KR20140140158A - 돼지써코바이러스 2형(pcv2)의 orf2 재조합 유전자, 전달 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 돼지써코바이러스 2형(pcv2) 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

돼지써코바이러스 2형(pcv2)의 orf2 재조합 유전자, 전달 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 돼지써코바이러스 2형(pcv2) 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자를 코돈 최적화한 ORF2 재조합 유전자, 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터, 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스, 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질 및 상기 재조합 캡시드 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

Description

돼지써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자, 전달 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법{ORF2 recombinant gene of porcine circovirus type 2, transfer vector, recombinant vaculovirus, recombinant capsid protein of porcine circovirus type 2 and manufacturing method thereof}
본 발명은 돼지써코바이러스 2형(PCV2)의 ORF2 재조합 유전자, 전달 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자를 코돈 최적화한 ORF2 재조합 유전자, 상기 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터, 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스, 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질 및 상기 재조합 캡시드 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
돼지써코바이러스 2형(PCV2)은 처음에는 이유자돈의 전신소모성증후군(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 원인체인 것으로 알려져 있으나, PMWS 뿐만 아니라 돼지호흡기복합감염증(porcine respiratory disease complex, PRDC), 돼지피부염신증증후군(porcine dermatopathy and nephropathy syndrome, PDNS), 번식장애, 소화기질병 등 다양한 질병의 발생에 관여함에 따라 이 바이러스와 관련되어 발생하는 질병들을 모두 통틀어 돼지써코바이러스병(porcine circovirus diseases, PCVD)라고 명명하고 있다.
PCVD의 주요 증상으로는 기침, 발열, 피부창백 및 변색, 호흡장애, 사료섭취 및 증체율 저하, 위축, 설사 등의 다양한 증상을 보이며, 심각한 피해를 초래하는 PMWS의 경우 이유자돈에 호흡기증상을 동반한 발육 부전이 가장 흔한 증상이며, PCV2의 단독감염보다는 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV), 돼지파보바이러스, 마이코플라즈마 등의 다른 호흡기 질병 등과 복합적으로 감염되어 증상이 악화된다.
PCV2는 크기가 약 17nm정도로 아주 작은 엔벨로프(envelope)가 없는 바이러스로서 외부환경이나 소독제에 강한 저항성을 가진다. 따라서 PCV2 감염농장은 지속적으로 순환감염되기 쉽고, 대부분의 농장에 상재화되어 있어 근절이 힘든 질병이다.
PCV2의 DNA는 1.76kb의 한가닥의 원형으로서 크게 바이러스 복제와 관련된 유전자인 ORF1과 중화항체를 생성하고 감염의 혈청학적인 마크로 인식되는 캡시드 단백질(capsid protein)을 코딩하는 ORF2로 구성되어 있는데, PCV2의 ORF2 유전형에 따라 PCV2a, PCV2b-1A, PCV2b-1B, PCV2b-1C등의 제노타입(genotype)으로 나눌수 있으며, 2003년 이후 심한 PMWS 발생은 PCV2b와 관련성이 많은 것으로 보고되고 있다.
그러나, 이러한 유전자형(genotype)간의 병원성은 아직 확실치 않으며, 인공감염을 통한 결과에서도 병원성의 차에 대한 결론을 내리지 못하고 있다. PCV2의 감염 피해를 줄이기 위해 농장의 위생 및 방역등의 관리가 우선되어야 하지만 근래에는 이러한 감염을 차단하기 위한 여러종류의 백신이 개발되어 사용되고 있다.
PCV2 백신 개발 연구분야에는 PCV2 분리주를 이용한 불활화 백신, 캡시드 단백질을 이용한 써브뉴니트(subunit) 백신, DNA 백신, ORF1 및 OFR2 유전자가 삽입된 재조합 슈도래비스(pseudorabies) 바이러스, ORF2 유전자가 삽입된 아데노바이러스 및 PCV1과 PCV2를 혼합한 키메릭(chimeric) 불활화백신 등 다양하다.
그 중 가장 성공적인 백신은 PCV2의 캡시드 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 백신이며, 이러한 백신들의 사용을 통해 PMWS를 포함한 PCVD의 발생과 피해를 감소시킨 것도 사실이다. 예를 들면, PCV1의 ORF1와 PCV2의 ORF2가 조합된 chimeric 바이러스을 이용한 불활화백신과 배큘로바이러스를 이용한 재조합 캡시드 단백질이 포함된 백신들이 현장에서 효과를 발휘하고 있다.
