CN106456742A - 用于治疗(包括预防)细小病毒感染及相关疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一些实施方案包括本发明多肽(例如突变VP2蛋白)和由本发明多肽制备的病毒样粒子。本发明的其它实施方案包括用于治疗(例如，预防)细小病毒(例如，红细胞病毒或细小病毒B19)感染和其他疾病的组合物。其它实施方案包括用于向动物给药组合物的方法。其它实施方案包括治疗(例如，预防)细小病毒(例如红细胞病毒或细小病毒B19)感染和其它疾病。其他实施方案包括编码本发明多肽的核酸序列。还讨论了本发明的其它实施方案。

Description

用于治疗(包括预防)细小病毒感染及相关疾病的组合物和 方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2014年3月10日提交的美国临时申请61/950,623的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景
细小病毒(Parvovirus)是用于指细小病毒科中所有病毒的常用名称。红细胞病毒(Erythrovirus)是细小病毒科的一个属，其包括感染红细胞祖细胞的病毒。红细胞病毒和细小病毒可感染许多动物(例如哺乳动物，猪，犬，猫，灵长类，猴，以及人)。人红细胞病毒含有三种基因型(Servant-Delmas等，J Virol.(2010年10月)第84卷，第19期，第9658-9665页)。基因型1包括细小病毒B19(也称为红细胞病毒B19)和两个新的与前病毒B19有明显不同遗传特性(在整个基因组上>9％的核苷酸趋异性)的基因型。基因型2包括Lali株和A6株，基因型3a为V9株，基因型3b为D91.1株。在某些情况下，与基因型2或3的病毒感染相关的临床谱可以与细小病毒B19(基因型1)感染观察到的相似。
细小病毒B19(红细胞病毒属的一种)可以在胎儿和新生儿中引起严重的、有时是致命的疾病，例如胎儿水肿(hydrops fetalis)，宫内胎儿死亡和儿童的感染性红斑(erythema infectiosum)(第五疾病(fifth disease))。患有遗传性疾病(例如镰刀状细胞贫血(sickle cell anemia)或地中海贫血(Thalassemia))或获得性疾病(例如疟疾或贫血(anemia))的较大龄儿童和成人有发生细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(red cellaplasia)或死亡的风险。免疫缺陷、器官移植、或HIV患者中的慢性贫血导致细小病毒B19感染。细小病毒B19的一种细胞受体是血型P抗原，这是一种红细胞糖苷酯(globoside)，在红细胞前体(erythroid precursors)中表达并在成熟红细胞(RBC)上维持。到目前为止，尚无疫苗可用于预防人类红细胞病毒包括细小病毒B19的感染。因此，本发明的一些实施方案包括治疗(例如，预防或疫苗接种以抵抗)红细胞病毒感染(例如细小病毒B19感染和其他红细胞病毒)。
本发明的一些实施方案包括本发明多肽(例如突变的VP2蛋白)和由本发明多肽制备的病毒样粒子。本发明的其它实施方案包括用于治疗(例如，预防)红细胞病毒感染，包括细小病毒B19感染和其他疾病的多种组合物。其它实施方案包括治疗活跃的红细胞病毒感染(包括活跃的细小病毒B19感染)和其它疾病的方法。其它实施方案包括编码本发明多肽的核酸。本文还讨论了本发明的另外的实施例。
概述
本发明的一些实施方案包括包含相对于野生型VP2具有至少一个氨基酸修饰的VP2多肽的多肽。在一些情况下，至少一个氨基酸修饰是插入，缺失或取代。在其它情况下，野生型VP2具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽形成mVLP，其在一些实例中相对于wtVLP具有降低的对P抗原的结合能力。在其他实施方案中，氨基酸修饰在三次对称的轴(three-fold axis)的凹部中或附近。在其它实施方案中，氨基酸修饰选自环3中的取代，环4中的取代，环3上游的取代，环4上游的取代，或其组合。在其它实施方案中，氨基酸修饰是在Y401处的取代，在Q399处的取代，在Q400处的取代，在Q404处的取代，在Q368处的取代，在Q369处的取代，在Y392处的取代，或其组合。在一些情况下，氨基酸修饰也可以是Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。在一些实施方案中，野生型VP2是来自细小病毒B19的野生型VP2。在一些方面，多肽选自构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W，以及构建体X。在其他实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO：1有至少90％同一性。
在本发明的一些实施方案中，mVLP包含如本文所述的任何突变体VP2。在其它实施方案中，mVLP具有比wtVLP减少的与P抗原的结合，mVLP与P抗原没有可检测的结合，mVLP具有比wtVLP减少的红细胞血凝(hemagglutination)，或mVLP没有可检测的血凝。在其它实施方案中，mVLP具有一个或多个中和表位。在另外的实施方案中，mVLP在动物中诱导抗体(例如高滴度的抗体)的生成，其中所生成的抗体能减少或抑制wtVLP血凝。
本发明的一些实施方案包括包含本文所述任何mVLP的组合物。在一些情况下，所述组合物包含约0.0001％(总组合物重量)至约99％的mVLP量。在一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含佐剂(adjuvant)或载物(carrier)。本发明的多个方面还包括包含本文所述任何mVLP的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含约0.0001％(总组合物重量)至约50％的mVLP量。在一些情况下，药物组合物可以进一步包含佐剂或载物。在一些实施方案中，疫苗包含本文所述的任何mVLP。在一些实施方案中，疫苗可包含约0.0001％(以总组合物的重量计)至约50％的量的mVLP。在其他情况下，疫苗还包含佐剂或载物。在一些实施方案中，疫苗还包含角鲨烯(squalene)，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶(alum hydro gel)，单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)，海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。在另一些实施方案中，疫苗不包含佐剂。
本发明的一些实施方案包括给动物提供mVLP的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含本文所述任何mVLP的组合物，其中如果存在多于一次给药，组合物可以相同或不同。在一些方面，所述一种或多种组合物不包含佐剂。在其它方面，一种或多种组合物还包含载物，佐剂，角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax或其组合。在其它实施方案中，所述一种或多种组合物包含(a)本文所述的任何组合物，(b)本文所述的任何药物组合物，或(c)本文所述的任何疫苗。在其它实施方案中，一种或多种给药可以包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部(topical)给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。在一些情况下，如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其它给药的组合物。在其它实施方案中，将所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给药于动物。在一些情况下，所述动物是人或灵长类动物。
本发明的一些实施方案包括治疗动物的细小病毒感染、与细小病毒感染相关的疾病、红细胞病毒感染、与红细胞病毒感染相关的疾病、细小病毒B19感染、或与细小病毒B19感染相关的疾病的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含本文所述任何mVLP的组合物，其中如果存在多于一次给药，所述组合物可以相同或不同。在一些方面，所述一种或多种组合物不包含佐剂。在其它方面，所述一种或多种组合物还包含载物，佐剂，角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。在其它实施方案中，所述一种或多种组合物包含(a)本文所述的任何组合物，(b)本文所述的任何药物组合物，或(c)本文所述的任何疫苗。在其它实施方案中，一种或多种给药可以包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。在一些情况下，如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其它给药的组合物。在其它实施方案中，将所述一种或多种组合物中至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mgmVLP/kg动物体重的量给药于动物。在一些情况下，所述动物是人或灵长类动物。在其他实施方案中，所述动物需要治疗。一些实施方案包括治疗动物的红细胞病毒感染、与红细胞病毒感染相关的疾病、细小病毒B19感染、或与细小病毒B19感染相关的疾病的方法。在另一些实施方案中，所述方法用于治疗红细胞病毒感染，细小病毒B19感染，与红细胞病毒感染相关的疾病，与细小病毒B19感染相关的疾病，胎儿水肿宫内胎儿死亡，感染性红斑(即第五疾病)，镰刀状细胞贫血，地中海贫血，贫血，由疟疾引起的贫血，细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(TRCA)，慢性贫血，急性关节病，持续性关节病，再生障碍危象，关节炎，肝炎，心肌炎，肝脾肿大，系统性红斑狼疮，脑膜脑炎(meningiencephalitis)，纤维肌痛。在一些实施方案中，所述方法诱导免疫应答，是疫苗接种，是预防性治疗，是治疗性治疗(therapeutictreatment)，或是其组合。
本发明的一些方面包括用于在动物中诱导免疫应答的方法，其包括一次或多次给药一种或多种包含本文公开的任何mVLP的组合物，其中如果存在多于一次给药，则所述组合物可以相同或不同。在一些方面，所述一种或多种组合物不包含佐剂。在其它方面，一种或多种组合物还包含载物，佐剂，角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。在其它实施方案中，一种或多种组合物包含(a)本文所述的任何组合物，(b)本文所述的任何药物组合物，或(c)本文所述的任何疫苗。在其它实施方案中，一种或多种给药可以包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。在一些情况下，如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其它给药的组合物。在其它实施方案中，将所述一种或多种组合物中至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给药于动物。在某些情况下，所述动物是人或灵长类动物。在其他实施方案中，所述动物需要治疗。在其他实施方案中，该方法预防或缓解未来的感染。
本发明的一些实施方案包括用于给动物接种以抵抗细小病毒感染、红细胞病毒感染、或细小病毒B19感染的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含本文公开的任何mVLP的组合物，其中如果有一个以上的给药，所述组合物可以相同或不同。在某些方面，所述一种或多种组合物不包含佐剂。在其它方面，一种或多种组合物还包含载物，佐剂，角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。在其它实施方案中，一种或多种组合物包含(a)本文所述的任何组合物，(b)本文所述的任何药物组合物，或(c)本文所述的任何疫苗。在其它实施方案中，一或多次给药可以包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。在一些情况下，如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其它给药的组合物。在其它实施方案中，将所述一种或多种组合物中至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给药于动物。在某些情况下，动物是人或灵长类动物。在其他实施方案中，动物对细小病毒感染、红细胞病毒感染、或细小病毒B19感染是易感的。在其它实施方案中，所述方法用于针对红细胞病毒感染或细小病毒B19感染进行疫苗接种。在其他实施方案中，该方法预防或缓解未来的感染或未来的疾病。
本发明的一些实施方案包括用于产生本文所述任何多肽的方法，包括：培养宿主细胞，所述细胞用包含编码所述多肽的核酸序列的载体转染，以提供表达；然后回收所述多肽。在一些实施方案中，所述载体的制备包括用RNA逆转录或从头合成。在其他方面，宿主细胞是昆虫细胞(例如Sf9细胞)或哺乳动物细胞。其它实施方案包括编码选自下组的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ IDNO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；和SEQID NO:26。
本发明的一些实施方案包括用于产生本文所述任何mVLP的方法，包括：培养用包含编码本发明多肽的核酸序列的载体转染的宿主细胞，以提供本发明多肽的表达；然后回收mVLP。在一些实施方案中，所述载体的制备包括用RNA逆转录或从头合成。在其他方面，宿主细胞是昆虫细胞(例如Sf9细胞)或哺乳动物细胞。其它实施方案包括编码选自下组的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；和SEQ ID NO:26。
本发明的一些实施方案包括编码本文所述任何多肽的核酸分子。在其它实施方案中，编码多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ IDNO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ IDNO:25；和SEQ ID NO:26。在其他实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同一性。在其他实施方案中，所述核酸分子在细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、人细胞、或Sf9昆虫细胞中。在其它实施方案中，核酸分子被包括在载体(vector)或质粒中。本发明的一些实施方案包括包含编码本文所述任何多肽的核酸分子的载体。
本文还讨论了本发明的其它实施例。
附图的简要描述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的描述，可以更好地理解本发明。
图1：突变的预计效果的实例，所述突变位于三次对称的轴(three-fold axis)的凹陷处的P抗原结合口袋上。(A)利用Kaufmann et al.2004(PNAS,August 4,2004,Vol.101,No.32,pp.11628-11633)的X-线晶体结构，展示了B19病毒的完整衣壳，三个酪氨酸用空间填充模型展示。(B)将图1A中的P-抗原结合位点放大，几个酪氨酸用空间填充模型展示(KEYQQ显示为红色，TYFPN显示为黄色，QQYTDQ显示为绿色)。(C)显示B19野生型VLP的预测的P-抗原结合口袋(QQY401TDQ)。(D)显示B19mVLP的P-抗原结合口袋的预测的改良结构，带有突变Y401→F401(构建体A)；圈出了三次对称的轴上三个突变残基中的一个。
图2：B19wtVLPs和mVLPs的电子显微照片。所有电子显微照片具有约72,000X～75,000X的放大倍数。(A)野生型VLP的显微照片。在实施例章节，野生型VLPs仅由野生型B19VP2蛋白制得；不包括其它蛋白。在实施例章节，野生型B19VLP称为wtVLP，也称野生型B19VLP。(B)由构建体A制得的mVLPs的显微照片。在实施例章节，突变的VLP称为mVLP，也称突变的VLP和突变的B19VLP。(C)由构建体B制得的mVLPs的显微照片。(D)由构建体D制得的mVLPs的显微照片。(E)由构建体E制得的mVLPs的显微照片。(F)由构建体F制得的mVLPs的显微照片。(G)由构建体F制得的mVLPs的显微照片。(H)由构建体G制得的mVLPs的显微照片。(I)由构建体H制得的mVLPs的显微照片。由构建体A、B、F、或G制得的mVLPs在形态上与wtVLPs相同。
图3：用人类O型血红细胞进行的血凝试验。进行血凝试验(HA)以确定P抗原结合能力。C-：HA阴性对照，加ADPBS[白蛋白-右旋糖PBS]而不是加wtVP2或mVLP。C+：HA阳性对照，加wtVLP。
