WO2023090556A1 - 신규 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

신규 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023090556A1
WO2023090556A1 PCT/KR2022/008361 KR2022008361W WO2023090556A1 WO 2023090556 A1 WO2023090556 A1 WO 2023090556A1 KR 2022008361 W KR2022008361 W KR 2022008361W WO 2023090556 A1 WO2023090556 A1 WO 2023090556A1
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WO
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porcine circovirus
circovirus type
pcv2b
group
protein
Prior art date
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PCT/KR2022/008361
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한태욱
김기주
최규성
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주식회사 이노백
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a novel recombinant porcine circovirus type 2 protein and a use thereof, and more particularly, to a novel recombinant porcine circovirus type 2 protein; And vaccine compositions, immunogenic compositions and feed compositions comprising the same; it relates to.
  • PCV2 Porcine circovirus type 2
  • PRDC Postweaning multisystemic wasting syndrome
  • PRDC Infectious diseases
  • PRDC reproductive disorders
  • enteritis etc.
  • PCVAD Porcine circovirus associated diseases
  • PCV2 is known to be infected mainly through direct contact through the oral or nasal cavities or through feces and urine.
  • PCV2 antigen was detected in semen and organs of stillborn fetuses, confirming that vertical transmission is possible.
  • the primary proliferation of the virus is presumed to occur in macrophages and dendritic cells of lymphoid tissue such as tonsils or lymph nodes, and the proliferated virus is transported to systemic lymph organs through lymph and blood. It spreads to the lymphocytes and causes lymphocyte depletion and peripheral blood lymphopenia.
  • PCV2 infected pigs causes immunosuppression due to depletion of lymphocytes in the systemic lymphoid organs, and facilitates infection with other viruses or secondary bacteria, causing various diseases such as PMWS and PCVAD.
  • PCV2 antigen was detected in the intestinal tissues of 83.3% of 24 animals diagnosed with mixed infection of PCV2 and salmonellosis.
  • PCV2 antigen was detected in the lesions along with granulomatous enteritis in the small and large intestines of six 40- to 60-day-old piglets with diarrhea.
  • enteritis associated with porcine circovirus type 2 was diagnosed only when lymphocyte depletion was observed in gut-associated lymphatic tissue (GALT) with enteritis lesions and no systemic lymphoid tissue lesions in pigs. ) was suggested.
  • GALT gut-associated lymphatic tissue
  • studies on EAPC are relatively lacking.
  • the present inventors completed the present invention by developing recombinant proteins against porcine circovirus types 2b and 2d and confirming their efficacy as vaccines.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding a recombinant porcine circovirus type 2 (PCV2) protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a composition comprising a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an infectious disease of porcine circovirus type 2, comprising administering a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to a pig. will be.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding a recombinant porcine circovirus type 2 protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating infectious diseases caused by porcine circovirus type 2, including a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides an immunogenic composition against porcine circovirus type 2 comprising a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or improving porcine circovirus type 2 infectious diseases, including a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a feed additive composition for preventing or improving porcine circovirus type 2 infectious diseases comprising a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a porcine circovirus type 2 infectious disease, comprising administering to a pig a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • porcine circovirus type 2 protein according to the present invention showed excellent antibody titers against both PCV2b and type 2d. This means that when the recombinant porcine circovirus type 2 protein of the present invention is used as a vaccine, porcine circovirus-related diseases can be effectively prevented by perfectly cross-protecting both genotypes PCV2b and PCV2d. Proteins can be used in a variety of ways in pig farming.
  • 1 is a diagram showing the results of Pierce BCA Protein Assay for quantification of vaccine antigen concentration.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of measuring the PCV2b-specific IgG antibody titer in guinea pigs.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the PCV2d-specific IgG antibody titer in guinea pigs.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of examining the amount of interferon gamma secretion in guinea pig PBMC.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of confirming the neutralizing antibody titer for PCV2b in guinea pigs.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of confirming the neutralizing antibody titer for PCV2d in guinea pigs.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring PCV2b-specific IgG antibody titers in pigs.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of measuring PCV2d-specific IgG antibody titers in pigs.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of measuring PCV2b-specific IgA antibody titers in pigs.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring PCV2d-specific IgA antibody titers in pigs.
  • 11 is a diagram showing the result of examining the amount of interferon-gamma secretion in porcine PBMC.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of confirming the neutralizing antibody titer against PCV2b in pigs.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of confirming the neutralizing antibody titer against PCV2d in pigs.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of measuring PCV2d viremia in pig blood.
  • 15 is a diagram showing the results of measuring PCV2d DNA load in porcine lungs and lymph nodes.
  • 16 is a diagram showing the results of measuring PCV2d DNA load in swine nasal and rectal swabs.
  • 17 is a diagram showing the results of visual observation of lesions in pig lungs and lymph nodes after challenge inoculation.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of quantifying lymphoid hyperplasia around the bronchi of pig lungs.
  • 19 is a view showing the results of confirming the number of lymphoid nodules around the bronchi in porcine lung tissue sections.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining for identifying lymphoid nodules around the bronchi in porcine lung tissue sections.
  • 21 is a view showing the results of confirming the results of inflammatory cell infiltration observed around blood vessels and bronchi in the lung parenchyma of pigs.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining for PCV2 in pig lungs (Ln, Lymphatic nodule; a, alveolus; b, bronchiole).
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of detecting PCV2 antigen in porcine lung samples through immunohistochemical staining.
  • 24 is a diagram showing the results of measuring the number of secondary lymph nodes in porcine lymph nodes.
  • 25 to 27 are views showing the results of PCV2 antigen detection in porcine lymph nodes through immunohistochemical staining.
  • 28 is a diagram showing the results of measuring the weight of piglets by week of age.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding a recombinant porcine circovirus type 2 protein represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleic acid.
  • porcine circovirus type 2 (PCV2) is a circular single-stranded DNA virus belonging to the Circovirus genus and has no hemagglutination ability, is inactivated in acidic conditions (pH 3) or chloroform, and is inactivated by high temperature (70 ° C., 15 min), the virus is stable.
  • the nucleic acids are preferably resynthesized genes of porcine circovirus types 2b and 2d, and more preferably, the genes of PCV types 2b and 2d are combined into one sequence using the Baculovirus Express system. It is preferably resynthesized as, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid preferably contains a sequence encoding a decoy epitope.
  • the decoy epitope is an immunodominant region composed of 169-180 residues (Cap(169-180)), which is exposed on the surface of the Cap protein monomer but is buried in viral particles or virus-like particles, thereby enabling humoral immunity It means the part that can avoid the .
  • the gene has a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: It means a sequence that exhibits substantially the same physiological activity as the nucleotide sequence represented by 1.
  • the "percentage of sequence homology" for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to (not including).
  • the recombinant porcine circovirus type 2 protein includes a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a functional equivalent of the protein.
  • the term "functional equivalent” means at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more sequence homology (i.e., identity) with the protein encoded by SEQ ID NO: 1 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids. For example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. It refers to a protein that has a sequence homology of %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, and exhibits substantially the same physiological activity as the protein encoded by SEQ ID NO: 1.
  • Sequence homology and identity herein are defined as the percentage of amino acid residues of the candidate sequence to the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 after aligning the candidate sequence with the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 and introducing gaps do. If necessary, conservative substitutions are not considered as part of sequence identity in order to obtain the maximum percent sequence identity. N-terminal, C-terminal or internal extensions, deletions or insertions of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 are not to be construed as affecting sequence identity or homology.
  • sequence identity can be determined by a general standard method used to compare similar parts of the amino acid sequences of two proteins.
  • a computer program such as BLAST or FASTA aligns the two proteins so that each amino acid is optimally matched (along the full length of one or both sequences or along a predicted portion of one or both sequences).
  • the program provides a default opening penalty and a default gap penalty and provides a scoring matrix such as PAM250 (Standard Scoring Matrix) that can be used in conjunction with a computer program.
  • percent identity can be calculated as: The total number of identical matches is multiplied by 100, then the length of the longer sequence within the matched span and the greater number of matches to align the two sequences. Divide by the sum of the number of gaps introduced into the long sequence.
  • substantially homogeneous physiological activity refers to an activity that induces immunity against PCV types 2b and 2d in an individual when applied to an individual.
  • the scope of the "functional equivalent” of the present invention includes derivatives in which some chemical structures of the peptides are modified while maintaining the basic skeleton of the peptide encoded by SEQ ID NO: 1 and the activity inducing immunity against PCV types 2b and 2d. .
  • structural modification to change the stability, storage stability, volatility or solubility of the peptide is included in this.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating a porcine circovirus type 2 infectious disease comprising a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the composition may be a vaccine composition or an immunogenic composition.
  • the porcine circovirus type 2 is preferably porcine circovirus type 2b or type 2d. Specifically, it was experimentally confirmed that the porcine circovirus type 2 protein of the present invention had significantly high antibody titers against both PCV type 2b and type 2d, which means that the protein of the present invention cross-protects both PCV2b and PCV2d genotypes. do.
  • the porcine circovirus type 2 infectious disease is porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), Glasser's disease, streptococcal meningitis, salmonellosis ( salmonellosis), postweaning colibacillosis, dietetic hepatosis, and suppurative bronchopneumonia.
  • PRRS porcine reproductive and respiratory syndrome
  • Glasser's disease streptococcal meningitis
  • salmonellosis salmonellosis
  • postweaning colibacillosis postweaning colibacillosis
  • dietetic hepatosis suppurative bronchopneumonia.
  • the composition is administered by intravenous administration, intramuscular administration, intranasal administration, intra-articular administration, intra-synovial administration, intrathecal administration, intrahepatic administration , Intralesional administration or intracranial administration is preferred, and intramuscular administration or intranasal administration may be more preferred.
  • the vaccine is a veterinary vaccine containing an antigenic material, which is specific for PCV2 and is administered for the purpose of inducing active or passive immunity.
  • an antigenic material which is specific for PCV2 and is administered for the purpose of inducing active or passive immunity.
  • the recombinant porcine circovirus type 2 protein of the present invention exhibits excellent antibody titers against PCV types 2b and 2d, and thus it can be usefully used to prevent diseases caused by PCV2.
  • the "immunologically effective amount" of PCV2 means an amount sufficient to exhibit a preventive effect of related diseases and an amount sufficient to not cause side effects or severe or excessive immune reactions, and the exact dosage concentration varies depending on the specific immunogen to be administered. It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well-known in the medical field, such as age, weight, health, sex, sensitivity to drugs of the subject, administration route, and administration method of the vaccination subject, and can be administered once or several times. can
  • the vaccine composition according to the present invention may include, in addition to the recombinant porcine circovirus type 2 protein as an active ingredient, one or more immune enhancing agents or excipients or carriers suitable for constituting the vaccine composition.
  • An adjuvant that may be included in the vaccine composition of the present invention refers to a substance that enhances the immune response of an injected animal, and many different adjuvants are known to those skilled in the art.
  • the immune enhancers include Freund's complete and incomplete immune enhancers, vitamin E, nonionic blocking polymers, muramyl dipeptide, Quil A, mineral oil and non-mineral oil and Carbopol, water-in-oil emulsion immune enhancers, etc., but are limited thereto it is not going to be
  • Carriers that may be included in the vaccine composition of the present invention are known to those skilled in the art, and include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like.
  • the above carriers may be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • non-aqueous carriers include propylene glycol, polyethylene glycol, edible oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous carriers include water, alcoholic/aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's or fixed oils.
  • Carriers for intravenous injection include electrolyte replenishers, liquid and nutritional supplements, and the like, such as those based on Ringer's dextrose.
  • the vaccine composition of the present invention may further contain preservatives and other additives such as, for example, antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases, and the like.
  • the preservatives include formalin, thimerosal, neomycin, polymyxin B and amphotericin B, and the like.
  • the vaccine composition of the present invention may include one or more suitable emulsifiers, such as Span or Tween.
  • the vaccine composition of the present invention may include a protecting agent, and a protecting agent known in the art may be used without limitation, which may include lactose (LPGG) or trehalose (TPGG), It is not limited thereto.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or ameliorating porcine circovirus type 2 infectious diseases, including a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the composition may be a feed composition or feed additive composition.
  • the feed refers to any natural or artificial structured food, one meal, etc., or a component of the one meal meal eaten by animals, and the feed containing the recombinant porcine circovirus type 2 protein according to the present invention as an active ingredient It can be prepared with various types of feed known in the art, preferably, concentrated feed, roughage and / or special feed may be included, but is not limited thereto.
  • the feed additive is aimed at various effects such as alleviation of disease symptoms in animals, nutrient supplementation and weight loss prevention, improvement of digestibility of fiber in feed, oil quality improvement, reproduction disorder prevention and conception rate improvement, and summer high temperature stress prevention.
  • the feed composition and feed additive composition of the present invention correspond to supplementary feed under the Feed Control Act, and include mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals, and trace minerals such as zinc, copper, cobalt, and selenium.
  • Mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals, and trace minerals such as zinc, copper, cobalt, and selenium.
  • Mineral preparations such as kerotene, vitamins A, D, E, nicotinic acid, and vitamin B complex
  • protective amino acids such as methionine and lysine
  • protective fatty acids such as calcium salts of fatty acids
  • probiotics lactic acid bacteria
  • yeast cultures lactic acid bacteria
  • molds Live bacteria such as fermentation products, yeast agents, and the like may be further included.
  • the enriched feed includes seed fruits including grains such as wheat, oats and corn, bran including rice bran, bran, barley bran, etc. as a by-product obtained by refining grains, soybeans, fluids, sesame seeds, linseed, coco Fish meal, which is a by-product obtained from oil extraction of palms, residual starch, which is the main component of starch residue, which is the remainder after removing starch from sweet potatoes, potatoes, etc., fish meal, fish residue, and fresh liquid obtained from fish Fish soluble, meat meal, blood meal, feather meal, skim milk powder, animal feed such as dry whey, yeast, chlorella, seaweed but not limited thereto.
  • seed fruits including grains such as wheat, oats and corn, bran including rice bran, bran, barley bran, etc.
  • bran including rice bran, bran, barley bran, etc.
