KR20230081996A

KR20230081996A - 구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼

Info

Publication number: KR20230081996A
Application number: KR1020230030652A
Authority: KR
Inventors: 김봉윤
Original assignee: 주식회사 왓슨알앤디
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2023-03-08
Publication date: 2023-06-08
Also published as: WO2023101381A1; KR102513632B1

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가치환된 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기서열이 순차적으로 배열된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 구제역 바이러스 유사 입자의 생산방법 및 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질을 이용한 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 FMDV VLP를 항원으로 하여 백신을 제조한 경우, 마우스에서 항체 생성 기간도 짧으며, 구제역 바이러스 공격 접종에 대해 생존율이 높으며, 중화항체 역가도 높다. 또한, 마우스 뿐만 아니라 돼지에서도 2주 정도에 항체 생성이 시작되었으며, 6주 후에도 PI 값이 50%이상 되는 것을 확인하여, 구제역 바이러스 유사입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼으로 적용이 가능하다.

Description

구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼{Vaccine platform to produce foot-and-mouth disease virus-like particles}

본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼에 관한 것이다.

구제역 바이러스(foot and mouth disease virus, FMDV)는 우제류, 특히, 소, 돼지 있어 매우 위독한 급성 전염병으로서, 전염시, 열, 절뚝거림, 다리, 혀, 유두부위에 수포형성을 유발하고, 최대 250km를 공기를 통하여 전파되는 빠른 전파력, 임신 저하, 우유 생산 저하 등을 통해 가축 산업에 심대한 영향과 함께 맹우 심각한 경제적 손실을 유발한다. 이 질환은 현재 전염병 예방법상 제1종 가축 전염병으로 세계 동물 보건기구(OIE)에서 관리 대상 질병으로 분류 지정하고 있으며, 발생시 의무적으로 세계보건 기구에 보고해야 하는 질병이다.

구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 O, A, Asia1, C, South African Territories (SAT) 1, SAT 2, SAT3를 포함하는 7종의 혈청형(Serotype)이 확인되었으며, 세계적으로 주로 Serotype O가 지속적으로 발생하고 있다. 또한, 중국, 북한 등 동아시아지역에서 Serotype O를 비롯하여 Serotype Asia1 및 A가 간헐적으로 발생하고 있는 추세이다. 구제역 바이러스는 혈청형이 다른 바이러스 간에는 혈청학적으로 중화가 되지 않고, 백신에 의해 교차방어가 되지 않을 만큼 유전적, 또는 항원적 큰 차이를 보인다.

도 1의 FMDV 게놈 및 캡시드 구조를 보면, 구제역 바이러스는 노출된 캡시드(capsid)를 갖고 있으며, 상기 캡시드(capsid)는 정20면체 구조를 가진다.

구제역 바이러스 다단백질(polyprotein)의 P1 영역은 구조 단백질을 암호화하며, P2 및 P3 영역은 비구조 단백질을 암호화한다. 바이러스 프로테아제 2A에 의해 구조 단백질 전구체 P1이 분할되고, P1 전구체는 캡시드 단백질 VPO, VP3 및 VP1으로 가공된다. 3C는 P1 전구체를 캡시드 단백질로 가공하는 역할을 하는 바이러스 프로테아제이다. VPO, VP1 및 VP3는 자발적으로 빈 캡시드를 조립하고 바이러스 RNA는 상기 캡시드의 조립 후 내부에 포장된다. 빈 캡시드와 게놈 RNA의 결합은 구조적 이동, RNA의 내재화, VPO의 VP2 및 VP4 로의 자가촉매 분할, 그리고 안정한 비리온으로의 성숙화를 유도한다.

한편, 구제역 백신은 전 세계적으로 불활화 (inactivated) 백신을 사용하고 있으며, 대부분 오일 아쥬반트(Double Oil Emulsion, DOE 또는 Single Oil Emulsion, SOE)를 이용한 백신을 접종함으로써 효과면에서 개선되었으나, 항체 생성 기간이 지연되거나, 항체 역가가 낮거나, 항체의 지속성이 짧으며, 돼지에서의 낮은 면역원성 등이 단점으로 지적되고 있다.

