KR20210089975A - 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법 - Google Patents
돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
유전자 재조합 기술을 통해, 돼지 써코바이러스 2형 백신을 짧은 시간과 낮은 비용으로 대량 생산하는데 이용될 수 있는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 안정성이 우수한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 클로닝 및 단백질 발현에 유리한 재조합 배큘로 바이러스를 제공한다.
Description
돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 재조합 배큘로 바이러스, 이들을 이용한 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법, 이로부터 제조된 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 단백질 및 상기 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 관련 질병(PCVAD; Porcine circovirus associated disease)은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)이 원인체가 되어 발생하는 것으로 널리 알려진 양돈 질병이다.
대표적인 돼지 써코바이러스 관련 질병으로는 만성 소모성증후군(PMWS; porcine multisystemic wasting syndrome), 돼지 피부염 신장애증후군(PDNS; porcine dermatitis and nephritis syndrome), 돼지 호흡기 복합감염증(PRDC; porcine respiratory disease complex) 등이 있으며, 드물게 번식질환도 관련될 수 있다. 이러한 돼지 써코바이러스 관련 질병은 개체별 폐사율이 높고, 다른 바이러스와 동시 감염될 위험성이 있어 양돈 산업에 큰 피해를 유발하고 있다. 또한, 현재 돼지 써코바이러스 관련 질병에는 특이적인 치료법이 없는 상태이며, 항염증제나 항생제를 통해 대증 요법을 통해 대응하여야 하는 어려움이 있어, 이러한 질병을 미리 예방하는 것이 매우 중요하다.
그러나, 돼지 써코바이러스 2형은 환경과 유기화합물에 대한 저항성이 매우 강하여, 클로로헥시딘(chlorhexidine), 에탄올(ethanol), 요오드제재(iodine) 등과 같은 종래의 소독제로 완전한 소독이 어렵고, 재발을 방지하기도 어려우므로, 일반적인 예방법만으로는 근절이 쉽지 않다.
한편, 오픈 리딩 프레임은 특정 유전자 내에서 단백질을 발현시킬 가능성이 있는 염기 서열로, 전사 과정에서 시작코돈과 종결코돈이 달라질 수 있는 특징이 있다. 돼지 써코바이러스 2형에서 오픈 리딩 프레임은 크게 ORF 1, ORF 2, ORF 3의 3가지로, ORF1은 복제효소 단백질과 연관되고, ORF2는 캡시드 단백질(casid protein)과 연관된 것으로 알려져 있으며, ORF3는 아직 그 역할이 정확히 확인되지 않았다.
이 중 ORF 2와 관련된 캡시드 단백질은 질병의 감염에 직접적으로 관여하면서도 면역 반응에서 혈청학적으로 인식되기 쉬운 특성이 있어, 이러한 특성을 활용한 백신 개발에 대한 연구가 증가하고 있다. 돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질을 이용한 백신은, 다양한 방식의 백신 중에서도 면역 반응을 유도하기에 유리하며, 이에 의한 감염 예방 효과가 큰 장점이 있다.
이에 따라, 돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질을 이용한 백신을 생산하는 방법에 대한 관심이 높아지고 있으며, 감염 예방성을 높이면서도, 제조 시간을 감축하고, 생산 수율을 높일 수 있는 백신 제조 기술의 필요성도 함께 증가하고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 유전자 재조합 기술을 통해, 돼지 써코바이러스 2형 백신을 짧은 시간과 낮은 비용으로 대량 생산하는데 이용될 수 있는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 안정성이 우수한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 클로닝 및 단백질 발현에 유리한 재조합 배큘로 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제조 시간과 제조 비용이 단축되고, 수율 및 제조 효율성이 더욱 향상된 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자로부터 얻어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 감염 예방성이 우수하며, 종래에 비해 수용성이 향상된 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질 및 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호 5의 염기서열에서 1번째 내지 150번째 서열이 서열번호 1의 염기서열로 치환된 써코바이러스 2형(PCV2; Porcine circovirus type 2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2; Open Reading Frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 발현 벡터 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자가 주입된 재조합 배큘로 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자를 백본 벡터(backbone vector)에 삽입하여 발현 벡터(expression vector)를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 매개 바이러스에 주입하여 재조합 바이러스(recombinant virus)를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 바이러스를 숙주 세포에 감염시켜 증폭 및 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
상기 매개 바이러스는 배큘로 바이러스(recombinant baculovirus)이고, 상기 발현 벡터의 백본 벡터는 pFastBac1이고, 상기 숙주 세포는 Sf9(Spodoptera frugiperda Sf9 cell), Sf21(Spodoptera frugiperda Sf21 cell) 및 High Five Cells (BTI-TN-5B1-4)= Tn5(trichoplucia ni 5 cell) 중 1종 이상을 포함하는 곤충 세포(insect cells)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 전술한 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 유전자 재조합 기술을 통해, 돼지 써코바이러스 2형 백신을 짧은 시간과 낮은 비용으로 대량 생산하는데 이용될 수 있는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 안정성이 우수한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 클로닝 및 단백질 발현에 유리한 재조합 배큘로 바이러스를 제공한다.
