JP2023549460A - バキュロウイルス発現ベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、プロモーターの制御下でＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を組換え発現させるためのバキュロウイルス発現ベクターに関し、発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列と、翻訳エンハンサーＳｙｎ２１およびｐ１０ＵＴＲとを含む。本発明は、バキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法、およびワクチンの生成方法にさらに関する。

Description

本発明は、プロモーターの制御下で口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質を組換え発現させるためのバキュロウイルス発現ベクターに関し、発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列と、翻訳エンハンサーとを含む。本発明は、バキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法、およびワクチンの生成方法にさらに関する。

口蹄疫（ＦＭＤ）は、偶蹄類、家畜および野生動物の高度に伝染性の急性ウイルス性疾患である。口蹄疫（ＦＭＤ）は、国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）によって越境家畜伝染病として分類されている。口蹄疫（ＦＭＤ）はまた、届け出義務のある疾患である。口蹄疫は、アフリカ、南米、中東およびアジアの大部分で流行しており、世界的には家畜の最も経済的に重大な感染性疾患であり、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ならびに、バッファローおよびシカなどの他の偶蹄類種に発症する。ＦＭＤは、かつては世界中に広まっていたが、北米および西ヨーロッパを含むいくつかの地域では根絶されている。流行国では、ＦＭＤは、国際的な家畜取引に経済的制約をもたらし、厳しい予防措置が講じられていない限り、疾患のない地域に容易に再度広まり得る。ＦＭＤは家畜産業全体に影響を及ぼし、地域の農業従事者の収入が失われる。

現在のワクチンは、不活化ウイルスから作製されている。ウイルスが不活化される前に、生ＦＭＤウイルスが高度封じ込め施設で産生され、ＦＭＤワクチンの生成は制限されている。ＦＭＤに対する効果的なワクチン接種は、免疫原性が不十分であることが証明されているカプシド構成要素ではなく、インタクトなＦＭＤＶカプシドの存在を必要とする（Ｄｏｅｌ ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ，１９８２，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。不活化ＦＭＤウイルスは、カプシド構成要素では、酸性ｐＨまたは高温で容易に崩壊する脆弱な構造である。したがって、効果的なＦＭＤワクチンを家畜飼育者に届けるためには、低温流通体系が必要である。

現在の不活化ウイルスワクチンの欠点の多くを克服することができる市販のＦＭＤワクチンのための新しいワクチン技術が必要とされている。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）技術は、現在、従来の不活化ワクチンの実行可能な代替物となる可能性を有する数少ない技術の１つと考えられている。現在の技術と比較したＶＬＰ技術の利点には、例えば、製品安定性が高まること、産生場所の柔軟性が増大すること（低度封じ込め産生）、および新たな株のアウトブレイクに対するさらに迅速な応答がある。ＶＬＰベースのワクチンは、典型的には、非構造タンパク質を除去するための生成工程を実施する必要性を軽減するマーカーワクチンとして設計される。

ＦＭＤＶゲノムは、１２個の成熟ウイルスタンパク質にプロセシングされる前駆体ポリタンパク質を産生する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする（図１Ａ）（Ｂａｌｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１０，７：１９９より）。Ｐ１ポリタンパク質中間体は、翻訳中にＰ１およびＰ２ポリタンパク質の非タンパク質分解的分離を引き起こしてＰ２からＰ１－２Ａを放出する２Ａタンパク質のすぐ上流に位置する４つのカプシド構造タンパク質ＶＰ１～ＶＰ４から構成される。その後、Ｐ１－２Ａポリタンパク質は、ＦＭＤＶ ３Ｃプロテアーゼによって、２Ａ、ＶＰ０（１ＡＢとしても知られる）、ＶＰ３（１Ｃ）およびＶＰ１（１Ｄ）にプロセシングされる。ＶＰ０タンパク質は、カプセル化中にＶＰ４およびＶＰ２に分離する。ＦＭＤＶビリオンは、プロセシングされたウイルス構造タンパク質からの自己集合によって形成される。

ＶＬＰベースのワクチンに使用するためのＶＬＰは、ＦＭＤＶビリオンの自己集合と同様に、好適な宿主細胞内でＦＭＤＶ前駆体タンパク質を組換え発現させることによって産生することができる。ＦＭＤＶ ＶＬＰも同様に、プロセシングされたウイルス構造タンパク質からの自己集合によって形成される。

ＶＬＰの熱安定性と低ｐＨに対する感受性は、カプシドタンパク質間の共有結合、例えば、システイン架橋の導入によってまたは他の合理的に設計された変異の導入によって、改善することができる（Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ）。