  • by-product obtained by refining grains soybeans, fluids, sesame seeds, linseed, coco Fish meal
  • Forage among the feed includes grass feed such as wild grass, grass, green cutting, turnip for feed, beet for feed, root vegetables such as Lutherbearer, a type of turnip, raw grass, green crops, grains, etc. are filled in a silo and fermented with lactic acid It includes, but is not limited to, silage, which is a stored feed, grass, hay made by cutting down grass, straw of breeding crops, and leaves of leguminous plants.
  • Special feeds include mineral feeds such as oyster shells and rock salt, urea feeds such as urea or its derivative, diureide isobutane, and supplements for ingredients that are likely to be insufficient when only natural feed ingredients are mixed, or formulated feeds to improve the storability of feeds.
  • feed additives and dietary supplements which are substances added in small amounts, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a step of administering to a pig a recombinant porcine circovirus type 2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; prevention or treatment of an infectious disease caused by porcine circovirus type 2 provides a way
  • the recombinant porcine circovirus type 2 protein is administered intravenously, intramuscularly, intranasally, intra-articularly, intra-synovially, or intrathecally.
  • Intrahepatic administration, intralesional administration or intracranial administration is preferred, more preferably intramuscular or intranasal administration, but is not limited thereto.
  • porcine circovirus type 2 infectious disease of the present invention it is preferable to increase the immune response in vivo by administering the recombinant porcine circovirus type 2 protein, and more specifically, antibodies, immune response-related factors It is desirable to regulate the expression of
  • Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not otherwise defined herein have meanings commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
  • PCV2b&d-ConCP Recombinant Porcine circovirus 2b, 2d Consensus Capsid Protein
  • PCV2b&d-ConCP Baculovirus Express system among the antigens of the InnoCirco vaccine (hereinafter referred to as InnoCirco) developed by Innovac Co., Ltd.
  • the prepared PCV2b&d-ConCP is a resynthesis of PCV type 2b and type 2d genes into one sequence, and the PCV2b&d-ConCP is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • guinea pigs 300-350g guinea pigs were used as test subjects, and the inoculated antigen concentrations of the test groups and vaccines used in this test were designed as shown in Table 1.
  • Guinea pig inoculation amount (half of pigs) and inoculation route (femoral intramuscular inoculation) were established by referring to the national shipping test standard. The test schedule was performed as shown in Table 2.
  • the BSA concentration for each standard is shown in Table 3.
  • the concentration of the purified antigen was quantified through BCA Protein assay, and then diluted in Phosphate Buffered Saline (PBS) to a concentration of 5 ⁇ g/mL/dose (1/2 dose of pig).
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • MONTANIDETM IMS1313 (Seppic, IMS1313 VG N) was used as an excipient, and was mixed with antigen diluted in PBS at a ratio of 50:50 (v/v).
  • Intramuscular inoculation was carried out by dividing 1 mL of vaccine with the final antigen amount of 5 ⁇ g (half dose of pig inoculation amount) into 0.5 mL each on both sides of the guinea pig thigh.
  • a 6-week-old female guinea pig weighing 300-350 g (Dooyeol Biotech, Korea) was used.
  • the guinea pigs that had undergone the acclimatization period were set to week 0, and each test group was inoculated with a total of 1 mL by dividing 0.5 mL of the vaccine into both femoral muscles.
  • a control group (G6) was inoculated with PBS under the same conditions. Blood was collected from the jugular vein of all groups on days 14 (14 DPV), 28 (28 DPV), and 42 (42 DPV) after inoculation, and serum was separated and stored at -70°C.
  • the purified PCV2b and PCV2d antigens were diluted in 0.05M Sodium bicarbonate buffer (pH 9.4), dispensed at 100 ⁇ L/well (100 ng) each on a MaxiSorp 96-well plate, and coated at 4°C for 16-24 hours.
  • the coating solution was removed and washed three times with 0.05% Phosphate Buffered Saline Tween (hereinafter referred to as PBS-T, 0.05% Tween-20 in PBS) at 300 ⁇ L/well.
  • PBS-T Phosphate Buffered Saline Tween
  • the blocking solution was removed and washed three times with 0.05% PBS-T at 300 ⁇ L/well.
  • a primary antibody a guinea pig serum sample was diluted 1:1,000 in 0.1% BSA and reacted at 37°C for 2 hours. The primary antibody was removed and washed three times with 0.05% PBS-T at 300 ⁇ L/well.
  • HRP-conjugated goat anti-Guinea pig IgG polyclonal antibody (Abcam, Cat No. ab7139) was diluted 1:10,000 and added at 100 ⁇ L/well, followed by reaction at 37°C for 1 hour. The secondary antibody was removed and washed three times with 0.05% PBS-T at 300 ⁇ L/well.
  • TMBW-1000-01, Lot No.TMBWW18 TetraMethyl-Benzidine
  • Test sera were assimilated at 56°C for 30 minutes.
  • the same amount of PCV2b or PCV2d 400 TCID 50 /mL was diluted 2-fold using a 96-well plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • PCV-1 free Porcine kidney (PK-15) cells were dispensed at 2 x 10 4 cells/100 ⁇ L/well, cultured in an incubator for 3 days, and IFA (Immunofluorescence assay) was performed as follows. The culture medium was removed, washed once with PBS, and then the plate was dried at 37° C. for about 10 minutes. 80% cold acetone was dispensed by 100 ⁇ L/well on the dried plate and then fixed at 4° C. for 1 hour.
  • Ficoll GE Healthcare, Cat No. 17-1440-02, Lot No. 1298684
  • dispensed by 4 mL each into another conical tube was mixed with the blood-PBS mixture. transferred to the tube. It was centrifuged at 840 xg for 30 minutes at room temperature. After recovering PBMC between Ficoll and serum, PBS was added and centrifuged at 210 xg for 10 minutes. After removing the supernatant, 3 mL of PBS was added to the cell pellet to suspend and centrifuged at 210 xg for 10 minutes.
  • Interferon-gamma secretion was measured using the Guinea pig Interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) ELISA Kit (Cusabio, Cat No. CSB-E06763Gu, Lot No. A13221097) according to the manufacturer's protocol. 100 ⁇ L/well of standard and each serum sample were added to the enclosed plate, and after incubation at 37°C for 2 hours, the solution was removed from each well. After dispensing 100 ⁇ L/well of Biotin-antibody (1x), it was incubated at 37°C for 1 hour. After washing 3 times with 1X Wash Buffer at 300 ⁇ L/well, HRP-avidin (1x) was added at 100 ⁇ L/well, followed by incubation at 37°C for 1 hour.
  • IFN- ⁇ Guinea pig Interferon- ⁇
  • ELISA Kit 100 ⁇ L/well of standard and each serum sample were added to the enclosed plate, and after incubation at 37°C for 2 hours, the solution was removed from each well. After dispensing 100
  • the TMB substrate was dispensed at 90 ⁇ L/well and incubated at 37°C for 15 to 30 minutes while blocking light. After adding 50 ⁇ L/well of Stop solution, the absorbance (OD) value was measured at 450 nm using an EpochTM Microplate Spectrophotometer (BioTek, USA).
  • 7-week-old pigs were used as test subjects, and the inoculation antigen concentrations of the test groups and vaccines used in this test were designed as shown in Table 4.
  • the pig inoculation amount (1 head) and inoculation route (muscular inoculation) were established by referring to the national test standard for shipment testing.
  • the additional challenge inoculation test was conducted at 13 weeks of age, and the challenge dose of the challenge inoculation strain used in the test group and this test is shown in Table 5.
  • the test schedule was performed as shown in Table 6.
  • Weeks Days post Vaccination Days post Challenge Performance contents 3 weeks old - - Weighing and blood sampling 4 weeks old - - Weighing and blood sampling 5 weeks old - - Weighing and blood sampling 6 weeks old - - Weighing and blood sampling 7 weeks old 0 - Weighing and blood sampling Vaccination (DPV, Days post Vaccination) 8 weeks old 7 - weighing 9 weeks old 14 - Weighing and blood sampling 10 weeks old 21 - weighing 11 weeks old 28 - Weighing and blood sampling 12 weeks old 35 - weighing 13 weeks old 42 0 Weighing and Blood Collection (PBMC) Days post Challenge (DPC) 14 weeks old 49 7 Weighing and blood sampling 15 weeks old 56 14 Weighing and blood sampling 16 weeks old 63 21 Weighing and blood sampling Autopsy after death (Lung, Lymphnodes)
  • the concentration of the purified antigen was quantified through BCA Protein assay, and then diluted in Phosphate Buffered Saline (PBS) to a concentration of 10 ⁇ g/2mL/dose (1 dose for pigs).
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • MONTANIDETM IMS1313 (Seppic, IMS1313 VG N) was used as an excipient, and was mixed with antigen diluted in PBS at a ratio of 50:50 (v/v).
  • 2 mL of the final 10 ⁇ g (pig 1 dose) antigen dose vaccine was inoculated intramuscularly into the upper ear (lateral cervical muscle) of 7-week-old pigs.
  • the CircoFlex vaccination group was inoculated intramuscularly by 1 mL according to the usage and dose.
  • PK-15 cells were tested in T-75cm 2 Flask (SPL , CatNo.70075, LotNo.BBCE11A70075) was prepared by culturing.
  • PCV2 isolate HID9071
  • DMEM fetal calf serum
  • DMEM fetal calf serum
  • Glucosamine was removed, washed three times with PBS, and then 20 mL of DMEM containing 1% Antibiotic-Antimycotic was added, followed by incubation at 37°C and 5% CO 2 for 3 days. After harvesting by repeating freezing and thawing three times, the titer was measured by IFA, and the titer was confirmed as TCID 50 /mL as a result of the measurement.
  • the challenge inoculation was administered at a concentration of PCV2 10 5.5 TCID 50 /mL at 13 weeks of age (42DPV) by dividing 1 mL into both nasal cavities of pigs in the PCV2b&d-ConCP group (G4), CircoFlex group (G5), and challenge control group (G6), a total of 2 mL was inoculated.
  • Two individuals (G6-1, G6-2) of the challenge control group (G6) were challenged intratracheally.
  • the purified PCV2b and PCV2d antigens were diluted in 0.05M Sodium bicarbonate buffer (pH 9.4), dispensed at 100 ⁇ L/well (100 ng) each on a MaxiSorp 96-well plate, and coated at 4°C for 16-24 hours.
  • the coating solution was removed and washed three times with 0.05% PBS-T at 300 ⁇ L/well.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • pig serum samples were diluted 1:2,000 and reacted at 37°C for 2 hours.
  • the primary antibody was removed and washed 3 times with 0.05% PBS-T and 300 ⁇ L/well each with PBS-T.
  • Secondary antibodies include Goat anti-Pig IgG FC-Fragment HRP Conjugated (Bethyl, Cat No. A100-104P) or Goat pAb to Pig IgA (HRP) (abcam, Cat No. ab112746, Lot No. GR272913-10) was added at 100 ⁇ L/well and reacted at 37°C for 1 hour. The secondary antibody was removed and washed 3 times with 0.05% PBS-T and 300 ⁇ L/well each with PBS-T.
  • TMBW-1000-01, Lot No.TMBWW18 TetraMethyl-Benzidine
  • 2N H 2 SO 4 was added to 100 ⁇ L. / well to stop the reaction.
  • Absorbance (OD) values were measured at a wavelength of 450 nm using an EpochTM Microplate Spectrophotometer (BioTek, USA).
  • PCV-1 free Porcine kidney (PK-15) cells were dispensed at 2 x 10 4 cells/100 ⁇ L/well, cultured in an incubator for 3 days, and IFA (Immunofluorescence assay) was performed as follows. After removing the culture medium, it was washed once with PBS, then the PBS was completely removed and the plate was dried well.
  • Ficoll GE Healthcare, Cat No. 17-1440-02, Lot No. 1298684
  • dispensed by 4 mL each into another conical tube was mixed with the blood-PBS mixture. transferred to the tube. It was centrifuged at 840 xg for 30 minutes at room temperature. After recovering PBMC between Ficoll and serum, PBS was added and centrifuged at 210 xg for 10 minutes. After removing the supernatant, 3 mL of PBS was added to the cell pellet to suspend and centrifuged at 210 xg for 10 minutes.
  • Interferon-gamma secretion was measured using the IFN- ⁇ Porcine ELISA Kit (Invitrogen, Cat No. KSC4021, Lot No. 224978-007) according to the manufacturer's protocol.
  • 50 ⁇ L/well of Standard Diluent buffer was added to the remaining wells except for the standard, and 50 ⁇ L of PBMC cell culture medium was added.
  • 50 ⁇ L of SW IFN- ⁇ Biotin Conjugate solution was added to all wells except chromogen blank wells, covered with a plate cover, and reacted at 37 ° C for 2 hours. 300 ⁇ L/well was washed 4 times with 1X Wash Buffer.
  • 1X Streptavidin-HRP solution was added to all wells except for the chromogen blank wells at 100 ⁇ L/well, and then covered with a plate cover and reacted at 37° C. for 30 minutes. 300 ⁇ L/well was washed 4 times with 1X Wash Buffer. After adding 100 ⁇ L/well of Stabilized Chromogen and reacting in the dark at room temperature for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L/well of Stop solution. The absorbance value (OD) was measured at a wavelength of 450 nm using an EpochTM Microplate Spectrophotometer (BioTek, USA).
  • Viral DNA in serum was isolated using the Ribospin TM vRDplus Kit (GeneAll, CatNo.312-150, LotNo.31221a08001) according to the manufacturer's protocol, and RT with SYBR GreenI (Enzynomics, Cat No. RT501M, Lot No. KE) -qPCR was performed to confirm the number of PCV2 DNA copies.
  • Viral DNA was isolated using the Ribospin TM vRDplus Kit (GeneAll, Cat No.312-150, Lot No.31221a08001) according to the manufacturer's protocol, and RT-qPCR using SYBR Green I (Enzynomics, Cat No. RT501M, Lot No. KE) was performed to confirm the number of PCV2 DNA copies.
  • BALT bronchus-associated lymphatic tissue
  • monocyte inflammatory cell
  • bronchioles bronchioles
  • diffuse alveolar wall damage Interstitial pneumonia with hypertrophy was included.
