KR20190014263A - 돼지 써코바이러스 2형(pcv2)의 orf2 재조합 유전자 및 이를 이용한 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자, 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .), 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 ORF2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로, 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자를 이용한 백신 조성물은 항체 생성 정도가 우수하여 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 치료 또는 예방 목적으로 이용이 가능하다.

Description

돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자 및 이를 이용한 백신 조성물{ORF2 recombinant gene of porcine circovirus type 2 and vaccine composition using the same}
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 2형(Porcine Circovirus type2, PCV2)는 원형의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은(17 nm) 정이십면체 비외피형 바이러스로서 지금까지 알려진 가장 작은 동물 바이러스 중 하나이다. PCV2 게놈의 길이는 약 1768 bp이다. PCV2는 PCV1(Porcine Circovirus type1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 하지만 일반적으로 비-병독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2에 감염된 돼지는 통상적으로 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome)이라고 하는 증상을 나타낸다. 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS)는 임상적으로 소모 (wasting), 피부의 창백함, 수척함, 호흡 곤란, 설사, 황달을 보이는 것이 특징이다. PCV2 감염 돼지를 부검시, 미시적 병변 및 육안 병변이 다수의 조직 및 기관에서 나타나는데, 림프 기관이 가장 흔한 병변 부위이다. PCV2에 감염된 돼지의 사망률은 80%에 이르며, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반한다. 따라서, PCV2의 감염을 예방할 수 있는 백신 치료제에 대한 필요성이 매우 크다.
PCV2는 오픈 리딩 프레임 1(open reading frame, ORF1) 단백질과 ORF2의 주된 두 가지의 단백질로 구성된다. ORF1은 바이러스의 복제를 담당하는 단백질을 암호화하고 ORF2는 약 30kDa의 분자량을 갖는 당단백질로서 바이러스의 유전체 핵산을 둘러싸는 캡시드를 암호화하고 있다(Mankertz et al., 1998; Nawagitgul et al., 2000). 비교적 새로운 단백질인 ORF3 단백질은 PCV2의 복제에는 연관이 없다고 알려져 있다.
한편, 기존의 곤충 세포를 이용한 재조합 PCV2 생산 방법은 배양액이 고가이며, PCV2 단백질의 분리, 농축을 위해 대규모의 분리 정제시설과 장비가 필요하여, PCV2 단백질 생산에 고비용이 소요되는 단점이 있다. 또한, 대장균을 이용한 PCV2 생산은 상대적으로 저비용이 소요되지만 낮은 단백질 발현율, 봉입체(inclusion bodies) 형성, 안정성 등이 문제가 되었다.
이에, 본 출원인은 상기 PCV2 생산의 고비용(곤충세포 시스템), 안정성(대장균 시스템) 문제를 개선하고자 예의 노력한 결과, 바실러스 서브틸리스를 기반으로 하는 PCV2 대량 생산 시스템이 안정적이고 연속적으로 재조합 PCV2 단백질 생산이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0113582호
본 발명의 목적은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자를 제공한다.
돼지 써코 2형 바이러스는 외피 비보유 단일가닥 원형 DNA 바이러스로, 이의 DNA는 ORF1과 ORF2로 구성되어 있으며 ORF2는 바이러스의 유전체 핵산을 둘러싸는 캡시드를 암호화한다.
상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자는 서열번호 1로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 코돈 최적화된 서열번호 2의 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자는 서열번호 1의 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 것이다. 도 1은 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2의 염기서열(서열번호 2)과 오리지널 PCV2의 ORF2의 염기서열을 비교한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 발현 효율을 높이기 위해 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 유전자(NCBI 등록번호 KT868120.1)의 염기서열을 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 맞도록 코돈 최적화했다. 코돈 최적화는 원래의 염기서열을 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 주로 사용되는 염기서열로 변경하는 방법으로 수행하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자에 해당하는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.
본 발명의 상기 재조합 벡터에는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자가 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 바실러스 서브틸리스 단백질 발현 벡터인 pLip DNA vector(Bioleaders crop)에 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 제조하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 제공한다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 상기 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환이라고도 한다.