본 발명은 제조 시간과 제조 비용이 단축되고, 수율 및 제조 효율성이 더욱 향상된 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 유전자로부터 얻어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 감염 예방성이 우수하며, 종래에 비해 수용성이 향상된 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질 및 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 3의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 모식도이다.
도 3은 종래의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 사용된 백본 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 전기영동 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에서 서열 치환이 완료된 후의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자를 포함하는 pFastBac1-PCV2 ORF2 Bacmid DNA의 전기영동 결과이다.
도 7은 비교예 1에서 형질전환된 곤충세포의 전자 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1에서 형질전환된 곤충세포의 전자 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 1에서 제조된 단백질을 포함하는 백신 조성물의 방어능 확인을 위하여 공격 접종에 따른 항체 역가 변화 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 서열 차이를 보여주는 정렬 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 3의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 모식도이다.
도 3은 종래의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 사용된 백본 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 전기영동 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에서 서열 치환이 완료된 후의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자를 포함하는 pFastBac1-PCV2 ORF2 Bacmid DNA의 전기영동 결과이다.
도 7은 비교예 1에서 형질전환된 곤충세포의 전자 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1에서 형질전환된 곤충세포의 전자 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 1에서 제조된 단백질을 포함하는 백신 조성물의 방어능 확인을 위하여 공격 접종에 따른 항체 역가 변화 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 서열 차이를 보여주는 정렬 결과이다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호 5의 염기서열에서 1번째 내지 150번째 서열이 서열번호 1의 염기서열로 치환된, 써코바이러스 2형(PCV2; Porcine circovirus type 2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2; Open Reading Frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 써코바이러스 2형 오픈 리딩 프레임 2 유전자 재조합 기술에 적용함으로써, 감염 예방성이 우수하면서도 종래에 비해 수용성이 향상된 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질 및 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 단백질의 제조 시간과 제조 비용이 단축되고, 수율 및 제조 효율성이 더욱 향상된 방법으로 상기 단백질을 포함하는 백신 조성물을 대량 생산할 수 있다.
특히, 본 발명의 서열번호 1의 핵산 염기서열은 종래의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2의 1 내지 150 bp 부위에 치환됨으로써, 수용성이 향상된 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 대량으로 생산하는데 이용된다.
이러한, 서열번호 1의 염기서열과 상기 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 제조하는 방법은, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 돼지 써코바이러스 관련 질병(PCVAD)이 발병된 돼지로부터 돼지 써코바이러스 2형의 유전자를 분리한 후, 서열번호 5의 오픈 리딩 프레임 2 유전자를 PCR 증폭시켜 확보하고, 유전자 합성 기술을 이용하여 상기 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 1~150 bp 부위를 서열번호 1의 염기서열로 치환하는 것일 수 있다.
이때, 상기 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2은 ATG 트리플렛(triplet)을 개시코돈으로 갖고, 상기 개시 코돈을 1bp, 2bp, 3bp로 하는 위치를 기준으로 1~150 bp 부위에 상기 서열번호 1의 유전자를 포함한다. 이와 같이 치환된 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2의 전체 유전자 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.
또한, 본 발명의 서열번호 3의 유전자를 포함하는 서열번호 3의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자(이하, 서열번호 3의 유전자)의 모식도를 첨부된 도 2에 나타내었다. 또한, 비교를 위해 치환되기 전인 종래의 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 유전자의 모식도를 도 3에 나타내었다.
본 발명의 다른 구현예는 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자를 백본 벡터(backbone vector)에 삽입하여 발현 벡터(expression vector)를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 매개 바이러스에 주입하여 재조합 바이러스(recombinant virus)를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 바이러스를 숙주 세포에 감염시켜 증폭 및 발현시키는 단계;를 포함한다.
이를 통해 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법의 제조 시간과 제조 비용을 단축하면서도, 단백질 및 면역 활성 물질의 수율 및 제조 효율성을 현저하게 향상시키는 효과를 구현한다.
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자는 전술한 바와 같다.