图4：兔和小鼠的抗VLP多克隆抗体的血凝抑制试验(HIA)。用血凝抑制试验(HIA)确定小鼠和家兔体内产生的抗wtVLPs或抗mVLPs多克隆抗体对血凝反应的抑制作用。
图5：P抗原结合的卡通画示意图。不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了B19病毒体、B19wtVLP、以及一例B19mVLP代表例与红细胞表面上P抗原结合(或无法结合)的实施方案。
图6：血凝现象的卡通画示意图。(A)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了可以在B19感染性病毒和红细胞(RBCs)之间发生以形成血凝作用的反应的实施方案，所述反应有可能在体内发生。(B)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了野生型B19VLPs之间可以发生的反应的实施方案，所述野生型B19VLPs保留了能与RBCs表面P抗原结合的配体，所述反应使得RBCs聚集，阻止B19VLPs被呈递给B细胞。(C)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了B19mVLPs之间可以发生的反应的实施方案，因不能与RBCs表面P抗原结合，导致有丰富的游离B19mVLPs能被呈递给B细胞。
发明详述
细小病毒是用于指细小病毒科中所有病毒的常用名称。红细胞病毒是细小病毒科(Parvoviridae family)的属，其含有感染红细胞祖细胞的病毒。红细胞病毒和细小病毒可以感染许多动物(例如哺乳动物，猪，犬，猫，灵长类，猴和人)。人类红细胞病毒包含三种基因型(Servant-Delmas等，J Virol.(2010年10月)第84卷，第19期，第9658-9665页)。基因型1包括细小病毒B19(也称为红细胞病毒B19)和两个新的与前病毒B19有明显遗传差异(全基因组有>9％的核苷酸趋异性)的基因型。基因型2包括Lali株和A6株，基因型3a有V9株，基因型3b有D91.1株。在一些情况下，基因型2或3病毒感染的相关临床谱可以与细小病毒B19(基因型1)感染观察到的相似。细小病毒表现为有2-4个多肽，包括VP1和VP2衣壳多肽；红细胞病毒也表现为有VP2衣壳多肽。细小病毒B19在其衣壳中包括VP2多肽。
细小病毒B19由约5.6kb单链基因组DNA(NCBI序列号NC_000883.2)组成，其编码一种非结构蛋白(NS1)、两种结构蛋白(VP1和VP2)、以及7.5和11KD的蛋白。跨nt 2624到nt4969的多个基因编码VP1(次要)和VP2(主要)衣壳蛋白。VP2蛋白(58KD)与VP1的C末端重叠，并且由至少95％的衣壳组成。VP1蛋白(81KD)比VP2长227个氨基酸，仅由5％的衣壳蛋白组成。P抗原是细小病毒B19的细胞受体；Ku80自身抗原和α5β1整合素是细小病毒B19进入细胞时的共同受体。在一些情况下(例如参见图5和图6)，细小病毒B19的P抗原结合可导致血细胞凝集，因此可阻断B细胞接近细小病毒B19；在一些情况下，这种不能接近可以防止免疫应答。
本发明的多肽、核酸分子和组合物
本发明的一些实施方案包括包含VP2多肽的本发明多肽，其中所述VP2多肽相对于野生型VP2(“wtVP2”)具有至少一个氨基酸修饰。术语“VP2多肽”包括突变的VP2多肽(例如对wtVP2多肽有一个或多个修饰)和wtVP2多肽。在一些实施方案中，wtVP2多肽可以是来自细小病毒的野生型VP2多肽、来自红细胞病毒的野生型VP2多肽、或来自细小病毒B19的野生型VP2多肽。在一些情况下，一个或多个修饰可包括插入、缺失、取代、或其组合。在一些实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可以位于由本发明多肽形成的VLP中的三次对称轴的凹部内或靠近该凹部(例如，靠近可以是约约约约约约约约约约小于约或小于约的距离)。在一些方面，对wtVP2的一个或多个修饰可包括环3中的取代、环3中的缺失、环4中的取代、环4中的缺失、环3上游的取代、环3上游的缺失、环4上游的取代、环4上游的缺失、或其组合。在一些实施方案中，本发明多肽不包括天然存在的多肽。
除非另有说明，本文所用的术语“上游”是指相对于wtVP2中参考氨基酸或二级结构而言的氨基酸位置(例如，氨基酸398的上游或环3的上游)；该相对位置可以是距离所述参考氨基酸或二级结构有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个氨基酸。该相对位置可以是距离参考氨基酸或二级结构约1至约35个，约5至约30个，约10至约25个，约12至约20个，或约14至约18个氨基酸。该相对位置可以是距离参考氨基酸或二级结构至少约1个，至少约5个，至少约10个，至少约20个，不超过约20个，不超过约25个，不超过约30个，或不超过约35个氨基酸。
在一些实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可包括取代或缺失一个或多个暴露于(例如，处在能与其它分子相互作用的可接近状态)或部分暴露于wtVLP或病毒体如B19病毒体的外表面(例如，位于P抗原结合位点)的氨基酸。在一些实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可包括GLN43,LEU45,ILE46,PRO47,TYR48,ASP49,PRO50,GLU51,HIS52,HIS53,TYR54,LYS55,VAL56,PHE57,PRO59,ALA60,ALA61,SER62,SER63,CYS64,HIS65,ASN66,ALA67,SER68,GLY69,LYS70,GLU71,ALA72,LYS73,VAL74,CYS75,THR76,ILE77,THR78,ILE80,SER84,THR85,PRO86,ASP130,VAL131,THR132,ASP133,LYS134,THR135,GLY136,GLY137,GLY138,VAL139,GLN140,VAL141,THR142,ASP143,ASP168,THR169,LEU170,ALA171,PRO172,GLU173,LEU174,PRO175,ILE176,TRP177,VAL178,TYR179,PHE180,PRO182,GLN183,LEU187,VAL189,GLY190,ASP191,VAL192,ASN193,THR194,GLN195,GLY196,ILE197,SER198,GLY199,ASP200,SER201,LYS202,LYS203,LEU204,SER206,GLU207,GLU208,PHE211,ASN241,GLU243,CYS245,HIS248,TYR250,GLU251,TYR253,PRO255,LEU256,TYR257,GLY258,ARG260,GLY262,VAL263,PRO264,ASP265,THR266,LEU267,GLY268,GLY269,PRO271,PHE273,ARG274,SER275,LEU276,THR277,HIS278,GLU279,ASP280,HIS281,ALA282,ILE283,GLN284,SER298,THR299,LYS300,GLU301,GLY302,ASP303,SER304,SER305,ASN306,THR307,GLY308,ALA309,GLY310,LYS311,ALA312,LEU313,THR314,LEU316,SER321,GLN322,ASN323,THR324,ARG325,ILE326,SER327,HIS338,HIS339,TRP340,ASP341,THR342,ASP343,LYS344,TYR345,VAL346,THR347,ILE349,HIS354,GLY355,GLN356,THR357,THR358,TYR359,GLY360,ASN361,ALA362,GLU363,ASP364,LYS365,GLU366,TYR367,GLN368,GLN369,GLY370,VAL371,PHE374,PRO375,ASN376,GLU377,LYS378,GLU379,LEU381,GLN383,LEU384,GLN385,GLY386,ASN388,MET389,HIS390,TYR392,PHE393,PRO394,ASN395,LYS396,GLY397,THR398,GLN399,GLN400,TYR401,THR402,ASP403,GLN404,ILE405,GLU406,ASN416,ARG417,ALA419,GLU423,LYS459,ILE460,PRO462,SER464,PRO466,ILE467,GLY468,GLY469,ILE470,LYS471,SER472,MET473,GLY474,ILE475,THR476,THR477,LEU478,VAL479,TYR481,ARG502,TRP503,GLN506,PRO507,GLY508,VAL509,TYR510,PRO512,HIS513,ALA514,ALA515,GLY516,HIS517,LEU518,LEU522,TYR523,ASP524,PRO525,THR526,ALA527,THR528,ASP529,ALA530,LYS531,GLN532,HIS533,HIS534,ARG535,GLY537,TYR538,GLU539,LYS540,PRO541,GLU542,GLU543,LEU544,TRP545,THR546,LYS548,SER549,ARG550,VAL551,HIS552,PRO553,LEU554,或它们的组合。
在一些实施方案中，一个或多个修饰可发生在wtVP2(例如，B19wtVP2)结合位点或病毒体(例如B19病毒体)结合位点，例如P抗原结合位点。在一些情况下，对wtVP2的一个或多个修饰可包括在Y401处的取代，在Y401处的缺失，在Q399处的取代，在Q399处的缺失，在Q400处的取代，在Q400处的缺失，在Q404处的取代，在Q404处的缺失，在Q368处的取代，在Q368处的缺失，在Q369处的取代，在Q369处的缺失，在Y392处的取代，在Y392处的缺失，或其组合。在其它实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可包括Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。在其它实施方案中，本发明的多肽是构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W，或构建体X(参见表1)。
在一些实施方案中，本发明的多肽可以具有与wtVP2有以下氨基酸序列同一性的多肽序列：约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％。在一些实施方案中，本发明的多肽序列与SEQ ID NO：1有以下的氨基酸序列同一性：约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％。氨基酸序列同一性(例如，百分比同一性)可以通过任何合适的方法确定，例如使用BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign软件。除非另有说明，氨基酸序列同一性(例如，百分比同一性)用BLAST-2测定。
在一些实施方案中，由本发明多肽制备的mVLP相对于wtVLP具有降低的对P抗原的结合能力。在其他实施方案中，由本发明多肽制备的mVLP没有可测量的与P抗原的结合。
本发明的一些实施方案包括可编码本发明多肽的核酸分子。在某些实施方案中，所述核酸分子包括在载体或质粒中。在某些实施方案中，所述核酸分子位于细胞中，例如昆虫细胞(例如Sf9)或哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)。
在一些实施方案中，所述核酸分子序列与wtVP2有约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核酸分子序列与SEQ ID NO：2有约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％的序列同一性。核酸序列同一性(例如，百分比同一性)可以通过任何合适的方法测定，例如使用BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，或Megalign软件。除非另有说明，核酸序列同一性(例如百分比同一性)用BLAST-2测定。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码本发明的多肽，所述多肽具有对wtVP2的一个或多个修饰，所述修饰可以是在由本发明多肽形成的VLP中的三次对称轴的凹部中或靠近该凹部(例如，靠近可以是约约约约约约约约约约小于约或小于约的距离)。在一些方面，所述核酸分子编码本发明的多肽，所述多肽具有对wtVP2的一个或多个修饰，所述修饰可以包括环3中的取代，环3中的缺失，环4中的取代，环4中的缺失，环3上游的取代，环3上游的缺失，环4上游的取代，环4上游的缺失，或其组合。在一些情况下，所述核酸分子编码本发明多肽，其具有对wtVP2的一个或多个修饰，所述修饰可包括在Y401处的取代，在Y401处的缺失，在Q399处的取代，在Q399处的缺失，在Q400处的取代，在Q400处的缺失，在Q404处的取代，在Q404处的缺失，在Q368处的取代，在Q368处的缺失，在Q369处的取代，在Q369处的缺失，在Y392处的取代，在Y392处的缺失，或其组合。在其它实施方案中，所述核酸分子编码本发明多肽，其具有对wtVP2的一个或多个修饰，所述修饰可包括Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。在其它实施方案中，所述核酸分子编码本发明的多肽，其是构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W，或构建体X(参见表1)。
由于可以在本发明的核酸分子和/或多肽的结构中进行修饰或改变，而获得具有相似或改进特征的分子，故这样的生物功能等同物也包括在本发明的一些实施方案中。在某些情况下，生物功能等同物可包含经过改造而含有不同序列同时保留编码期望的本发明多肽的能力的核酸。这可以由于编码相同氨基酸的遗传密码的简并性(即，存在多个密码子)而实现。在一个实例中，本领域普通技术人员可能希望将限制性内切酶识别序列引入核酸序列中，同时不干扰多核苷酸编码蛋白质的能力。
在另一个实例中，所述核酸分子可以被改造成含有某些序列，导致(并编码)具有更显著变化的生物功能等同物。在一些实施方案中，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不明显丧失所需功能，该功能例如突变型VP2蛋白之间的分子间相互作用，mVLP的形成，mVLP的P-抗原结合的减少，mVLP血凝反应的减少，mVLP的中和表位，或mVLP中和表位对抗体的诱导。所谓的“保守”变化不破坏蛋白质的所需生物活性，因为该结构变化不影响蛋白质执行其所需功能的能力。本发明的一些实施方案包括可以在本文公开的核酸分子序列和多肽序列中进行的各种改变。
就功能等同物而言，本领域普通技术人员都理解，“生物功能等同的”多肽或多核苷酸的定义中固有的概念是，在该分子指定部位进行改变但同时保留目标生物活性的可接受水平时，所述改变的数量是受限制的，这里提到的目标生物活性的可接受水平例如突变型VP2蛋白之间的分子间相互作用、mVLP形成、mVLP的P-抗原结合的减少、mVLP血凝的减少、mVLP的中和表位、或mVLP中和表位对抗体的诱导。因此，生物功能等同物在本文中定义为一些多肽(和核酸分子)，在它们的结构中指定的氨基酸(或密码子)可能已被取代。
通常，分子的长度越短，能在分子中进行的保持功能的变化越少。较长的域可以具有中间数量的改变。全长蛋白质最能耐受较大量的变化。然而，必须认识到，高度依赖于结构的某些分子或域可能只容许很少的修饰或不容许有修饰。
氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状或类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸或组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸都具有相似的大小；或者，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸都具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸或组氨酸；丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；或者，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；在本文中定义为生物功能等同物。其它氨基酸虽然在此不分组归类，但也可能提供功能等同的多肽。