  • BALT it is classified as normal level (often, 0), slight increase (quite often, 1), frequent increase (frequent, 2), and very frequent (3) according to the observed frequency, and is semi-quantitatively graded.
  • the number of lymph nodes with distinct nodule shapes was measured in two tissue sections per subject and the results were compared between groups.
  • grading was classified into normal range (0), mild (1), moderate (2), and severe (3).
  • lymph nodes if there is a lesion, the contents are recorded and the degree is classified into normal range (0), mild (1), moderate (2) and severe (3) in a semi-quantitative way and graded.
  • the number of secondary lymph nodes was counted at 400x magnification and the results were compared between groups. Tissue sections were prepared from two different sites from lung and lymphoid tissues, and were paraffin-embedded through general tissue processing procedures.
  • the Antigen Unmasking Solution was allowed to cool down sufficiently, it was washed with running tap water, further washed with distilled water, and then treated with a solution containing methanol and 0.3% hydrogen peroxide for 30 minutes to inactivate endogenous peroxidase. After washing several times with PBS, the tissue was incubated for 30 minutes at room temperature with diluted normal horse blocking serum. After shaking off the normal blocking serum, primary antibody Rabbit polyclonal anti-porcine PCV2 antibody (Invitrogen, Cat No. PA5-34969) diluted 1:500 was dispensed and incubated overnight at 4 ° C. For negative control, PBS was applied instead of the primary antibody.
  • biotin-attached secondary antibody was dispensed and reacted at room temperature for 40 minutes. After washing with PBS, it was reacted with VECTASASTAIN ® Elite ® ABC reagent at room temperature for 30 minutes, and then colored with peroxidase substrate (DAB) for about 1 minute. After performing counter staining on hematoxylin, it was sealed with a cover glass after dehydration and purification, and the positive status was confirmed with an optical microscope.
  • the body weight was measured individually by putting pigs in all groups into a cage installed on a scale. Average weight gain (ADWG) per day was analyzed using the measured body weight.
  • ADWG Average weight gain
  • the PCV2b&d ConCP quantitative value was a total of 1,080 ⁇ g based on 60 mL of ConCP antigen purified to 18 ⁇ g / mL, and the Bac-wt quantitative value was 10 wt antigen purified to 116 ⁇ g / mL A total of 1,160 ⁇ g of antigen was prepared on a mL basis. Thereafter, inoculation was performed by diluting according to the vaccine antigen concentration in the guinea pig and pig tests.
  • PCV2b&d-ConCP vaccine in guinea pigs, serum was separated after vaccination by group, and PCV2b or PCV2d antigen-specific IgG antibody titers were confirmed by indirect ELISA.
  • the PCV2b-specific IgG antibody titer test results are shown in FIG. 2 and Table 9, and the PCV2d-specific IgG antibody titer is shown in FIG. 3 and Table 10.
  • the control group (G6) vaccinated with PBS showed low IgG antibody titers in all test sections, but the PCV2b&d-ConCP group (G4) vaccinated with the development vaccine produced PCV2b or PCV2d antigen-specific IgG antibodies from 14 DPV. It was confirmed that it induces When compared with the control group, a significant difference was shown. In addition, a relatively low level of IgG antibody production was induced in the Bac-wt inoculated group (G5), but showed a significant difference compared to the control group.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • control group (G6) inoculated with PBS and the Bac-wt inoculated group (G5) showed similar levels of interferon-gamma secretion.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) vaccinated with the development vaccine showed the highest secretion amount with an average value of 66 pg/mL for PCV2b antigen sensitization and 56.25 pg/mL for PCV2d antigen sensitization.
  • Neutralizing antibodies against PCV2b and PCV2d of the PCV2b&d-ConCP vaccine were tested in guinea pigs. The results of confirming neutralizing antibodies against PCV2b are shown in FIG. 5 and Table 11, and the results of confirming neutralizing antibodies against PCV2d are shown in FIG. 6 and Table 12.
  • the control group (G6) and the Bac-wt inoculation group (G5) inoculated with PBS up to 28 DPV after vaccination showed low neutralizing antibody titers of 16 times or less on average in all test sections.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) vaccinated with the development vaccine induced the production of neutralizing antibodies more than 32 times from 42 DPV.
  • the greatest difference was shown at 42 DPV for PCV2b, and a significantly significant difference was confirmed by inducing an average 7.2-fold higher level of neutralizing antibody titer.
  • the control group (G6) and the Bac-wt inoculation group (G5) inoculated with PBS up to 28 DPV after vaccination showed low neutralizing antibody titers of 16 times or less on average in all test sections, but development It was confirmed that the vaccinated PCV2b&d-ConCP group (G4) induced more than 32-fold neutralizing antibody production from 28 DPV.
  • the greatest difference was shown at 42 DPV for PCV2d, and a significantly significant difference was confirmed by inducing an average of 19.2 times higher level of neutralizing antibody titer.
  • the IgA antibody titer of all groups showed a significantly lower antibody titer compared to IgG, but the challenge control group (G6) showed a relatively high level of IgA antibody titer at 63 DPV. induced, and showed a significant difference when compared to the non-challenge control group (G7).
  • the challenge control group G6
  • the non-challenge control group G7
  • IgA was produced during the protective immunity formation process because PCV2d was not neutralized because vaccination was not performed after challenge.
  • PBMC peripheral blood cells
  • interferon-gamma secretion was measured using an Invitrogen IFN- ⁇ Porcine ELISA Kit. The results of measuring the amount of interferon gamma secretion are shown in FIG. 11 .
  • the challenge control group (G6) and non-challenge control group (G7) inoculated with PBS and the CircoFlex group (G5) inoculated with commercial vaccines had a relatively low level of interferon with an average of 50 pg/mL or less.
  • the amount of gamma secretion was shown.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) vaccinated with the development vaccine showed the highest secretion amount with an average value of 126.53 pg/mL for PCV2b antigen sensitization and 82.45 pg/mL for PCV2d antigen sensitization.
  • significantly significant differences were shown in the results of PCV2b sensitization compared to the non-challenge control group (G7).
  • Neutralizing antibody titers against PCV2b and PCV2d of the PCV2b&d-ConCP vaccine were measured in pigs.
  • the measurement results of neutralizing antibodies against PCV2b are shown in FIG. 12 and Table 17, and the results of measurement of neutralizing antibodies against PCV2d are shown in FIG. 13 and Table 18.
  • the neutralizing antibody titer for PCV2b was low on average of 16 or less in the challenge control group (G6) and non-challenge control group (G7) inoculated with PBS up to 28 DPV after vaccination.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) induces neutralizing antibody production from 28 DPV.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) induced a neutralizing antibody titer of 51.2 higher than the CircoFlex group (179.2), with an average of 230.4 against PCV2b based on 56 DPV, and a significantly significant difference when compared to the control group.
  • the neutralizing antibody titer for PCV2d was low on average of 16 or less in the challenge control group (G6) and non-challenge control group (G7) inoculated with PBS up to 28 DPV after vaccination.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) induces the production of neutralizing antibodies from 14 DPV.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) induced a neutralizing antibody titer of 51.2 higher than the CircoFlex group (307.2), with an average of 358.4 for PCV2d based on 63 DPV, and a significantly significant difference when compared to the control group. showed up
  • the neutralizing antibody titer against PCV2d was relatively higher than that of PCV2b.
  • PCV2d viremia was analyzed in pig blood by challenge, and the results are shown in FIG. 14 .
  • PCV2b & d-ConCP group (G4) was not confirmed PCV2d viremia after inoculation until the end of the test, but the challenge control group (G6) inoculated with PBS and the CircoFlex group (G5) inoculated with commercial vaccine were challenged It was confirmed that viremia increased from day 7 (56 DPV).
  • the challenge control group (G6) showed the highest level with an average of 1.21 x 10 6 copies / mL based on 56 DPV, and showed a significant difference when compared to the non-challenge control group (G7).
  • PCV2b&d-ConCP group (G4) PCV2d viremia was not confirmed even after challenge inoculation in the same way as in the non-challenge control group (G7).
  • test groups were euthanized at 63 DPV, and lung and lymphoid tissues were collected from each subject. Then, viral DNA was extracted from each tissue sample and the amount of PCV2d DNA was measured through real time-qPCR. PCV2 DNA load was measured in lungs and lymph nodes, and the results are shown in FIG. 15 .
  • the challenge control group (G6) inoculated with PBS had an average of 2.37 x 10 9 copies/mL in the lung and an average of 1.78 x 10 9 copies/mL in the lymph node, significantly higher levels compared to other test groups.
  • PCV2d DNA copy number was confirmed.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) showed an average of 1.98 x 10 5 copies/mL or less, similar to that of the non-challenge control group (G7).
  • CircoFlex group (G5) inoculated with a commercial vaccine in the lymph node showed more effective protection against PCV2d challenge than the CircoFlex group (G5), and showed a significant difference compared to the PCV2b&d-ConCP group (G4).
  • Viral DNA was extracted from nasal and rectal samples and the amount of PCV2d DNA was measured through real time-qPCR, and the results are shown in FIG. 16 .
  • the challenge control group (G6) inoculated with PBS had a very high PCV2d DNA copy number with an average of 1.22 x 10 8 copies/mL in nasal samples and an average of 2.03 x 10 6 copies/mL in rectal samples.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) vaccinated with the developed vaccine showed an average of 4.32 x 10 4 copies/mL, similar to the CircoFlex group (G5) vaccinated with the commercial vaccine, and compared to the challenge control group (G6), significant showed a difference.
  • rectal swab samples showed a relatively low level and no significant difference between groups.
  • the findings observed in pig lungs included hyperplasia of lymph nodes around the bronchi, mononuclear inflammatory cell infiltrates mainly observed around the bronchi and blood vessels, and interstitial pneumonia.
  • BALT lymph nodes
  • Proliferation of lymph nodes (BALT) around the bronchi may increase in number and size if the proliferation of lymphocytes is promoted by an infectious agent, and may decrease in number and size if an infectious agent induces lymphoid depletion. Therefore, in order to compare the effect on BALT in this test, a semi-quantitative analysis based on the frequency of lymph nodes around the bronchi and the number of BALT were counted, and the results were compared, respectively, and the results are shown in FIG. 18 and Table 20.
  • the number of lymphoid nodules around the bronchi was counted in two tissue slices for each individual, and as a result, as shown in FIGS. 19 and 20, the number of lymphoid nodules increased in the challenge control group (G6) compared to the non-challenge control group (G7), but significant There was no difference.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) and the CircoFlex group (G5) showed a significant difference by increasing the number of lymphoid nodules.
  • PCV2b&d-ConCP vaccine or CircoFlex vaccine could promote lymphoid nodules proliferation to some extent. Therefore, as the number of lymphoid nodules increases, more antigen stimuli are received, which induces the activation of B cells, which can increase the immune response in tissues.
  • lung tissue was immunostained for PCV2, and the results are shown in Table 21, FIGS. 22 and 23.
  • FIGS. 22 and 23 only the challenge control group (G6) showed PCV2 positive reaction, and PCV2 positive reaction was confirmed in 3 out of 4 tested subjects.
  • PCV2-positive reactions were observed mainly in inflammatory cells (histocytes or lymphocytes) infiltrated around bronchi and blood vessels, and scattered in the center of lymph nodes and interstitial pneumonia.
  • inflammatory cells histocytes or lymphocytes
  • G7 non-challenge control group
  • PCV2b&d-ConCP group (G4) PCV2b&d-ConCP group
  • CircoFlex group CircoFlex group
  • the number of secondary lymph nodes formed per unit field of view tended to increase in the Challenge control group (G6), and also increased in the PCV2b & d-ConCP group (G4) and CircoFlex group (G5).
  • a trend was confirmed. Secondary lymph nodes in lymph nodes are B cell regions, so an increase in secondary lymph nodes suggests that B cells are activated.
  • higher antibody titers were induced in the vaccinated PCV2b&d-ConCP group (G4) and CircoFlex group (G5) than in the non-vaccinated group.
  • PCV2 antigen expression in the lymph nodes was confirmed in all individuals in the Challenge control group (G6).
  • the positive reaction for PCV2 was strong mainly in the germinal center of the secondary lymph nodes.
  • some positive cells were observed in a diffuse form in the lymphoid tissue and medulla.
  • local positive reactions in the diffuse lymphoid tissue and medulla in some individuals did not show a significant difference from the non-challenge control group (G7), so it was judged to be insignificant.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) which did not show weight loss, increased by an average of 3.0 kg, and the non-challenge control group (G7) by an average of 5.9 kg.
  • the mean weight at the end of the test was 35.2 kg in the PCV2b&d-ConCP group (G4), 32.44 kg in the CircoFlex group (G5), 30.25 kg in the challenge control group (G6), and 34.33 kg in the non-challenge control group (G7).
  • the difference in body weight between groups was confirmed in kg.
  • the daily weight gain after vaccination (0-6DPV) was an average of 382.4g in the PCV2b&d-ConCP group (G4), which was lower than that of the CircoFlex group (G5), 457.6g.
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) showed a significantly higher level of daily weight gain than the CircoFlex group (G5) by an average of 247.7g (P ⁇ 0.05).
  • the PCV2b&d-ConCP group (G4) showed a higher level of 430.5g than the CircoFlex group (G5) of 398.1g.
  • the challenge control group (G6) showed the lowest with 366.3g
  • the non-challenge control group (G7) showed the highest level of daily gain with 465.6g.
  • PCV2b&d-ConCP a vaccine against porcine circovirus types 2b and 2d, and confirmed that it effectively induced excellent IgG antibody titers and neutralizing antibody titers against both PCV2b and 2d in pigs.
  • the PCV2b&d-ConCP vaccine of the present invention is capable of cross-protecting both PCV2b and PCV2d genotypes.
  • significantly higher levels of IgG antibody titer and neutralizing antibody than the control group were maintained even after PCV2d challenge, and IFN-gamma was increased in response to PCV2 sensitization in PBMC, viremia was not detected, lung and lymph node tissue, and nasal and rectal specimens.
  • PCV2b&d-ConCP vaccine of the present invention can be used in various ways in the swine farming field.