PCV2a는 상기의 상용화된 백신의 항원의 원천 바이러스이다. 이론적으로는 PCV2b의 캡시드 단백질의 아미노산 변화에 의해 PCV2a에 의해 유발되는 방어면역이 저해될수 있지만 실험적인 결과를 통해 교차 방어가 성립됨이 밝혀졌으며, 이를 이용한 PCVD 백신 개발은 성공적이라고 할 수 있는데, PCV2 감염으로 많은 피해를 보는 농장에 이러한 백신을 사용할 경우 농장내 폐사돈 및 위축돈 감소 및 증체율 개선 등의 직접적인 효과를 보고 있다.
그러나 백신을 중단할 경우나 백신에 의한 면역 수준이 저하될 시점에 면역성이 저하된 돼지에서 배출된 바이러스나 외부에서 유입된 바이러스에 의해 충분히 PCV2의 재감염이 이루어질 수 있다.
따라서 소모성질환의 피해가 많은 농장은 지속적인 PCV2 백신 접종과 더불어 농장내 위생 및 사양관리에도 더욱 관심을 기울여야 하며, 특히 복합감염을 유발하는 병원체에 대한 관리도 필수적으로 동반되어야 한다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 돼지에서 폐사 및 성장지연을 유발하는 돼지소모성 질병의 주요 원인체인 PCV2의 캡시드 단백질을 코돈 최적화된 유전자를 이용함으로써, 발현률이 높은 재조합 단백질을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
또한, 본 발명은 PCV2에 대한 면역반응의 유도를 통하여 감염을 보다 경제적이고 효과적으로 억제할 수 있는 상기 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명은, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자를 코돈 최적화한 ORF2 재조합 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 배큘로바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질의 제조방법을 제공한다.
PCV2에 대한 면역원성이 높은 백신은 방어항체를 포함한 주요 면역유도 단백질인 캡시드 단백질의 함유량에 따라 결정되는 바, PCV2의 ORF2 유전자가 곤충세포에서 효과적으로 번역되도록 코돈 최적화된 본 발명의 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법에 의해 항원을 생산할 경우, 동일한 조건에서 면역 항원의 생산효율이 향상시킬 수 있으므로, 경제적이고 효과적인 PCV2의 재조합 백신을 생산할 수 있고, 이를 이용하여 PCV2에 대한 예방관리를 더욱 효율적으로 할 수 있다.
도 1은 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자를 클로닝한 후의 제한효소 절단 사진을 나타낸 것으로서, M은 사이즈 마커, 1 및 2는 pGEMTPCV2vORF2의 Bgl II 절단 분절을 의미하고, 아래쪽 밴드가 PCV2vORF2 유전자를 나타낸다.
도 2는 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자(vORF2) 및 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자(sORF2)의 염기서열 및 아미노산 서열(Amino acid)을 나타낸 것이다.
도 3은 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자(vORF2)가 삽입된 전달벡터(pBacPAK8PCV2vORF2) 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자(sORF2)가 삽입된 전달벡터(pBacPAK8PCV2sORF2) 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자 삽입 배큘로바이러스(reBacPCV2vORF2, 좌) 및 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자가 삽입된 배큘로바이러스(reBacPCV2sORF2, 우) 감염 곤충세포의 형광발색 사진이다.
도 6은 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자가 삽입된 배큘로바이러스(reBacPCV2vORF2, 좌) 및 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자가 삽입된 배큘로바이러스(reBacPCV2sORF2, 우)의 PCR 확인 사진을 나타낸 것으로서, 이때 reBacPCV2vORF2의 증폭산물은 722bp이고, reBacPCV2sORF2의 증폭산물은 538bp이다.
도 7은 재조합 배큘로바이러스 감염세포에서 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자 이용 재조합 캡시드 단백질(vCap, 좌) 및 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자 이용 재조합 캡시드 단백질(sCap, 중간)에 대한 특이 단크론항체 반응성(대조 세포, 우)을 나타내는 사진이다.
도 8은 PCV2 야외분리주의 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(vCap, 회색) 및 코돈 최적화된 합성 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(sCap, 흑색)의 발현 측정치(감염량 및 감염시간별)를 나타낸 것이다.