氨基酸的疏水指数(hydropathic index)也可以考虑。每个氨基酸按其疏水性或电荷特性分配了一个疏水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；或精氨酸(-4.5)。氨基酸疏水指数可用于体现(confer)蛋白质在相互作用方面的生物功能。在一些情况下，某些氨基酸可以取代为具有相似疏水指数或分数或仍保持相似生物活性的其他氨基酸。在基于疏水指数进行改变时，可以用疏水指数在±2以内或±1以内或±0.5以内的氨基酸取代。
相似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行，特别是在由此产生的生物功能等同多肽或肽打算用于免疫学实施方案中时，如在本发明的某些实施方案中那样。美国专利4,554,101指出，多肽的最大局部平均亲水性受其邻近的各个氨基酸的亲水性掌控，该最大局部平均亲水性可与其免疫原性或抗原性(即，与该多肽的生物特性)关联。
如美国专利4,554,101中详述，各氨基酸残基分配了以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水值进行改变时，可以用亲水值在±2以内、或±1以内、或±0.5以内的氨基酸进行取代。
保守取代的序列是指，指定的氨基酸残基被具有相似理化特性的残基替代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如Ile、Val、Leu或Ala彼此的取代，或一个极性残基取代另一个，例如Lys与Arg、Glu与Asp、或Gln与Asn之间的取代。其他这样的保守取代包括例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代。
尽管讨论集中于由氨基酸变化产生的功能等同多肽，但是应当理解，这些变化可以通过改变编码DNA来实现；还应考虑到遗传密码是简并性的，两个或多个密码子可以编码相同的氨基酸。下面提供了氨基酸及其密码子的列表，用于这类实施方案中，以及用于其他用途，例如探针和引物的设计等等。
表A和B.氨基酸的命名和密码子列表
术语“功能等同的密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，还指编码生物学等同的氨基酸的密码子(参见上述密码子列表)。
还将理解，氨基酸和核酸序列可以包括另外的残基(例如另外的N端或C端氨基酸或5'或3'序列)但仍然基本上就是本文公开的一个序列，只要该序列满足上述标准，包括考虑多肽表达后维持生物活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，例如可以在编码区的5'或3'侧翼包括各种非编码序列，或者可以包括已知在多种基因中会出现的各种内部序列(即，内含子)。
本发明在一些方面有赖于肽和多肽在细胞中的(in cyto)合成，其通过对合适的多核苷酸进行转录和翻译来实施。这些肽和多肽将包括二十个“天然”氨基酸，及其翻译后修饰。然而，体外肽合成允许使用修饰的或不常见的氨基酸。示例性但非限制性的修饰或不常见氨基酸的列表提供在表C中。
本发明公开的主题还包括产生包含VP2多肽突变体的多肽(或VLP，包括自我装配成VLP的多肽)的方法。真核表达系统包括基于植物的系统；借助重组杆状病毒的昆虫细胞系统；借助重组杆状病毒的全昆虫系统；遗传改造的酵母系统，包括但不限于糖酵母物种(Saccharomyces sp)和毕赤酵母物种(Picchia spp)；以及哺乳动物细胞系统，包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞或通常用于重组蛋白的工业规模表达的其它细胞系。在一些实施方案中，有用的基于植物的表达系统可以包括转基因植物系统。在一些实施方案中，有用的基于植物的表达系统可以包括叶绿体转基因植物系统(transplastomic plant systems)。
在一些实施方案中，产生本发明多肽(其可以自我组装成VLP)的方法包括，提供含有本文所述多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸在表达编码多肽的条件下与启动子可操作地连接；并从宿主细胞中回收多肽。
一种或多种VP2多肽突变体可以是组合物的一部分，并且其含量可以是(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，或不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
一种或多种VP2多肽突变体可以纯化或分离至含量为(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。本发明的一些实施方案包括包含一种或多种VP2多肽突变体的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物组合物(例如疫苗)，例如适合给药于动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴，人，犬，猪，小鼠，兔，或大鼠)的组合物。
病毒样粒子和组合物，包括药物组合物
在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽可以形成病毒样粒子。如本文所定义，除非另有说明，“VLP”是病毒样粒子。VLP是包含来自病毒的外包层(例如衣壳)的一种或多种多肽的小粒。VLP不含有来自病毒的任何遗传物质，因此不会引起感染。在一些情况下，VLP可用于制备疫苗。一些病毒结构蛋白(例如，包膜或衣壳蛋白)的表达可导致VLP的自我组装。如本文所定义，除非另有说明，“wtVLP”(也称为“野生型VLP”)是仅由VP2蛋白(即，无VP2氨基酸序列的修饰)制备的VLP；wtVLP不包括除VP2以外的任何其它蛋白质(即，不包括VP1)。如本文所定义，除非另有说明，“mVLP”(也称为“突变的VLP”)是由本发明多肽形成的病毒样粒子，其中本发明多肽相对于野生型VP2具有至少一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，mVLP在形态上可以与wtVLP相似(例如，如用电子显微镜所确定的)。在一些实施方案中，mVLP可以具有比wtVLP降低的与P抗原的结合(例如，如用血凝试验测量的)。在一些实施方案中，mVLP可以没有可检测的与P抗原的结合(例如，如用血凝试验测量的)。在其他实施方案中，mVLP具有比wtVLP降低的红细胞血凝反应(例如，如用血凝试验测定的)。在其他实施方案中，mVLP没有可检测的血凝反应(例如，如用血凝试验测定的)。在某些实施方案中，mVLP可以具有能通过任何合适方法(例如，如用血凝抑制试验的)确定的一个或多个中和表位(例如，构象表位)。在一些实施方案中，表位是mVLP表面上能够引发免疫应答的区域(例如，mVLP中的构象变化可以产生或诱导表位的出现)；在某些实施方案中，中和表位是可诱导对mVLP，wtVLP，细小病毒，红细胞病毒，B19细小病毒或其组合的免疫应答的表位(例如，构象表位)。在一些实施方案中，所述表位由mVLP中能激发免疫应答的一或多个mVP2(例如，mVLP表面的一或多个VP2)的构象变化来创建；在某些实施方案中，中和表位是由能诱导针对mVLP、wtVLP、细小病毒、红细胞病毒、B19细小病毒、或其组合的免疫应答的构象性表位来创建的表位。在其他实施方案中，mVLP可以诱导动物(例如哺乳动物，人，大鼠，小鼠，猫，犬，猪，猴，或灵长类动物)的抗体生成(例如抗体高滴度)，在动物中，这些抗体能抑制wtVLP的血凝反应(例如，如用血凝抑制试验测定的)。
在一些实施方案中，mVLP可以由本发明多肽制成，所述多肽具有对wtVP2的一个或多个修饰，所述修饰可以位于由本发明多肽形成的VLP中三次对称轴的凹陷内或在其附近(例如，距其约约约约约约约约约约小于约或小于约)。所述mVLP可以由对wtVP2具有一个或多个修饰的本发明多肽制成，在一些方面，所述修饰可以包括环3中的取代，环3中的缺失，环4中的取代，环4中的缺失，环3上游的取代，环3上游的缺失，环4上游的取代，环4上游的缺失，或其组合。在一些情况下，所述mVLP可以由具有对wtVP2的一个或多个修饰的本发明多肽制成，所述修饰可以包括在Y401处的取代，在Y401处的缺失，在Q399处的取代，在Q399处的缺失，在Q400处的取代，在Q400处的缺失，在Q404处的取代，在Q404处的缺失，在Q368处的取代，在Q368处的缺失，在Q369处的取代，在Q369处的缺失，在Y392处的取代，在Y392处的缺失，或其组合。在其它实施方案中，所述mVLP可以由对wtVP2具有一个或多个修饰的本发明多肽制成，所述修饰可包括Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。在其它实施方案中，所述mVLP可以本发明多肽制成，所述多肽是构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W，或构建体X(参见表1)。
一个或多个mVLP可以是组合物的一部分，并且其含量可以是(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，或不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
一种或多种mVLP可以纯化或分离为含量(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
本发明的一些实施方案包括包含一种或多种mVLP的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物(例如疫苗)，例如适于给动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴，人，犬，猫，猪，小鼠，兔，或大鼠)给药的组合物。在一些情况下，所述药物组合物是无毒的，不引起副作用，或两者兼之。在一些实施方案中，可能存在固有的副作用(例如，其可能损害患者或可能对某些患者是在一定程度上有毒的或有害的)。
“治疗有效量”是指有效实现所需和/或有益效果的量。有效量可以在一次或多次给药中给与。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症的量。治疗适应症是指，实现任何期望的效果，诸如减轻、改善、稳定、逆转、减速、或延缓疾病进展，增加生活质量，或延长寿命中的一种或多种。这种实现可以通过本领域已知的任何方法测量，例如抗体滴度的测量。
在一些实施方案中，一种或多种mVLP可以是药物组合物(例如疫苗)的一部分，并且其含量可以是至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.001％至约99％，从约0.001％至约50％，从约0.1％至约99％，从约1％至约95％，约10％至约90％，或约25％至约75％。在一些实施方案中，所述药物组合物可以呈现为适于表面局部，皮下，鞘内，腹膜内，口服，肠胃外，直肠，皮肤，鼻部，阴道，或眼部给药途径的剂型。在其它实施方案中，所述药物组合物可以呈现为适于胃肠外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药的剂型。所述药物组合物可以是，例如，片剂，胶囊，丸剂，粉剂粒剂，悬浮剂，乳剂，溶液剂，凝胶剂(包括水凝胶)，糊剂，软膏剂，霜剂，膏药(plasters)，灌服剂(drenches)，递送装置，栓剂，灌肠剂(enemas)，注射剂，植入物，喷雾剂，气溶胶，或其它合适的形式。
在一些实施方案中，所述药物组合物可包括一种或多种配方成分。“配方成分(formulary ingredient)”可以是任何合适的成分(例如，适合于药物，适合于药物的剂量，适合于药物释放的时间表，适合于疾病，适合于疾病状态，或适合于递送途径)，包括但不限于水(例如开水，蒸馏水，过滤水，无热原水，或有氯仿的水)，糖(例如蔗糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，或由其制备的糖浆)，乙醇，甘油，二羟基醇(例如丙二醇)，丙酮，醚，DMSO，表面活性剂(例如阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂，或非离子表面活性剂(例如聚山梨酸酯(polysorbates))，油(例如，动物油，植物油(例如椰子油或花生油)，或矿物油)，油衍生物(例如油酸乙酯，单硬脂酸甘油酯，或氢化甘油酯)，赋形剂，防腐剂(例如半胱氨酸，甲硫氨酸，抗氧化剂(例如维生素(例如A，E或C)，硒，棕榈酸视黄酯，柠檬酸钠，柠檬酸，氯仿，或对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯))，或其组合。
在某些实施方案中，药物组合物可以配制成在给药后基本上立即或在基本上预定的时间或在给药后释放活性成分(例如一个或多个mVLP)。这样的制剂可以包括例如控释制剂，例如各种控释组合物和包衣。
在某些实施方案中，其它制剂(例如药物组合物的各种制剂)可包括将药物(或控释制剂)掺入食品、食材(food stuffs)、饲料或饮料中而得的那些。
本发明的其它实施方案可包括给药或治疗生物体的方法，其可涉及对患有、怀疑患有、易感某种疾病、病症或障碍的生物体用有效治疗所述疾病、病症或障碍或有效于产生所需生理效应的量的至少一种mVLP进行治疗。在一些实施方案中，所述组合物或药物组合物(例如疫苗)包含至少一种mVLP，其可以以下列量给药于动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴，或人)：约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg，约5.5mg/kg，约6mg/kg，约6.5mg/kg，约7mg/kg，约7.5mg/kg，约8mg/kg，约10mg/kg，约12mg/kg，或约15mg/kg。就一些条件而言，剂量可以是约0.5mg/kg人体重或约6.5mg/kg人体重。在一些情况下，一些动物(例如，哺乳动物，小鼠，兔，猫，猪，或犬)可以以下列剂量给药：约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约1mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约20mg/kg，约30mg/kg，约40mg/kg，约50mg/kg，约80mg/kg，约100mg/kg，或约150mg/kg。当然，本领域技术人员将理解，可以在本发明的方法中使用多种浓度，并且在部分地使用本文提供的指导的情形下，将能够按顺序调节和测试任意多个浓度以找到在给定情况下实现所想结果的浓度。在其它实施方案中，本发明的化合物可以与一种或多种其它治疗剂组合给药于给定的疾病、病症或障碍(disorder)。
在一些实施方案中，所述组合物可以包括单位剂量的一种或多种mVLP与药学上可接受的载体的组合，并且另外可以包括其它医疗制剂，药物制剂，载物，佐剂，稀释剂和赋形剂。在某些实施方案中，载物，媒介或赋形剂可以促进组合物的给药、递送和/或改善组合物的保存。在其它实施方案中，一种或多种载物包括但不限于，盐水溶液如生理盐水，林格氏溶液(Ringer's solution)，PBS(磷酸盐缓冲盐水)，以及含有或不含糖添加剂如葡萄糖的各种盐(包括钾盐和磷酸盐)的混合物。载物可以包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，杀菌性抗生素，以及使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；还有水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。在其它实施方案中，一种或多种赋形剂可包括但不限于水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，及其组合。也可以向组合物中加入无毒辅助物质，例如润湿剂，缓冲剂或乳化剂。口服制剂可包括常用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。
在某些实施方案中，所述组合物(例如药物组合物或疫苗)可包括一种或多种佐剂。在一些实施方案中，佐剂不包括在组合物中。在其它实施方案中，组合物包含一种或多种佐剂，例如但不限于丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酸酐和链烯基衍生物的聚合物；免疫刺激序列(ISS)，水包油乳剂(例如由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”第147页上描述的SPT乳剂，以及该文献第183页上描述的乳剂MF59)，含季铵盐的阳离子脂质，AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH(SO4)4，硅(silica)，明矾(alum)，AI(OH)3，Ca3(PO4)2，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1'2'-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，也称MTP-PE)，RIBI(MPL+TDM+CWS)溶于2％角鲨烯/吐温-80.RTM.乳液，脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A，弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂，默克佐剂65，多核苷酸(例如poly IC和poly AU酸)，结核分枝杆菌蜡质D，在小棒状杆菌、百日咳博德特氏菌和布鲁氏菌属各个成员中发现的物质，脂质体或其它脂质乳剂，ISCOMS，Quil A，ALUN，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质或GMDP，细胞因子，白细胞介素1，白介素2，Montanide ISA-51，QS-21，Titermax或Adjuplex疫苗佐剂。