細胞培養物１ミリリットル当たりのＦＭＤＶ ＶＬＰの初期収率は典型的には低いため、一般的な成功した発現系を使用する場合であっても、発現レベルを増加させて、ＶＬＰベースのＦＭＤワクチンを現在市販されている従来のＦＭＤワクチンの費用対効果の高い代替物にする必要がある。そのため、バキュロウイルス発現ベクターを最適化してＶＬＰの収率を改善し、抗原収率に関して従来のＦＭＤワクチン生成プロセスと少なくとも同等またはさらにはそれを上回る大規模生成プロセスを達成した。

バキュロウイルス発現ベクタープラットフォームは、現在、ＶＬＰの産生のための好ましいプラットフォームの１つとして使用されている。しかし、バキュロウイルス発現プラットフォームによってもたらされるＦＭＤＶ ＶＬＰの比較的低い発現レベルは、ＶＬＰベースのＦＭＤワクチンの開発を制限する。

Ｄｏｅｌ ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ，１９８２，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｂａｌｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１０，７：１９９ Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ

本発明では、驚くべきことに、バキュロウイルス発現系を介したＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現が、２つの翻訳エンハンサー：Ｓｙｎ２１およびＰ１０ＵＴＲの組合せを使用することによって増強され得ることが見出された。驚くべきことに、これらの２つの翻訳エンハンサーの組合せが、当技術分野のバキュロウイルス発現系で使用される他の翻訳エンハンサーによって達成される発現収率よりも優れていることが示され得る。

したがって、第１の態様では、本発明は、プロモーターの制御下でＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができるバキュロウイルス発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、
（ｉ）ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列、
（ｉｉ）ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列（ｉ）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する翻訳エンハンサーＳｙｎ２１、および
（ｉｉｉ）ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列（ｉ）の３’ＵＴＲ内に位置する翻訳エンハンサーＰ１０ＵＴＲ、
を含む。

本発明の第２の態様では、本発明のバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。そのような宿主細胞は、組織培養ではインビトロで使用され得、宿主細胞は典型的には不死化細胞である。

第３の態様では、本発明は、ＦＭＤＶ ＶＬＰを産生する方法であって、本明細書に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、宿主細胞によって産生されたＶＬＰを採取する工程とを含む方法を提供する。

本発明は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現のためのバキュロウイルス発現ベクターの使用にさらに関する。

本発明は、ＦＭＤＶ ＶＬＰを産生し、薬学的に許容される担体を加えることによってＦＭＤＶ ＶＬＰをワクチンに組み込むことによってワクチンを生成する方法にさらに関する。

本発明は、宿主細胞内で本発明のバキュロウイルス発現ベクターからＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を発現させてＶＬＰを産生し、薬学的に許容される担体を加えることによってＶＬＰをワクチンに組み込み、そして、ＶＬＰを対象に投与することによって、ＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法にさらに関する。

本発明は、ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するのに使用するための、本発明の第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターにさらに関する。

本発明は、ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するための医薬の製造に使用するための本明細書に記載のバキュロウイルス発現ベクターにさらに関する。

発明の詳細な説明
用語の定義
用語「核酸配列」は、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列を含む。ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムｍＲＮＡまたはゲノムｃＤＮＡ、組換えｍＲＮＡまたは組換えｃＤＮＡであり得る。

「発現ベクター」（同義語「発現構築物」）は、通常、細胞内の組換え遺伝子発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスである。ベクターは、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用され、該遺伝子によってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するタンパク質合成のための細胞の機構を操作することができる。組換え遺伝子を発現させてＰＯＩを産生するために、発現ベクターは、典型的には、遺伝子発現を開始させるための少なくとも１つのプロモーターを含み、１つ以上の翻訳エンハンサーをさらに含み得る。

「バキュロウイルス発現ベクター」は、昆虫細胞などの宿主細胞内の組換え遺伝子発現に使用される、バキュロウイルスに基づく発現ベクターである。バキュロウイルス発現系は、当技術分野で確立されており、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など、市販されている。これらのバキュロウイルス発現系では、野生型バキュロウイルスゲノム内の天然に存在するポリヘドリン遺伝子は、典型的には組換え遺伝子またはｃＤＮＡによって置換されている。これらの遺伝子は、一般的にポリヘドリンまたはｐ１０バキュロウイルスプロモーターの制御下にある。

遺伝子発現に使用される最も一般的なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）である。ＡｃＮＰＶは、大きな（１３０ｋｂ）環状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、非必須遺伝子座に由来するバキュロウイルスＤＮＡ、例えば、ポリヘドリン遺伝子が隣接するバキュロウイルスプロモーターを含有するトランスファーベクターにクローニングされる。ＧＯＩを含有する組換えバキュロウイルスは、トランスファーベクターと親ウイルス（ＡｃＮＰＶなど）のゲノムとの間の昆虫細胞における相同組換えによって産生される。