Abstract

본 발명은 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질; 및 이를 포함하는 백신 조성물, 면역원성 조성물 및 사료 조성물;에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 PCV2b 및 2d형 모두에 대해 우수한 항체가를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 백신으로 이용할 경우 PCV2b와 PCV2d 두 유전형을 교차 방어함으로써 돼지 써코바이러스 관련 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 양돈 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신규 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도
본 발명은 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질; 및 이를 포함하는 백신 조성물, 면역원성 조성물 및 사료 조성물;에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2)는 Circoviridae과, Circovirus 속에 속하는 환상의 단일가닥 DNA 바이러스로서 혈구 응집능이 없으며, 산성조건(pH 3)이나 클로로포름에 비활성화 되고 고온(70℃, 15분)에서도 안정한 바이러스이다. PCV2는 전 세계적으로 양돈 산업에 많은 피해를 주고 있는 이유후 전신 소모성 증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 주요 원인체이며, 이외에도 돼지 피부염 및 신증 증후군(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS), 돼지 호흡기 복합 감염증(Porcine respiratory disease complex, PRDC), 번식장애, 장염 등 다양한 병변들을 유발하는데 최근에는 이러한 질병들을 포괄적으로 돼지 써코바이러스 관련 질병(Porcine circovirus associated diseases, PCVAD)이라고 명명하고 있다.
PCV2는 주로 구강 또는 비강을 통한 직접 접촉이나 분변 및 오줌을 통해서 감염되는 것으로 알려져 있다. 또한 정액과 유, 사산 태아의 장기에서도 PCV2 항원이 검출되어 수직 전파가 가능한 것으로 확인되었다. PCV2가 돼지에 감염된 후 바이러스의 1차 증식은 편도 또는 림프절과 같은 림프조직의 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)에서 이루어지는 것으로 추정되며, 증식한 바이러스는 림프와 혈액을 통해 전신 림프장기로 확산되어 림프구 고갈과 말초 혈액의 림프구 감소증을 유발한다. 그러므로 돼지에 감염된 PCV2는 전신 림프장기의 림프구 고갈에 따른 면역억제를 유발하여 다른 바이러스나 이차적인 세균의 감염을 용이하게 하여 PMWS, PCVAD 등의 여러 질병을 발생시키는 것으로 해석된다. 국내에서는 PCV2와 살모넬라증의 혼합감염으로 진단된 24마리 중 83.3%의 장 조직에서 PCV2 항원이 검출되었다는 보고가 있었다. 또한 설사증상을 나타낸 40-60일령 자돈 6마리의 소장과 대장에서 육아종성 장염과 함께 병변 내에서 PCV2 항원을 검출한 바 있다. 또한 돼지에서 전신 림프조직의 병변이 없는 상태이고 장염 병변과 함께 장 관련 림프조직(Gut-associated lymphatic tissue, GALT)에서 림프구 고갈을 보이는 경우에 한하여 PCV2 관련 장염(Enteritis associated with porcine circovirus type 2, EAPC)이라 명명할 것을 제안하였다. 그러나 아직까지 PCVAD에 포함되는 다른 질병에 비하여 EAPC에 대한 연구가 상대적으로 부족한 실정이다.
이에 본 발명자들은 돼지 써코바이러스 2b형 및 2d형에 대한 재조합 단백질을 개발하고, 이의 백신으로써의 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형(PCV2; Porcine circovirus type 2) 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형에 대한 면역원성 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 PCV2b 및 2d형 모두에 대해 우수한 항체가를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 백신으로 이용할 경우 PCV2b와 PCV2d 두 유전형을 완벽하게 교차 방어함으로써 돼지 써코바이러스 관련 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 양돈 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 백신 항원 농도 정량을 위한 Pierce BCA Protein Assay 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 기니픽에서 PCV2b-specific IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 기니픽에서 PCV2d-specific IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 기니픽 PBMC에서 인터페론감마 분비량을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 기니픽에서 PCV2b에 대한 중화항체가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 기니픽에서 PCV2d에 대한 중화항체가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 돼지에서 PCV2b-specific IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 돼지에서 PCV2d-specific IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 돼지에서 PCV2b-specific IgA 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 돼지에서 PCV2d-specific IgA 항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 돼지 PBMC에서 인터페론감마 분비량을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 돼지에서 PCV2b에 대한 중화항체가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 돼지에서 PCV2d에 대한 중화항체가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 돼지 혈액에서 PCV2d viremia를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 돼지 폐 및 림프절에서 PCV2d DNA load를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 돼지 Nasal 및 Rectal swab에서 PCV2d DNA load를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 공격접종 후 돼지 폐 및 림프절의 병변을 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 돼지 폐의 기관지 주위의 lymphoid hyperplasia를 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 돼지 폐 조직 절편에서 기관지 주변의 lymphoid nodule 수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 돼지 폐 조직 절편에서 기관지 주변의 lymphoid nodule을 확인하기 위한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 돼지 폐장 실질 내 혈관 및 기관지 주변에서 관찰되는 염증세포 침윤 결과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 돼지 폐의 PCV2에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 도이다(Ln, Lymphatic nodule; a, alveolus; b, bronchiole).
도 23은 면역조직화학 염색을 통해 돼지 폐 시료에서 PCV2 항원을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 돼지 림프절에서 이차림프소절의 수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 25 내지 27은 면역조직화학 염색을 통해 돼지 림프절에서 PCV2 항원을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 자돈의 주령별 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 코딩하는 핵산; 및 상기 핵산으로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2)은 Circovirus 속에 속하는 환상의 단일가닥 DNA 바이러스로서 혈구 응집능이 없으며, 산성조건(pH 3)이나 클로로포름에 비활성화 되고 고온(70℃, 15분)에서도 안정한 바이러스이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 핵산은 돼지 써코바이러스 2b형 및 2d형의 유전자가 재합성된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 Baculovirus Express system을 이용하여 PCV 2b형 및 2d형의 유전자가 하나의 서열로 재합성된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 핵산은 디코이 에피토프(decoy epitope)를 암호화하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 디코이 에피토프는 169-180 잔기(Cap(169-180))로 구성된 면역우세 (immunodominant) 영역으로, Cap 단백질 단량체의 표면에 노출되지만 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자에 묻혀 있어 체액성 면역을 회피할 수 있도록 하는 부위를 의미한다.
본 발명의 범위에는 상기 염기서열의 변이체가 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1로 코딩되는 단백질과 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1로 코딩되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1로 코딩되는 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 1로 코딩되는 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1로 코딩되는 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다.
또한 상기 서열 동질성은 두 개의 단백질의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 단백질을 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(mached span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
상기에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 개체에 적용되었을 때 개체 내에서 PCV 2b형 및 2d형에 대한 면역을 유도하는 활성을 말한다. 본 발명의 "기능적 동등물"의 범위에는 서열번호 1로 코딩되는 펩타이드의 기본골격과 PCV 2b형 및 2d형에 대한 면역을 유도하는 활성을 유지하면서 펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 백신 조성물 또는 면역원성 조성물일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 돼지 써코바이러스 2형은 돼지 써코바이러스 2b형 또는 2d형인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명의 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 PCV 2b형 및 2d형 모두에 대해 항체가가 현저히 높은 것을 실험적으로 확인한바, 이는 본 발명의 단백질이 PCV2b와 PCV2d 두 유전형을 교차 방어한다는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병(Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이성 간증(dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것이 바람직하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 관절내(intra-articular) 투여, 활액내(intra-synovial) 투여, 수막강내 투여, 간내(intrahepatic) 투여, 병변내(intralesional) 투여 또는 두개강내(intracranial) 투여되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 근육내 투여 또는 비강내 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 백신은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, PCV2에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다. 본 발명의 실시 예에서는 본 발명의 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질이 PCV 2b형 및 2d형에 대해 우수한 항체가를 나타낸다는 것을 확인한바, PCV2에 의한 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 PCV2는 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 유효 성분인 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역 증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 사료는 동물이 먹는 임의의 천연 또는 인공 구성식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 본 발명에 따른 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계에 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후 사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 사료 첨가제는 동물에 있어 질병 증상의 완화, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료 조성물 및 사료 첨가제 조성물은 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 중 농후사료로는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분, 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류가 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 사료 중 조사료로는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등 의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특수사료에는 굴껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질은 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 관절내(intra-articular) 투여, 활액내(intra-synovial) 투여, 수막강내 투여, 간내(intrahepatic) 투여, 병변내(intralesional) 투여 또는 두개강내(intracranial) 투여되는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 근육내 또는 비강내 투여되는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료방법은 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질의 투여로 인해 생체 내 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직하며, 보다 상세하게는 항체가, 면역반응 관련 인자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실험예]
실험예 1. PCV2b&d-ConCP 백신 제조
㈜이노백에서 개발한 이노써코백신(이하 이노써코)의 항원 중 Baculovirus Express system을 이용하여 재조합 Porcine circovirus 2b, 2d Consensus Capsid Protein(이하 PCV2b&d-ConCP)을 제조하였다. 제조된 PCV2b&d-ConCP는 PCV 2b형 및 2d형의 유전자가 하나의 서열로 재합성된 것으로, 상기 PCV2b&d-ConCP는 서열번호 1의 염기서열로 표시된다.
실험예 2. 기니픽에서 PCV2b&d-ConCP 백신 효능 평가 시험
2-1. 시험의 설계 및 일정
시험 대상으로는 300-350g 기니픽을 사용하였으며, 시험 그룹과 본 시험에 사용된 백신의 접종 항원 농도는 표 1과 같이 설계하였다. 기니픽 접종량(돼지의 1/2두 분량)과 접종 경로(대퇴부 근육접종)는 국가출하검정 시험 기준을 참조하여 설정하였다. 시험 일정은 표 2와 같이 수행하였다.
그룹
번호		 그룹명 접종 항원 농도 접종량 개체수 접종경로
G4 PCV2b&d-ConCP 5 μg/mL/dose 1mL 5 근육접종
G5 Bac-wt 5 μg/mL/dose 1mL 5 근육접종
G6 Control (PBS) - 1mL 3 근육접종
No. Days postvaccination (DPV) 수행 내용
1 0 (경정맥)채혈 및 접종
2 14 (경정맥)채혈
3 28 (경정맥)채혈
4 42 (심장)채혈 후 안락사
2-2. 백신 항원 농도 정량과 백신 제조 및 접종
1) Pierce BCA (Bicinchoninic acid) Protein Assay
Pierce BCA Protein Assay kit (ThermoFisher, Cat No.23227, Lot No. VA294776D)의 제조사의 메뉴얼에 따라 백신 항원의 농도를 정량하였다. Microplate well에 각각의 standard(working range = 5 - 250 μg/mL) 및 sample을 25 μL씩 각 well마다 첨가하였다. 각 standard별 BSA 농도는 표 3에 나타내었다.
Vial Volume
of Diluent (μL)		 Volume and Source
of BSA (μL)		 Final BSA
Concentration (μg/mL)
A 700 100 of Stock 250
B 400 400 of vial A dilution 125
C 450 300 of vial B dilution 50
D 400 400 of vial C dilution 25
E 400 100 of vial D dilution 5
F 400 0 0 = Blank
각 well마다 WR(Working reagent)를 200 μL씩 첨가하여 30초 동안 plate shaker에서 완전히 혼합 될 수 있도록 하였다. Plate cover를 씌운 다음 37℃ 에서 30분 동안 반응시켰다. Epoch™ Microplate Spectrophotometer(BioTek, USA)를 사용하여 562 nm 파장에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
2) 백신 제조 및 접종
정제한 항원의 농도를 BCA Protein asssay를 통하여 정량한 다음 항원의 농도가 5 μg/mL/dose (돼지의 1/2 dose)가 되도록 Phosphate Buffered Saline (PBS)에 희석하였다. 부형제는 MONTANIDE™ IMS1313 (Seppic, IMS1313 VG N)을 사용하였으며, PBS로 희석한 항원과 50:50 (v/v)의 비율로 혼합하였다. 최종 5μg (돼지 접종량의 1/2 dose) 항원량의 백신 1mL을 기니픽 대퇴부 양쪽에 0.5 mL씩 나누어 근육접종을 실시하였다.
2-3. 기니픽 시험 방법
300~350g의 6주령 암컷 기니픽(두열바이오텍, 대한민국)을 사용하였다. 순화기간을 거친 기니픽을 0주차로 설정하였으며, 각각의 시험그룹에 백신을 양쪽 대퇴부 근육에 0.5mL씩 나누어 총 1mL을 접종하였다. Control 그룹(G6)에는 PBS를 동일한 조건으로 접종하였다. 접종 후 14일(14 DPV)과 28일(28 DPV), 42일(42 DPV)에 모든 그룹의 경정맥에서 채혈하여 혈청을 분리한 후 -70℃에 보관하였다.
2-4. 기니픽에서 PCV2b 및 PCV2d 항체가 분석 방법
1)Indirect ELISA
MaxiSorp 96-well plate에 정제된 PCV2b 및 PCV2d 항원을 0.05M Sodium bicarbonate buffer (pH 9.4)에 희석하여 100 μL/well (100 ng)씩 분주한 뒤 4°C에서 16~24시간 동안 코팅시켰다. 코팅 용액을 제거하고 0.05% Phosphate Buffered Saline Tween (이하 PBS-T, 0.05% Tween- 20 in PBS)로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. PBS에 1% Bovine Serum Albumin (BSA)를 희석(BSA in PBS)하여 각 well에 200 μL/well씩 분주한 후 37°C 에서 2시간 동안 blocking하였다. Blocking solution을 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. 1차 항체로는 기니픽 혈청 시료를 1:1,000으로 0.1% BSA에 희석하여 37°C 에서 2시간 동안 반응하였다. 1차 항체를 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. 2차 항체로는 HRP-conjugated goat anti-Guinea pig IgG polyclonal antibody(Abcam, Cat No. ab7139)를 1:10,000으로 희석하여 100 μL/well씩 첨가한 후 37°C에서 1시간동안 반응시켰다. 2차 항체를 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. 기질로는 TetraMethyl-Benzidine (TMB, Surmodics, USA, Cat No. TMBW-1000-01, Lot No.TMBWW18)을 100 μL/well씩 첨가하여 실온에서 5분간 암반응 후, 2N H2SO4를 100 μL/well씩 첨가하여 반응을 중단시켰다. Epoch™ Microplate Spectrophotometer(BioTek, USA)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
2) 중화항체가 조사
시험 혈청을 56℃에서 30분간 비동화하였다. 96-well plate를 이용하여 2배수 희석하여 PCV2b 또는 PCV2d (400 TCID50/mL)를 동량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PCV-1 free Porcine kidney(PK-15) cell을 2 x 104 cells/100μL/well로 분주하여 Incubator에서 3일간 배양한 후 IFA (Immunofluorescence assay)를 다음과 같이 실시하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 다음 Plate를 37℃에서 10분 정도 건조를 수행하였다. 건조된 Plate에 80% cold 아세톤을 100 μL/well씩 분주한 다음 4℃에서 1시간동안 고정시켰다. 고정액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 다음 Pig anti-PCV2 antiserum을 1:500으로 희석하여 100 μL/well씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 Goat anti-Pig IgG(h+I) FITC Conjugated(Bethyl, Cat No. A100-105F, Lot No. A100-105F-20)를 1:200으로 희석하여 100 μL/well씩 분주하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 형광 현미경으로 관찰하여 PCV2 증식을 억제한 최고 혈청 희석배수의 역수를 중화항체가로 판정하였다.