在一些实施方案中，可以使用(例如，用于改变或刺激免疫应答)的其它佐剂或化合物包括Toll样受体(TLR)的配体。在哺乳动物中，TLR是DC上表达的受体家族，其识别和响应与微生物病原体相关的分子模式。已经作为疫苗佐剂集中研究了几种TLR配体。细菌脂多糖(LPS)是TLR4配体，它的解毒变体单磷酰脂质A(MPL)是批准用于人类的佐剂。TLR5在单核细胞和DC上表达并响应鞭毛蛋白，而TLR9识别含有CpG基序的细菌DNA。含有CpG基序的寡核苷酸(OLGs)都是TLR9的有效配体和激动剂，并且已深入研究了其佐剂性质。在一些实施方案中，佐剂是明矾。在一些实施方案中，佐剂不是M59佐剂。
在某些实施方案中，组合物(例如药物组合物或疫苗)的给药诱导免疫应答以预防或改善未来感染的影响。根据预期的给药方式，本发明的组合物可以是各种形式的药物组合物。可以使用制备疫苗和致免疫剂的任何方法，如美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770所举例的那些。通常，这样的疫苗被制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂；也可以制备固体形式，是适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以乳化。此外，如果需要，疫苗可以含有少量辅助物质，例如增强疫苗效力的润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂或佐剂。
肠胃外给药(如果使用的话)通常以注射为特征。无菌注射剂可以制备成常规形式(液体溶液或悬浮液)，适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳液。
给药途径和疾病的治疗
本发明的mVLP可以以任意多种合适的给药途径或制剂给药于动物。本发明的mVLP也可用于治疗动物的各种疾病。动物包括但不限于哺乳动物，灵长类动物，猴(例如猕猴(macaque)，恒河猴(rhesus macaque)或猪尾猕猴(pig tail macaque))，人，犬，猫，牛，猪，禽(例如小鸡)，小鼠，兔和大鼠。本文中，术语“受试者”是指人和动物受试者。易受细小病毒感染，红细胞病毒感染或B19细小病毒(例如人)感染的受试者可以是人或动物受试者。
本发明mVLP的给药途径可以是任何合适的途径。给药途径可以是但不限于口服途径，胃肠外途径，皮肤途径，鼻道途径，直肠途径，阴道途径和眼部途径。在其它实施方案中，给药途径可以是肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药或肌内给药。给药途径的选择可取决于mVLP特性(例如，mVLP的物理和化学性质)以及动物的年龄和体重，特定疾病和疾病的严重性。当然，可以根据需要组合多种给药途径来给药。
本发明的一些实施方案包括向受试者提供包含本文所述mVLP的组合物(例如药物组合物)的方法，所述方法包括一次或多次给药一种或多种所述组合物；如果存在多于一次给药，则组合物可以相同或不同。
能用所述mVLP在动物(例如哺乳动物，猪，犬，禽(例如小鸡)，牛，猫，灵长类动物，猴，兔子和人)中治疗的疾病包括但不限于，细小病毒感染，与细小病毒感染相关的疾病，红细胞病毒感染，与红细胞病毒感染相关的疾病，细小病毒B19感染，和与细小病毒B19感染相关的疾病。与细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关的一些疾病包括但不限于，胎儿水肿宫内胎儿死亡，感染性红斑(即第五疾病)，遗传性疾病(例如镰刀状细胞性贫血或地中海贫血)，获得性疾病(例如贫血或由疟疾引起的贫血)，细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(TRCA)，慢性贫血，与免疫缺陷个体相关的疾病(例如器官移植受体，经历化疗的动物，经历骨髓移植的动物，或HIV阳性动物)，急性关节病，持续性关节病，再生障碍，关节炎，肝炎，心肌炎，肝脾肿大，急性甲状腺炎，亚急性甲状腺炎，格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎，以及自身免疫性疾病(例如自身免疫性甲状腺疾病，系统性红斑狼疮(SLE)，脑膜脑炎，或纤维肌痛)。与细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关的其它疾病包括但不限于胃肠道损伤，脱水，心脏综合征，嗜睡，腹泻(例如严重腹泻)，发烧，呕吐，食欲不振，死胎，木乃伊化，胚胎死亡，不孕症，低白细胞计数，小脑发育不全，淋巴结病，脾肿大，肾小球肾炎和贫血。可以治疗的动物包括但不限于哺乳动物，灵长类动物，猴子(例如猕猴，恒河猴，猪尾猕猴)，人，犬，猫，猪，禽(例如鸡)，牛，小鼠，兔和大鼠。本文中，术语“受试者”是指人和动物受试者。易受细小病毒感染，红细胞病毒感染或B19细小病毒(例如人)感染的受试者可以是人或动物受试者。在一些情况下，所述动物需要治疗(例如，预防性治疗)。
本文中，术语“治疗”(有不同表现形式，例如“treating”,“treatment”)在其最广义的上下文中考虑。具体地，术语“治疗”不一定意味着动物被治疗直到完全恢复。因此，“治疗”包括改善症状，缓解与病症相关的症状或效果，降低病症的严重程度，或预防，预防性改善症状，或以其他方式降低发生特定病症的风险。本文中，提及“治疗”动物时，包括但不限于预防性治疗(例如疫苗接种)和治疗性治疗。本文所述的任何组合物(例如药物组合物或疫苗)可用于治疗动物。
与治疗细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关时，治疗可包括但不限于预防性治疗和治疗性治疗。因此，治疗可以包括但不限于：赋予针对细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的保护；防止细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)；减少细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的风险；改善或缓解细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的症状；激发针对细小病毒(例如，红细胞病毒或细小病毒B19)或其抗原成分的免疫应答；抑制细小病毒感染(红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的发生或进展；抑制或预防与细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关的症状的发作；减少细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的严重性；和引起细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)症状的消退或者引起一种或多种与细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关的症状的消退。在一些实施方案中，治疗不包括预防性治疗(例如，疫苗接种或以其它方式预防或改善未来的疾病)。
与细小病毒感染(例如，红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)相关的症状是本领域普通技术人员已知的，并且可以包括本文所述和为本领域普通技术人员所熟知的那些。可以用本领域普通技术人员已知的方法评估感染的存在。在一些情况下，可以用本领域普通技术人员已知的方法测定细小病毒感染(例如，红斑病毒感染或细小病毒B19感染)的存在。
动物的治疗可以使用任何合适的给药方法(例如本文公开的那些)以及使用任何合适量的mVLP(例如本文公开的那些)进行。在一些实施方案中，治疗方法包括治疗动物的细小病毒感染(例如在人或灵长类动物中)，与细小病毒感染相关的疾病(例如在人或灵长类动物中)，红细胞病毒感染(例如在人或灵长类动物中)，与红细胞病毒感染相关的疾病(例如在人或灵长类动物中)，与细小病毒B19感染相关的疾病(例如在人或灵长类动物中)，细小病毒B19感染(例如在人类或灵长类动物中)，或其组合。本发明的一些实施方案包括用包含本文所述mVLP的组合物(例如药物组合物)治疗受试者(例如动物，例如人或灵长类动物)的方法，其包括一次或多次给药这样的组合物；如果存在多于一次给药，则所述组合物可以相同或不同。
在一些实施方案中，治疗方法包括给药有效量的包含mVLP的组合物。本文中，术语“有效量”是指一种剂量或一系列剂量，其足以在动物中影响治疗(例如，治疗细小病毒感染，例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染，或治疗与细小病毒感染相关的疾病，例如与红细胞病毒感染相关的疾病或与细小病毒B19感染相关的疾病)。在一些实施方案中，有效量可以包括治疗有效量，如本文公开的那样。在某些实施方案中，有效量可以根据受试者和受影响的具体治疗而有变。所需的确切量可以例如在不同受试者之间不同，取决于受试者的年龄和一般状况，所使用的具体佐剂(如果用了)，给药方案等。因此，有效量可以例如基于特定情况而变化，并且在具体情况下可以确定适当的有效量。有效量可以例如包括本文公开的任何剂量或组合物量。在一些实施方案中，(可以给药于动物例如哺乳动物，灵长类动物，猴或人的)有效量的至少一种mVLP可以是约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg，约5.5mg/kg，约6mg/kg，约6.5mg/kg，约7mg/kg，约7.5mg/kg，约8mg/kg，约10mg/kg，约12mg/kg，或约15mg/kg。就一些条件而言，剂量可以是约0.5mg/kg人体重或约6.5mg/kg人体重。在一些情况下，一些动物(例如，哺乳动物，小鼠，兔，猫，猪或犬)的给药剂量可以是约0.01至约15mg/kg体重，约0.1至约10mg/kg体重，约0.5至约7mg/kg体重，约0.01mg/kg，约0.05mg/kg，约0.1mg/kg，约1mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约20mg/kg，约30mg/kg，约40mg/kg，约50mg/kg，约80mg/kg，约100mg/kg，或约150mg/kg。
本文中，“免疫”和“免疫应答”是指受试者的免疫系统的应答。例如，免疫应答包括但不限于下列各项的可检测的改变(例如增加)：Toll受体活化，淋巴因子(例如细胞因子(例如Th1或Th2型细胞因子)或趋化因子)表达和/或分泌，巨噬细胞活化，树突细胞活化，T细胞活化(例如CD4+或CD8+T细胞)，NK细胞活化和/或B细胞活化(例如抗体产生和/或分泌)。免疫应答的另外的实例包括，免疫原与MHC分子结合以及诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答，诱导B细胞应答(例如抗体产生)，和/或T辅助淋巴细胞应答，和/或针对从免疫原性多肽衍生的抗原的迟发型超敏(DTH)反应，免疫系统细胞(例如，T细胞，B细胞(例如，任何发展阶段的B细胞(例如，浆细胞)))的扩增(例如细胞群的生长)，以及通过抗原呈递细胞增加抗原的加工和呈递。免疫应答可以针对被受试者免疫系统识别为外来物的免疫原(例如，来自微生物(例如病原体)的非自身抗原，或被识别为外来物的自身抗原)。因此，应当理解，本文中，“免疫应答”是指任何类型的免疫应答，包括但不限于，先天性免疫应答(例如，激活Toll受体信号传递级联反应和/或激活补体)，细胞介导的免疫应答(例如由免疫系统的T细胞(例如抗原特异性T细胞)和非特异性细胞介导的应答)，以及体液免疫应答(例如，B细胞介导的应答(例如，通过抗体生成并分泌到血浆、淋巴和/或组织液中而进行)。术语“免疫应答”意在包括受试者免疫系统响应抗原和/或免疫原的能力的所有方面(例如，对免疫原(例如，病原体)的初始应答以及作为适应性免疫反应结果的获得性(例如，记忆性)反应)。
在一些实施方案中，治疗包括疫苗接种。在一些方面，疫苗接种包括给动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴子(例如猕猴，恒河猴，猪尾猕猴)，人，犬，猫，牛，猪，禽(例如小鸡)，小鼠，兔，和大鼠)接种以抵抗细小病毒，红细胞病毒，细小病毒B19或其组合。任何合适的给药方法或方案可用于接种动物。疫苗接种的一些实施方案包括向受试者提供包含本文所述mVLP的组合物(例如药物组合物)的方法，所述方法包括一次或多次给药一种或多种所述组合物；如果存在多于一次给药，则组合物可以相同或不同。例如，可以向受试者给药单一剂量，或者，可以以几周至几个月的间隔进行两次或更多次接种。可以使用本领域通常已知的多种技术来评估受试者中诱导的免疫应答的程度和性质。例如，可以从受试者收集血清，并测试例如血清样品中的细小病毒DNA或RNA，使用例如细小病毒VLP检测细小病毒或其抗原片段的抗体的存在，或监测与细小病毒感染相关的症状。相关技术在本领域中有详细描述，例如Coligan et al.Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons Inc.(1994)，其通过引用并入本文。
疫苗的给药时间表和免疫所需剂量的使用次数可以从标准疫苗给药方案确定。在一些情况下，疫苗组合物将以两个剂量给药。第一剂量将在选定的日期给药，第二剂量将在第一剂量之后一个月给药。如果需要，可以给药第三剂量，而且，当具体一种mVLP要递送多个剂量时，期望的时间间隔也是可以确定的。在其他实施方案中，mVLP可以作为单剂量给予。
在一些情况下，对于每个接受者，必需的疫苗总量可以从用其它疫苗免疫的方案推导。在一些实施方案中，所需的mVLP的确切量可以在不同受试者中有不同，取决于受试者的物种，年龄，体重和一般状况，所用的具体融合蛋白，其给药方式，等等。在其它实施方案中，剂量将接近其它疫苗的给药的典型剂量，并且可以是约1ng/kg至约1mg/kg体重，约10ng/kg至约15mg/kg，或约10ng/kg至约100mg/kg。
成年人群有高达85％对细小病毒B19感染是血清阳性的。细小病毒B19感染可引起胎儿水肿和子宫内胎儿死亡，尽管最广为人知的是与感染性红斑(第五疾病)相关并且在健康个体中可以是无症状的。患有遗传性(镰刀状细胞性贫血)或获得性(由疟疾引起的贫血)贫血的大龄儿童和成年人具有发生细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(TRCA)或死亡的风险。免疫缺陷个体(例如器官移植或HIV阳性患者的受体)中的慢性贫血的原因是细小病毒B19感染。在一些情况下，细小病毒B19感染的病理表现可能受到患者的免疫学和血液学状态的影响，并且可诱导更严重的疾病，例如急性或持续性关节病，再生障碍，并且还涉及关节炎，肝炎，心肌炎，肝脾肿大，一系列自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)，脑膜脑炎或纤维肌痛。
在一些实施方案中，儿童(即，约0至约18岁)可以在他们进入小学之前(即，从约0至约13岁)接种疫苗。在其它实施方案中，可以给处于风险的动物免疫。处于危险中的动物包括但不限于，已经输血、器官移植的动物，具有感染性疾病(例如，HIV或疟疾)的动物，有孩子(例如，18岁以下孩子)的怀孕动物(例如，人类妇女)，被细小病毒B19感染的动物，生活在疟疾流行地区的动物(例如儿童)，免疫缺陷动物(例如器官移植受体，经历化疗的动物，经历骨髓移植的动物，或HIV阳性动物)，或具有自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮；SLE，脑膜脑炎和纤维肌痛)的动物。
在一些实施方案中，本文公开的治疗可包括使用其它药物(例如抗生素)或治疗疾病的疗法。例如，抗生素可用于治疗感染，并可与mVLP组合以治疗疾病(例如感染)。在其它实施方案中，静脉内免疫球蛋白(IVIG)疗法可以作为细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的治疗方案的一部分(即，不仅仅是给药mVLP)。
本文公开的主题通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可能包括多组数据，它们代表了在与本发明相关的开发和实验过程中的不同时间收集的数据。