「翻訳エンハンサー」は、翻訳を促進し、それによってタンパク質産生を増加させることができるエレメントを形成するヌクレオチド配列である。典型的に、翻訳エンハンサーは、ｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に見出され得る。特に、ＧＯＩの開始ＡＴＧコドンのすぐ上流の５’－ＵＴＲ内のヌクレオチドは、翻訳開始のレベルに大きな影響を及ぼし得る。

ウイルス「カプシド」は、当技術分野では、典型的にはその遺伝物質を封入するウイルスのタンパク質シェルとして一般的に理解されている。

「カプシド前駆体タンパク質」は、ウイルスカプシドまたはその構成要素の形成に関与する、カプシドタンパク質とも呼ばれる１つ以上の構造タンパク質の前駆体である。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、典型的には、構造タンパク質Ｐ１を含む。タンパク質Ｐ１は、ＦＭＤＶ ３Ｃプロテアーゼ（３Ｃｐｒｏ）によって成熟型のＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質にプロセシングされるため、Ｐ１タンパク質は、ポリタンパク質またはプロタンパク質とも呼ばれ得る。本発明に関連して、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、典型的には、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含む少なくともＰ１を含む。あるいは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のうちの１つ以上を含み得る。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質はまた、タンパク質ＶＰ２およびＶＰ４を含むタンパク質ＶＰ０を含み得る。最も好ましくは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、Ｐ１および２Ａタンパク質を少なくとも含む（本明細書ではＰ１－２Ａカプシド前駆体とも呼ばれる）。

当技術分野では「空カプシド」とも呼ばれ得る「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルスのタンパク質シェルを含むがＲＮＡゲノムまたはＤＮＡゲノムを欠く実体である。ＶＬＰは、同じ構造エピトープを保持するため、野生型ウイルスと同じように抗原性および免疫原性であるはずであるが、ウイルスゲノムの欠如のために感染を生じないはずである。

ＦＭＤＶ ＶＬＰは、典型的には、Ｐ１－２Ａカプシド前駆体から形成される。上記のように、２Ａプロテアーゼは、そのＣ末端でそれ自体を切断して、Ｐ２からＰ１－２Ａを放出する。Ｐ１－２Ａカプシド前駆体のプロセシングは、３Ｃプロテアーゼによって影響を受けて、２Ａならびにカプシドタンパク質ＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１を産生する。ＶＬＰは、これらのカプシドタンパク質からの自己集合によって形成される。

本発明のバキュロウイルス発現系では、昆虫細胞に対して毒性の低い改変３Ｃプロテアーゼを使用してＶＬＰを産生してもよい（Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。Ｐ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットでは、３Ｃ酵素の中間活性および非毒性活性により、ＶＬＰに集合する構造タンパク質ＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３へのＰ１－２Ａ前駆体の組換え発現およびプロセシングが可能になる。ＶＬＰの産生は、当技術分野で公知の技術、例えば、スクロース密度遠心分離または電子顕微鏡法を使用して調査または検証され得る（Ａｂｒａｈａｍｓ ｅｔ ａｌ（１９９５））。空カプシドの構造および抗原性が保持されているかどうかを調査するために、野生型ウイルス上の立体配座エピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用してもよい。

本明細書で使用される用語「ワクチン」は、対象に投与された場合、防御免疫応答を誘導または刺激する調製物を指す。ワクチンは、生物を特定の疾患に対して免疫性にすることができる。

「ＦＭＤＶによる感染から動物を保護する」とは、ＦＭＤＶによる病原性感染の予防、改善もしくは治癒を補助すること、またはその感染から生じる障害の予防、改善もしくは治癒を補助すること、例えば、ＦＭＤＶによる処置後（すなわち、ワクチン接種後）感染から生じる１つ以上の臨床徴候を予防もしくは低減することを意味する。

用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、予防的処置によってＦＭＤＶ感染を回避する、遅延させる、妨げる、または妨害することを指すことを意図している。ワクチンは、例えば、感染性ＦＭＤＶが細胞に入る可能性を予防または低減し得る。

バキュロウイルス発現ベクター
本発明の第１の態様のバキュロウイルス発現ベクターは、プロモーターの制御下でＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができる。発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現を増強する２つの翻訳エンハンサーＳｙｎ２１およびｐ１０ＵＴＲを含む。

翻訳エンハンサー「Ｓｙｎ２１」は、「Ｂ．Ｄ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ（２０１２），Ｖｏｌ．１０９（１７），ｐ．６６２６－６６３１」に記載されているように、Ｃａｖｅｎｅｒコンセンサス配列をマラコソマ・ネウストリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ）核多角体病ウイルス（ＭｎＮＰＶ）ポリヘドリン遺伝子由来のエレメントと組み合わせることによって作製された、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のＡＴリッチ合成配列である。Ｓｙｎ２１翻訳エンハンサーの核酸配列は、核酸配列５’－ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＡＡ－３’（配列番号１）に対応する核酸配列を有し得る。本発明では、翻訳エンハンサーＳｙｎ２１は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する。好ましい実施形態では、Ｓｙｎ２１配列は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列のＡＴＧ開始コドンの５’側に直接近接して位置する。