본 발명에서 용어, "형질전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다. 본 발명의 형질전환체는 당업계에 공지된 형질전환에 이용될 수 있는 세포이면 제한없이 당업자에 의해 적절하게 선택되어 사용될 수 있으며, 인간을 제외한 형질전환체로, 미생물 유래의 형질전환체일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 형질전환체는 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에 형질전환하여 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 제조하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 배양하여, 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질을 분리 정제하여 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질을 제조할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
상기 돼지 써코 2형 바이러스는 외피 비보유 단일가닥 원형 DNA 바이러스로, 이의 DNA는 ORF1과 ORF2로 구성되어 있으며 ORF2는 캡시드(capsid) 단백질, ORF1은 복제(replication)에 관여하는 단백질이다. 캡시드 단백질은 면역에 관여하며 에피토프(epitope, 항원 결정기)가 있고, 바이러스 중화에 관여한다. 본 발명의 상기 ORF2 재조합 단백질은 캡시드 단백질에 해당하는 ORF2의 재조합 단백질로, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환을 예방 또는 치료용 백신 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 ORF2 재조합 단백질을 이용한 PCV2 백신 투여군에서 항체 생성 정도가 매우 높음을 확인하였으며, 상기 백신 조성물의 접종 후 4주차까지 항체가가 지속적으로 증가함을 확인하였는 바, 본 발명의 바실러스 서브틸리스에서 발현한 재조합 PCV2는 항체생성 효과를 나타내는 백신으로서, PCV2에 의해 발생하는 감염성 질환 예방 또는 치료용 백신으로 이용이 가능하다.
본 발명에서, 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환은 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명에서 용어, "ORF2 재조합 단백질", "바실러스 속 균주(Bacillus sp.)"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.
본 발명에서 용어, "면역원" 또는 "항원성 물질"은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.
상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 10 중량%일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "면역증강제"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요해 진다. 면역증강제를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제현탁액)에 따라 분류된다. 구체적으로, 콜레라 톡신(CT; cholera toxin), 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일이 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "ORF2 재조합 단백질", 바실러스 속 균주(Bacillus sp.)", "돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환", "예방"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 사료 조성물은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 사료 조성물은 사료첨가제 이외에, 개체의 유지와 성장을 위해 반드시 사료로부터 공급되어야 할 필수 영양소로서 에너지, 아미노산, 광물질, 비타민 및 물을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.
상기 사료는, 각종 사료, 기능성 사료, 음료, 사료 첨가제 및 음료(음수) 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
또한, 상기 사료 조성물에서, 상기 유효성분의 양은 사료 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "ORF2 재조합 단백질", 바실러스 속 균주(Bacillus sp.)", "돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환", "예방"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 사료에 첨가하여 생산성 향상이나 건강을 증진시킬 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물은 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자, 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .), 상기 ORF2 재조합 단백질 또는 상기 ORF2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로, 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자를 이용한 백신 조성물은 항체 생성 정도가 우수하여 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 치료 또는 예방 목적으로 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2의 염기서열(서열번호 2)과 오리지널 PCV2의 ORF2의 염기서열을 비교한 것이다.
도 2는 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 구축한 후, 재조합 벡터의 클로닝을 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 바실러스 서브틸리스에서 발현된 PCV2의 ORF2 단백질의 발현능을 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 에 형질전환된 재조합 벡터를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 바실러스 서브틸리스에서 발현된 PCV2를 FPLC를 이용하여 분리 정제된 재조합 PCV2 단백질을 확인한 결과이다.
도 6은 마우스에서 PCV2 백신 조성물에 의한 항체 생성능을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
< 실시예 1> PCV2의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF2 ) 유전자 코돈 최적화 및 합성
바실러스 서브틸리스에서 발현 효율을 높이기 위해 (Porcine Circovirus type2)의 ORF2 유전자(NCBI 등록번호 KT868120.1)의 염기서열을 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에 맞도록 코돈 최적화했다. 코돈 최적화는 원래의 염기서열을 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 주로 사용되는 염기서열로 변경하는 방법으로 수행하였다. 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자가 바실러스 서브틸리스에서 발현되는 경우 원래 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 도 1은 PCV2의 원래의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF2) 유전자 염기서열(서열번호 1)과 본 발명의 실시예 1의 코돈 최적화된 PCV2의 염기서열(서열번호 2: 서열 549bp)을 나타낸 것이다. 상기 코돈 최적화된 PCV2의 합성 유전자 양 말단에 하기의 실시예 2의 클로닝에서 사용할 제한효소 EcoRI과 HindIII 부위 및 poly histidine 서열을 추가하여 582bp의 뉴클레오타이드를 합성하였다.