2-5. 기니픽 PBMC에서 인터페론감마(IFN-γ) 분비량 조사
1) Cytokine 분비량 측정을 위한 시료의 준비 (PBMC 분리)
혈액 4 mL과 PBS 4 mL을 conical tube에 혼합 이후, 다른 Conical tube에 4 mL씩 분주해 놓은 Ficoll(GE Healthcare, Cat No. 17-1440-02, Lot No. 1298684)을 혈액-PBS 혼합액을 Ficoll tube로 옮겨주었다. 840 x g에서 30분간 상온으로 원심 분리하였다. Ficoll과 혈청 사이의 PBMC를 회수한 후 PBS를 넣어 210 x g에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 cell pellet에 PBS 3 mL을 넣어 부유시킨 후 210 x g에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하여 cell pellet에 RPMI(10% FBS+1% P/S) 2 mL을 첨가하였다. 그 중 10 μL를 따서 세포계수를 측정한 후 96-well cell culture plate에 2 x 105 cells/well로 분주하였다. Cell 분주 30분 후 재조합 PCV2b 및 PCV2d 단백질을 100 μL/well씩 감작하고 72시간 배양한 다음 16,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 세포 상층액을 분리하여 ELISA로 측정할 때까지 -70℃에 보관하였다.
2) 기니픽 IFN-γ ELISA assay
Guinea pig Interferon-γ (IFN-γ) ELISA Kit (Cusabio, Cat No. CSB-E06763Gu, Lot No. A13221097)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 인터페론감마 분비량을 측정하였다. 동봉되어 있는 plate에 standard와 각 혈청 sample을 100 μL/well씩 첨가하였으며, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 각 well에 용액을 제거하였다. Biotin-antibody(1x)를 100 μL/well씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1X Wash Buffer로 300 μL/well씩 3회 세척한 다음 HRP-avidin (1x)를 100 μL/well씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1X Wash Buffer로 well당 300 μL씩 5회 세척한 다음 TMB substrate를 90 μL/well씩 분주하여 빛을 차단한 상태로 37℃에서 15분~30분 동안 배양하였다. Stop solution을 50 μL/well씩 첨가한 후, Epoch™ Microplate Spectrophotometer(BioTek, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
실험예 3. 돼지에서 PCV2b&d-ConCP 백신 효능 평가 시험
3-1. 시험의 설계
시험 대상으로는 7주령 돼지를 사용하였으며, 시험 그룹과 본 시험에 사용된 백신의 접종 항원 농도는 표 4와 같이 설계하였다. 돼지 접종량(1두분)과 접종경로(근육접종)는 국가출하검정 시험 기준을 참조하여 설정하였다. 추가 공격 접종 시험은 13주령에 실시하였으며, 시험 그룹과 본 시험에 사용된 공격 접종 균주의 Challenge dose는 표 5와 같다. 시험 일정은 표 6과 같이 수행하였다.
그룹번호 그룹명 접종 항원 농도 접종량 개체수 접종경로
G4 PCV2b&d-ConCP 10 μg/2mL/dose 2mL 5 근육접종
G5 CircoFlex - 1mL 5 근육접종
G6 Challenge control
(PBS)		 - 2mL 4 근육접종
G7 Non-challenge control
(PBS)		 - 2mL 3 근육접종
그룹번호 그룹명 Challenge dose 개체수 공격접종
경로
TCID50/mL mL
G4 PCV2b&d-ConCP 5.5 2mL 5 비강
G5 CircoFlex 5.5 2mL 5 비강
G6 Challenge control
(PBS)		 5.5 2mL 4 비강, 기도
G7 Non-challenge control
(PBS)		 3
Weeks Days post
Vaccination		 Days post
Challenge		 수행내용
3주령 - - 체중측정 및 채혈
4주령 - - 체중측정 및 채혈
5주령 - - 체중측정 및 채혈
6주령 - - 체중측정 및 채혈
7주령 0 - 체중측정 및 채혈
백신접종(DPV, Days post Vaccination)
8주령 7 - 체중측정
9주령 14 - 체중측정 및 채혈
10주령 21 - 체중측정
11주령 28 - 체중측정 및 채혈
12주령 35 - 체중측정
13주령 42 0 체중측정및채혈(PBMC)
공격접종(DPC, Days post Chaellenge)
14주령 49 7 체중측정 및 채혈
15주령 56 14 체중측정 및 채혈
16주령 63 21 체중측정 및 채혈
폐사후 부검(Lung, Lymphnodes)
3-2. 돼지의 사육방법
시험기간 내 시험농장의 감염을 방지하기 위하여 소독을 실시한 다음 2주가 경과된 돈사에 3주령 돼지를 사육하였다. 모든 돼지는 시험기간 동안 사료와 음수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 7주령 돼지에 PCV2b&d-ConCP 그룹(G4)과 CircoFlex 그룹(G5)은 백신을 이근부(측면경부근육)에 접종하였으며, Challenge control 그룹(G6)과 Non-challenge control 그룹(G7)에는 PBS를 동일한 조건으로 접종하였다. 백신 접종 6주 경과 후, 13주령의 PCV2b&d-ConCP 그룹(G4) 및 CircoFlex 그룹(G5)은 비강으로 공격 접종을 실시하였으며, Challenge control 그룹(G6)에는 비강과 기도로 나누어 공격 접종을 실시하였다. 공격 접종 3주 경과 후, 16주령 모든 그룹의 비강과 직장에서 면봉을 이용하여 시료를 채취하였으며, 안락사한 다음 부검을 실시하여 폐 병변 및 서혜부 림프절의 종대를 확인하였다. 추가적으로 조직 분석과 바이러스 분리를 위하여 폐 및 서혜부 림프절 조직을 채취 하였다. 시험기간 동안 매주 체중을 측정하였으며, 혈액은 백신 접종 후 공격 접종일(13주령)까지 2주 간격으로, 공격 접종(13주령) 이후에는 1주 간격으로 채혈을 실시하였다.
3-3. 백신 항원 농도 정량과 백신 제조 및 접종
1) 백신 제조 및 접종
정제한 항원의 농도를 BCA Protein asssay를 통해 정량한 다음 항원의 농도가 10 μg/2mL/dose (돼지 1 dose) 되도록 Phosphate Buffered Saline (PBS)에 희석하였다. 부형제는 MONTANIDE™ IMS1313 (Seppic, IMS1313 VG N)을 사용하였으며, PBS로 희석한 항원과 50:50 (v/v)의 비율로 혼합하였다. 국가출하검정 시험을 기준을 참조하여 최종 10 μg (돼지 1 dose) 항원량의 백신 2 mL을 7주령의 돼지 이근부(측면경부근육)에 근육접종을 실시하였다. CircoFlex 백신 접종군은 용법 및 용량에 따라 1 mL씩 근육접종을 실시하였다.
3-4. PCV2 Challenge
1) 공격접종용 PCV2 제조
PK-15 cell을 8% FBS(GenDEPOT, Cat No. F0600-050, Lot No. 5101912)를 첨가한 DMEM(GeneDEPOT, Cat No. CM002, Lot No.5292011)을 이용하여 T-75cm2 Flask(SPL,CatNo.70075,LotNo.BBCE11A70075)에 배양하여 준비하였다. PCV2 분리주(HID9071)를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 다음 1% Antibiotic-Antimycotic을 함유한 DMEM을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 바이러스 배양액을 제거한 다음 PBS를 이용하여 3회 세척하고 300mM Glucosamine을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. Glucosamine을 제거하고 PBS를 이용하여 3회 세척한 다음 1% Antibiotic-Antimycotic을 함유한 DMEM을 20 mL을 첨가하여 37℃, 5% CO2 에서 3일간 배양하였다. 얼렸다 녹였다를 3회 반복하여 harvest한 다음 IFA를 실시하여 역가를 측정하였으며, 측정 결과 역가는 TCID50/mL로 확인하였다
2) PCV2 공격접종
공격 접종은 13주령(42DPV)에 PCV2 105.5 TCID50/mL의 농도로 PCV2b&d-ConCP그룹(G4) 및 CircoFlex그룹(G5), Challenge control그룹(G6) 돼지의 양쪽 비강에 1 mL씩 나누어 총 2 mL을 접종하였다. Challenge control그룹(G6) 중 개체 두 마리(G6-1, G6-2)는 기관내로 공격 접종을 실시하였다.
3-5. 돼지에서 PCV 2b 및 PCV2d 항체가 분석 방법
1) Indirect ELISA
MaxiSorp 96-well plate에 정제된 PCV2b 및 PCV2d 항원을 0.05M Sodium bicarbonate buffer (pH 9.4)에 희석하여 100 μL/well (100 ng)씩 분주한 뒤 4°C에서 16~24시간 동안 코팅시켰다. 코팅 용액을 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. PBS에 1% Bovine Serum Albumin (BSA)를 희석하여 각 well에 200 μL/well씩 분주한 후 37°C에서 2시간 동안 blocking하였다. Blocking solution을 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 3회 세척하였다. 1차 항체로는 돼지 혈청 시료를 1:2,000으로 희석하여 37°C 에서 2시간 동안 반응시켰다. 1차 항체를 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 PBS-T로 3회 세척하였다. 2차 항체로는 1:10,000으로 희석한 Goat anti-Pig IgG FC-Fragment HRP Conjugated (Bethyl, Cat No. A100-104P) 또는 Goat pAb to Pig IgA(HRP) (abcam, Cat No. ab112746, Lot No. GR272913-10)를 100 μL/well씩 첨가한 후 37°C에서 1시간동안 반응시켰다. 2차 항체를 제거하고 0.05% PBS-T로 300 μL/well씩 PBS-T로 3회 세척하였다. 기질로는 TetraMethyl-Benzidine (TMB, Surmodics, USA, Cat No. TMBW-1000-01, Lot No.TMBWW18)을 100 μL/well씩 첨가하여 실온에서 5분간 암반응 후, 2N H2SO4를 100 μL/well씩 첨가하여 반응을 중단하였다. Epoch™ Microplate Spectrophotometer(BioTek, USA)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
2) 중화항체가 조사
시험 혈청을 56℃에서 30분간 비동화하였다. 96-well plate를 이용하여 2배수 희석하여 PCV2b 또는 PCV2d (400 TCID50/mL)를 동량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PCV-1 free Porcine kidney(PK-15) cell을 2 x 104 cells/100μL/well로 분주하여 Incubator에서 3일간 배양한 후 IFA (Immunofluorescence assay)를 다음과 같이 실시하였다. 배양액을 제거한 후 PBS로 1회 세척한 다음 PBS를 완전히 제거하고 Plate를 잘 건조시켰다. 건조 시킨 Plate에 80% cold 아세톤을 100 μL/well씩 분주한 다음 4℃에서 1시간(또는 -20℃에서 15분)동안 고정시켰다. 고정액을 제거한 후 PBS로 1회 세척한 다음 Pig anti-PCV2 antiserum을 1:500으로 희석하여 100 μL/well씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 Goat anti-Pig IgG h+I FITC Conjugated(Bethyl, Cat No. A100-105F, Lot No. A100-105F-20)를 1:200으로 희석하여 100 μL/well씩 분주하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 형광 현미경으로 관찰하여 PCV2 증식을 억제한 최고 혈청 희석배수의 역수를 중화항체가로 판정하였다.
3-6. 돼지 PBMC에서 인터페론감마(IFN-γ) 분비량 조사
1) Cytokine 분비량 측정을 위한 시료의 준비 (PBMC 분리)
혈액 4 mL과 PBS 4 mL을 conical tube에 혼합 이후, 다른 Conical tube에 4 mL씩 분주해 놓은 Ficoll(GE Healthcare, Cat No. 17-1440-02, Lot No. 1298684)을 혈액-PBS 혼합액을 Ficoll tube로 옮겨주었다. 840 x g에서 30분간 상온으로 원심 분리하였다. Ficoll과 혈청 사이의 PBMC를 회수한 후 PBS를 넣어 210 x g에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 cell pellet에 PBS 3 mL을 넣어 부유시킨 후 210 x g에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하여 cell pellet에 RPMI(10% FBS+1% P/S) 2 mL을 첨가하였다. 그 중 10 μL를 따서 세포계수를 측정한 후 96-well cell culture plate에 2 x 105 cells/well로 분주하였다. Cell 분주 30분 후 재조합 PCV2b 및 PCV2d 단백질을 100 μL/well씩 감작하고 72시간 배양한 다음 16,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 세포 상층액을 분리하여 ELISA로 측정할 때까지 -70℃에 보관하였다.