전통적인 백신은 불활화 백신과 약독화 백신 두 가지 종류를 포함한다. 그러나 바이러스의 병원성 복귀, 바이러스의 불완전한 불활화, 백신 가공공장에서 생바이러스의 탈출 등 불안전한 요인으로 인하여, 일부 지역에서 구제역의 발병은 불활화 백신에 잔존하는 생바이러스와 연관이 있는 것으로 보고되고 있어, 불활화 백신의 안전성에 문제가 있는 실정이다.

또한, 약독화 백신도 생바이러스이기에, 예방 접종 과정에서 동물이 바이러스를 보유하게 되며, 감수성이 높은 동물 체내에서 장기간 생존하는 과정에서 약독화된 구제역 바이러스주가 병원성을 회복할 가능성이 높다. 이러한 이유로, 약독화 백신은 도태되고 있으나, 불활화 백신은 여전히 우리나라를 포함하여 많은 구제역 발생국가와 지역에서 광범위하게 사용되고 있다.

이에 구제역 바이러스의 지속적인 변이와 신규 바이러스의 출현으로 인하여, 전통적인 불활화 백신의 방어능력 한계성, 신규 발생하는 변이 바이러스에 대한 백신의 개발이 시급한 상황이다.

등록특허 제10-0430934호(2004년 04월 29일)

본 발명의 발명자들은 서로 다른 2 종의 벡터의 다중클로닝 부위(MCS) 1과 MCS 2에 구제역 바이러스 유사 입자(FMDV VLP)를 자가조립에 의해 생성 및 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드 두 카피를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 상기 2종의 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 기존에 비해 카피 수가 4배 이상 증가되어 백신 내에 들어가는 FMDV VLP 항원량이 높은 것을 확인하였다.

또한, 상기와 같이 제조한 FMDV VLP를 항원으로 하여 백신을 제조한 경우, 마우스에서 항체 생성 기간도 짧으며, 구제역 바이러스 공격 접종에 대해 생존율이 우수하며, 중화항체 역가도 높은 것을 확인하였다. 또한, 마우스 뿐만 아니라 돼지에서도 2주 정도에 항체 생성이 시작되었으며, 6주 후에도 PI 값이 50%이상 되는 것을 확인하여, 구제역 바이러스 유사입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼으로 적용이 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 상기 폴리뉴클레오티드로부터 구제역 바이러스 유사 입자로의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 구제역 바이러스 유사 입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 구제역 바이러스를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시 예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.

본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선을 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 자가조립에 의해 구제역 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 것이다.

본 발명에서 용어 "구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, 이하 FMDV)"는 피코르나비리다에(Picornaviridae)과의 아프토 바이러스(Aphthovirus) 속에 속한다. 상기 바이러스는 4가지 캡시드(capsid) 단백질(VP1, VP2, VP3 및 VP4)의 60 개 카피와 단일 가닥인 RNA 게놈(약 8.5kb)으로 구성되어 있으며, 우제류 특히 소, 돼지, 면양, 산양에 감염하여 전염력이 강한 질병이다.

FMDV의 4가지 캡시드 단백질은 VP1, VP2, VP3, 및 VP4이며 이 중 캡시드 표면에 노출되어 있는 단백질은 VP1, VP2 및 VP3로 VP1이 바이러스의 감염성과 가장 관련되어 있다. 지역에 따라 많은 혈청형이 있으며, 항원 구조에 따라 A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia1 등 7종의 혈청형이 있고 이들 혈청형에는 80종이 넘는 혈청아형이 있다.

본 발명에서 용어 "바이러스 유사입자(Virus-Like Particle, VLP)"는 바이러스의 복제 및 세포내 침투 역할을 담당하는 비구조 단백질을 포함하는 바이러스와 거의 동일한 형태의 모양을 가지는 항원으로, 유전물질을 포함하지 않고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 바이러스의 항원성을 대표하는 구조 표면(외피) 단백질의 조합을 통하여, 바이러스와 거의 동일한 형태를 가진다.