实施例
介绍和设计和生成B19VP2突变体
我们突变了VP2上的P-抗原结合位点，生成了mVLPs，并测试了它们在小鼠中的免疫力(在有些例子中，已知小鼠对wtVLPs无反应或反应差)(Rosenfeld et al.,“Uniqueregion of the minor capsid protein of human parvovirus B19is exposed on thevirion surface”J Clin Invest.(1992)Vol.89,No.6,pp.2023-2029；Bansal et al.,“Candidate recombinant vaccine for human B19parvovirus”J Infect Dis.(1993)Vol.167,No.5,pp 1034-1044)。某些突变体中，位于或靠近环4(Q383LQGLNMHTYFPNKGTQQYTDQ404)的氨基酸(例如，H390TYFPN395、Q399QYTDQ404、或K365EYQQ369中的氨基酸)被其它具有类似特性(例如，大小、骨架结构、疏水性、和/或电荷)的氨基酸替换。两个突变的VP2(N399NFTDT404和N399NYTDT404)形成mVLPs，表现出改变的人RBC凝集，并且对小鼠有免疫原性。在不受理论限制的情形下，单个突变如果是发生在三次对称轴上或者在其附近，会潜在地较大影响P抗原结合，因为理论上它可以在某些情况下有效地三倍放大病毒配体(P抗原)结合位点处的变化(例如，图1A和1B)。潜在的野生型和突变型VLPs的3D结构预测例见图1C(野生型：QQT401YDQ)和图1D(构建体A：QQF401TDQ)。
突变的VP2基因每一个都通过双重PCR法产生。为此，N末端和C末端DNA片段使用两组引物分别产生，这两种片段退火后，用能使VP2ORF的5'和3'末端退火的引物进行另一PCR，由此生成全长VP2基因。将全长PCR产物克隆到pFAST Bac1中，生成重组杆状病毒(rBac)。然后使用rBac在Sf9昆虫细胞中表达VP2。
克隆并表达突变的B19VP2基因
以杆状病毒的密码子优化型VP1迷你基因(Integrated Technologies，Iowa)的基因型1(NCBI参考序列NC_000883.2)作为模板，通过对它的双重PCR产生定点突变。用高保真Tag DNA聚合酶(Platinum Tag DNA polymerase High Fidelity,LifeTechnologies,CA)扩增多个全长VP2基因片段，进行凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒；Qiagen，CA)，克隆至pCR-XL-Topo(Life Technologies，CA)质粒，全面测序，再亚克隆至pFASTBac1，从中产生重组bacimids并进而产生杆状病毒，操作过程遵循试剂盒(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统；Life Technologies，CA)制造商提供的程序。mVP2在Sf9昆虫细胞中的表达首先用免疫荧光(IF)和免疫印迹(IB)(Ghim et al.Virology(1992)vol.190,No.1,pp.548-552)检测。将专为克隆mVP2基因而产生的重组大肠杆菌和具有正确的VP2蛋白的重组杆状病毒接种物都予以冷冻，以备将来研究。
构建多个B19VP2多肽突变体，它们在环4中的H390TYFPN395和Q399QYTDQ404处、以及在环4上游的K365EYQQ369处具有一个或多个氨基酸插入或点突变，如表1所示。
表1:B19VP2多肽野生型和突变体
用电子显微镜检查B19VP2多肽形成B19病毒样粒子(VLP)的能力。
为了纯化B19wtVLPs(B19野生型VLP)和B19突变VLP(B19mVLPs)，在rBac感染的72小时后收集(750rpm，10分钟)细胞，悬浮在Tris缓冲液(20mM Tris，0.25M NaCl，pH8.5)中，匀浆(downs homogenized)，45℃温育10分钟。将pH调至7.2，密度调至1.30g/ml，然后在SW15Ti(Beckman Coulter，MO)中以32,000rpm超速离心过夜。收集VLP条带，在Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中透析。测量VLP储液的蛋白质浓度(Bio-Rad Protein Assay；BioRad，CA)。
为进行电子显微镜检，将纯化的VLPs和mVLPs加载到涂覆formvar-碳的300目铜网上，用2％磷钨酸(pH 6.8)染色，在透射电子显微镜(EM:100S,JEOL Ltd.,Tokyo,JPN)下观察。
仅使用突变的B19VP2蛋白尝试构建突变的B19VLPs(mVLPs)；这些mVLPs中不包括其他蛋白质。尽管少数VP2突变体未形成mVLPs，大多数形成了在形态上类似于野生型VLPs的mVLPs(例如，见图2A-图2I)，但是产率各不相同；VLP组装的紧密度也不同。
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HAI)
纯化的B19VLPs的血凝试验用人RBC进行，以研究与P抗原结合的能力(参见图5和图6，其代表P抗原结合引起的血凝反应的一些实例及其可能造成的效果)。HIA试验确定抗VLPs抗体对血凝反应的抑制，所述VLP由野生型B19VP2蛋白生成(“野生型VLPs”或“wtVLPs”)或由突变的B19VP2多肽生成(“突变VLPs”或“mVLPs”)；HIA试验用于确认能诱导中和抗体的构象表位存在的证据。
兔和小鼠的免疫：兔皮下免疫，Balb/c小鼠腹膜内免疫。兔和小鼠以两周的间隔注射两次，每次100μg，使用了Titermax或Adjuplex疫苗佐剂(Sigma-Aldrich，MO)，然后在一个月后进行末次加强注射。如果需要，在末次加强注射后的一周至10天时进行最大放血。
ELISA试验：为了进行ELISA试验，将稀释在PBS(pH7.2)中的VLPs在ELISA板(Immunolon II，Dynatech)上37℃包被1小时。板用含有5％牛血清白蛋白的PBS(5％PBSA)37℃保温1小时而饱和后，添加用1％PBSA稀释的一抗，37℃再保温1小时。用碱性磷酸酶标记的二抗和Sigma 104底物(Sigma-Aldrich，MO)检测所结合的一抗。
血凝试验(HA)：简言之，将100μl VLP液(在ADPBS[白蛋白-右旋糖PBS；0.05M PBS，pH6.3，0.2％牛血清白蛋白，5g/L右旋糖]中的0.01至0.5μg/ml)置于圆底微量滴定板的孔中，再添加50μl在ADPBS中的2％hRBC(人类红细胞，经野生型VLP预先测试存在P抗原，作为抗原：人类O型血；Innovative Research，MI)，4℃保温2小时。读取结果。
血凝抑制试验(HIA)：将50μl在ADPBS中连续稀释的抗体与50μl在ADPBS中稀释的VLPs一起于室温(RT)温育30分钟。加入50μl 2％hRBCs，4℃保温2小时，然后读取血凝结果。
HA和HIA试验的结果：图3显示wtVLPs或mVLPs的血凝试验(HA)结果。该HA中使用人类O型红细胞。图4包括抗B19VLPs多克隆兔或小鼠抗体的血凝抑制试验的结果，所述B19VLPs含有野生型VP2或mVP2。该试验中使用人类O型红细胞和野生型VLPs。
表2提供了各种构建体和相应mVPLs的一些特征的概述。
表2.B19VP2突变分析和一部分特征的总结
构建体J、K、M和N在这些条件下不产生纯化的mVLPs。
1小鼠免疫原性：wtVLPs不导致鼠红细胞凝集。然而，不能确定它们之间绝对没有弱结合。因此，该结果不一定反映人类中mVLPs的免疫性。
2HIA(血凝抑制试验)：抗mVLPs抗体抑制wtVLPs的血凝反应。该测试使用鼠多克隆抗体进行。采用TiterMax佐剂进行免疫。
表3显示抗B19野生型VLPs或抗B19mVLPs的兔血清的交叉反应性。抗体稀释至1/4000，它们的反应性用直接ELISA测量。用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗，光密度在410nm处测量。
表3-交叉反应
<-表示抗该抗原的抗体
表4显示抗B19野生型VLPs或抗B19突变VLPs的小鼠多克隆抗体的滴定。抗体滴度用ELISA测量。野生型VLPs已知在小鼠中无免疫原性。用于产生每种多克隆抗体的免疫原被用作该分析的抗原。OD在410nm测量。所有抗体当与作为阴性对照抗原的牛白蛋白反应时，产生小于0.200的OD。
表4.抗体稀释至1/500。ODs超过1.00用粗体表示。
<-表示抗该抗原的抗体
由构建体F制备的mVLPs是HA阴性的，在小鼠中有免疫原性(表2和图3)，诱导了能抑制wtVLPs的HA的抗体(图4)。
就三个被靶向的位置而言，QQY 401 TDQ和HTY 392 FPN中的“Y”位于P-抗原结合口袋中，它们看来对于形成P-抗原的病毒配体具有影响。构建A形成mVLPs；这些mVLPs是HA阴性，但在小鼠中具有中等免疫原性。构建体B mVLPs产生好的mVLPs，产量不错；这些mVLPs在小鼠中有免疫原性，但它们是HA阳性。兔抗wtVLPs、抗构建体A mVLPs和抗构建体B mVLPs的抗体都有生成。这些兔血清在wtVLPs、构建体AmVLPs和构建体B mVLPs之间显示高水平交叉反应性(表3)。
构建体D mVLPs在小鼠中诱导了HIA阳性抗体，但却是HA阳性(图4和表4)。构建体FmVLPs是HA阴性的，在小鼠中诱导了高滴度抗体免疫应答(表4)，并且抗wtVLPs的HIA滴度较好(图4)。构建体G mVLPs是部分地HA阴性，但是诱导出高滴度的HIA鼠抗体。Q393Q400YTDQ404中的三个Q似乎对HA具有部分影响，但可能对各个VLPs的形成更有影响，特别是第三个Q(Q404)。KEYQ368Q369中的两个Q看来对HA的影响较小。这一次，我们未能成功从构建体J、构建体M、构建体N或构建体C中纯化出VP2突变体来源的VLPs。
“QQYTDQ”，特别是残基Y，对于细小病毒B19与RBC结合的能力表现出有影响。“QQYTDQ”中的三个“Q”、“KEYQQ”中的“QQ”，以及“HTYFPN”中的“Y”，这三者中任一者看来都影响mVLPs对RBC的亲和力，表明这些氨基酸有一些贡献。在HTYFPN中Y突变为A得到的VP2、以及在KEYQQ中QQ突变为AA得到的VP2，它们所形成的mVLPs比wtVLPs具有更弱的RBCs亲和力。在“QQYTDQ”之后添加四个氨基酸“DPIG”看来是消除了VP2蛋白形成VLPs的能力。
由在QQYTDQ中Y突变为F导致的VP2构成的mVLPs(即构建体A)形成了在形态上与wtVLPs相当的VLPs，看上去消除了RBC的血凝反应，并在小鼠和兔中诱导出能识别wtVLPs以及其他mVLPs的抗体。此外，针对构建体AmVLPs产生的抗体也能阻断wtVLPs的血凝反应。Y和F具有相同的氨基酸骨架结构，只不过Y在苯环的4位具有羟基，而F不具有。
由构建体B mVLPs(即，QQYTDQ中Y变为W)制备的mVLPs形成形态上与wtVP2相当的mVLPs。虽然它们使RBCs发生血凝，但它们在小鼠和兔中都诱导出高滴度抗体，而已知小鼠和兔的RBCs是不结合B19的。构建B mVLPs的抗体能识别wtVLPs以及其他mVLPs，还阻断wtVLPs的血凝反应，表明其与wtVLPs和其他mVLP共享交叉反应性表位。事实上，构建体BmVLPs在电子显微镜下观察时产生比wtVLPs和构建体AmVLPs更多和形成得更好的VLPs，并且在小鼠和兔中都是有免疫原性的。
针对野生型VLPs产生的兔抗血清能识别构建体A mVLPs和构建体B mVLPs，是在ELISA试验中确定的，这再次证实了在这些mVLPs表面存在交叉反应性表位。
构建体C mVLPs(即，QQYTDQ中Y突变为A)在本研究所用条件下不形成可纯化的VLPs。
构建体F中的三个Q的突变(即，QQYTDQ突变为NNFTDT)或构建体G中的三个Q的突变(即，QQYTDQ突变NNYTDT)导致形成不仅在形态学上类似于wtVLPs、而且也具有免疫原性的mVLPs。构建体F mVLPs不引起RBC血凝，构建体G mVLPs引起RBC部分地血凝。而构建体J、K、M和N不能在本研究所采用条件下形成稳定的mVLPs。这可以指示该配体位点(即QQYTDQ)中第三个“Q”在mVLPs形成和与P抗原结合中的影响。在一些情况下，对取代的氨基酸的选择不仅影响mVLPs的形成，而且影响该mVLP的免疫原性。
当“KEYQQ”中的两个“Q”被AA替换时(即，构建体D)，所得mVLPs在形态上与wtVLP相当，并且它们可以部分地使RBC血凝，但是它们在小鼠中不具有免疫原性。当“KEYQQ”中的两个“Q”被NN替代时(即构建体E)，mVLPs在形态上良好并与wtVLPs相当；它们使RBC血凝并且在小鼠中是有免疫原性的。
HTYFPN中Y突变而产生HTFFPN(构建体I)导致形成良好的mVLPs，这些mVLPs能使RBC部分地凝集，但是它们在小鼠中的免疫原性较低。
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在某些情况下，本文公开的序列都包括在公众可获得的数据库例如和SWISSPROT中。除非另有说明或显而易见，否则引用这种公众可用的数据库时是指在本申请的提交日当时的数据库最新版本。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分含量，性质例如反应条件等等的所有数字应理解为在任何情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和权利要求书中给出的数值参数是近似值，其可以根据本文公开的主题所期望获得的性质而有不同。
如本文所使用的，术语“约”当指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，意味着与所标明的量相比而包括在一些实施方案中±20％的变化，在一些实施方案中±10％的变化，在一些实施例中为±5％的变化，在一些实施例中为±1％的变化，在一些实施例中为±0.5％的变化，在一些实施例中为±0.1％的变化，只要这些变化对于执行所公开的方法而言是合适的。
本文提供了一个或多个实施方案的详细描述。然而，应当理解，本发明可以以各种形式实施。因此，本文公开的具体细节(即使表明是优选的或有利的)都不应被解释为限制性的，而是用作权利要求的举例说明，并且作为教导本领域技术人员以任何适当方式应用本发明时的代表例。实际上，除了本文所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述和附图中将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 路易斯维尔大学研究基金会有限公司(University of Louisville ResearchFoundation, Inc.)
Ghim, Shin-je
Jenson, A. Bennett
Trent, John O.
<120> 用于治疗(包括预防)细小病毒感染及相关疾病的组合物和方法
<130> 35783.04055
<150> US 61/950,623
<151> 2014-03-10
<160> 76
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 554
<212> PRT
<213> 细小病毒 B19
<400> 1
Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr Phe Ser
20 25 30
Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu Ile Pro Tyr
35 40 45
Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys
50 55 60
His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile
65 70 75 80
Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn
85 90 95
Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly
100 105 110
Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val
115 120 125
Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser
130 135 140
Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro
145 150 155 160
Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile
165 170 175
Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val
180 185 190
Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu
195 200 205
Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr
210 215 220
Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu
225 230 235 240
Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp Pro Lys
260 265 270
Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro Gln Asn Phe
275 280 285
Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gly Asp Ser
290 295 300
Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr
305 310 315 320
Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro
325 330 335
Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile
340 345 350
Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu
370 375 380
Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln
385 390 395 400
Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn
405 410 415
Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn
420 425 430
Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly
435 440 445
Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser
450 455 460
Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln
465 470 475 480
Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly Pro
485 490 495
Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr Pro Pro
500 505 510
His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr
515 520 525
Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu
530 535 540
Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu
545 550
<210> 2
<211> 1665
<212> DNA
<213> 细小病毒 B19
<400> 2
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 3
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体A
<400> 3
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tttacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 4
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体B
<400> 4
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tggacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 5
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体C
<400> 5
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
gctacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 6
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体D
<400> 6
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tgctgctgga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 7
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体E
<400> 7
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta taacaacgga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 8
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体F
<400> 8
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aaccaacaac 1200
tttacagata acattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
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gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
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<210> 9
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体G
<400> 9
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gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
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ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
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gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
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cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 10
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体H
<400> 10
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cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 11
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体I
<400> 11
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ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
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gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
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aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
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tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
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ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 12
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体J
<400> 12
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
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gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aaccaacaac 1200
tttacagata acattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 13
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体K
<400> 13
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aaccaacaac 1200
tatacagata acattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
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gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 14
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体L
<400> 14
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
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gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
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ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
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catttaccat atgtactata tgaccctaca gctacagatg caaaacaaca ccacagacat 1620
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<210> 15
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体M
<400> 15
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
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ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aaccgctgct 1200
tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 16
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体N
<400> 16
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac acctactttc ccaataaagg aacccaacaa 1200
ccagctgcac aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
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ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
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<211> 1665
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<220>
<223> 构建体O
<400> 17
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<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 构建体P
<400> 18
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<210> 19
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 构建体Q
<400> 19
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cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 20
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体R
<400> 20
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
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cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 21
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体S
<400> 21
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
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cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
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agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
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gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
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<210> 22
<211> 1665
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<223> 构建体T
<400> 22
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<210> 23
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<212> DNA
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<223> 构建体U
<400> 23
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
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<210> 24