2) Pig Interferon-γ (IFN-γ) ELISA assay
IFN-γ Porcine ELISA Kit (Invitrogen, Cat No. KSC4021, Lot No. 224978-007)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 인터페론감마 분비량을 측정하였다. 동봉되어있는 plate에 standards를 100 μL/well씩 첨가한다. Standard를 제외한 나머지 well에 Standard Diluent buffer를 50 μL/well씩 첨가하고 PBMC 세포 배양액을 50 μL 첨가하였다. Chromogen blank well을 제외한 모든 well에 SW IFN-γ Biotin Conjugate solution을 50 μL 첨가하여 plate cover를 씌워 37℃에서 2시간 반응시켰다. 1X Wash Buffer로 300 μL/well씩 4번 세척하였다. Chromogen blank well을 제외한 모든 well에 1X Streptavidin-HRP solution 을 100 μL/well씩 첨가한 후 Plate cover를 씌워 37℃에서 30분간 반응시켰다. 1X Wash Buffer로 300 μL/well씩 4번 세척하였다. Stabilized Chromogen을 100 μL/well씩 첨가한 후 실온에서 30분간 암반응 후, Stop solution을 100 μL/well씩 첨가하여 반응을 중단하였다. Epoch™ Microplate Spectrophotometer(BioTek, USA)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광값(OD)을 측정하였다.
3-7. 돼지 혈액 및 조직 내 Viral DNA 측정
1) 돼지 혈액에서 PCV2d viremia 측정
백신 접종(0 DPV) 후 2주 간격으로 채혈을 진행하여 백신 접종 이후 14일(14 DPV), 28일(28 DPV), 42일(42 DPV)에 혈액을 채취하였으며, 공격 접종(42 DPV)후에는 매주 채혈을 진행하여 공격 접종 이후 7일(49 DPV), 14일(56 DPV), 21일(63 DPV)에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. RibospinTM vRDplus Kit (GeneAll, CatNo.312-150, LotNo.31221a08001)을 사용하여 제조사의 protocol에 따라 혈청 내 viral DNA를 분리하였으며, SYBR GreenⅠ(Enzynomics, Cat No. RT501M, Lot No. KE)으로 RT-qPCR을 실시하여 PCV2 DNA copy수를 확인하였다.
2) 돼지 조직(Lung and Lymph nodes)에서 PCV2 DNA loads 측정
공격 접종 이후 21일차(63DPV)에 모든 그룹은 안락사를 진행하였으며, 개체 별로 폐 조직과 림프절을 채취하였다. 2 mL E-tube에 조직과 PBS를 1:1 (g/mL)로 맞추어 넣어주었으며, 균질화하기 위해 steal beads를 넣고 Tissue lyserⅡ(Quiagen, Sesrial No.128140260)를 사용하였으며, 2 x 24 Adapter(Quiagen, Cat No. 69982, Lot No. 130163660) 30Hz로 5분동안 3회 수행하였으며, 조직 균질 상태에 따라 추가 수행하였다. 이후, 10,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. RibospinTM vRDplus Kit(GeneAll, CatNo.312-150, LotNo.31221a08001)을 사용하여 제조사의 protocol에 따라 viral DNA를 분리하였으며, SYBR GreenⅠ(Enzynomics, Cat No. RT501M, Lot No. KE)으로 RT-qPCR을 실시하여 PCV2 DNA copy수를 확인하였다.
3) 돼지 Nasal and Rectal swab에서 PCV2d DNA loads 측정
공격 접종 이후 21일(63DPV)에 모든 그룹은 안락사를 진행하였으며, 개체 별로 비강과 직장에서 면봉을 이용하여 시료를 채취하였다. 2 mL E-tube에 PBS 1 mL과 swab sample을 혼탁한 후 10,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. RibospinTM vRDplus Kit (GeneAll, CatNo.312-150, LotNo.31221a08001)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 viral DNA를 분리하였으며, SYBR GreenⅠ(Enzynomics, Cat No. RT501M, Lot No. KE)으로 RT-qPCR을 실시하여 PCV2 DNA copy수를 확인하였다.
3-8. 병리학적 평가
1) 육안적 병변 확인
공격 접종 이후 21일(63 DPV)에 모든 그룹은 안락사를 진행하였으며, 개체 별로 부검하여 폐 조직과 림프절에서 육안적 병변을 확인하였다.
2) Immunohistochemistry (IHC, 면역조직화학염색법)
폐와 림프 조직은 10% 중성포르말린에 고정하여 조직검경을 실시하였다. 폐장에서의 조직학적 평가는 기관지 주변의 림프소절(Bronchus-associated lymphatic tissue, 이하 BALT), 혈관과 기관지(세기관지) 주변의 염증 세포(단핵구) 침윤을 포함하는 국소다발성 염증소, 미만성으로 폐포 벽의 비후를 동반한 간질성 폐렴을 포함하였다. BALT의 경우, 관찰되는 빈도에 따라 정상 수준(often, 0), 미약한 증가(quite often, 1), 빈번한 증가(frequent, 2) 상당히 증가함(very frequent, 3)으로 구별하여 반정량적으로 등급화 하였으며, 보다 정량적 비교를 위하여 개체당 2개의 조직 절편에서 결절의 형태가 뚜렷한 림프소절의 수를 측정하여 그룹간의 결과를 비교하였다. 염증소와 미만성의 간질성 폐렴의 경우, 정상(normal range, 0), 미약(mild, 1), 중등도(moderate, 2), 심함(severe, 3)으로 구별하여 grading 하였다. 림프절의 경우 병변이 있을 경우, 그 내용을 기록하고 정도를 반정량적 방법으로 정상(normal range, 0), 미약(mild, 1), 중등도(moderate, 2) 심함(severe, 3)으로 구별하여 등급화 하였으며, B세포 영역의 활성화를 비교하기 위해 2차 림프소절의 수를 400배의 현미경 배율로 계수하여 그룹간 결과를 비교하였다. 폐와 림프 조직으로부터 각각 2개의 다른 부위에서 조직 절편을 제작하였으며, 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 이 조직을 3cm 두께로 박절한 후 헤마톡실린과 에오신 염색을 진행하였으며, 광학현미경을 사용하여 검경하였다. PCV2에 대한 면역 염색은 VECTASASTAIN® Elite® ABC Universal Kit(Vector Laboratories, Cat No. ZF0924)를 이용하였다. 파라핀 포매된 폐장 및 림프 조직을 면역 염색용 특수슬라이드에 부착한 후 탈파라핀과 함수하였다. 항원 노출(antigen unmasking)을 위하여 Antigen Unmasking Solution(citrate-based, pH 6.0) (VECTOR Laboratories, Cat No. H-3300) 용액을 전자레인지에 7분 동안 예열한 후 조직을 넣은 다음 추가로 12분 동안 열을 가하였다. Antigen Unmasking Solution이 충분히 식도록 놓아둔 후 흐르는 수돗물에 수세하였고, 증류수로 추가 수세한 후 메탄올과 0.3% 과산화수소가 포함된 용액에 30분 동안 처리함으로써 endogenous peroxidase를 불활화시켰다. PBS로 수회 수세한 다음 희석된 normal horse blocking serum으로 실온에서 30분 동안 조직을 배양하였다. Normal blocking serum을 털어낸 후 1:500으로 희석한 1차 항체 Rabbit polyclonal anti-porcine PCV2 antibody(Invitrogen, Cat No. PA5-34969)를 분주하여 4oC에서 overnight하였다. Negative control의 경우 1차 항체 대신 PBS를 적용시켰다. PBS로 수세한 다음 희석된 biotin이 부착된 2차 항체를 분주하여 실온에서 40분 동안 반응하였다. PBS로 수세한 다음 VECTASASTAIN® Elite® ABC reagent로 30분 동안 실온에서 반응한 이후 peroxidase substrate(DAB)로 약 1분 동안 발색시켰다. 헤마톡실린에 counter stain을 실시한 후 탈수와 정화 과정을 거쳐 커버글라스로 봉입하여 광학현미경으로 양성 여부를 확인하였다.
3-9. 주령별 체중 변화 및 평균 증체량(Average of daily weight gain, 이하 ADWG) 분석
체중은 모든 그룹의 돼지를 저울에 설치된 케이지에 1마리씩 넣어 개체별로 체중을 측정하였다. 측정된 체중을 이용하여 각 개체당 일당 평균증체량 (ADWG)을 분석하였다.
실험예 4. 통계적 분석
통계적 분석은 GraphPad Prism software를 사용하여 분석하였다. 그룹간의 비교를 위하여 One-way ANOVA를 사용하였으며, 사후 검정은 Dunnett’s multiple comparisons test를 이용하여 유의적인 차이를 확인하였다. 대조군을 기준으로 P<0.05인 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
[실시예]
실시예 1. 기니픽에서 PCV2b&d-ConCP 백신 효능 평가 시험
1-1. 백신 항원 농도 정량을 위한 Pierce BCA Protein Assaay 결과
백신 접종을 위해 정제된 항원을 Pierce BCA Protein Assay kit (ThermoFisher, Cat No.23227, Lot No. VA294776D) 내의 방법에 따라 백신 항원의 농도를 정량하였으며, Standard curve(working range = 5-250 μg/mL)를 통해 R-squared(결정 계수)값은 0.9989으로 확인하였다. 정량 결과는 도 1, 표 7 및 8에 나타내었다.
Label μg/mL OD값
(562nm)		 평균 OD값
(562nm)
Standard A 250 0.499 0.50
0.502
Standard B 125 0.301 0.30
0.295
Standard C 50 0.162 0.16
0.162
Standard D 25 0.124 0.12
0.119
Standard E 5 0.092 0.09
0.09
Standard F 0 0.091 0.09
Label OD값(562nm) 정량값(μg/ml)
PCV2b&d-ConCP 0.115 18
Bac-wt 0.281 116
도 1, 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, PCV2b&d ConCP 정량값은 18 μg/mL로 정제한 ConCP 항원 60 mL 기준으로 총 1,080 μg, Bac-wt 정량값은 116 μg/mL로 정제한 wt 항원 10 mL 기준으로 총 1,160 μg의 항원을 준비하였다. 이후, 기니픽 및 돼지 시험에서 백신 항원 농도에 맞게 희석하여 접종을 실시하였다.
1-2. 기니픽에서 PCV2b-specific IgG 항체가 및 PCV2d-specific IgG 항체가 시험
기니픽에서 PCV2b&d-ConCP백신 효능을 평가하기 위하여 그룹별 백신 접종 후 혈청을 분리하여 PCV2b 또는 PCV2d 항원특이적 IgG 항체가를 indirect ELISA로 확인하였다. PCV2b-specific IgG 항체가 시험 결과는 도 2 및 표 9에 나타내었고, PCV2d-specific IgG 항체가는 도 3 및 표 10에 나타내었다.
그룹번호 그룹명 기니픽에서의 PCV2b-specific IgG 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 0.02±0.00 0.51±0.08 1.62±0.06 1.69±0.06
G5 Bac-wt 0.01±0.00 0.04±0.01 0.33±0.08 0.41±0.10
G6 Control(PBS) 0.02±0.00 0.02±0.00 0.04±0.00 0.03±0.00
그룹번호 그룹명 기니픽에서의 PCV2d-specific IgG 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 0.07±0.00 0.48±0.04 1.91±0.10 1.92±0.09
G5 Bac-wt 0.08±0.00 0.18±0.05 0.97±0.20 1.06±0.20
G6 Control(PBS) 0.09±0.01 0.09±0.00 0.09±0.00 0.09±0.00
시험 결과, PBS를 접종한 Control그룹(G6)은 모든 시험 구간에서 낮은 IgG 항체가를 나타내었지만, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 14 DPV부터 PCV2b 또는 PCV2d 항원특이적 IgG 항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다. 대조군과 비교하였을 때, 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 또한, Bac-wt 접종 그룹(G5)에서도 비교적 낮은 수준의 IgG 항체 생성이 유도되었지만, 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 나타내었다.
기니픽에서 그룹 별 백신(돼지 접종량의 1/2 dose)을 접종 한 후 42일 뒤 기니픽 혈액에서 PBMC를 분리하였으며, Guinea pig Interferon-γ (IFN-γ) ELISA Kit (Cusabio, Cat No. CSB-E06763Gu, Lot No. A13221097)를 이용하여 인터페론감마 분비량을 측정하였다. 인터페론감마 분비량을 측정한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, PBS를 접종한 Control그룹(G6)과 Bac-wt 접종 그룹(G5)은 유사한 수준의 인터페론감마 분비량을 나타내었다. 한편, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 PCV2b 항원 감작에 대하여 66 pg/mL, PCV2d 항원 감작에 대하여 56.25 pg/mL의 평균값으로 가장 높은 분비량을 나타내었다.
1-3. 기니픽에서 PCV2b 및 PCV2d에 대한 중화항체가 조사 결과
기니픽에서 PCV2b&d-ConCP백신의 PCV2b 및 PCV2d에 대한 중화항체가 확인 시험을 진행하였다. PCV2b에 대한 중화항체가 확인 결과는 도 5 및 표 11에 나타내었고, PCV2d에 대한 중화항체가 확인 결과는 도 6 및 표 12에 나타내었다.
그룹번호 그룹명 기니픽에서의 PCV2b에 대한 중화항체가 (평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 57.6±6.4
G5 Bac-wt 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 9.6±1.6
G6 Control(PBS) 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0
그룹번호 그룹명 기니픽에서의 PCV2d에 대한 중화항체가 (평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 8.0±0.0 12.8±2.0 44.8±7.8 153.6±43.4
G5 Bac-wt 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 17.6±3.9
G6 Control(PBS) 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 16.0±8.0
도 5 및 표 11에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 28 DPV까지 PBS를 접종한 Control그룹(G6)과 Bac-wt 접종 그룹(G5)은 모든 시험구간에서 평균 16배 이하의 낮은 중화항체가를 나타냈지만, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 42 DPV부터 32배 이상의 중화항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, Control그룹(G6)과 비교하였을 때 PCV2b에 대해 42 DPV에 가장 큰 차이를 나타냈으며, 평균 7.2배 더 높은 수준의 중화항체가를 유도하며 상당히 유의적인 차이가 나타나는 것을 확인하였다.도 6 및 표 12에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 28 DPV까지 PBS를 접종한 Control그룹(G6)과 Bac-wt 접종 그룹(G5)은 모든 시험구간에서 평균 16배 이하의 낮은 중화항체가를 나타냈지만, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 28 DPV부터 32배 이상의 중화항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, Control그룹(G6)과 비교하였을 때 PCV2d에 대해 42 DPV에 가장 큰 차이를 나타냈으며, 평균 19.2배 더 높은 수준의 중화항체가를 유도하며 상당히 유의적인 차이가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 2. 돼지에서 PCV2b&d-ConCP 백신 효능 평가 시험
2-1. 항체가 측정 결과
1) 돼지에서 PCV2b-specific IgG 항체가 및 PCV2d-specific IgG 항체가 측정
목적 동물인 돼지에서 PCV2b&d-ConCP백신의 효능을 평가하기 위하여 그룹 별 백신 접종 후 혈청을 분리하였으며, PCV2b 또는 PCV2d 항원에 특이적인 IgG 항체가 조사를 위해 indirect ELISA 방법으로 확인하였다. PCV2b-specific IgG 항체가 측정 결과는 도 7 및 표 13에 나타내었고, PCV2b-specific IgG 항체가 측정 결과는 도 8 및 표 14에 나타내었다.