구제역 바이러스의 외피 부위는 체내 감염 후, 가장 확실하게 면역 시스템에 의해서 감지되는 항원성 부위로 이 외피를 형성하는 단백질을 이용하여 안전하고 효과적인 신규 백신의 제조가 가능하다.

VLP 백신은 분자 생물학 기술을 통하여, 바이러스의 하나 또는 다수의 구조 단백질을 발현하며, 이러한 구조 단백질은 천연적인 자기조립 능력을 가지고 있기에, 천연 바이러스 입자와 유사한 공간 구조와 항원결정부를 형성할 수 있지만, 바이러스 핵산이 없고, 면역원성이 강할 뿐만 아니라 감염성도 없다. 또한, 표면에 고밀도의 바이러스 항원이 존재하므로, 바이러스가 생체를 감염하는 것과 동일한 방식으로 면역세포에 전달될 수 있어, 생체 면역시스템의 체액성 면역과 세포성 면 역을 효과적으로 유도하며, 잠복기를 단축시킬 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로, 단백질로 발현시 자가조립에 의해 구제역 바이러스 유사 입자의 제조가 가능하다.

본 발명에서 상기 구제역 바이러스는 O 혈청형, A 혈청형, Asia 혈청형, SAT 혈청형, 및 C 혈청형으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 구제역 바이러스 A 혈청형은 A22-Iraq, A-Bangladesh(A-Ban), A-Malaysia97(A-May97), A-Gimpo(A-GP), A-Pocheon(A-PC), 및 A-Yeoncheon(A-YC)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 구제역 바이러스 O 혈청형은 O-PanAsia2(O-PA2), O1manisa, O-Taiwan97(O-Twn97), O-Campos, O-Boeun(O-BE), O-Jincheon(O-JC), O-Anseong(O-AS) 및 O-Gimje(O-GJ)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 구제역 바이러스 Asia 혈청형은 Asia1-Shamir 또는 Asia1-Mongol일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어질 수 있다.

상기 3C는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 FMDV 3C는 프로테아제이고, FMDV VP4, VP2, VP3, VP1 단백질을 절단하여 FMDV VLP의 자가조립을 가능하게 한다.

상기 3D 절단부위(cleavage site)는 FMDV 3D의 일부분으로 절단부위만을 포함한다. 상기 3D는 RNA 중합효소 코딩 영역으로, viral RNA 게놈을 주형으로 cRNA 및 viral RNA를 합성하는 효소이다. 본 발명에서는 3D의 전체서열에서 절단부위 서열만을 사용한 것이다. 상기 3D 절단부위는 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어질 수 있다.

도 2는 본 발명의 FMDV VLP 제조를 위한 플랫폼을 나타낸 것이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 FMDV의 3C-3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 연결되도록 설계한 것으로, 상기 FMDV VP1, FMDV VP2, FMDV VP3, FMDV VP4는 상기 FMDV 캡시드를 형성하는 구조 단백질이다.

상기 VP4의 N-말단 부위는 서열번호 135의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 3C는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,

상기 3D 절단부위는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,

상기 VP4의 N-말단 부위는 서열번호 135의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어진다.

상기 3C와 3D는 FMDV 혈청형 별로 서열이 상이하지 않고, 공통적으로 보존된 서열을 가진다. 그러나, FMDV의 VP4-VP2-VP3-VP1의 서열은 O 혈청형, A 혈청형, Asia1 혈청형, SAT 혈청형, 및 C 혈청형에서 상이하고, 동일한 혈청형도 혈청아형 별로 서열이 상이하다.

도 3은 구제역 바이러스의 계통도를 나타낸 것이다.

도 4는 A-type FMDV A22-Iraq, A-Bangladesh(A-Ban), A-Malaysia97(A-May97), A-Gimpo(A-GP), A-Pocheon(A-PC), 및 A-Yeoncheon(A-YC) VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다(파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1).