翻訳エンハンサー「Ｐ１０ＵＴＲ」は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列の３’ＵＴＲ内に位置する。本明細書で使用される用語「Ｐ１０ＵＴＲ」は、「Ｙ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２０１５），Ｖｏｌ．３７，ｐ．１７６５－１７７１」に記載されているＡｃＮＰＶ ｐ１０遺伝子由来の３’ＵＴＲに関する。好ましくは、Ｐ１０ＵＴＲは、配列番号２の核酸配列に対応する核酸配列を有する。

用語「Ｓｙｎ２１」および「Ｐ１０ＵＴＲ」には、配列番号１および２のものに対応するが、１つ以上の核酸の変異および／または自然変異などの保存的改変を含む核酸配列が包含される。改変は、１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは付加、または１つ以上の他のヌクレオチドによる１つ以上のヌクレオチドの置換であり得る。保存的改変は、典型的には、翻訳エンハンサーとしての配列の機能を実質的に変化させない改変であり、すなわち、改変された配列は、発現カセットのプロモーターの制御下で依然として発現を増強することができる。

ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、好適なプロモーターの制御下で組換え発現される。プロモーターは特に限定されないが、バキュロウイルス発現系におけるＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現が可能な任意のプロモーターであり得る。本発明のバキュロウイルス発現系に使用するのに好ましいプロモーターは、ＡｃＮＰＶのポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター（Ａｙｒｅｓ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４），Ｖｏｌ．２０２０，ｐ．５８６－６０５に記載されている）およびｐ１０プロモーター（Ｋｎｅｂｅｌ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）Ｖｏｌ．４（５），１３０１－１３０６に記載されている）である。別の好ましいプロモーターは、Ｓ．エキシグア（Ｓ．ｅｘｉｇｕａ）核多角体病ウイルス（ＳｅＮＰＶ）のｏｒｆ４６ウイルス遺伝子のプロモーター（Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｓｏｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰｅｅｒＪ（２０１６），ＤＯＩ １０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．２１８３に記載されている）である。

タンパク質の組換え発現のためのバキュロウイルス発現系に使用するためのバキュロウイルス発現ベクターは市販されており、タンパク質およびウイルス様粒子の産生では当技術分野で広く使用されている。この系は、例えば、バキュロウイルス発現ベクターが増殖する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞または昆虫細胞などの細胞を形質転換するために使用される１つ以上のトランスファープラスミドを包含し得る。市販のバキュロウイルス発現ベクターには、限定するものではないが、Ｔｏｐ－Ｂａｃ（登録商標）ベクター（ＡＬＧＥＮＥＸ，Ｓｐａｉｎ）、ｐＦａｓｔＢａｃ（登録商標）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｆｌａｓｈＢＡＣ（登録商標）ベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）およびＢｅｓｔＢａｃ（登録商標）ベクター（ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡ）が含まれる。

本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、機能的プロモーターの制御下で宿主細胞内で発現されるＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含み、Ｓｙｎ２１およびＰ１０ＵＴＲ翻訳エンハンサーを含む発現カセットを含有する。

したがって、本発明では、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現のための発現カセットは、典型的には、図１Ｂに示す概略構造を有する。

この構造は、本発明のバキュロウイルス発現ベクター内の翻訳エンハンサーＳｙｎ２１およびｐ１０ＵＴＲと組み合わせて使用され得る追加のエレメント、特に他のシス作用エレメント、例えば、追加の翻訳エンハンサーを含み得る。

ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、特に限定されず、任意のＦＭＤＶ血清型、例えば、血清型Ａ、Ｏ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３およびＣであり得る。特に好ましい実施形態では、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、ＡまたはＯ血清型に由来する。

本発明のバキュロウイルス発現ベクターでは、カプシド前駆体タンパク質は、典型的には少なくともカプシド前駆体Ｐ１を含む。さらに好ましくは、カプシド前駆体タンパク質は、カプシド前駆体Ｐ１と、２Ａペプチドとを含む。