상기 발현 벡터(expression vector)를 제조하는 단계에서, 발현 벡터의 종류는 상기 서열번호 3의 유전자를 포함하는 한 어떠한 것이든 될 수 있으며, 예를 들면, 상기 유전자가 삽입된 유전자 단편이 삽입된 벡터, 플라스미드, 재조합 DNA 등일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 발현 벡터로 플라스미드를 이용하는 경우, 숙주세포 또는 수용성 세포 내에 더욱 효율적으로 삽입될 수 있으며, 표지에 의한 선별이 쉽고, 대량 생산성 및 형질 전환 안정성 향상에 더욱 우수한 효과가 있다.
다른 구체예에서, 상기 발현 벡터로 재조합 DNA를 이용하는 경우, 숙주세포 내에 더욱 효율적으로 삽입되고, 증식능이 향상되어, 대량 생산성 및 형질 전환 안정성 향상에 더욱 우수한 효과가 있다.
상기 발현 벡터를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 전술한 서열번호 3의 유전자를 백본 벡터에 삽입 후 클로닝하는 것일 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 발현 벡터는 클로닝 및 발현율이 높고, 유전자 삽입에 안정성이 우수하여, 단백질 생산능을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 발현 벡터의 백본 벡터(backbone vector)는 pFastBac1일 수 있다. 이러한 경우, 전술한 본 발명의 서열번호 3의 유전자에 대한 상용성 및 클로닝 효율이 더욱 우수할 수 있다.
상기 백본 벡터는 제한효소 처리되어, 절단된 부위에 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 유전자를 결착시킬 수 있다. 절단에 이용되는 제한효소는 특별히 제한되지 않으나, BamHI 및 HindⅢ일 수 있다. 이러한 제한 효소를 사용하는 경우, 백본 벡터에 대해 우수한 상용성을 가질 수 있으며, 형질전환율을 더욱 향상시킬 수 있다. 이와 같이 제한효소로 BamHI 및 HindⅢ를 사용하는 경우, 서열번호 3의 유전자도 이와 동일한 제한효소에 의해 처리될 수 있다.
또한, 상기 제한효소는 벡터 내의 발현 방향에 맞춰 알맞은 제한효소를 이용할 수 있으며, 예를 들면 정방향에서 BamHI, 역방향에서 HindⅢ을 사용할 수 있다. 이러한 경우의 제한 효소 처리된 백본 벡터의 모식도를 도 4에 나타내었다.
상기 재조합 바이러스(recombinant virus)를 제조하는 단계에서 재조합 바이러스는 매개 바이러스에 상기 발현 벡터가 주입된 것을 의미한다. 이때, 매개 바이러스에는 상기 발현 벡터가 직접 주입되거나, 또는 발현 벡터로부터 분리된 재조합 DNA가 직접 주입될 수 있다.
상기 매개 바이러스는 배큘로 바이러스일 수 있다. 이와 같이 배큘로 바이러스에 상기 발현 벡터가 주입된 재조합 배큘로 바이러스는 폴리헤드린 프로모터와 같은 발현성이 매우 강한 프로모터를 포함하고 있어 단백질의 대량 생산성을 구현할 수 있다.
상기 재조합 바이러스는 숙주 세포에 감염시켜 증폭 및 발현시키는 단계를 통해, 서열번호 3의 유전자로부터 돼지 써코바이러스 2의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 대량 생산하는데 이용된다.
상기 숙주 세포는 재조합 바이러스에 이용되는 매개 바이러스에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 매개 바이러스가 배큘로 바이러스인 경우, 곤충 세포(insect cells)일 수 있다. 이러한 경우, 상기 재조합 배큘로 바이러스에 대한 증폭 및 발현이 더욱 활발하게 진행될 수 있다.