도 5는 O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2), O1manisa, O-Taiwan97(O-Twn97), O-Campos, O-Boeun(O-BE), O-Jincheon(O-JC), O-Anseong(O-AS) 및 O-Gimje(O-GJ) VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다 (파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1).

도 6은 Asia1-type Asia1-Shamir와 Asia1-Mongol VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다 (파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1).

도 4 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 3C와 3D는 FMDV 혈청형 별로 서열이 상이하지 않고 동일한 것을 알 수 있으며, VP4-VP2-VP3-VP1의 아미노산 서열은 같은 종류의 A 혈청형, O 혈청형 또는 Asia1 혈청형 사이에도 혈청 아형에 따라 상이하다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 야생형 FMDV의 3C에서 379-381 위치의 염기서열 CTG가 CCG로 변형되도록 디자인하여, 서열번호 1에 의해 코딩되는 3C의 아미노산 서열도 127번 위치의 L(류신)이 P(프롤린)으로 변형되도록 설계된 것이다. 상기 3C의 변형은 숙주세포에 폴리뉴클레오티드가 도입시 숙주 요소(host factor)의 분해는 저해하고, FMDV P1(VP4-VP2-VP3-VP1) cleavage 활성은 유지하도록 한 것이다.

상기 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 및 서열번호 35의 염기서열에 포함된 VP2는 야생형 VP2의 염기서열을 기준으로 각각 277-279 위치의 염기서열이 표 1과 같이 변형되도록 설계되었다. 또한, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 및 서열번호 36의 아미노산 서열에 포함된 VP2는 야생형 VP2의 아미노산 서열을 기준으로 각각 93번째 위치한 히스티딘(H), 글루타민(Q), 세린(S), 글라이신(G)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계된 것이다.

상기와 같이 VP2의 서열의 변형을 통해, FMDV VLP의 안정적 구조를 형성하도록 하였다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 5는 Global strain A-type FMDV A22-Iraq VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 5에 의해 서열번호 6의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 7은 Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 7에 의해 서열번호 8의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 9는 Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 9에 의해 서열번호 10의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 11은 Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 11에 의해 서열번호 12의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 13은 Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 13에 의해 서열번호 14의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 15는 Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 15에 의해 서열번호 16의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 17은 Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 17에 의해 서열번호 18의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 19는 Global strain O-type FMDV O1manisa VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 19에 의해 서열번호 20의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 21은 Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 21에 의해 서열번호 22의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 23은 Global strain O-type FMDV O-Campos VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 23에 의해 서열번호 24의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 25는 Korea strain O-type FMDV O-Boeun(O-BE) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 25에 의해 서열번호 26의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 27은 Korea strain O-type FMDV O-Jincheon(O-JC) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 27에 의해 서열번호 28의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 29는 Korea strain O-type FMDV O-Anseong(O-AS) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 29에 의해 서열번호 30의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 31은 Korea strain O-type FMDV O-Gimje(O-GJ) VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 31에 의해 서열번호 32의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 33은 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Shamir VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 33에 의해 서열번호 34의 아미노산으로 코딩된다.

상기 폴리뉴클레오티드 중에서 상기 서열번호 35는 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Mongol VLP를 제조하기 위한 염기서열로, 상기 서열번호 35에 의해 서열번호 36의 아미노산으로 코딩된다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.

상기 "폴리뉴클레오티드"는 자가조립에 의해 구제역 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 것으로 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.

본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명의 상기 재조합 벡터에는 상기 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 또한, 상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 바와 같이 상기 폴리뉴클레오티드 두 카피(copy)가 삽입될 수 있다.

도 7은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pET-duet벡터 모식도를 나타낸 것이고, 도 8은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pACY-duet벡터 모식도를 나타낸 것이다.