さらに好ましい実施形態では、本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を切断することができるプロテアーゼをコードする核酸配列をさらに含む。プロテアーゼは、ＦＭＤＶ空カプシドを生成するために、カプシドの生成および集合の工程としてＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を切断することができる任意のプロテアーゼであり得る。上述のように、ＦＭＤＶでは、前駆体Ｐ１からＶＰ０（ＶＰ２＋ＶＰ４）、ＶＰ３およびＶＰ１へのタンパク質分解プロセシングは、ウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその前駆体３ＣＤによって起こる。したがって、プロテアーゼは、ＦＭＤＶの３Ｃプロテアーゼであることが好ましい。ＦＭＤＶ Ａ型株由来のＦＭＤＶ野生型３Ｃプロテアーゼの配列は当技術分野で記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４８３５３号に開示されている。３Ｃプロテアーゼはまた、そのタンパク質分解活性を低下させる１つ以上の変異、例えば、システイン１４２での変異を含む機能性誘導体であり得る。

さらに好ましい実施形態では、第１の態様のバキュロウイルス発現ベクターは、（ｉ）ＦＭＤＶカプシド前駆体の核酸配列と、（ｉｉ）翻訳エンハンサーＳｙｎ２１と、（ｉｉｉ）翻訳エンハンサーＰ１０ＵＴＲと、（ｉｖ）プロテアーゼの核酸配列とを含むヌクレオチド配列であり得る。（ｉ）ＦＭＤＶカプシド前駆体および（ｉｖ）プロテアーゼのヌクレオチド配列は、好ましくは連続的に配置される。核酸配列（ｉ）と（ｉｖ）との間に核酸配列が存在してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４８３５３号に記載されているような制御エレメントなどの制御エレメントが、プロテアーゼの発現を制御するがカプシド前駆体タンパク質の発現を制御するかまたはそれに影響を与えないように、その配列に存在してもよい。

カプシド前駆体タンパク質は、空カプシド（の一部）を形成するようにプロテアーゼによって切断可能であり得る。前駆体タンパク質は、空カプシドを形成するのに必要なあらゆるタンパク質を含み得る。

カプシド前駆体タンパク質は、３ＣプロテアーゼによってＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１に切断されるＰ１であり得る。あるいは、カプシド前駆体タンパク質はＰ１－２Ａであり得る。２Ａペプチドは、そのＣ末端でそれ自体を切断して、任意の下流タンパク質配列からＰ１－２Ａを放出する。最も好ましくは、バキュロウイルス発現系は、Ｐ１－２Ａ－３Ｃカセットを発現し、すなわち、タンパク質Ｐ１、２Ａおよび３Ｃのコード領域を同時に発現する。Ｐ１－２Ａ－３Ｃカセットでは、３Ｃ酵素の発現により、ＶＬＰに集合する構造タンパク質へのＰ１－２Ａ前駆体の発現およびプロセシングが可能になる。カプシド前駆体タンパク質およびプロテアーゼは、個々のプロモーターの制御下または同じプロモーターの制御下で、発現され得る。例えば、カプシド前駆体タンパク質は、本明細書に記載の第１のプロモーターの制御下で発現され得、遺伝子発現は、Ｓｙｎ２１およびｐ１０ＵＴＲ翻訳エンハンサーによって調節され、プロテアーゼは、第１のプロモーターとは異なり得る別個の（第２の）プロモーターの制御下で発現される。

カプシド前駆体タンパク質またはＶＬＰの切断は、当技術分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、バキュロウイルス感染宿主細胞からの抽出物は、ゲル電気泳動によって分離され得、分離されたタンパク質は、ウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースメンブランに転写され得る。タンパク質特異的抗体によるウエスタンブロッティングにより、プロテアーゼ媒介性切断の程度が明らかにされるはずである。例えば、ＦＭＤＶの場合、プロセシングされていないカプシド前駆体タンパク質（Ｐ１－２Ａ）は、約８１ｋＤａのバンドとして現れ、切断により、ＶＰ３－１（約４７ｋＤａ）、ＶＰ０（約３３ｋＤａ）、ＶＰ２（約２２ｋＤａ）、ＶＰ３（約２４ｋＤａ）および／またはＶＰ１（約２４ｋＤａ）が産生され得る。

宿主細胞
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、カプシド前駆体タンパク質を産生することができ、好ましくはＦＭＤＶ ＶＬＰを産生することができる。

宿主細胞は、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ２１細胞のクローン単離物）またはＴｎｉ細胞（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）から単離された卵巣細胞）である。最も好ましくは、宿主細胞は、Ｔｎｉ細胞、またはＴｎａｏ３８細胞などのＴｎｉ由来細胞株である。

ウイルス様粒子の産生方法
第３の態様では、本発明は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を産生する方法を提供する。あるいは、本発明は、ＦＭＤＶ ＶＬＰを産生する方法を提供する。第３の態様による方法は、
（ｉ）第２の態様による宿主細胞に、第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターを感染させる工程、および
（ｉｉａ）宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を採取する工程、または
（ｉｉｂ）宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶ ＶＬＰを採取する工程、
を含む。