보다 구체적으로 상기 숙주 세포는 Sf9(Spodoptera frugiperda Sf9 cell), Sf21(Spodoptera frugiperda Sf21 cell) 및 High Five Cells (BTI-TN-5B1-4)= Tn5(trichoplucia ni 5 cell) 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 재조합 배큘로 바이러스에 대한 증폭 및 발현이 더욱 활발하게 진행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 전술한 제조 방법에 의해 수득되는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질은 서열번호 3의 유전자로부터 코딩되는 것으로, 이러한 단백질은 감염 예방성이 우수하며, 종래에 비해 수용성이 향상되어 백신 활성능이 우수할 뿐만 아니라, 제조 비용을 현저하게 감축시킬 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 본 명세서에서 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예 1
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 유전자의 제조
본 발명의 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 준비하기 위해, 돼지 써코바이러스 관련 질병(PCVAD)이 발병된 국내 돼지 농장의 돼지로부터 림프절에서 시료를 채취하여 Virus를 분리하였다. 분리된 Virus를 Circo Free PK-15 Cell Line에서 10계대 배양하여 Virus 배양액을 확보하였다. 상기의 배양액을 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit의 Manual에 따라 실험을 진행하여 PCV2 DNA를 추출하였다(Cat#9766). 상기와 같이 추출된 PCV2 DNA를 주형가닥으로 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 BIOFACT 2X Pfu PCR Master MIX2를 이용하여 진행하였다(Cat. PD302-50H). PCR용 Tube에 BIOFACT사의 매뉴얼에 따라 PCV2 DNA와 중합효소를 첨가한 후 Thermofisher사의 ProFlex PCR System을 이용하여 95℃에서 5분간 열처리한 후 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 35 사이클 실시하고 마지막으로 72℃ 10분간 처리하였다. 이로부터 증폭된 PCV2 ORF2 유전자를 얻었다. 최종 PCR 반응이 끝난 뒤 1% Agarose gel에 110v로 15분간 전기영동을 하여 증폭된 PCV2 ORF2 유전자를 확인하였다. PCV2 ORF2 유전자의 확인 결과는 하기 도 5에 나타내었다. 이와 같이 얻어진 PCV2 ORF2 유전자를 Bioneer사에 의뢰하여 유전자 합성법을 통해 1~150 bp 부위를 서열번호 1의 염기서열로 치환하여, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 유전자를 준비하였다. 이 1-150 bp의 서열로 코딩되는 폴리펩타이드는 분자량이 6053 da이고 PI가 7.93이며, 이를 포함하는 PCV2 ORF2 전체 단백질의 분자량은 27.2 Kda이고, PI는 9.26이다.
치환이 완료된 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 유전자를 1% Agarose gel에 110v로 15분간 전기영동을 하여 서열번호 3의 유전자를 확인하였다. 서열번호 3의 유전자에 대한 확인 결과는 하기 도 6에 나타내었다.
발현 벡터의 제조
상기 서열번호 3의 유전자와 pFastBac1 벡터에 각각 BamHI, HindⅢ을 2ul씩 첨가하여 제한효소로 처리한 후, 제한효소 처리된 서열번호 3의 유전자 1ul와 pFastBac1 1ul, T4 DNA ligase 1ul, 2x ligase buffer 5ul, Water 2ul를 넣고 혼합하여 4시간 동안 ligation을 실시하여 발현 벡터를 제조하였다.
재조합 DNA의 분리
실시예 1에서 제조된 발현 벡터(FastBac1-PCV2 ORF2)를 이용하여 재조합 배큘료 DNA를 Bac-to-Bac®(Thermo Fisher Scientific, USA) 메뉴얼에 따라 제조하였다.
재조합 배큘로 바이러스의 제조(Baculo Virus DNA Transfection)
숙주세포인 곤충세포 sf9 cell(SFM adaptation)을 T-25 플라스크에 2X106 세포를 넣어주고, 27℃에서 1시간 부착하는 동안 앞서 수득한 재조합 배큘로 DNA 2ug과 Cellfectin(Thermo Fisher Scientific, USA) 20ul와 Grace media(Thermo Fisher Scientific, USA) 250ul의 혼합액을 제조하고, 세포 부착 1시간이 경과하였을 때 플라스크의 배지를 제거한 뒤 위에서 제조한 혼합액을 T-25 플라스크에 균일하게 분주하여 준 후 27℃ 배양기에 플라스크를 보관하여 30분간격으로 플라스크를 shaking하였다. 4시간이 경과하면 플라스크의 혼합액을 제거하여 주고, Sf-900II SFM(Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 5ml 넣어준 뒤, 27℃ 배양기에서 4일간 배양하였다. 위의 T-25 플라스크의 배양액 5ml을 수확하여 PCV2 ORF2 재조합 배큘로 바이러스 시료 1로 지정하였다.
재조합 배큘로 바이러스의 발현
상기와 같이 제조된 재조합 배큘로 바이러스를 이용하여 바이러스의 증폭 및 재조합 단백질의 생산에 이용하였다.
비교예 1
재조합 배큘로 바이러스 제조 단계에서 재조합 배큘로 DNA없이 혼합액을 제조하며, 나머지 과정은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
비교예 2 (야생형 바이러스 백신)
실시예 1과 1-150 bp까지의 유전자만 다르며(도 12a 참조) 실험예 3까지 모두 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 이 1-150 bp의 서열로 코딩되는 폴리펩타이드는 분자량이 6630 da이고 PI가 12.94이며, 이를 포함하는 PCV2 ORF2 전체 단백질의 분자량은 27.8 Kda이고, PI는 10.87이다.