도 9는 코돈 최적화된 합성 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(sCap, 좌) 및 PCV2 야외주의 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(vCap, 우)의 발현 반응치(20MOI 감염, 3일간 배양)를 나타낸 것이다.
도 10은 PCV2 야외분리주의 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시 드단백질(vCap, 회색) 및 코돈 최적화된 합성 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(sCap, 흑색)의 닭에 대한 항체 형성능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자를 코돈 최적화한 ORF2 재조합 유전자에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 재조합 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 ORF2 재조합 유전자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 코돈 최적화는 상기 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자 전체 염기서열의 GC 비율의 평형화, 및 헬릭스(helix) 구조의 염기서열 개수와 길이의 감축을 통하여 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 전달 벡터는 제4도에 개시된 개열지도를 갖는 전달 벡터 pBacPAK8PCV2sORF2일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 발현률은, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 ORF2 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 발현률의 1.5배 내지 2배 높은 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 재조합 캡시드 단백질의 항체 형성능은, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 ORF2 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 항체 형성능의 1.5배 내지 2배 높은 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 배큘로바이러스를 이용한 PCV2 재조합 캡시드 단백질의 발현을 높이기 위하여 코돈 최적화(codon usage)한 유전자를 합성하여 이용하였다. 즉, 야외 PCV2 분리주로부터 캡시드 단백질을 코딩하는 ORF2 유전자를 증폭하여, 그 염기서열을 분석하였다.
분석된 ORF2 유전자의 코돈이 곤충세포에서 가장 효율적으로 변역(translation)될 수 있도록 각 코돈별 최적화된 염기서열로 수정하였다. 코돈 최적화된 유전자를 인공적으로 합성하고, 클로닝 및 형질도입(transfection)을 통해 재조합 배큘로바이러스를 제작하였다.
또한, 원래의 분리주 ORF2 유전자를 이용한 재조합 배큘로바이러스도 함께 제작하여 재조합 캡시드 단백질간의 발현 효율을 비교하였다.
동일 역가의 재조합 배큘로바이러스를 감염시킨 곤충세포에서는 코돈 최적화된 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(sCap)이 PCV2 야외주의 ORF2 유전자를 이용한 재조합 캡시드 단백질(vCap)보다 발현 효율이 1.5배 내지 2배 높은 것으로, 효소면역측정법(ELISA)을 통하여 확인하였다.
또한, 웨스턴 블로팅(western blotting)으로도 발현이 증강되는 것을 확인하였고, 동일 역가로 감염된 세포를 용해 및 초음파 파쇄하여 닭에게 접종한 결과, sCap을 접종한 개체가 vCap을 접종한 개체보다 항체 형성이 1,5배 내지 21배 높은 것으로 확인되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 실시예에 국한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> PCV2 의 ORF2 유전자 클로닝
돼지 PMWS의 증상을 보이는 자돈의 림프절에서 DNA Mini kit(Qiagen)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출하였다. PCV2의 전체 ORF2 유전자(서열번호 1)를 클로닝하기 위하여 제한효소 Bgl II 부위(밑줄)가 5' 말단에 포함되고 개시 코돈(대문자)이 포함된 서열번호 2의 센스 프라이머(5'-gaagatcttcATGacgtatccaaggag-3')와 개시 코돈(대문자)이 포함된 서열번호 3의 안티센스 프라이머(5'gaagatcttcTTAgggtttaagtgggg-3')를 제작하였다.
ORF2 유전자 증폭은 5㎕ 추출 DNA, 1.5 mM MgCl2, 1xPCR buffer, 0.2mM dNTP, 각 0.4μM 프라이머 및 2.5U Taq DNA polymerase(Qiagen)을 혼합하고, 최종 25㎕가 되도록 멸균 증류수를 채운 후, PCR을 실시하였다. 이때, 온도 조건은 94℃, 5분 반응 후, 94℃, 30초와 55℃, 45초 및 72℃, 45초의 온도에서 35회 반복 증폭하고, 최종 72℃에서 10분간 연장 반응을 실시하였다.
PCR로 증폭된 722 bp의 유전자는 1.5% 아가로즈겔에서 전기영동하여 확인하였다. 아가로즈겔상의 증폭된 유전자는 gene cleaning kit(Q-biogene)를 이용하여 정제한 후, pGEM- easy Vector(Promega)에 클로닝한 다음 염기서열을 분석하였다. 이에 해당하는 야외주 염기서열(vORF2)은 도 2에서 확인할 수 있다.