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体V
<400> 24
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tcagcaagga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac accgcttttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tttacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
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<210> 25
<211> 1665
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<220>
<223> 构建体W
<400> 25
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tgctgctgga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac accgcttttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tggacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 26
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体X
<400> 26
atgacttcag ttaattctgc agaagccagc actggtgcag gagggggggg cagtaatcct 60
gtcaaaagca tgtggagtga gggggccact tttagtgcca actctgtgac ttgtacattt 120
tctagacagt ttttaattcc atatgaccca gagcaccatt ataaggtgtt ttctcccgca 180
gcaagtagct gccacaatgc cagtggaaag gaggcaaagg tttgcaccat tagtcccata 240
atgggatact caaccccatg gagatattta gattttaatg ctttaaactt atttttttca 300
cctttagagt ttcagcactt aattgaaaat tatggaagta tagctcctga tgctttaact 360
gtaaccatat cagaaattgc tgttaaggat gttacagaca aaactggagg gggggtgcag 420
gttactgaca gcactacagg gcgcctatgc atgttagtag accatgaata caagtaccca 480
tatgtgttag ggcaaggtca agatacttta gccccagaac ttcctatttg ggtatacttt 540
ccccctcaat atgcttactt aacagtagga gatgttaaca cacaaggaat ttctggagac 600
agcaaaaaat tagcaagtga agaatcagca ttttatgttt tggaacacag ttcttttcag 660
cttttaggta caggaggtac agcaactatg tcttataagt ttcctccagt gcccccagaa 720
aatttagagg gctgcagtca acacttttat gagatgtaca atcccttata cggatcccgc 780
ttaggggttc ctgacacatt aggaggtgac ccaaaattta gatctttaac acatgaagac 840
catgcaattc agccccaaaa cttcatgcca gggccactag taaactcagt gtctacaaag 900
gagggagaca gctctaatac tggagctggg aaagccttaa caggccttag cacaggtacc 960
tctcaaaaca ctagaatatc cttacgcccg gggccagtgt ctcagccgta ccaccactgg 1020
gacacagata aatatgtcac aggaataaat gctatttctc atggtcagac cacttatggt 1080
aacgctgaag acaaagagta tgctgctgga gtgggtagat ttccaaatga aaaagaacag 1140
ctaaaacagt tacagggttt aaacatgcac accgcttttc ccaataaagg aacccagcaa 1200
tatacagatc aaattgagcg ccccctaatg gtgggttctg tatggaacag aagagccctt 1260
cactatgaaa gccagctgtg gagtaaaatt ccaaatttag atgacagttt taaaactcag 1320
tttgcagcct taggaggatg gggtttgcat cagccacctc ctcaaatatt tttaaaaata 1380
ttaccacaaa gtgggccaat tggaggtatt aaatcaatgg gaattactac cttagttcag 1440
tatgccgtgg gaattatgac agtaaccatg acatttaaat tggggccccg taaagctacg 1500
ggacggtgga atcctcaacc tggagtatat cccccgcacg cagcaggtca tttaccatat 1560
gtactatatg accctacagc tacagatgca aaacaacacc acagacatgg atatgaaaag 1620
cctgaagaat tgtggacagc caaaagccgt gtgcacccat tgtaa 1665
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型P1
<400> 27
atgatggaat tcatgacttc agttaattct g 31
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型P2
<400> 28
atgatgctcg agaagcttac aatgggtgca cacgg 35
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体A P1
<400> 29
ggggcgctca atttgatctg taaattgctg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体A P2
<400> 30
cccaataaag gaacccagca atttacagat 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体B P1
<400> 31
ggggcgctca atttgatctg tccattgctg 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体B P2
<400> 32
cccaataaag gaacccagca atggacagat 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体C P1
<400> 33
ggggcgctca atttgatctg tagcttgctg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体C P2
<400> 34
cccaataaag gaacccagca agctacagat 30
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体D P1
<400> 35
ggaaatctac ccactccagc agcatactc 29
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体D P2
<400> 36
gctgaagaca aagagtatgc tgctggagtg 30
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体E P1
<400> 37
ggaaatctac ccactccgtt gttatactc 29
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体E P2
<400> 38
gctgaagaca aagagtataa caacggagtg 30
<210> 39
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体F P1
<400> 39
cccaccatta gggggcgctc aatggtatct gtaaagttgt tggttcc 47
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体F P2
<400> 40
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactttacag ataccattga g 51
<210> 41
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体G P1
<400> 41
cccaccatta gggggcgctc aatggtatct gtatagttgt tggttcc 47
<210> 42
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体G P2
<400> 42
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactatacag ataccattga g 51
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体H P1
<400> 43
ctgggttcct ttattgggaa aagcggtgtg 30
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体H P2
<400> 44
ggtttaaaca tgcacaccgc ttttccc 27
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体I P1
<400> 45
ctgggttcct ttattgggaa aaaaggtgtg 30
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体I P2
<400> 46
ggtttaaaca tgcacacctt ttttccc 27
<210> 47
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体J P1
<400> 47
cccaccatta gggggcgctc aatgttatct gtaaagttgt tggttcc 47
<210> 48
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体J P2
<400> 48
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactttacag ataacattga g 51
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体K P1
<400> 49
cccaccatta gggggcgctc aatgttatct gtatagttgt tggttcc 47
<210> 50
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体K P2
<400> 50
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactatacag ataacattga g 51
<210> 51
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体L P1
<400> 51
cccaccatta gggggcgctc aataccaatt ggatcttgat c 41
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体L P2
<400> 52
cagcaatata cagatcaaga tccaattggt attgag 36
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体M P1
<400> 53
ggcgctcaat ttgatctgta taagcagc 28
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体M P2
<400> 54
acctactttc ccaataaagg aaccgctgct 30
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体N P1
<400> 55
acccaccatt agggggcgct caatagctgc agctggttgt tg 42
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体N P2
<400> 56
acctactttc ccaataaagg aacccaacaa ccagctgca 39
<210> 57
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体O P1
<400> 57
cccaccatta gggggcgctc aatggtatct gtccagttgt tggttcc 47
<210> 58
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体O P2
<400> 58
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactggacag ataccattga g 51
<210> 59
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体P P1
<400> 59
cccaccatta gggggcgctc aatggtatct gtccagttgt tggttcc 47
<210> 60
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体P P2
<400> 60
cacacctact ttcccaataa aggaaccaac aactggacag ataccattga g 51
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体Q P1
<400> 61
ggaaatctac ccactccagc agcatactc 29
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体Q P2
<400> 62
gctgaagaca aagagtatgc tgctggagtg 30
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体R P1
<400> 63
ggaaatctac ccactccagc agcatactc 29
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体R P2
<400> 64
gctgaagaca aagagtatgc tgctggagtg 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体S P1
<400> 65
ctgggttcct ttattgggaa aagcggtgtg 30
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体S P2
<400> 66
ggtttaaaca tgcacaccgc ttttccc 27
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体T P1
<400> 67
ggaaatctac ccactccagc agcatactc 29
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体T P2
<400> 68
