 있음을 확인하였다.

이상의 실험을 통해, 신규 PCV2d 분리주인 QIA244는 현행 백신에 대한 중화효율이 현저히 낮아 최근 유행하는 야외바이러스를 효율적으로 제어할 수 있는 백신 개발이 가능하고, 나아가 QIA244에 의해 면역유도된 항-혈청은 다른 유전자형의 PCV2 바이러스 간에도 높은 교차중화능을 나타낼 수 있어 적은 비용으로 치료효율을 극대화할 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 QIA244를 2019년 04월 17일자로 한국생명공학연구원(KCTC 13839BP)에 기탁하였다.

본 발명에 따른 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주는 효율적인 PCV2 백신 개발을 위한 신규 국내 분리주로 활용할 수 있어, 다양한 유전자형의 돼지 써코바이러스 2형에 대한 백신 조성물, 치료제, 진단제 등으로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

한국생명공학연구원

KCTC13839BP

20190417

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Novel Porcine circovirus type 2 virus and uses thereof <130> QIA1-97P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCTC13839P <400> 1 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 aaaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac acaaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattatttta 180 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacccca cctccagggg ttcgctaatt 240 ttgtgaagaa gcaaacattt aataaagtga aatggtattt cggtgcccgc tgccacatcg 300 agaaagcgaa aggaacggat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360 tgatcgaatg tggagctcct agatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420 gtaccttgct ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggcaaa agtaaatggg 600 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccctggg 720 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ttttattatt cacttagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080 atacatggtt atacggatat tgtagtcctg gtcgtatata ctgttttcga atgcagtgcc 1140 gaggcctaca tggtctacat ttccagtagt ttgtagtctc agccagagtt gatttctttt 1200 gttattgggt tggaagtaat cgattgtcct atcaaggaca ggtttcgggg taaagtaccg 1260 ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320 ataggttagg gcattggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cagtggagcc 1380 cactcccctg tcaccctggg tgattgggga gcagggccag aattcaacct taaccttcct 1440 tattctgtag tattcaaagg gcacagtgag ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500 atcattaata ttaaatctca tcatgtccac attccaggag ggcgttctga ctgtggtttt 1560 cttgacagta taaccgatgg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620 ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg cggcggagga tttggccaag 1680 atggctgcgg gggcggtgtc ttcgtctgcg gaaacgcctc cttggatacg tcatcgctga 1740 aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767 <210> 2 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF2 <400> 2 atgacgtatc caaggaggcg tttccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 caaatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180 acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240 cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360 actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420 tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480 tttaccccga aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540 aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600 gcattcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta agtga 705

Claims

수탁번호 KCTC 13839BP로 수탁되었고, PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d 및 PCV2e로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 PCV2 유전형에 대하여 교차 방어능을 갖는 것을 특징으로 하며, PCV2d의 유전자형에 속하는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 국내 분리주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 분리주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 전장게놈 DNA를 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 2형 국내 분리주.
제1항에 있어서, 상기 분리주는 돼지 써코바이러스 2형 국내 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 2형 국내 분리주.
삭제
삭제
돼지 써코바이러스 2형 백신후보물질을 돼지에 투여하는 단계;
상기 백신후보물질이 투여된 돼지에 제1항의 국내 분리주를 공격접종하는 단계; 및
상기 공격접종한 돼지의 증상을 조사하는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2 virus, PCV2) 바이러스 백신후보물질의 면역원성에 대한 정보를 제공하는 방법.