< 실시예 2> PCV2 의 ORF2 유전자 코돈 최적화 및 합성
본 발명에 사용된 야외분리 PCV2의 ORF2 유전자 염기서열 정보를 바탕으로 동물 및 곤충세포에서 유전자의 변역(translation) 효율을 높여, 보다 많은 재조합 단백질을 수확하기 위하여, ORF2 코돈을 최적화(optimization)하였다.
즉, 야외주의 ORF2 유전자가 코딩하는 233개의 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 각 아미노산별로 목적하는 곤충세포에 가장 적합한 코돈 비율을 조정하고, 전체 염기서열의 CG 비율의 평형화 및 헬릭스(helix) 구조의 염기서열 개수 및 길이의 단축을 통하여, 최종 최적화된 염기서열을 새로 작성하였는데, 이에 해당하는 서열번호 4의 최적화 염기서열(sORF2)은 도 2에서 확인할 수 있다.
최적화된 합성 유전자 양 말단에 상기의 야외주 클로닝에서 사용한 제한효소 Bgl II 부위 및 개시 코돈을 추가하여 722bp의 뉴클레오타이드을 합성하였다.
< 실시예 3> PCV2 의 vORF2 및 sORF2 유전자의 전달벡터 삽입
배큘로바이러스 발현시스템을 이용한 PCV2의 캡시드 단백질 발현을 위해 vORF2 및 sORF2 유전자가 삽입된 벡터와 전달벡터인 pBacPAK8(Clontech)을 Bgl II로 절단하였다.
아가로스겔상에서 삽입유전자인 vORF2와 sORF2 유전자만을 추출, 정제하였으며, 절단된 전달벡터는 Alkaline phosphatase를 처리하였다. vORF2 및 sORF2 유전자와 전달벡터에 T4 ligase를 첨가하여 실온에서 하룻밤 반응시켜 접합(ligation)시켰다.
상기 접합된 플라스미드는 대장균(DH5a)에 형질전환하고, 정방향으로 삽입된 벡터를 제한효소 처리를 통해 선발하였다. 도 3은 vORF2 유전자가 클로닝된 전달 벡터 지도를 나타낸 것이고, 도 4는 sORF2 유전자가 클로닝된 전달 벡터 지도를 나타낸 것이다.
< 실시예 4> PCV2 의 vORF2 및 sORF2 유전자의 형질도입
재조합 베큘로바이러스를 제작하기 위하여, 혈청 무첨가 Sf-900 II 배지(Invitrogen)에 배양된 곤충세포(Spodoptera frugiperda, Sf9)를 4x106 개/ml로 부유하여 60mm 세포배양용 페트리 디시에 5ml씩 분주하여 27℃에서 정치시켰다.
1시간 후 배지를 버리고, 신선 배지로 2회 세척하여 부착되지 않고, 세포 활성이 좋지 않은 세포를 제거하였다. 형질도입(transfection)을 위해 PCV2의 vORF2 및 sORF2 유전자가 삽입된 전달벡터(pBacPAK8PCV2vORF2 및 pBacPAK8PCV2sORF2)를 대량으로 정제하여 최종 농도가 0.5㎍/㎕가 되도록 조정하였다.
PCV2의 vORF2 및 sORF2 유전자가 삽입될 배큘로바이러스 DNA는 단백질 folding을 돕는 열충격 단백질인 heat shock protein 40(Hsp40)과 heat shock congnate 70 protein(Hsc70)의 샤페론(chaperone) 유전자와 발현 유무를 쉽게 확인하기 위하여, 녹색형광 단백질(green fluorescence protein, GFP) 유전자가 삽입되어 있는 Profold C1(AB vector)을 사용하였다.
별도의 튜브에 전달 벡터를 각각 10㎕ 씩 분주하고, 250㎕의 항생제와 혈청이 첨가되지 않은 배지와 0.5㎍의 Profold C1을 첨가하여 가볍게 혼합하였다. 별도의 튜브에 형질도입 용액인 cellfectin(Invitrogen) 30㎕와 250㎕의 상기 배지를 첨가하여 가볍게 혼합한 다음 실온에서 30분간 정치시켰다.
배큘로바이러스 전달 벡터 및 배큘로바이러스 DNA가 포함된 튜브에 cellfectin이 포함된 배지를 넣고 가볍게 혼합한 다음, 실온에서 약 20분간 정치한 후, 세포에 한 방울씩 조심스럽게 분주하였다.