비교예 3 (CADIDATE 1)
실시예 1과 1-150 bp까지의 유전자만 다르며(도 12b 참조) 실험예 3까지 모두 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 이 1-150 bp의 서열로 코딩되는 폴리펩타이드는 분자량이 6179 da이고 PI가 10.28이며, 이를 포함하는 PCV2 ORF2 전체 단백질의 분자량은 27.3 Kda이고, PI는 9.69이다.
비교예 4 (CADIDATE 2)
실시예 1과 1-150 bp까지의 유전자만 다르며(도 12c 참조) 실험예 3까지 모두 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 이 1-150 bp의 서열로 코딩되는 폴리펩타이드는 분자량이 5684 da이고 PI가 2.49이며, 이를 포함하는 PCV2 ORF2 전체 단백질의 분자량은 26.8 Kda이고, PI는 4.54이다.
<실험예에 의한 효과성 평가>
실험예 1
실시예 1 및 비교예 1에서 재조합 배큘로 바이러스 DNA가 정상적으로 곤충세포 내에 정상적으로 도입 되었는지의 여부를 평가하기 위해, 실시예 1의 재조합 배큘로 바이러스의 제조단계의 Transfection 과정에서 재조합 배큘로 DNA 2ug과 Cellfectin(Thermo Fisher Scientific, USA) 20ul로 처리한 혼합액과 재조합 배큘로 DNA를 넣지 않고 Cellfectin만을 처리한 control을 Grace media(Thermo Fisher Scientific, USA) 250ul의 혼합액을 제조하고, 세포 부착 1시간이 경과하였을 때 플라스크의 배지를 제거한 뒤 위에서 제조한 혼합액을 T-25 플라스크에 균일하게 분주하여 준 후 27℃ 배양기에 플라스크를 보관하여 30분 간격으로 플라스크를 shaking하였다. 4시간이 경과하면 플라스크의 혼합액을 제거하여 주고, Sf-900II SFM(Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 5ml 넣어준 뒤, 27℃ 배양기에서 4일간 배양하였다. 4일간 배양한 T-25 flask의 세포를 10X 배율의 LEICA DMi8 전자 현미경의 10X 배율로 세포를 육안관찰 하였고, 이를 LAS X program을 이용하여 이미지를 촬영하였다. 결과는 도 7(비교예 1) 및 도 8(실시예 1)에 나타내었다.
도 8을 통해 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예 1은 recombinant Bacmid DNA가 정상적으로 Transfection되어서 sf9 세포의 성장이 둔화되며 baculovirus의 생성으로 인해 세포가 팽창 및 분해되어 있는 것을 볼 수 있다. 도 7을 통해 알 수 있는 바와 같이 비교예 1은 sf9 세포가 정상적으로 분화하여 밀도가 높게 형성되어 있는 것으로 확인되었다. 실시예 1에서 baculovirus가 정상적으로 생성되었다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2
단백질의 발현을 확인하기 위해, 실시예 1 및 비교예 2 내지 4의 세포를 배양액을 원심분리기에 12000 RPM, 10분간 원심분리하여 배양액만을 수확하였다. 수확한 배양액을 2X SDS sample buffer과 1:1로 micro centrifuge tube에 분주한 뒤 혼합하여 100℃에서 10분간 열처리한다. 샘플이 들어있는 tube를 원심분리기에 1000RPM, 10초간 처리하였다. TGX Stain-Free?? FastCast?? Acrylamide Solutions(BIO-RAD)를 이용하여 준비한 10% SDS-PAGE Unstained Protein Standards 마커를 넣어준 후 열처리된 실시예 1, 비교예 2-4의 샘플을 20ul씩 로딩하였다. 100Volts, 80분간 전기영동하여 ChemiDoc Touch를 이용하여 사진을 촬영하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 위에서 사진을 촬영한 SDS-PAGE를 PVDF membrane에 Transfer buffer를 이용하여 밀착시킨 후 Trans-Blot® TurboTM Transfer System을 이용하여 단백질을 PVDF membrane에 Transfer하였다. 단백질 Transfer된 PVDF membrane을 3% BSA(TBS-T) solution에 1시간 반응시켜 블록킹을 한 후 PVDF membrane를 TBS-T로 3회 세척한 후, HRP가 conjugation된 PCV2 monoclonal Antibody를 3% BSA(TBS-T) solution에 50ng/ml이 되게 섞어준 후 1시간 동안 항체반응을 진행하였다. PVDF membrane를 TBS-T로 3회 세척하여 항체 반응을 정지시킨 후 ClarityTM and Clarity MaxTM Western ECL Blotting Substrates(BIO-RAD)을 manual에 따라 PVDF membrane에 처리한 후, ChemiDoc Touch를 이용하여 Detection하였다. 결과는 도 10에 나타내었다.