< 실시예 2> 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2의 발현을 위한 pLip - PCV 재조합벡터 구축
실시예 1에서 획득된 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 단백질 발현을 위해서 바실러스 서브틸리스 단백질 발현 벡터인 pLip DNA vector(Bioleaders crop)에 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 하기 방법으로 클로닝하였다.
먼저, 상기 pLip의 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)에 적합한 제한 효소인 EcoRI와 HindIII들을 이용하여 합성된 코돈 최적화 유전자 PCV2의 ORF2를 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리 정제하였고, 상기 PCV2의 ORF2 DNA와 똑같은 제한 효소로 절단된 pLip(ECoRI/HindIII) 벡터를 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 PCV2의 ORF2와 pLip의 DNA를 3:1(45ng:15ng)의 비율로 T4 합성효소(ligase)를 이용하여 16℃에 18시간 동안 반응하여 접합하였다. 접합된 pLip-PCV DNA를 대장균인 DH5a에 열충격 방식으로 형질 전환하여, 암피실린(50ug/ml)이 첨가된 LB 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pLip-PCV 대장균(DH5a)을 선별하였다. 이후, 대장균에서 pLip-PCV의 DNA를 분리하였다.
재조합 발현벡터의 클로닝을 확인하기 위해서, 상기 분리된 pLip-PCV의 DNA를 주형으로 하여, 정방향 프라이머(AGAACCTTCGGGTAT: 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(TTAAGGCTTTAATGG: 서열번호 4)를 사용하여, PCR(중합효소연쇄반응)을 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 30회 반복 수행하여 얻어진 생성물을 1% 한천 겔에 전기 영동하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축한 후, 재조합 벡터의 클로닝을 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 전기영동을 통해 재조합 벡터의 정상적인 클로닝을 확인하였다. 이후, pLip-PCV가 형질 전환된 대장균(DH5a)에서 DNA 소량분리 키트(Qiagen)를 사용하여 pLip-PCV의 DNA를 분리하였고, 이를 이후 실시예 3에서 바실러스 형질 전환용 DNA로 이용하였다.
< 실시예 3> PCV2의 단백질이 발현되는 재조합 바실러스 서브틸리스의 제조
PCV2의 단백질이 발현되는 바실러스 균주를 제조하기 위해서 실시예 2에서 획득된 pLip-PCV의 DNA를 사용하였다. 형질 전환용 바실러스 균주의 제조를 위해서 Ito And Nagane(Ito M, Nagane M. 2001. Biosci Biotechnol Biochem. 65:2773-2775)의 방법에 따라 일렉트로 바실러스 서브틸리스(Electrocompetent Bacillus subtilis)를 제조하였다. 상기 pLip-PCV의 DNA 2ug을 형질전환용 일렉트로 바실러스 서브틸리스 (Electrocompetent Bacillus subtilis) 100ul에 첨가한 후, Gene-Pulser cuvette에 옮기고, Gene-Pulser(Bio-Rad)를 이용하여 형질 전환하였다. 카나마이신(50ug/ml)이 첨가된 LB 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pLip-PCV 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)를 선별하였다.
선별된 pLip-PCV를 함유하고 있는 형질 전환된 바실러스(B. subtilis)를 초음파로 파쇄한 후 pLip-PCV의 DNA를 miniprep-Kit(Qiagen)를 사용하여 획득하였고, 이를 주형 DNA로 이용하여 실시예 2에 기재된 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 PCR(중합효소연쇄반응)을 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 30회 반복 수행하여 얻어진 생성물을 1% 한천 겔에 전기 영동하여 pLip-PCV가 바실러스 서브틸리스에 형질전환됨을 확인하였다. 도 4는 바실러스 서브틸리스에 형질전환된 재조합 벡터를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
< 실시예 4> 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 PCV2 단백질 생산
상기 실시예 3에서 형질전환된 바실러스 서브틸리스의 PCV2 단백질의 생산을 확인하기 위하여 하기 표 1와 같이 바실러스 서브틸리스 배양용 배지를 제조하였다.