상기 재조합 벡터로는 pET-duet 벡터와 pACY-duet 벡터가 사용될 수 있으며, 상기 각각의 pET-duet 벡터와 pACY-duet 벡터의 MCS1와 MCS2 부분에 상기 폴리뉴클레오티드가 각각 삽입되도록 제작되어, 2종의 벡터에 각각 2 카피의 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 총 4 카피가 삽입되도록 재조합 벡터를 제조할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명에서 용어, "형질전환체" 제조를 위한 숙주 세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균; 효모; 동물세포; 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

상기 형질전환체는 구제역 바이러스 유사 입자를 제조하기 위한 것이다.

종래 구제역 외피 형성 재조합 단백질을 이용하여 상업화한 백신은 곤충세포에서 발현을 유도한 것이다. 그러나 이러한 곤충 세포를 이용한 백신 생산 시스템은 고용량의 VLP 항원 생산이 불가하며, 고가인 단점이 있다.

본 발명에서는 3C의 변형을 통해, 대장균 등의 미생물에서 자가조립에 의해 구제역 바이러스 유사 입자의 발현 유도가 가능하다. 또한, 상기 형질전환체는 종류가 다른 2종의 재조합 벡터로 형질전환되어 제조될 수 있다.

전술한 바와 같이, 서로 다른 두 종의 벡터에 각각 2 카피의 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 총 4 카피가 삽입된 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하므로, FMDV VLP의 발현양이 현저히 증가될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 상기 폴리뉴클레오티드로부터 구제역 바이러스 유사 입자로의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 구제역 바이러스 유사 입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터", "숙주세포", "형질전환체", "구제역", "바이러스 유사 입자", "폴리뉴클레오티드"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 구제역 바이러스 유사 입자의 제조방법은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계를 포함한다.

또한, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 폴리뉴클레오티드로부터 구제역 바이러스 유사 입자로의 발현을 유도하는 단계;를 포함한다.

상기 발현 유도는 형질전환체를 배양하여, 상기 폴리뉴레오티드로부터 구제역 바이스러 유사 입자로의 자가조립이 가능하도록 발현을 유도하는 것이다.

즉, FMDV 3C-3D 절단부위에 의해 완전히 가공되어 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3 및 VP1의 개별적인 FMDV 캡시드 단백질로 절단되고, 상기 절단된 캡시드 단백질은 자가조립되어 빈 캡시드인 FMDV VLP를 형성하여 구제역 바이러스와 유사한 형태로 조립이 되므로, 본 발명에 의해 FMDV VLP의 제조가 가능하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드", "자가조립", "형질전환체", "구제역", "바이러스 유사 입자"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 발명에서 용어, "면역원" 또는 "항원성 물질"은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.

상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 15 중량%일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "면역증강제"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요하다. 면역증강제를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제현탁액)에 따라 분류된다. 구체적으로, 콜레라 톡신(CT; cholera toxin), 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일이 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 구제역 바이러스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "개선"는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 구제역 바이러스 감염 증상을 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 사료 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있다.

본 발명에서, 상기 사료 조성물은 사료첨가제 이외에, 개체의 유지와 성장을 위해 반드시 사료로부터 공급되어야 할 필수 영양소로서 에너지, 아미노산, 광물질, 비타민 및 물을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.

상기 사료는, 각종 사료, 기능성 사료, 음료, 사료 첨가제 및 음료(음수) 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 상기 사료 조성물에서, 상기 유효성분의 양은 사료 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 사료에 첨가하여 생산성 향상이나 건강을 증진시킬 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 구제역 바이러스를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물은 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다. 예를 들면, 상기 동물은 돼지 또는 소이다.

본 발명에서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하로 개체에 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 예를 들면 투여되는 개체 1kg 당 1pg 내지 5g의 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질일 수 있다.

본 발명은 2종의 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 기존에 비해 카피 수가 4배 이상 증가되어 백신 내에 들어가는 FMDV VLP 항원량이 높다.