상기 도 9 및 도 10를 통해 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예 1은 SDS-PAGE와 western blot 결과에서 단백질 발현이 원활한 것을 확인하였으며, 비교예 3 내지 4는 단백질의 발현이 비슷한 수준이고, 비교예 2는 실시예 1에 비해 단백질 발현량이 매우 적음을 확인하였다.
실험예 3
실험예 2에서 단순히 단백질의 발현 여부만을 확인하였기 때문에, 실질적인 단백질의 생산량을 측정하기 위하여, 실시예 1, 비교예 2-4 에서 제작된 재조합 배큘로 바이러스의 Titer를 BacPAKTM Baculovirus Rapid Titer Kit(Takara Bio, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정된 Titer를 이용하여 sf9 세포에 재조합 배큘로 바이러스를 MOI별로 접종하고, 27℃ 배양기에서 배양한 후, 접종 3일째부터 7일째까지의 배양액을 각 1ml씩 수확하여 단백질 생산량을 PCV2 Q-ELISA를 이용하여 비교하였다. 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
| MOI(multiplicity of infection)_실시예 1 | |||||
| Day | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 |
| 3 | 5ug/ml | 4.5ug/ml | 3ug/ml | 2.5ug/ml | 1.5ug/ml |
| 4 | 6ug/ml | 7.2ug/ml | 6ug/ml | 4.8ug/ml | 2.8ug/ml |
| 5 | 7ug/ml | 8.6ug/ml | 8.8ug/ml | 7ug/ml | 5ug/ml |
| 6 | 8ug/ml | 10.5ug/ml | 12ug/ml | 9.3ug/ml | 8ug/ml |
| 7 | 9ug/ml | 11ug/ml | 15ug/ml | 13ug/ml | 12ug/ml |
| MOI(multiplicity of infection)_비교예 2 | |||||
| Day | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 |
| 3 | 4.1ug/ml | 3.2ug/ml | 2.8ug/ml | 2.4ug/ml | 1.9ug/ml |
| 4 | 5ug/ml | 4ug/ml | 3.6ug/ml | 3.2ug/ml | 2.5ug/ml |
| 5 | 6.2ug/ml | 7ug/ml | 6.7ug/ml | 6.4ug/ml | 4ug/ml |
| 6 | 7.4ug/ml | 8ug/ml | 9ug/ml | 8ug/ml | 6ug/ml |
| 7 | 7.6ug/ml | 9.1ug/ml | 11ug/ml | 10ug/ml | 9.5ug/ml |
| MOI(multiplicity of infection)_비교예 3 | |||||
| Day | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 |
| 3 | 5.7ug/ml | 4.6ug/ml | 2ug/ml | 2.2ug/ml | 1ug/ml |
| 4 | 5.8ug/ml | 6.1ug/ml | 2.5ug/ml | 2.9ug/ml | 1.8ug/ml |
| 5 | 7ug/ml | 7ug/ml | 5.9ug/ml | 5.8ug/ml | 3.2ug/ml |
| 6 | 8.1ug/ml | 8.5ug/ml | 7.9ug/ml | 7.3ug/ml | 5.4ug/ml |
| 7 | 8.1ug/ml | 10ug/ml | 11.5ug/ml | 9.1ug/ml | 8.6ug/ml |
| MOI(multiplicity of infection)_비교예 4 | |||||
| Day | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 |
| 3 | 4.3ug/ml | 2.6ug/ml | 2.5ug/ml | 1.7ug/ml | 1ug/ml |
| 4 | 5.6ug/ml | 3.3ug/ml | 3.3ug/ml | 2.5ug/ml | 1.5ug/ml |
| 5 | 6.6ug/ml | 6.4ug/ml | 6.3ug/ml | 4.8ug/ml | 2ug/ml |
| 6 | 8ug/ml | 8ug/ml | 8.1ug/ml | 6.7ug/ml | 3.9ug/ml |
| 7 | 8.8ug/ml | 10.3ug/ml | 10.1ug/ml | 9.3ug/ml | 6.8ug/ml |
상기 표 1을 통해 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 재조합 배큘로 바이러스는 단백질을 충분히 생산하고 있으며, MOI 0.1 구간의 7일째 배양액 수확물에서 가장 높은 수율을 가짐을 알 수 있다. 이를 통해 본원발명이 15ug/ml의 최대 단백질을 얻을 수 있는 조건을 구하였고, 이로써 우수한 효과를 구현할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 4
실시예 1에서 제조된 단백질의 항체 형성 여부를 확인하기 위하여 동물실험을 진행하였다.