형질도입된 페트리 디시는 27℃에서 4시간 배양한 후, 상청액을 버리고 항생제와 혈청이 첨가된 배지로 교체하여 6일간 배양하였다. 배양기간에 형광 현미경으로 재조합 배큘로바이러스의 증식을 확인하였다.
최종 배양액을 수거한 후, 새로운 곤충세포에 재접종하여 배양하면서 형광발색 및 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 확인하였다. 수거된 바이러스 배양액은 소분하여 -70℃와 4℃에 각각 보관하였다.
도 5는 PCV2 야외 분리주의 ORF2 유전자 삽입 배큘로바이러스(reBacPCV2vORF2, 좌) 및 코돈 최적화에 의한 합성 ORF2 유전자가 삽입된 배큘로바이러스(reBacPCV2sORF2, 우) 감염 곤충세포의 형광발색 사진이다.
< 실시예 5> 재조합 베큘로바이러스의 정제
형질도입을 실시하고 1대 계대한 바이러스 배양액에서 바이러스 플라크법(plaque assay)을 통해 재조합 베큘로바이러스를 순수 정제하였다.
먼저 8개의 60mm 세포배양용 페트리 디시에 0.5x106 개/ml의 Sf9 세포를 4ml 분주하여 2시간 배양하고, 2회 세척후 현미경 경검을 통해 세포의 활성을 관찰하였다. 각각의 바이러스 배양액을 배지를 이용하여 10진 희석한 후, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 희석 바이러스 배양액을 각각의 페트리 디시에 1ml씩 분주하였다.
접종 페트리 디시를 1시간 동안 천천히 회전 배양하는 사이에 미리 37℃에서 예열된 1.25% 아가로스(SeaPalaque agarose)가 포함된 배지를 준비하였다.
1시간 배양이 끝난 각각의 페트리디시에서 접종액을 제거한 후, 아가로스가 포함된 배지를 조심스럽게 4ml씩 분주하고 물에 적셔진 종이를 깔은 상자에 페트리 디시를 넣고 27℃에서 7일간 배양하였다. 배양기간중 CPE와 형광 발색이 나타나는 여러 개의 플라크를 채집하여 각각 상기의 방법대로 배양하여 보관하였다.
< 실시예 6> PCV2 재조합 베큘로바이러스의 확인
Plaque assay를 통해 순수 배양된 각각의 바이러스 배양액으로부터 DNA를 추출하였다. PCV2 vORF2 유전자가 삽입된 재조합 배큘로바이러스(reBacPCV2vORF2)와 PCV2 sORF2 유전자가 삽입된 재조합 배큘로바이러스(reBacPCV2sORF2)를 감별하기 위하여 추출된 DNA를 이용하여 PCR을 실시하였다.
즉, reBacPCV2vORF2를 확인하기 위해 서열번호 5의 정방향 프라이머(5'-gaagatcttcatgacgtatccaaggag-3')와 서열번호 6의 역방향 프라이머(5'-gaagatcttcttagggtttaagtgggg-3')를 사용하였고, reBacPCV2sORF2를 확인하기 위해 서열번호 7의 정방향 프라이머(5'-cagatggaggcgtaagaac-3')와 서열번호 8의 역방향 프라이머(5'-aaccctgatgttgtag tcctg-3')와 같은 프라이머를 사용하였다.
도 6과 같이, reBacPCV2vORF2는 야외주에 대한 프라이머를 이용한 PCR에서 증폭이 확인되었고, reBacPCV2sORF2는 코돈 최적화된 합성 유전자에 대한 프라이머를 이용한 PCR에서만 증폭이 확인되었다. 최종 확인된 바이러스 클론을 대량 증식배양하여 역가 확인후 -70℃와 4℃에 각각 보관하였다.
< 실시예 7> PCV2 재조합 캡시드 단백질의 확인
PCV2 재조합 캡시드 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 최종 선발된 재조합 배큘로바이러스인 reBacPCV2vORF2와 reBacPCV2sORF2를 24웰에 부착되어 있는 Sf9 세포에 접종하였다.
배양 3일째에 상청액을 버리고, Sf9 세포를 건조시킨 후, 차가운 80% 아세톤을 첨가하여 10분간 세포를 고정하였다. 고정된 감염세포는 PBS로 1회 세척한 후, PCV2의 캡시드 단백질에 특이적으로 반응하는 단크론항체(12C48, Median diagnostic)를 37℃에서 1시간 반응시켰다.