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2b-specific IgG 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 1.04±0.10 1.05±0.14 1.85±0.22 2.17±0.20 2.45±0.20 2.99±0.19 2.96±0.08
G5 CircoFlex 0.85±0.10 0.62±0.10 1.04±0.22 2.02±0.34 2.46±0.31 2.65±0.13 3.04±0.09
G6 Challenge control 0.97±0.22 0.65±0.13 0.36±0.06 0.20±0.03 0.21±0.03 0.82±0.29 3.01±0.23
G7 Non-challenge control 0.99±0.18 0.53±0.08 0.33±0.04 0.21±0.01 0.21±0.01 0.24±0.03 0.21±0.02
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2d-specific IgG 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 1.44±0.10 1.29±0.22 2.35±0.26 2.69±0.17 2.71±0.15 3.33±0.05 3.37±0.02
G5 CircoFlex 1.32±0.15 0.89±0.06 1.45±0.30 2.23±0.41 2.49±0.30 3.13±0.17 3.26±0.02
G6 Challenge control 1.29±0.25 0.77±0.13 0.51±0.07 0.32±0.03 0.32±0.02 0.83±0.24 3.19±0.13
G7 Non-challenge control 1.41±0.21 0.82±0.13 0.55±0.05 0.29±0.03 0.37±0.01 0.31±0.03 0.28±0.02
돼지에서 PCV2b 또는 PCV2d 항원특이적 IgG 항체가 조사 결과, 모든 그룹은 백신 접종 전임에도 불구하고 모체이행항체를 보유하고 있어 비교적 높은 수준의 항체가를 나타내었다. PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)과 Non-challenge control그룹(G7)은 14 DPV부터 모체이행항체가 떨어지기 시작하였지만, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 28 DPV부터 높은 수준의 IgG 항체가 유도되는 것을 확인하였다. 특히, 상용백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)보다 비교적 더 높은 수준의 항체가를 유도하였고, Non-challenge control그룹(G7)과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 또한, 공격 접종 이후(42 DPV) 백신 접종 그룹은 방어능 평가 시험 종료 시까지 상당히 높은 수준의 항체가를 유지하였다. PCV2 유전형에 대한 항체가 비교 결과, 시험종료일(63 DPV)에 PCV2b보다 PCV2d 항체가가 약1.13배 더 높은 수준을 나타내었다.
2) 돼지에서 PCV2b-specific IgA 항체가 및 PCV2d-specific IgA 항체가 측정
목적 동물인 돼지에서 PCV2b&d-ConCP백신의 효능을 평가하기 위하여 그룹 별 백신 접종 후 혈청을 분리하였으며, PCV2b 또는 PCV2d 항원에 특이적인 IgA 항체가를 indirect ELISA를 통하여 확인하였다. PCV2b-specific IgA 항체가 측정 결과는 도 9 및 표 15에 나타내었고, PCV2d-specific IgA 항체가 측정 결과는 도 10 및 표 16에 나타내었다.
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2b-specific IgA 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 0.08±0.01 0.08±0.01 0.10±0.01 0.11±0.01 0.09±0.01 0.10±0.01 0.10±0.01
G5 CircoFlex 0.09±0.01 0.10±0.02 0.11±0.02 0.12±0.00 0.10±0.01 0.11±0.01 0.12±0.01
G6 Challenge control 0.06±0.00 0.08±0.01 0.08±0.01 0.12±0.01 0.10±0.01 0.10±0.01 0.25±0.05
G7 Non-challenge control 0.06±0.00 0.09±0.01 0.10±0.03 0.10±0.01 0.11±0.03 0.10±0.01 0.12±0.03
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2d-specific IgA 항체가 (OD450, 평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 0.11±0.01 0.12±0.02 0.19±0.03 0.12±0.01 0.16±0.02 0.26±0.02 0.22±0.01
G5 CircoFlex 0.12±0.02 0.20±0.07 0.26±0.07 0.20±0.02 0.25±0.03 0.42±0.07 0.46±0.08
G6 Challenge control 0.08±0.01 0.12±0.02 0.11±0.01 0.14±0.02 0.17±0.03 0.24±0.08 1.23±0.15
G7 Non-challenge control 0.07±0.01 0.11±0.01 0.17±0.02 0.10±0.01 0.15±0.03 0.13±0.01 0.13±0.02
돼지에서 PCV2b 또는 PCV2d 항원특이적 IgA 항체가 조사 결과, 모든 그룹의 IgA 항체가는 IgG와 비교하여 상당히 낮은 항체가를 나타내었지만, Challenge control그룹(G6)은 63 DPV에서 비교적 높은 수준의 IgA 항체가를 유도하였고, Non-challenge control그룹(G7)과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 이는 백신접종 그룹과 달리 공격접종 이후 백신접종이 되지 않아 PCV2d를 중화하지 못하기 때문에 방어 면역형성 과정에서 IgA가 생성된 것으로 판단된다.
돼지에서 백신을 접종한 후 42일 뒤 돼지 혈액에서 PBMC를 분리하였으며, Invitrogen IFN-γ Porcine ELISA Kit를 이용하여 인터페론감마 분비량을 측정하였다. 인터페론감마 분비량을 측정한 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)과 Non-challenge control그룹(G7) 및 상용백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)은 평균 50 pg/mL 이하로 비교적 낮은 수준의 인터페론감마 분비량을 나타내었다. 한편, 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 PCV2b 항원 감작에 대하여 126.53pg/mL, PCV2d 항원 감작에 대하여 82.45pg/mL의 평균값으로 가장 높은 분비량을 나타내었다. 특히, PCV2b 감작 결과에서 Non-challenge control그룹(G7)과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다.
2-2. 돼지에서 PCV2b 및 PCV2d에 대한 중화항체가 측정
돼지에서 PCV2b&d-ConCP 백신의 PCV2b 및 PCV2d에 대한 중화항체가를 측정하였다. PCV2b에 대한 중화항체가 측정 결과는 도 12 및 표 17에 나타내었고, PCV2d 대한 중화항체가 측정 결과는 도 13 및 표 18에 나타내었다.
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2b에 대한 중화항체가 (평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 8.0±0.0 8.0±0.0 25.6±3.9 128.0
±0.0		 102.4
±15.7		 230.4
±25.6		 204.8
±31.4
G5 CircoFlex 8.0±0.0 8.0±0.0 38.4±6.4 230.4
±25.6		 230.4
±25.6		 179.2
±31.4		 179.2
±31.4
G6 Challenge control 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 10.0±2.0 20.0±4.0 88.0±24.0 128.0
±0.0
G7 Non-challenge control 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 13.3±2.7 13.3±2.7 16.0±0.0 16.0±0.0
그룹번호 그룹명 돼지에서의 PCV2d에 대한 중화항체가 (평균±표준오차)
0 DPV 14 DPV 28 DPV 42 DPV 49 DPV 56 DPV 63 DPV
G4 PCV2b&d-ConCP 8.0±0.0 19.2±3.2 51.2±7.8 153.6
±25.6		 230.4
±25.6		 230.4
±25.6		 358.4
±62.7
G5 CircoFlex 8.0±0.0 25.6±3.9 51.2±7.8 102.4
±15.7		 115.2
±12.8		 153.6
±25.6		 307.2
±51.2
G6 Challenge control 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 16.0±0.0 64.0±22.6 104.0
±24.0		 192.0
±37.0
G7 Non-challenge control 8.0±0.0 8.0±0.0 8.0±0.0 21.3±5.3 21.3±5.3 21.3±5.3 32.0
±0.0
도 12 및 표 17에 나타낸 바와 같이, PCV2b에 대한 중화항체가는 백신 접종 후 28 DPV까지 PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)과 Non-challenge control그룹(G7)은 평균 16 이하의 낮은 중화항체가를 나타내었지만, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 28 DPV부터 중화항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 56 DPV를 기준으로 PCV2b에 대해 평균 230.4로 CircoFlex 그룹(179.2)보다 51.2가 더 높은 수준의 중화항체가를 유도하였고, 대조군과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 도 13 및 표 18에 나타낸 바와 같이, PCV2d에 대한 중화항체가는 백신 접종 후 28 DPV까지 PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)과 Non-challenge control그룹(G7)은 평균 16 이하의 낮은 중화항체가를 나타내었지만, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 14 DPV부터 중화항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 63 DPV를 기준으로 PCV2d에 대해 평균 358.4로 CircoFlex 그룹(307.2)보다 51.2가 더 높은 수준의 중화항체가를 유도하였고, 대조군과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 또한, PCV2d에 대한 중화항체가는 PCV2b에 비하여 비교적 높은 수준을 나타내었다.
따라서, 중화항체가 확인 결과를 통해 PCV2b와 PCV2d의 교차 중화반응을 확인하였으며, 돼지에서 PCV2b&d-ConCP 백신이 상용백신인 CircoFlex 백신보다 PCV2b와 PCV2d에 대해 더 효과적으로 중화항체가를 유도하는 것을 확인하였다.
2-3. 돼지 혈액 및 조직 내 Viral DNA 측정
1) 돼지 혈액에서 PCV2d viremia 측정 결과
백신 접종 후 공격접종에 의한 돼지 혈액에서의 PCV2d 바이러스 혈증(viremia)을 분석하였으며, 그 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 접종 이후 시험 종료시까지 PCV2d viremia는 확인되지 않았지만, PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6) 및 상용백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)은 공격접종 7일(56 DPV)부터 바이러스 혈증이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, Challenge control그룹(G6)은 56 DPV기준으로 평균 1.21 x 106 copies/mL로 가장 높은 수준을 나타내었으며, Non-challenge control그룹(G7)과 비교하였을 때 상당히 유의적인 차이를 나타내었다. 한편, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 Non-challenge control그룹(G7)과 동일하게 공격 접종 이후에도 PCV2d viremia가 확인되지 않았다.
2) 돼지 폐 및 림프절에서의 PCV2d DNA loads 측정 결과
모든 시험 그룹은 63 DPV에 안락사를 진행하여 각 개체별로 폐와 림프 조직을 채취하였다. 이후 각각의 조직 시료에서viral DNA를 추출하여 real time-qPCR을 통해 PCV2d DNA 양을 측정하였다. 폐 및 림프절에서의 PCV2 DNA load를 측정하였으며, 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)은 폐에서 평균 2.37 x 109 copies/mL, 림프절에서 평균 1.78 x 109 copies/mL로 다른 시험 그룹과 비교하여 상당히 높은 수준의 PCV2d DNA copy수가 확인되었다. 반면, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 평균 1.98 x 105 copies/mL 이하로 Non-challenge control그룹(G7)과 유사한 수준을 나타내었다. 특히, 림프절에서 상용 백신을 접종한 CircoFlex 그룹(G5)보다 PCV2d 공격접종에 대하여 더 효과적인 방어능을 나타내었으며, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 비교하여 상당히 유의적인 차이를 나타내었다.
3) 돼지 Nasal 및 Rectal swab에서의 PCV2d DNA loads 측정 결과
비강 및 직장 시료에서 viral DNA를 추출하여 real time-qPCR을 통해 PCV2d DNA 양을 측정하였으며, 그 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)은 비강 시료에서 평균 1.22 x 108 copies/mL, 직장 시료에서 평균 2.03 x 106 copies/mL로 매우 높은 수준의 PCV2d DNA copy수가 확인되었다. 개발 백신을 접종한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 평균 4.32 x 104 copies/mL로 상용 백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)과 유사한 수준을 나타냈으며, Challenge control그룹(G6)과 비교하여 유의적인 차이를 나타내었다. 반면, 직장 swab 시료에서는 비교적 낮은 수준을 나타내며 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
2-4. 병리학적 평가 결과
1) 육안적 병변 확인
실험종료일 63 DPV에 모든 그룹은 안락사를 진행하였으며, 개체별 폐와 림프절을 채취하여 육안적 병변을 확인하였다. 도 17a 내지 d에 나타낸 바와 같이 모든 시험 그룹에서 림프절의 종대 및 무게 변화에 대한 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, PBS를 접종한 Non-challenge control그룹(G7)과 비교하였을 때, Challenge control 그룹(G6)과 상용 백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)의 일부 개체에서 폐와 림프절 내 출혈과 유사한 병변이 나타나는 것을 확인하였다. 반면, PCV2b&d-ConCP그룹 (G4)에서는 특이할만한 병변이 확인되지 않았다.
2) 폐장의 조직학적 검사
돼지 폐장에서 관찰된 소견으로는 기관지 주변의 림프소절의 증식, 주로 기관지 및 혈관 주변에서 관찰되는 단핵염증세포침윤소, 간질성폐렴 등이 있었다.
기관지 주변의 림프소절(BALT)의 증식은 감염원에 의해 림프구의 증식이 촉진될 경우 수와 크기가 증가할 수 있으며, 반대로 감염원이 Lymphoid depletion을 유발할 경우 그 수와 크기가 감소할 수 있다. 따라서 본 시험에서 BALT에 미치는 영향을 비교하기 위하여 기관지 주변 림프소절의 빈도를 기초로 반정량적 분석과 BALT의 수를 count하여 그 결과를 각각 비교하였으며, 그 결과는 도 18 및 표 20에 나타내었다.