상기와 같이 제조한 FMDV VLP를 항원으로 하여 백신을 제조한 경우, 마우스에서 항체 생성 기간도 짧으며, 구제역 바이러스 공격 접종에 대해 생존율이 높으며, 중화항체 역가도 높다. 또한, 마우스 뿐만 아니라 돼지에서도 2주 정도에 항체 생성이 시작되었으며, 6주 후에도 PI 값이 50%이상 되는 것을 확인하여, 구제역 바이러스 유사입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼으로 적용이 가능하다.

도 1은 FMDV 게놈 및 캡시드 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 FMDV VLP를 제조하기 위한 플랫폼을 나타낸 것이다.
도 3은 구제역 바이러스의 계통도를 나타낸 것이다.
도 4(a, b)는 A-type FMDV A22-Iraq, A-Bangladesh(A-Ban), A-Malaysia97(A-May97), A-Gimpo(A-GP), A-Pocheon(A-PC), 및 A-Yeoncheon(A-YC) VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다(파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1, 3C에서 볼드체 P: 변이위치, VP2에서 C 볼드체: 변이위치).
도 5(a, b, c)는 O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2), O1manisa, O-Taiwan97(O-Twn97), O-Campos, O-Boeun(O-BE), O-Jincheon(O-JC), O-Anseong(O-AS) 및 O-Gimje(O-GJ) VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다 (파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1, 3C에서 볼드체 P: 변이위치, VP2에서 C 볼드체: 변이위치).
도 6은 Asia1-type Asia1-Shamir와 Asia1-Mongol VLP 제조에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교한 것이다 (파랑: 3C, 초록: 3D 절단부위, 분홍: VP4, 적색: VP2, 보라: VP3, 갈색: VP1, 3C에서 볼드체 P: 변이위치, VP2에서 C 볼드체: 변이위치).
도 7은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pET-duet벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 8은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pACY-duet벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 9는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A22-Iraq의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 5의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A22-Iraq VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 10은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 7의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 11은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A-Malaysia97(A-May97)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 9의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 12는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A-Gimpo(A-GP)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 11의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 13은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A-Pocheon(A-PC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 13의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 14는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 15의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 15는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 17의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 16은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O1manisa의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 19의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O1manisa VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 17은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 21의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 18은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Campos의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 23의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-Campos VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 19는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Boeun(O-BE)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 25의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Boeun(O-BE) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 20은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Jincheon(O-JC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 27의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Jincheon(O-JC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 21은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Anseong(O-AS)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 29의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Anseong(O-AS) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 22는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV O-Gimje(O-GJ)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 31의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Gimje(O-GJ) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 23은 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV Asia1-Shamir의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 33의 유전자를 포함하는 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Shamir VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 24는 FMDV의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 FMDV Asia1-Mongol의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 35의 유전자를 포함하는 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Mongol VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 25는 대장균에서 발현된 구제역 바이러스 유사입자 단백질을 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 26은 대장균에서 발현된 FMDV VLP을 FMDV 간이 진단키트(VDRG^® FMDV 3Diff/PAN Ag Rapid Kit, MEDIAN DIAGNOSTICS)를 이용하여 확인한 것이다.
도 27은 FMDV VLP의 표준 검량 곡선을 나타낸다.
도 28은 정제된 FMDV VLP 항원을 TEM(Transmission electron microscopes)으로 확인한 것이다.
도 29는 표 6과 같이 제조한 백신을 7~8주령의 야생형 C57BL/6 마우스에 접종한 후 마우스 혈청을 분리하고 PrioCHECK?? FMDV Type A, O, Asia1 Antibody ELISA Kit(Thermoscientific사) 또는 FMD Type O Ab ELISA kit(BIONOTE사) 를 사용하여 ELISA test를 진행하는 과정을 나타낸 것이다.
도 30은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 Global strain O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2, 실시예 2-3의 O-Taiwan97, 실시예 2-2의 O1manisa을 백신으로 접종한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다. 도 24A는 type A의 ELISA 결과, 도 24B는 Type O의 ELISA 결과이다.
도 31은 Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP), 실시예 1-5의 A-Pocheon(A-PC)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-7의 O-Anseong(O-AS), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 백신으로 접종한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.
도 32는 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir을 사용하여 백신으로 접종한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.
도 33은 상기 FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 접종하고, 마우스의 몸무게 및 생존율을 확인하는 실험과정을 나타낸 것이다.
도 34는 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 Global strain O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), 실시예 2-2의 O1manisa을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.
도 35는 Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.
도 36은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.
도 37은 상기 FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 접종하고, 마우스의 혈액을 채취하여 중화항체 역가(VNT)을 측정하는 시험과정을 나타낸 것이다.
도 38은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir을 백신으로 접종한 후 중화항체 역가를 측정한 결과이다.
도 39는 표 7과 같이 제조한 백신을 돼지에 접종한 후 돼지 혈청을 분리하고 ELISA test를 진행하는 과정을 나타낸 것이다.
도 40은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2)을 백신으로 접종한 후 돼지 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다. 왼쪽(A)은 Type A의 ELISA 결과, 오른쪽(B)은 Type O의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 41은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir을 사용하여 백신으로 접종한 후 돼지 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<실험예 A. 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 및 재조합 벡터 제조>