바실러스 서브틸리스 배양용 배지 구성성분의 조성
바실러스용 배양용 배지 (g/L)
펩톤 : 10
효모추출물 : 5
글루코스 : 10
K2HPO4 : 2
KH2PO4 : 2
MgSO4 : 0.1
상기 형질전환된 바실러스 서브틸리스 균주를 활성화하기 위해 시험관을 준비하고 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5mL를 분주하였다. 상기 형질전환된 바실러스 서브틸리스의 단일 콜로니를 상기 LB 배지에 접종하여 37℃, 200rpm으로 16시간 배양하였다. 이후, 플라스크를 준비한 후 카나마이신 50ug/mL을 함유하는 바실러스 서브틸리스 배양용 배지(표 1)를 플라스크에 각각 100ml씩 넣은 후 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종한 후 200rpm, 30℃에서 16시간 배양하여 본 배양을 실시하였으며, 형질 전환된 서브틸리스 균주에서 단백질을 분리하였다.
< 실시예 5> 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용한 바실러스 서브틸리 스에서 PCV2의 ORF2 단백질의 발현능 확인
상기 실시예 4에서 분리된 단백질을 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE 방법으로 확인하였다.
구체적으로, SDS-PAGE를 위해 시료를 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 80V의 전압으로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 Coomassie brilliant blue solution로 염색하고 Destaining solution으로 탈색하여 관찰하였다.
웨스턴 블롯팅은, SDS-PAGE 겔을 nitrocellulose membrane에 300mA로 2-3시간동안 트랜스퍼하였고, 블로킹을 위하여 TBS-T 완충액에 녹인 5% 스킴 밀크를 1시간 처리하였다. 1차 항체로 Santa Cruz사의 His-Probe mouse monoclonal IgG (Cat.No. SC-8036, 1:500)를 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. HRP-결합 2차 항체 역시 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, 15분씩 3번 세척하였다. 단백질을 HRP 검출 시약 키트(Novagen, Darmstadt, Germany)를 이용하여 시각화한 후, 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 바실러스 서브틸리스에서 발현된 PCV2의 ORF2 단백질의 발현능을 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 코돈 최적화 과정을 거치지 않은 PCV2의 ORF2 유전자를 이용할 때 바실러스 서브틸리스에서 단백질의 발현이 안되었지만(lane 2), 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용할 경우, 바실러스 서브틸리스에서 PCV2의 ORF2 단백질 생산 효율이 증가함을 확인하였다(lane 3). 따라서 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하여, 바실러스 서브틸리스를 배양하여 PCV2의 ORF2 단백질의 대량 생산이 가능하다.
< 실시예 6> 바실러스에서 생산된 재조합 인간 PCV2의 ORF2 단백질의 분리 정제
상기 실시예 4에서 제조된 재조합 PCV2의 ORF2 단백질을 분리-정제하기 위해서 250ml 용량의 저온원심분리기(한일, Supra 21K)를 이용하여 4℃, 6000rpm의 조건으로 30분간 처리하여, 바실러스 서브틸리스 배양액을 분리하였다. 상기 분리된 배양액을 동결 건조기(일신랩, FD5508S)를 이용하여 분말이 될 때까지 동결 건조하였다. 분말화된 시료를 binding buffer와 섞은 뒤 AKTA FPLC(Fast protein liquid chromatography) 시스템의 his-tag column (Histrap-GE Healthcare)에 통과시킨 뒤 elution buffer를 이용하여 분리정제 하였다. 분획된 재조합 PCV2의 ORF2 단백질을 확인하기 위해서 SDS-PAGE 분석을 수행하였으며, 결과를 도 4에 나타내었다. 도 5는 바실러스 서브틸리스에서 발현된 PCV2의 ORF2를 FPLC(Fast protein liquid chromatography)를 이용하여 분리 정제한 재조합 PCV2의 ORF2 단백질을 확인한 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 PCV2의 ORF2 단백질 분리 정제가 정상적으로 되었음을 확인하였다.
< 실시예 7> PCV2 백신 조성물의 제조 및 항체 생성능 확인
PCV2의 항체 형성여부를 확인하기 위해서 모델 동물인 마우스를 이용한 동물 실험으로 항체 생성 여부를 확인하였다. 상기 실시예 6에서 분리 정제된 PCV2의 ORF2 단백질을 어쥬번트(0.2% Carbopol)와 혼합하여 균질화 하였다. 마우스를 2개군으로 나누고 음성대조군에는 PBS를, PCV2 백신군에는 10ug/ml 농도로 근육 접종 하였다. 접종 2주 후, 4주 후 채혈하여 혈청을 분리하였다.