동물실험은 기니피그(guinea pig) 체중 300~400g (female) 6주령 5마리를 DBL로부터 구매하여 준비하였다. 동물실험실에 입실한 기니피그를 1주간 순치하여 키운 6주령의 기니피그에 개체에 1 내지 5의 번호를 임의로 지정한 후 실시예 1에서 얻어진 단백질을 정제하여 1 Dose당 10ug/ml을 부형제와 혼합하여 각 개체마다 1ml의 접종량이 되게 근육부위에 주사한 후, 1주일 간격으로 매주 채혈하여 10주간 실험을 진행하였다.
면역으로 생성된 항체를 확인하기 위하여 PCV2 항체 측정용 Blocking ELISA를 이용하여 확인하였으며, 항체 생성능이 있는 것을 확인하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 측정값은 S/N Value로 표현되며 일반적으로 S/N 값이 낮을수록 항체역가가 높은 것으로, S/N값이 0.4이하이면 양성인 혈청으로 표현한다.
| Week | ||||||||||
| No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 1 | 0.93 | 0.68 | 0.39 | 0.21 | 0.12 | 0.11 | 0.16 | 0.24 | 0.3 | 0.4 |
| 2 | 0.95 | 0.61 | 0.36 | 0.25 | 0.15 | 0.14 | 0.17 | 0.22 | 0.29 | 0.42 |
| 3 | 0.92 | 0.55 | 0.38 | 0.21 | 0.14 | 0.13 | 0.19 | 0.23 | 0.33 | 0.46 |
| 4 | 0.91 | 0.71 | 0.31 | 0.27 | 0.16 | 0.12 | 0.18 | 0.27 | 0.32 | 0.39 |
| 5 | 0.88 | 0.52 | 0.24 | 0.18 | 0.11 | 0.11 | 0.15 | 0.21 | 0.25 | 0.31 |
실험예 5
실시예 1에서 제조된 단백질 0.1mg과 Carbopol971 부형제 1mg을 생리식염수에 10ml에 혼합하여 제조한 백신 조성물을 이용하여 방어능을 확인하는 실험을 진행하였다. 위에서 제조한 백신 조성물을 돼지에 각 1ml씩 주사하였다.
실험은 돼지에서 진행하였으며, 실험군 5두 대조군 5두 비교군으로 국내 판매중인 PCV2 상용 백신 2종을 각각 5두씩 접종하여 실험을 진행하였으며, 백신접종 시기는 일반적인 백신 접종 권장 시기인 3주령 21일에 실시하였으며, 공격접종은 백신항체가 충분히 생성되는 백신접종 3주 후에 진행하였으며, 매주 채혈을 진행하여 항체 역가를 측정하였으며, PCR을 통하여 Virus의 존재 유무를 확인하였다.
항체 역가수준의 변화는 재조합백신 접종군과 A사, B사의 상용백신과 유의한 결과를 보였다. 공격접종 1주일 뒤부터 매주 혈액을 채취하여 PCR 검사를 진행하였다. 그 결과 공격접종 5주-6주 이후 3개의 백신 모두 Virus가 검출 되지 않았다. 위 결과를 종합하였을 때 재조합백신은 충분한 면역원성을 가지며, Virus 감염에 대한 충분한 방어능을 가지므로 PCV2 백신으로서 충분한 효용가치가 있을 것으로 판단된다. 공격접종 이후 PCR 검사 결과를 하기 표 6 및 도 11에 나타내었다.