したがって、方法は、カプシド前駆体タンパク質を産生するために、宿主細胞がバキュロウイルス発現ベクターからカプシド前駆体タンパク質を発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することを含む。上記のように、バキュロウイルス発現構築物がカプシド前駆体タンパク質の切断が可能なプロテアーゼをさらに発現する場合、ＦＭＤＶ ＶＬＰが宿主細胞によって産生され得る。ＶＬＰが宿主細胞によって放出される場合、それらは細胞培養培地から採取され得る。空のウイルスカプシドが宿主細胞の内部に保持されている場合、それらは、例えば、
（ｉ）宿主細胞の溶解（例えば、凍結融解による）；ならびに任意に、
（ｉｉ）濃縮（例えば、ＰＥＧ沈殿による）、および／または
（ｉｉｉ）精製、
によって採取され得る。

ワクチンおよびその生成
本発明は、ワクチンの生成に使用されるＦＭＤＶ ＶＬＰの産生にさらに関する。

したがって、本発明はまた、ワクチンを生成する方法であって、第３の態様による方法によってＦＭＤＶ ＶＬＰを産生する工程と、例えば、薬学的に許容される担体を加えることによってＦＭＤＶ ＶＬＰをワクチンに組み込む工程とを含む方法を提供する。

薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。単なる例として、そのような担体は、滅菌水、またはＰＢＳなどの緩衝液と同じくらい単純であり得る。ワクチンは、単一の担体、または２つ以上の担体の組合せを含み得る。ワクチンはまた、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含み得る。ワクチンはまた、別の活性剤、例えば、ワクチン接種実体によって誘導される適応免疫応答の前に早期保護を刺激し得るものを含み得るか、または発現させることができ得る。作用物質は、Ｉ型インターフェロンなどの抗ウイルス剤であり得る。代替的にまたはそれに加えて、作用物質は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）であり得る。

ワクチンは、既存のＦＭＤＶ感染を処置するために（特にウイルスが流行している集団または地域で）処置的に使用され得るが、好ましくは、ＦＭＤＶ感染の可能性を阻止もしくは低減するため、および／または疾患を拡大する可能性を防止もしくは低減するために、予防的に使用される。

多くの市販のＦＭＤワクチンは、様々なＦＭＤ血清型に対する防御を提供するために多価である。同様に、本発明のワクチンは、各々が所与の血清型内の異なる血清型および／または異なるサブタイプを対象とする複数のワクチン接種実体を含み得る。

処置
本発明はまた、本発明のワクチンの有効量の投与によってＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法を提供する。

ＦＭＤでは、対象は、偶蹄類であり得る。ＦＭＤに感染しやすい動物には、家畜の中ではウシ、ヒツジ、ブタおよびヤギ、ならびにラクダ科動物（ラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコおよびビクーニャ）が含まれる。一部の野生動物、例えば、ハリネズミ、ヌートリア、ならびに任意の野生の偶蹄類、例えば、シカ、およびゾウを含む動物園動物もＦＭＤに感染しやすい。

投与
本発明は、本発明によるワクチンの有効量の動物への少なくとも１回の投与を意図する。ワクチンは、任意の局所投与方法または全身投与方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法で投与することができる。投与は、例えば、抗原を筋肉組織（筋肉内、ＩＭ）に、真皮（皮内、ＩＤ）に、皮膚の下（皮下、ＳＣ）に、粘膜の下（粘膜下、ＳＭ）に、静脈（静脈内、ＩＶ）に、体腔（腹腔内、ＩＰ）に投与すること、経口、肛門投与することなどによって行うことができる。現在のワクチンの場合、ＩＭ、ＩＤおよびＳＣ投与が好ましい。

本発明に従って使用するためのＤＮＡ構造を概略的に示す。 本発明を使用する場合の収率を様々な方法で表す。 本発明を使用する場合の収率を示すウエスタンブロットを示す。

［実施例］
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、これらの実施例は、本発明を実施する際に当業者を支援するのに役立つように意図されている。

「Ｏｐｔ１」バキュロウイルス構築物
市販の標準的なバキュロウイルストランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の転写は、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターによって促進される。得られたｍＲＮＡは、ＳＶ４０ ３’ＵＴＲを含有する。

このｍＲＮＡの翻訳が改善され得るかどうかを調査するために、ＳＶ４０ ３’ＵＴＲを、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ｐ１０遺伝子（Ｐ１０ＵＴＲ）由来の３’－ＵＴＲに置換した。さらに、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに、および、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のすぐ前に、Ｓｙｎ２１翻訳エンハンサーを配置した。発現カセットの得られた改変を「Ｏｐｔ１」と命名した（図１Ｂ）。標準的な発現カセットからのＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現と、「Ｏｐｔ１」発現カセットからのＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現とを比較した。