gctgaagaca aagagtatgc tgctggagtg 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体U P1
<400> 69
ctgggttcct ttattgggaa aagcggtgtg 30
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体U P2
<400> 70
ggtttaaaca tgcacaccgc ttttccc 27
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体V P1
<400> 71
ctgggttcct ttattgggaa aagcggtgtg 30
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体V P2
<400> 72
ggtttaaaca tgcacaccgc ttttccc 27
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体W P1
<400> 73
ctgggttcct ttattgggaa aagcggtgtg 30
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体W P2
<400> 74
ggtttaaaca tgcacaccgc ttttccc 27
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体X P1
<400> 75
ggaaatctac ccactccagc agcatactc 29
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体X P2
<400> 76
gctgaagaca aagagtatgc tgctggagtg 30

Claims (87)

1.一种多肽，其包含相对于野生型VP2具有至少一个氨基酸修饰的VP2多肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰是插入，缺失或取代。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述野生型VP2具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多肽形成mVLP。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中由所述多肽形成的mVLP相对于wtVLP具有降低的与P抗原的结合。
6.根据权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰在三次对称轴的凹部中或附近。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰选自环3中的取代，环4中的取代，环3上游的取代，环4上游的取代，或其组合。
8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰是在Y401处的取代，在Q399处的取代，在Q400处的取代，在Q404处的取代，在Q368处的取代，在Q369处的取代，在Y392处的取代，Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。
9.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述野生型VP2是来自细小病毒B19的野生型VP2。
10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述多肽选自构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W和构建体X。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO：1具有至少90％的同一性。
12.一种mVLP，其包含权利要求1-11中任一项的多肽。
13.如权利要求12所述的mVLP，其中所述mVLP具有比wtVLP降低的与P抗原的结合，所述mVLP没有可检测的与P抗原的结合，所述mVLP具有比wtVLP减少的红细胞血凝反应，或所述mVLP没有可检测的血凝反应。
14.权利要求12或13的mVLP，其中所述mVLP具有一个或多个中和表位。
15.如权利要求12-14中任一项所述的mVLP，其中所述mVLP在动物中诱导抗体的产生，其中所产生的抗体能减少或抑制wtVLP血凝。
16.一种组合物，其包含权利要求12-15中任一项所述的mVLP。
17.权利要求16的组合物，其中mVLP的量为约0.0001％(组合物总重量)至约99％。
18.权利要求16或17的组合物，其还包含佐剂或载物。
19.一种药物组合物，其包含权利要求12-15中任一项所述的mVLP。
20.权利要求19的药物组合物，其中mVLP的量为约0.0001％(总组合物重量)至约50％。
21.权利要求19或20的药物组合物，其还包含佐剂或载物。
22.一种疫苗，其包含权利要求12-15中任一项所述的mVLP。
23.权利要求22的疫苗，其中mVLP的量为约0.0001％(以总组合物重量计)至约50％。
24.权利要求22或23的疫苗，其还包含佐剂或载物。
25.权利要求22-24中任一项的疫苗，其还包含角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。
26.权利要求22或23的疫苗，其中所述疫苗不包含佐剂。
27.一种为动物提供mVLP的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含权利要求12-15任一项所述mVLP的组合物，其中如果存在超过一次给药，所述组合物可以相同或不同。
28.权利要求27的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种不包含佐剂。
29.权利要求27或28的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含载物或佐剂。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种包含权利要求16-18中任一项所述的组合物，权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，或权利要求22-26中任一项所述的疫苗。
32.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述一次或多次给药中的至少一次包括胃肠外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌肉内给药。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次另外的给药的组合物。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量对动物给药。
35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其中所述动物是人或灵长类动物。
36.一种用于治疗动物的细小病毒感染、与细小病毒感染相关的疾病，红细胞病毒感染、与红细胞病毒感染相关的疾病、细小病毒B19感染、或与细小病毒B19感染相关的疾病的方法，包含一次或更多次给药一种或多种包含权利要求12-15中任一项所述mVLP的组合物，其中如果存在多于一次给药，所述组合物可以相同或不同。
37.权利要求36的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种不包含佐剂。
38.权利要求36或37的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含载物或佐剂。
39.权利要求36-38中任一项的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种包含权利要求16-18中任一项所述的组合物，权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，或权利要求22-26中任一项所述的疫苗。
41.权利要求36-39中任一项的方法，其中所述一次或多次给药中的至少一次包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌肉内给药。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次另外的给药的组合物。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给动物给药。
44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述动物是人或灵长类动物。
45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述动物需要该治疗。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗红细胞病毒感染，与红细胞病毒感染相关的疾病，细小病毒B19感染，或与细小病毒B19感染相关的疾病。
47.权利要求36-46中任一项的方法，其中所述方法用于治疗红细胞病毒感染，细小病毒B19感染，与红细胞病毒感染相关的疾病，与细小病毒B19感染相关的疾病，胎儿水肿(hydrops fetalis)宫内胎死，感染性红斑(即，第五病)，镰刀状细胞贫血，地中海贫血，贫血，疟疾引起的贫血，细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(TRCA)，慢性贫血，急性关节病，持续性关节病，再生障碍危象，关节炎，肝炎，心肌炎，肝脾肿大，系统性红斑狼疮，脑膜脑炎，或纤维肌痛。
48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述方法诱导免疫应答，是疫苗接种，是预防性治疗，是治疗性治疗，或是其组合。
49.一种在动物中诱导免疫应答的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含权利要求12-15中任一项所述的mVLP的组合物，其中如果存在超过一次给药，所述组合物可以相同或不同。
50.权利要求49的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种不包含佐剂。
51.权利要求49或50的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含载物或佐剂。
52.权利要求49-51中任一项的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种包含权利要求16-18中任一项所述的组合物，权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，或权利要求22-26中任一项所述的疫苗。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的方法，其中所述一次或多次给药中的至少一次包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。
55.根据权利要求49-54中任一项所述的方法，其中如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其他给药的组合物。
56.根据权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给动物给药。
57.权利要求49-56中任一项的方法，其中所述动物是人或灵长类动物。
58.如权利要求49-57中任一项所述的方法，其中所述动物需要该治疗。
59.权利要求49-58中任一项的方法，其中所述方法预防或缓解未来的感染。
60.一种给动物接种以抵抗细小病毒感染、红细胞病毒感染、或细小病毒B19感染的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含权利要求12-15中任一项所述mVLP的组合物，其中，如果有一次以上的给药，所述组合物可以是相同或不同。
61.权利要求60的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种不包含佐剂。
62.权利要求60或61的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含载物或佐剂。
63.权利要求60-62中任一项的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种还包含角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。
64.权利要求60-63中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种包含权利要求16-18中任一项所述的组合物，权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，或权利要求22-26中任一项所述的疫苗。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的方法，其中所述一次或多次给药中的至少一次包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的方法，其中如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其他给药的组合物。
67.权利要求60-66中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mg mVLP/kg动物体重至约15mg mVLP/kg动物体重的量给动物给药。
68.权利要求60-67中任一项的方法，其中所述动物是人或灵长类动物。
69.权利要求60-68中任一项的方法，其中所述动物对细小病毒感染、红细胞病毒感染、或细小病毒B19感染易感。
70.权利要求60-69中任一项的方法，其中所述方法用于针对红细胞病毒感染或细小病毒B19感染进行疫苗接种。
71.权利要求60-70中任一项的方法，其中所述方法预防或缓解未来的感染或未来的疾病。
72.一种用于产生权利要求1-11中任一项的多肽的方法，包括
-对经过含核酸序列的载体转染的宿主细胞进行培养，以提供所述核酸序列编码的多肽的表达；和
-回收所述多肽。
73.权利要求72的方法，其中载体的制备包括从头合成或用RNA进行逆转录。
74.权利要求72或73的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
75.权利要求72-74中任一项的方法，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
76.权利要求72-75中任一项的方法，其中编码所述多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；和SEQ ID NO:26。
77.一种用于产生权利要求12-15中任一项所述的mVLP的方法，
-对经过载体转染的宿主细胞进行培养，所述载体包含编码权利要求1-11中任一项所述多肽的核酸序列，由此提供所述多肽的表达；和
-回收所述mVLP。
78.权利要求77的方法，其中所述载体的制备包括从头合成或用RNA进行逆转录。
79.权利要求77或78的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
81.权利要求77-80中任一项的方法，其中编码所述多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；和SEQ ID NO:26。
82.核酸分子，其编码权利要求1-11中任一项的多肽。
83.权利要求82的核酸分子，其中所述编码多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；和SEQ ID NO:26。
84.权利要求82或83的核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同一性。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子在细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、人细胞、或Sf9昆虫细胞中。
86.如权利要求82-85中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括在载体或质粒中。
87.载体，其包含权利要求82-85任一项的核酸序列。
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