Histopathology G4
(PCV2b&d-ConCP) 		G5
(CircoFlex) 		G6
(Challenge control) 		G7
(Non-challenge control)
No. of animals (No. of examined tissues) 5(10) 5(10) 4(8) 3(6)
Lymphoid hyperplasia, BALT* 1.5±0.53 1.5±0.53 1.12±0.99 0.0±0.00
No. of lymphatic nodules 18.5±7.04 22.6±12.9 12.1±9.22 6.5±2.35
Inflammatory cell infiltration, multifocal* 1.10±0.32 1.2±0.42 1.88±0.83 1.83±0.41
Interstitial pneumonia, diffuse* 1.10±0.32 1.6±0.52 2.1±1.13 2.0±0.89
*, grading criteria; 1, minimal; 2, mild; 3, moderate; 4, severe
도 18에서 나타낸 바와 같이, 기관지 주변 림프소절(BALT)의 증식에 대한 육안적 및 반정량적 평가 결과, Non-challenge control그룹(G7)에 비하여 Challenge control그룹(G6)에서 BALT의 빈도가 다소 증가한 것으로 나타났으며, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex 그룹(G5)은 Challenge control 그룹(G6)에 비하여 평균적으로 좀 더 높았으나 Non-challenge control 그룹(G7)을 제외하고 그룹간의 유의할 만한 차이는 나타나지 않았다.
각 개체별로 두 개의 조직 절편에서 기관지 주변의 lymphoid nodules 수를 count하였고, 그 결과 도 19 및 20과 같이 Non-challenge control그룹(G7)에 비하여 Challenge control 그룹(G6)에서 lymphoid nodules 수가 증가하였으나 유의적인 차이는 없었다. 반면, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5)은 lymphoid nodules 수가 더욱 증가하며 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 PCV2의 감염이 돼지의 폐장에서 기관지 주변의 lymphoid nodules 증식을 다소 촉진하는 것으로 판단되었다. 이에 더하여 PCV2b&d-ConCP 백신 또는 CircoFlex 백신의 투여는 lymphoid nodules 증식을 다소 촉진할 수 있는 것으로 판단되었다. 따라서, lymphoid nodules 수가 증가함에 따라 더욱 많은 항원 자극을 수용하게 되며, 이는 B 세포의 활성화를 유도하여 조직 내 면역반응이 증가할 수 있다.
폐장 실질 내 혈관 및 기관지 주변에서 관찰되는 염증세포 침윤 결과를 확인하였고, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, Non-challenge control그룹(G7)과 Challenge control그룹(G6)에서 다소 심한 것으로 나타났으며, Non-challenge control 그룹(G7)에서의 염증 세포 침윤은 자연적으로 농장 내 산재되어 있는 다른 병원체들에 의한 염증 반응으로 생각되었다. PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5)에서는 상대적으로 낮았으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 하지만, 이와 같은 결과는 PCV2b&d-ConCP 백신과 CircoFlex 백신 투여에 의해 면역반응이 활성화되어 폐장에서의 염증이 다소 완화된 것으로 생각되었다.
또한 폐장 조직에서 PCV2에 대해 면역 염색하였고, 그 결과는 표 21, 도 22 및 도 23에 나타내었다.
Group ID BALT* No. lymphatic
nodules 		Inflammatory cell
infiltration* 		Interstitial pneumonitis, diffuse* Immunoreactivity to PCV2
G4
PCV2b&d-ConCP 		1-14-1 2 27 1 1 -
1-14-2 2 26 1 1 -
2-15-1 1 9 1 1 -
2-15-2 1 10 1 1 -
3-19-1 2 18 2 2 -
3-19-2 1 12 1 1 -
4-28-1 2 17 1 1 -
4-28-2 2 18 1 1 -
5-32-1 1 19 1 1 -
5-32-2 1 29 1 1 -
MEAN 1.5±0.53 18.5±7.04 1.1±0.35 1.1±0.32
G5
CircoFlex 		1-3-1 1 24 1 1 -
1-3-2 1 16 1 1 -
2-4-1 1 13 1 1 -
2-4-2 1 5 2 1 -
3-7-1 2 46 1 2 -
3-7-2 2 41 2 2 -
4-22-1 2 18 1 2 -
4-22-2 2 23 1 2 -
5-29-1 1 12 1 2 -
5-29-2 2 28 1 2 -
MEAN 1.5±0.53 22.6±12.9 1.2±0.42 1.6±0.52
G6
Challenge control 		1-6-1 2 27 2 1 1+
1-6-2 2 26 1 1 1+
2-8-1 0 6 1 1 -
2-8-2 0 5 1 2 -
3-20-1 0 4 2 2 3+
3-20-2 1 12 2 3 3+
4-31-1 2 9 3 3 3+
4-31-2 2 8 3 4 2+
MEAN 1.13±0.99 12.1±9.22 1.88±0.83 2.13±1.13
G7
Non-challenge control 		1-13-1 0 3 2 3 -
1-13-2 0 9 2 3 -
2-25-1 0 7 2 2 -
2-25-2 0 9 1 2 -
3-27-1 0 6 2 1 -
3-27-2 0 5 2 1 -
MEAN 0.0±0.00 6.5±2.35 1.83±0.40 2.0±0.89
표 21, 도 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, Challenge control 그룹(G6)에서만 PCV2 양성반응이 나타났으며, 검사한 4개체 중 3개체에서 PCV2 양성반응을 확인하였다. PCV2 양성반응은 주로 기관지와 혈관 주변에 침윤된 염증세포(조직구 또는 림프구)와 림프소절의 중심부와 간질성폐렴 내에서 산재하여 관찰되었다. Non-challenge control 그룹(G7)과 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5)의 폐장에서는 PCV2에 대한 양성반응이 확인되지 않았다.
3) 림프절의 조직학적 검사
- 림프절에서 이차림프소절 수의 변화
림프절에서는 PCV2의 감염에 의한 림프구의 괴사나 퍼져있는 림프조직에서 림프구 수에 있어 뚜렷하게 구별되는 변화는 관찰되지 않았고, 이차림프소절(secondary lymphatic nodule)의 수를 확인하였다. 림프절에 화농성염증소가 관찰된 예의 경우 결과 값에서 제외하였다. 이차림프소절의 수를 비교한 결과는 표 22 및 도 24에 나타내었다.
Group G4 G5 G6 G7
No. of animals (No. of tissue sections examined) PCV2b&d-ConCP CircoFlex Challenge control Non-challenge control
4(8) 4(8) 3(6) 3(6)
No. of lymphatic nodules 15.8±5.03 19.8±8.78* 13.0±6.74 10.6±6.65
Secondary lymphatic nodules were counted under x400 magnification at 2 different areas of two different sections.
*, significantly different from the uninfected control group at p<0.05.
표 22 및 도 24에 나타낸 바와 같이, 단위 시야당 형성된 이차림프소절의 수가 Challenge control 그룹(G6)에서 증가하는 경향을 나타내었으며, PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5)에서도 더욱 증가하는 경향을 확인하였다. 림프절에서 이차림프소절은 B세포 영역이므로 이차림프소절의 증가는 B세포가 활성화되었음을 시사한다. 또한, 항체가시험 결과와 비교하였을 때, 비백신 그룹보다 백신 접종을 실시한 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5)에서 더 높은 항체가가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
- PCV2의 검출
림프절에서 PCV2의 면역조직화학 염색을 실시하였다. 면역조직화학 염색 결과는 표 23, 도 25 내지 27에 나타내었다.
Group ID/Location Lymphatic nodules Other areas
G4
PCV2b&d-ConCP 		1-14 No positive cells No positive cells
2-15 No positive cells No positive cells
G5
CircoFlex 		3-19 No positive cells Some strong positive cells
4-28 No positive cells No positive cells
5-32 No positive cells No positive cells
1-3 No positive cells No positive cells
G6
Challenge control 		2-4 Many strong positive cells Quite a few strong positive cells
3-7 No positive cells No positive cells
4-22 No positive cells No positive cells
G7
Non-challenge control 		5-29 No positive cells No positive cells
1-6 Many strong positive cells Quite a few strong positive cells
2-8 Many strong positive cells Some strong positive cells
3-20 Many strong positive cells Quite a few strong positive cells
4-31 Many strong positive cells Some strong positive cells
1-13 No positive cells Some positive cells
2-25 No positive cells No positive cells
3-27 No positive cells Focally aggregated positive cells
표 23, 도 25 내지 27에 나타낸 바와 같이, 림프절에서 PCV2 항원 발현은 Challenge control 그룹(G6) 모든 개체에서 확인되었다. PCV2에 대한 양성반응은 주로 이차림프소절의 germinal center에서 강하게 나타났다. 개체에 따라서는 퍼져있는 림프조직과 속질(medulla) 부위에서 일부 양성세포들이 퍼져있는 형태로 관찰되기도 하였다. 하지만, 일부 개체에서의 퍼져있는 림프조직, 속질 부위에서의 국소적 양성 반응들은 Non-challenge control 그룹(G7)과 유의적인 차이가 나타나지 않아 유의미하지 않다고 판단하였다. Non-challenge control 그룹(G7)과 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)과 CircoFlex그룹(G5) 대부분의 개체들은 PCV2에 대한 면역염색에서 양성반응을 확인하지 못하였으나, CircoFlex그룹(G5) 1개체에서 Challenge control 그룹(G6)과 동일한 수준의 PCV2에 대한 양성반응이 나타나는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과로 보아 농장 내 산재되어 있는 PCV2 병원체로 인하여 일부 조직에서 국소적인 PCV2 양성반응이 나타났지만, Non-challenge control 그룹(G7)과 비교하였을 때 유의미한 결과는 아닌 것으로 나타내었다. 특히, 상용 백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)의 림프절에서 PCV2 양성반응이 나타난 것으로 보았을 때, PCV2b&d-ConCP 개발 백신 접종이 PCV2 감염에 대하여 더 효율적인 방어효능을 나타낼 것으로 생각하였다.
2-5. 주령별 체중 변화 및 평균 증체량(ADWG) 분석
1) 자돈 주령별 체중 측정
백신 접종 후 자돈의 주령별 평균 체중을 확인하였고, 그 결과는 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 7주령의 자돈에 백신 접종을 실시하였으며, 시험 기간 동안 1주 간격으로 모든 자돈의 체중은 측정하였다. 자돈의 주령별 체중 측정 결과, 공격접종 전(13주령)까지 모든 자돈의 체중 감소는 나타나지 않았으며, 공격접종 2주(15주령)에는 상용 백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)이 평균 33.0kg으로 체중이 가장 높게 유지되었다. 그러나 공격접종 3주(16주령)가 되었을 때 PBS를 접종한 Challenge control그룹(G6)은 평균 2.0 kg 감소하였고, 상용 백신을 접종한 CircoFlex그룹(G5)은 평균 0.6 kg의 체중 감소가 나타났다. 반면, 체중 감소가 나타나지 않은 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 평균 3.0 kg, Non-challenge control 그룹(G7)은 평균 5.9 kg이 증가하였다. 시험 종료 시 평균 체중은 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)이 35.2 kg으로 가장 높았으며, CircoFlex그룹(G5)은 32.44 kg, Challenge control그룹(G6)은 30.25 kg, Non-challenge control그룹(G7)은 34.33 kg으로 그룹 간 체중의 차이를 확인하였다.
2) 자돈의 일당증체량(ADWG) 분석
백신 접종 후 자돈의 일당증체량을 분석하였고, 그 결과는 표 24에 나타내었다.
Groups Average of daily weight gain (g)
0-6 DPV 6-9 DPV 0-9 DPV
PCV2b&d-ConCP 382.4±42.1 526.7±38.7 430.5 ± 36.3
CircoFlex 457.6±41.3 279.0±44.6 398.1 ± 34.4
Challenge control 368.5±45.7 361.9±82.2 366.3 ± 17.9
Non-challenge control 335.7±26.3 725.4±24.6 465.6 ± 23.1
표 24에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 이후(0-6DPV) 일당 증체량은 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)이 평균 382.4g으로 CircoFlex그룹(G5) 457.6g 보다 낮은 수준을 보였다. 그러나 공격 접종 이후(6-9DPV)에는 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)이 CircoFlex그룹(G5)보다 평균 247.7g 더 유의적으로 높은 수준의 일당증체량을 나타냈다(P<0.05). 시험전구간(0-9DPV)의 일당증체량에서도 PCV2b&d-ConCP그룹(G4)은 430.5g으로 CircoFlex그룹(G5) 398.1g 보다 더 높은 수준을 나타냈다. 한편 Challenge control그룹(G6)은 366.3g으로 가장 낮았으며, Non-challenge control그룹(G7)은 465.6g으로 가장 높은 수준의 일당증체량을 나타냈다.
종합적으로 본 발명자들은 돼지 써코바이러스 2b형 및 2d형에 대한 백신인 PCV2b&d-ConCP를 개발하고, 돼지에서 PCV2b 및 2d형 모두에 대해 우수한 IgG 항체가와 중화항체가를 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 PCV2b&d-ConCP 백신이 PCV2b와 PCV2d 두 유전형을 교차 방어가 가능하다는 것을 의미한다. 또한 PCV2d 공격접종 이후에도 대조군보다 유의적으로 높은 수준의 IgG 항체가와 중화항체가 유지하였으며, PBMC의 PCV2 감작에 대한 IFN-gamma의 상승, 바이러스 혈증의 미검출, 폐와 림프절 조직 및 비강, 직장 검체 시료에서의 유의적으로 낮은 수준의 PCV2 DNA copy수를 나타냈으며, 폐와 림프절의 육안적 병변이 발견되지 않았고, 조직화학염색법에서의 PCV2 항원 미검출, 시험종료일을 기준으로 시험그룹 중 가장 높은 평균체중과 유의적인 수준의 일당증체율의 증가 등의 결과로 미루어 볼 때 돼지 써코바이러스 관련 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 PCV2b&d-ConCP 백신은 양돈 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형(PCV2; Porcine circovirus type 2) 단백질을 코딩하는 핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 돼지 써코바이러스 2b형 및 2d형의 유전자가 재합성된 것인, 핵산.
  3. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질.
  4. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 돼지 써코바이러스 2형은 돼지 써코바이러스 2b형 또는 2d형인, 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병(Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이성 간증(dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인, 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 관절내(intra-articular) 투여, 활액내(intra-synovial) 투여, 수막강내 투여, 간내(intrahepatic) 투여, 병변내(intralesional) 투여 또는 두개강내(intracranial) 투여되는 것인, 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형에 대한 면역원성 조성물.
  9. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  10. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
  11. 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형의 감염성 질환의 예방 또는 치료방법.
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