当技術分野で周知の標準的なクローニング手順によって、実施例１で使用した発現カセットＯ／ＴＵＲ／５／０９ ＶＰ２－Ｓ９３Ｆおよび実施例２で使用した発現カセットＡ／ＩＲＮ／７／１３ ＶＰ２－Ｈ９３Ｆのクローニングを行った。Ｏ／ＴＵＲ／５／０９ ＶＰ２－Ｓ９３Ｆの発現カセットのヌクレオチド配列は、配列番号３の核酸配列に従う。発現カセットＡ／ＩＲＮ／７／１３ ＶＰ２－Ｈ９３Ｆのヌクレオチド配列は、配列番号４の核酸配列に従う。

［実施例１］
この実施例では、高収率を得るために、Ｏｐｔ１発現カセットからのＯ血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、標準的な発現カセットからの発現とを比較する。

３．２×１０^５細胞／ｍｌのＴｎｉ細胞を含有する１００ｍｌの三角フラスコに、Ｏ／ＴＵＲ／５／０９ ＶＰ２－Ｓ９３Ｆに基づくＰ１－２Ａ－３Ｃｐｒｏ発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝１で感染させた。培養物を４ｄｐｉで採取し、細胞を遠心分離によって回収し、続いて、元の培養体積の１／１０でＴｒｉｓ－ＫＣｌ ｐＨ８．０緩衝液中で超音波処理した。

抗ＶＰ０モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングによって試料を分析した（Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｌｌｃｏｍｅｏｐｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／３－８８）。ウエスタンブロットの目視検査は、バキュロウイルスベクターのＯｐｔ１バージョンがＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関して標準的なものよりもわずかに良好に機能することを示唆している。

２つのバキュロウイルス構築物間の差を定量するために、インタクトなカプシド（７５Ｓ／１４６Ｓ）、およびカプシドの五量体構成要素（１２Ｓ）の両方を検出するモノクローナル抗体ＩＮＴ－ＦＭＡ－０１－０８を使用してＥＬＩＳＡを行った。このために、抗体によって４℃で一晩コーティングしたマイクロタイタープレート上で、連続希釈した試料を３７℃で１時間インキュベートした。試料を除去し、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄した後、一定量のビオチン化ＩＮＴ－ＦＭＡ－０１－０８抗体をプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化抗体を除去し、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄した後、ペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンをプレートに加え、発色団検出を行った。

ウエスタンブロッティングの結果を図２Ａに示す。ＥＬＩＳＡの結果を図２Ｂに示す。ＥＬＩＳＡは、標準的な発現カセットと比較して、Ｏｐｔ１発現カセットではＯ血清型のＦＭＤＶ関連タンパク質の１．４倍の発現の増加を示す。これは実質的ではないように思われる可能性があるが、産生操作に典型的には５日間かかるという事実を考慮すると、これは、他の発現カセットを使用する場合の約１５日間（３回の操作）と比較して、Ｏｐｔ１発現カセットを使用して１０日間（２回の操作）で同量の抗原を作製することができることを意味する。

［実施例２］
この実施例では、Ｏｐｔ１発現カセットからのＡ血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、標準的な発現カセットからの発現とを比較する。

Ａ／ＩＲＮ／７／１３ ＶＰ２－Ｈ９３Ｆに基づく発現カセットを使用したこと以外は、実施例１に記載した通りに細胞の感染と細胞培養とを行った。

実施例１に記載されるように、ウエスタンブロッティングによって試料を分析した。ウエスタンブロットの目視検査は、バキュロウイルスベクターのＯｐｔ１バージョンが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関して標準的なものよりも良好に機能することを示唆している。

ウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。バンド強度に基づいて、Ａ血清型のＦＭＤＶ関連タンパク質の発現の増加は、標準的な発現カセットと比較して、Ｏｐｔ１発現カセットでは３倍であると推定される。

［実施例３］
この実施例では、Ｏｐｔ１発現カセット内のＳｙｎ２１およびＰ１０ＵＴＲ翻訳エンハンサーから得られた発現レベルと、市販の系（ＴｏｐＢａｃ（登録商標）、Ａｌｇｅｎｅｘ）とを比較した。ＴｏｐＢａｃ（登録商標）発現ベクターでは、発現はポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター、およびｐ１０キメラプロモーターに機能的にシス連結された相同反復（ｈｒ）転写エンハンサー配列の制御下で達成される。ＴｏｐＢａｃ（登録商標）発現ベクターは、標準的なバキュロウイルスベクターと比較して、組換えモデルタンパク質（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）の産生収率の最大４倍の増加を達成すると記載された（Ｌｏｐｅｚ－Ｖｉｄａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（１０）：ｅ０１４００３９）。