| 검사 주차 | 1 W | 2 W | 3 W | 4 W | 5 W | 6 W | 7 W | 8 W | 9 W | 10 W |
| 음성대조군 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 음성 + 공격접종 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 재조합백신 | + | + | + | + | + | - | - | - | - | - |
| A사 | + | + | + | + | + | - | - | - | - | - |
| B사 | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - |
상기 표 6의 결과를 통해, 백신 조성물을 이용하여 방어능을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> Respectbio
<120> GENE FOR CORDING PCV2 ORF2 PROTEIN AND METHOD FOR MANUFACTURING
<130> AJP18245
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 1
atggacgctc ctactgagtt tcacgacaaa tcagtgagac aactgtggga caaaggtaac 60
gaacactaca tcagagtgcc tatcaacaaa gaatggggtc acactctgag acctgctaga 120
tacgaaggtt tctcaatgaa acaagaccac 150
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> Porcine circovirus
<400> 2
Met Asp Ala Pro Thr Glu Phe His Asp Lys Ser Val Arg Gln Leu Trp
1 5 10 15
Asp Lys Gly Asn Glu His Tyr Ile Arg Val Pro Ile Asn Lys Glu Trp
20 25 30
Gly His Thr Leu Arg Pro Ala Arg Tyr Glu Gly Phe Ser Met Lys Gln
35 40 45
Asp His
50
<210> 3
<211> 699
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 3
atggacgctc ctactgagtt tcacgacaaa tcagtgagac aactgtggga caaaggtaac 60
gaacactaca tcagagtgcc tatcaacaaa gaatggggtc acactctgag acctgctaga 120
tacgaaggtt tctcaatgaa acaagaccac cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180
acagtcagca cgccctcctg ggcggtagac atgctgagat ttaatcttga cgactttgtt 240
cccccaggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agttggatcc 360
agtgctatta ttctagatga caactttgta ataaaggcca cagcccaaac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480
ttcgcaccca aacctgttct tgattccact attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540
aatcagctgt ggatgagact ccaaaccagt agaaatgtcg accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccct 699
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> Porcine circovirus
<400> 4
Met Asp Ala Pro Thr Glu Phe His Asp Lys Ser Val Arg Gln Leu Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asn Glu His Tyr Ile Arg Val Pro Ile Asn Lys Glu Trp Gly
20 25 30
His Thr Leu Arg Pro Ala Arg Tyr Glu Gly Phe Ser Met Lys Gln Asp
35 40 45
His Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr Pro
50 55 60
Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Leu Asp Asp Phe Val Pro
65 70 75 80
Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg
85 90 95
Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln
100 105 110
Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Ile Ile Leu Asp Asp Asn Phe
115 120 125
Val Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser
130 135 140
Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe
145 150 155 160
Ala Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn
165 170 175
Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val
180 185 190
Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln
195 200 205
Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn
210 215 220
Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 5
<211> 699
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 5
atggcgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgcct ctggctcctc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180
acagtcagca cgccctcctg ggcggtagac atgctgagat ttaatcttga cgactttgtt 240
cccccaggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agttggatcc 360
agtgctatta ttctagatga caactttgta ataaaggcca cagcccaaac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480
ttcgcaccca aacctgttct tgattccact attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540
aatcagctgt ggatgagact ccaaaccagt agaaatgtcg accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccct 699
Claims (10)
- 서열번호 5의 염기서열에서 1 에서 150번째 서열이 서열번호 1의 염기서열로 치환된, 써코바이러스 2형(PCV2; Porcine circovirus type 2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2; Open Reading Frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자.
- 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자.
- 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
- 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로 바이러스(recombinant baculovirus).
- 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자를 백본 벡터(backbone vector)에 삽입하여 발현 벡터(expression vector)를 제조하는 단계;
상기 발현 벡터를 매개 바이러스에 주입하여 재조합 바이러스(recombinant virus)를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 바이러스를 숙주 세포에 감염시켜 증폭 및 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 매개 바이러스는 배큘로 바이러스(recombinant baculovirus)인 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 발현 벡터의 백본 벡터는 pFastBac1인 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 숙주 세포는 Sf9(Spodoptera frugiperda Sf9 cell), Sf21(Spodoptera frugiperda Sf21 cell) 및 Tn5(trichoplucia ni 5 cell) 중 1종 이상을 포함하는 곤충 세포(insect cells)인 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질.
- 제9항의 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스 2형 백신 조성물.
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| KR1020200003219A KR102397061B1 (ko) | 2020-01-09 | 2020-01-09 | 돼지 써코바이러스 2형의 오픈 리딩 프레임 2 단백질을 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 돼지 써코바이러스 2형 백신의 대량 생산 방법 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20140140158A (ko) * | 2013-05-28 | 2014-12-09 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 돼지써코바이러스 2형(pcv2)의 orf2 재조합 유전자, 전달 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 돼지써코바이러스 2형(pcv2) 재조합 캡시드 단백질 및 그의 제조방법 |
| KR20170050990A (ko) * | 2015-11-02 | 2017-05-11 | 주식회사 옵티팜 | PCV2(Porcine Circovirus type2) 백신의 대량 생산 방법 및 이를 이용한 백신 조성물 |
-
2020
- 2020-01-09 KR KR1020200003219A patent/KR102397061B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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