구제역 바이러스의 바이러스 유사입자를 제조하기 위한 재조합 벡터를 유전공학적인 방법으로 제조하였다. O 혈청형, A 혈청형, Asia1 혈청형 모두 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다. 도 7은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pET-duet벡터 모식도를 나타낸 것이고, 도 8은 구제역 바이러스 유사입자((FMDV VLP)를 클로닝하기 위한 pACY-duet벡터 모식도를 나타낸 것이다.

먼저, 도 7에 도시된 바와 같이, 서열번호 37과 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 PCR를 진행하여, FMDV의 3C, 3D 절단부위(cleavage site) 그리고 VP4의 N-말단 부위를 포함하는 유전자 단편을 얻었다. 상기 PCR은 A22-iraq 바이러스에서 얻은 유전자를 주형(template)으로 사용하여 PCR을 진행하였다.

그리고 상기 3C, 3D 절단부위와 VP4, VP2, VP3, VP1이 순서대로 위치하면서, pET28a 벡터에 삽입될 수 있도록 서열번호 39 내지 70의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 PCR를 진행하였으며, VP4의 N-말단 부위를 제외한 VP4의 전체, VP2, VP3, VP1을 포함하는 유전자 단편을 얻었다. PCR을 진행하기 위하여, 각각의 타입별로 구제역 바이러스에서 얻은 유전자를 주형(template)으로 사용하였다.

구체적으로, 구제역 바이러스 A 혈청형은 A22-Iraq, A-Bangladesh(A-Ban), A-Malaysia97(A-May97), A-Gimpo(A-GP), A-Pocheon(A-PC), 및 A-Yeoncheon(A-YC) 바이러스에서 얻은 유전자(template)를 시료로 사용하였으며, 구제역 바이러스 O 혈청형은 O-PanAsia2(O-PA2), O1manisa, O-Taiwan97(O-Twn97), O-Campos, O-Boeun(O-BE), O-Jincheon(O-JC), O-Anseong(O-AS) 및 O-Gimje(O-GJ) 바이러스에서 얻은 유전자(template)를 시료로 사용하였으며, 구제역 바이러스 Asia1 혈청형은 Asia1-Shamir 또는 Asia1-Mongol 바이러스에서 얻은 유전자(template)를 시료로 사용하여 PCR을 진행하였다.

상기 두차례의 PCR을 통해 얻은 3C-3D 절단부위-VP4의 N-말단 부위를 포함하는 유전자 단편과, N-말단 부위를 제외한　VP4 전체-VP2-VP3-VP1를 포함하는 유전자 단편을 pET28a 벡터에 라이게이션하여 pET28a 재조합 벡터를 제조하였다.