細胞の感染と細胞培養とを実施例１に記載されるように行った。

実施例１に記載されるように、ウエスタンブロッティングによって細胞および上清を分析した。ウエスタンブロットの目視検査は、バキュロウイルスベクターのＯｐｔ１バージョンが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関して市販のＴｏｐＢａｃ（登録商標）ベクターの両方よりも優れていることを示唆している。

２つの構築物間の差をさらに良好に定量するために、実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡを行った。

ＥＬＩＳＡデータにより、Ｏｐｔ１発現ベクターがＴｏｐＢａｃ（登録商標）ベクターよりも全体的に高いタンパク質収率をもたらすという点でウエスタンブロットの結果が確認された。実際に、ＴｏｐＢａｃ（登録商標）ベクターは、ＧＦＰのような他の多くのタンパク質では成功しているが、Ｏｐｔ１発現ベクターのＦＭＤＶ Ｐ１－２Ａ－３Ｃｐｒｏカセットの高レベルの発現を達成しない（以下の表１を参照）。

結論
２つの異なる血清型ＯおよびＡに属する２つのＦＭＤＶ株では、標準的な発現系と比較して、Ｓｙｎ２１およびＰ１０ＵＴＲ翻訳エンハンサーを含むＯｐｔ１バキュロウイルス構築物を使用することによって、ＦＭＤＶタンパク質発現レベルの増加が得られた。驚くべきことに、Ｏｐｔ１バキュロウイルス発現ベクターを使用することによる発現レベルの増加は、他の翻訳エンハンサーを含有し、発現レベルおよびタンパク質収率の増加を達成することが当技術分野で記載されている市販の系と比較しても達成された。

Claims (17)

1. プロモーターの制御下で口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができるバキュロウイルス発現ベクターであって、前記発現ベクターが、
   （ｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列、
   （ｉｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする前記核酸配列（ｉ）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する翻訳エンハンサーＳｙｎ２１、および、
   （ｉｉｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする前記核酸配列（ｉ）の３’ＵＴＲ内に位置する翻訳エンハンサーＰ１０ＵＴＲ、
   を含む、
   バキュロウイルス発現ベクター。
2. 前記翻訳エンハンサーＳｙｎ２１が、配列番号１の核酸配列に対応する核酸配列を有する、
   請求項１に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
3. 前記翻訳エンハンサーＰ１０ＵＴＲが、配列番号２の核酸配列に対応する核酸配列を有する、
   請求項１または２に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
4. 前記ＦＭＤＶがＡ血清型である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
5. 前記ＦＭＤＶがＯ血清型である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
6. 前記カプシド前駆体タンパク質が、カプシド前駆体Ｐ１を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
7. 前記ベクターが、
   （ｉｖ）前記カプシド前駆体タンパク質を１つ以上のカプシドタンパク質に切断することができるプロテアーゼをコードする核酸配列
   をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
8. 前記カプシド前駆体タンパク質が、カプシド前駆体Ｐ１と２Ａペプチドとを含み、そして、前記プロテアーゼが３Ｃである、請求項７に記載のバキュロウイルス発現ベクター。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞。
10. 昆虫細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
11. （ｉ）請求項１～６のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、
    （ｉｉ）前記宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を採取する工程と
    を含む、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を産生する方法。
12. （ｉ）請求項７または８に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、
    （ｉｉ）前記宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶ ＶＬＰを採取する工程と
    を含む、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法。
13. ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現のためのバキュロウイルス発現ベクターの使用であって、前記発現ベクターが、
    （ｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列、
    （ｉｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする前記核酸配列（ｉ）の５’ＵＴＲ内に位置する翻訳エンハンサーＳｙｎ２１、および
    （ｉｉｉ）前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする前記核酸配列（ｉ）の３’ＵＴＲ内に位置する翻訳エンハンサーＰ１０ＵＴＲ
    を含む、使用。
14. 発現が、昆虫細胞内で達成される、請求項１３に記載のバキュロウイルス発現ベクターの使用。
15. （ｉ）請求項１２に記載の方法によってＦＭＤＶ ＶＬＰを産生する工程と、
    （ｉｉ）薬学的に許容される担体を加えることによって前記ＦＭＤＶ ＶＬＰをワクチンに組み込む工程と
    を含む、ワクチンを生成する方法。
16. ＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法であって、該方法は、
    宿主細胞内で請求項７または８に記載のバキュロウイルス発現ベクターからＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を発現させてＶＬＰを産生する工程、薬学的に許容される担体を加えることによって前記ＶＬＰをワクチンに組み込む工程、および、前記ワクチンを前記対象に投与する工程、
    を含む、方法。
17. ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するための医薬の製造に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

Images