PCV2의 ORF2(0.1 ㎍)가 코팅된 플레이트에 5% BSA를 첨가하여 블로킹한 후, 다양한 농도로 희석시킨 각 군의 마우스로부터 채취한 혈청을 첨가한 후, 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, HRP가 표지된 goat anti-mouse IgG(Southern Biotech)를 첨가하고 1시간 반응시켰다. 마지막으로 PBS에 0.05% Tween을 첨가한 PBS-T 버퍼를 이용하여 3회 세척 후, 기질인 TMB(3,3',5,5'- tetramethylbenzidine; BD biosiences)를 첨가하여 20분간 암실에서 반응시키고, 0.5 N H2SO4 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤, 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 결과를 도 5에 나타내었다. 도 6은 마우스에서 PCV2 백신 조성물에 의한 항체 생성능을 확인한 결과이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, PCV2 백신 투여군에서 항체 생성 정도가 매우 높음을 확인하였으며, 백신 조성물의 접종 후 4주차까지 항체가가 지속적으로 증가함을 확인하였다.
이처럼, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 세포에서 발현한 재조합 PCV2는 항체생성 효과를 나타내는 백신으로서, PCV2에 의해 발생하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신으로 이용이 가능하다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
<110> KBNP, Inc. <120> ORF2 recombinant gene of porcine circovirus type 2 and vaccine composition using the same <130> DP20170124 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 549 <212> DNA <213> Porcine circovirus <220> <221> gene <222> (1)..(549) <223> ORF2 gene <400> 1 cgcaccttcg gatatactgt caagcgtacc acggtcacaa cgccctcctg ggcggtggac 60 atgatgagat ttaaacttga cgactttgtt cccccgggag gggggaccaa caaaatctct 120 ataccctttg aatactacag aataagaaag gttaaggttg aattctggcc ctgctccccc 180 atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc actgctgtta ttctagatga taactttgta 240 ccaaaggcca cagccctaac ctatgaccca tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc 300 ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac ttcacaccca aacctgttct tgactccact 360 attgattact tccaaccaaa taacaaaagg aatcagcttt ggctgaggct acaaacctct 420 agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac 480 tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca 540 cttaacccc 549 <210> 2 <211> 549 <212> DNA <213> Porcine circovirus <220> <221> gene <222> (1)..(549) <223> ORF2 recombinant gene <400> 2 agaacattcg gatatactgt aaaaagaact actgtcacta caccgtcttg ggcggttgat 60 atgatgcgtt tcaagttaga tgactttgta ccaccgggag gaggaacgaa taagatctct 120 atcccttttg agtactaccg tataagaaaa gtaaaagtag agttttggcc ttgcagtcca 180 attacacaag gagatcgtgg cgtaggaagt acggctgtaa tccttgatga taattttgtc 240 cctaaggcta cagccttaac gtacgaccct tacgtcaact acagctcaag acatactata 300 cctcagccat tttcatatca tagccgttac tttactccaa agccggtgct tgatagcacg 360 attgattatt ttcaaccaaa caataaaaga aatcagcttt ggcttcgtct tcaaacatct 420 cgcaatgtag accatgttgg acttggtact gcgttcgaaa actctaaata cgaccaagat 480 tataatatac gtgtaacgat gtacgtgcaa ttcagagagt tcaaccttaa agatccacca 540 ttaaagcct 549 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 agaaccttcg ggtat 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ttaaggcttt aatgg 15

Claims (10)

  1. 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자를 코돈 최적화한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것인, ORF2 재조합 유전자.
  3. 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질.
  4. 제1항의 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 속 균주(Bacillus sp .).
  6. 제5항의 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)를 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 단백질의 제조방법.
    의 제조방법.
  7. 제3항의 ORF2 재조합 단백질 또는 제5항의 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  9. 제3항의 ORF2 재조합 단백질 또는 제5항의 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  10. 제3항의 ORF2 재조합 단백질 또는 제5항의 바실러스 속 균주(Bacillus sp .)에서 분리된 ORF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물.
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