3회 세척후 바이오틴이 부착된 항마우스 IgG(biotinylated anti-mouse IgG, Vector Lab)를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3회 세척후 아비딘이 부착된 페록시다제(avidin-HRPO)를 37℃에서 1시간 반응시켰다.
3회 세척후 신선한 디에비(diaminobenzidine, DAB)를 분주하고 세포의 염색을 확인하고, 증류수로 세척한 다음 현미경으로 경검하였다.
도 7은 감염 Sf9 세포질에 발현된 PCV2 캡시드 단백질이 염색된 결과를 나타낸 것이다.
< 실시예 8> PCV2 vCap 과 sCap 의 발현률 비교
PCV2의 vCap과 sCap의 세포내 발현효율을 비교하기 위하여, 역가가 측정된 reBacPCV2vORF2와 reBacPCV2sORF2 바이러스를 동일한 수의 세포가 배양된 플라스크에 2MOI와 20MOI로 각각 접종하였다.
접종 2일째부터 4일째까지 감염세포를 수거하고, 곤충세포 용해액(lysis buffer)을 동일하게 첨가하여 초음파 분쇄후, 그 상청액을 수거하였다. 수거된 상청액을 효소면역 측정법용 고정액(coating buffer)으로 100배부터 2진 단계 희석하여 효소면역 측정용 플레이트(Nunc)에 100㎕씩 분주하여 4에서 하루밤 고정하였다.
재조합 항원이 고정된 플레이트를 세척액으로 3회 세척 후, 3%의 탈지유(skim milk)를 150㎕씩 분주하여 37에서 1시간 반응시켰다. 3회 세척 후, 0.5㎍/ml의 PCV2 캡시드 단백질에 대한 특이 단클론 항체(12C48, Median diagnostic)를 100㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다.
5회 세척 후, 1㎍/ml의 항 마우스 IgG(anti-mouse IgG, KPL)를 100㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 5회 세척 후, 기질 용액인 TMB(tetramethyl benzidine substrate solution, KPL)를 100㎕씩 분주하여 실온에서 20분간 반응시킨 후, 4N H2SO4를 50㎕씩 분주하여 반응을 종료하였다.
플레이트의 흡광도를 450nm에서 측정한 후, 광학 밀도(optical density, OD) 수치가 가장 높은 웰을 기준으로 vCap과 sCap의 발현효율을 비교하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 2MOI 및 20 MOI 역가의 바이러스를 접종하였을 경우, reBacPCV2vORF2 접종을 통한 vCap 발현률보다는 reBacPCV2sORF2 접종을 통한 sCap의 발현률이 약 2배 높은 것으로 확인되었다.
또한, PCV2의 vCap과 sCap의 세포내 발현효율을 비교하기 위하여, 20MOI로 reBacPCV2vORF2와 reBacPCV2sORF2를 각각 접종하고, 3일간 배양한 후, 수거한 세포 용해액을 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 비교한 결과, 도 9와 같이 sCap의 발색 강도가 vCap보다는 높은 것으로 확인되었다.
< 실시예 9> PCV2 vCap 과 sCap 의 면역능 비교
PCV2의 vCap과 sCap의 면역 유도반응을 비교하기 위하여, 20MOI의 reBacPCV2vORF2와 reBacPCV2sORF2를 각각 접종하고 3일간 배양한 후, 수거한 세포 용해액을 PBS로 10배 희석한 후, 어쥬번트(ISA70)를 혼합하여 균질하였다.
PCV2의 vCap과 sCap가 포함된 접종액을 산란계 5두씩에 1 ml 근육 접종하고 3주후 동량을 2차 접종하였다. 접종된 산란계에서 1차 접종 3주 후, 2차 접종 4주후 및 2차 접종 8주 후에 상완정맥을 통해 채혈하여 혈청을 분리하였다.
각각의 혈청내 존재하는 PCV2 캡시드 단백질에 대한 항체 수준을 확인하기 위하여, 상용화된 브로킹 효소면역측정법(Blocking ELISA, Synbiotics)을 이용하여 측정하였다. 각 혈청을 1,000배 희석한 후, 각각의 검사 웰에 첨가하고 제조사의 사용방법에 따라 시험하였다.
최종 450nm에서 각각의 웰의 OD 수치를 측정한 후 술식(1-검사혈청 OD/음성대조 OD)에 따라 혈청 역가가 계산하였다. 도 10에서 보는 바와 같이, PCV2의 vCap보다는 sCap을 접종한 닭에서 항체 형성이 높은 것을 확인할 수 있다.
PCV2의 ORF2 유전자가 곤충세포에서 효과적으로 번역되도록 코돈 최적화된 본 발명의 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법에 의해 항원을 생산할 경우, 동일한 조건에서 면역 항원의 생산효율이 향상시킬 수 있으므로, 경제적이고 효과적인 PCV2의 재조합 백신을 생산할 수 있고, 이를 이용하여 PCV2에 대한 예방관리를 더욱 효율적으로 할 수 있다.
<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> ORF2 recombinant gene of porcine circovirus type 2, transfer vector, recombinant vaculovirus, recombinant capsid protein of porcine circovirus type 2 and manufacturing method thereof <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> porcine circovirus type 2 <220> <221> gene <222> (1) <223> ORF2 gene <400> 1 atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga agaagacacc gtccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgctaccg ttggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caagcgtacc 180 acagtcacaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaagcttga cgactttgtt 240 cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctccccc atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360 actgctgtta ttctagatga taactttgta ccaaaggcca cagccctaac ctatgaccca 420 tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480 ttcacaccca aacctgttct ggactccact attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540 aatcagcttt ggctgaggct acaaacctct agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 2 gaagatcttc atgacgtatc caaggag 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 3 gaagatcttc ttagggttta agtgggg 27 <210> 4 <211> 702 <212> DNA <213> porcine circovirus type 2 <220> <221> gene <222> (1) <223> recombinant ORF2 gene <400> 4 atgacctatc cgagacgaag gtacagacga aggagacacc gtccacgtag tcatctgggc 60 caaatcctga ggaggcgacc atggttggtt catcccagac acaggtacag atggaggcgt 120 aagaacggca tcttcaacac gcgtctgtca aggaccttcg gatacacggt taagcgcacc 180 acagtgacta ccccttcttg ggcagtcgac atgatgcggt tcaagctgga cgactttgtg 240 ccacctggcg gcgggactaa caagatcagc atccctttcg agtactaccg catccgaaag 300 gtgaaggtgg aattctggcc ttgctctccc ataacgcagg gtgatagggg tgttggcagt 360 actgctgtca tcctggacga caacttcgtg ccgaaagcaa ctgcgctcac atacgaccca 420 tacgtgaact acagctctag gcacactatc cctcagccat ttagctacca ctccaggtac 480 tttaccccta aaccggtcct tgatagcacc atcgactact tccagcccaa caacaagcgg 540 aatcagcttt ggcttcgtct gcaaacctca cgtaacgtgg atcacgtggg cctcggaacg 600 gctttcgaga actccaagta cgaccaggac tacaacatca gggttacgat gtacgtgcag 660 ttcagggagt tcaacctgaa ggatccgcca cttaagccct aa 702 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gaagatcttc atgacgtatc caaggag 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gaagatcttc ttagggttta agtgggg 27 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 cagatggagg cgtaagaac 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 aaccctgatg ttgtagtcct g 21

Claims (10)

  1. 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하고, 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자를 코돈 최적화한 ORF2 재조합 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 ORF2 재조합 유전자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코돈 최적화는 상기 서열번호 1로 이루어지는 ORF2 유전자 전체 염기서열의 GC 비율의 평형화, 및 헬릭스(helix) 구조의 염기서열 개수와 길이의 감축을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 ORF2 재조합 유전자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 ORF2 재조합 유전자를 포함하는 전달 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전달 벡터가 제4도에 개시된 개열지도를 갖는 전달 벡터 pBacPAK8PCV2sORF2인 것을 특징으로 하는 전달 벡터.
  6. 제4항의 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스.
  7. 제6항의 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 발현률은, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 ORF2 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 발현률의 1.5배 내지 2배 높은 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 재조합 캡시드 단백질의 항체 형성능은, 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 야외 분리주의 ORF2 유전자를 포함하는 전달 벡터로 형질도입된 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 캡시드 단백질의 항체 형성능의 1.5배 내지 2배 높은 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질.
  10. 제6항의 재조합 배큘로바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 돼지써코바이러스 2형(PCV2) 재조합 캡시드 단백질의 제조방법.
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