다음으로, pET-duet 벡터의 MCS1과 MCS2에 상기 FMDV의 3C, 3D 절단부위(cleavage site)와 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 두 카피(copy) 삽입하기 위하여, 상기 pET28a-FMDV-VLP 재조합 벡터를 주형(template)으로 하면서, 서열번호 71 내지 134의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여, PCR을 진행하였다. 상기 pET-duet 벡터는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 상기 유전자 2 카피가 MCS1의 NcoI와 EcoRI 부위, MCS2의 NdeI와 EcoRV 부분에 삽입되도록 제작되었다.

또한, 위와 동일하게 pET28a 벡터에 FMDV의 3C, 3D 절단부위(cleavage site)와 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자 2 카피를 삽입하여 pACY-duet 벡터를 제조하였다. 따라서, 하나의 벡터에 각각 2 카피의 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 두 개의 벡터(pET-duet, pACY-duet)에 총 4 카피가 삽입되도록 재조합 벡터를 제조하였다.

실시예 1. A-type 구제역 바이러스 유사입자(FMDV VLP) 유전자 클로닝

1-1. Global strain A-type FMDV A22-Iraq VLP의 재조합 벡터 제조

Global strain A-type 구제역 바이러스의 바이러스 유사입자를 유전공학적인 방법을 이용한 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하고자 하였다. 실험예 A와 같이 FMDV의 3C, 3D 절단부위(cleavage site)와 FMDV A22-Iraq의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자가 순서대로 위치하도록 PCR을 진행하여 서열번호 5의 유전자 단편을 얻었다.

상기 서열번호 5의 유전자 단편은 도 2에 도시된 바와 같이, FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 5에 포함된 VP2는 Global strain A-type FMDV A22-Iraq의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAC가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 Global strain A-type FMDV A22-Iraq의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 히스티딘(H)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

또한, 상기 서열번호 5에 포함된 FMDV의 3C는 서열번호 1의 염기서열을 가지고, 3D 절단부위는 서열번호 3의 염기서열을 가진다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 야생형 FMDV의 3C에서 379-381 위치의 염기서열 CTG가 CCG로 변형되도록 디자인하여, 서열번호 1에 의해 코딩되는 3C의 아미노산 서열도 127번 위치의 L(류신)이 P(프롤린)으로 변형되도록 설계되었다.

도 9는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A22-Iraq의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 5의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A22-Iraq VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

상기 FMDV A22-Iraq의 VLP를 제조하고자 서열번호 5의 유전자 단편을 pET-duet vector와 pACY-duet vector의 MCS1의 NcoI와 EcoRI 부위, MCS2의 NdeI와 EcoRV 부분에 각각 라이게이션(ligation)하여 실험예 A와 같이 재조합 벡터를 제조하였다. 따라서, 벡터당 상기 유전자 단편 2 카피(COPY)가 삽입되어 두개의 벡터에 총 4 카피가 삽입되도록 유전자 재조합을 진행하였다.

1-2. Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 7의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 7의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 7에 포함된 VP2는 Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAT가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 8의 아미노산 서열에서 Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 히스티딘(H)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 10은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A-Bangladesh(A-Ban)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 7의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A-Bangladesh(A-Ban) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

1-3. Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV A-Malaysia97(A-May97) 의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 9의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 9의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A-Malaysia97(A-May97)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 9에 포함된 VP2는 Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAA가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 글루타민(Q)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 11은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A-Malaysia97(A-May97)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 9의 유전자를 포함하는 Global strain A-type FMDV A-Malaysia97(A-May97) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

1-4. Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV A-Gimpo(A-GP)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 11의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 11의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A-Gimpo(A-GP)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 11에 포함된 VP2는 Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAG가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 12의 아미노산 서열에서 Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 글루타민(Q)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 12는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A-Gimpo(A-GP)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 11의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Gimpo(A-GP) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

1-5. Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV A-Pocheon(A-PC)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 13의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 13의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A-Pocheon(A-PC)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 13에 포함된 VP2는 Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAG가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 14의 아미노산 서열에서 Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 글루타민(Q)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 13은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A-Pocheon(A-PC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 13의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Pocheon(A-PC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

1-6. Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 15의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 15의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 15에 포함된 VP2는 Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 CAG가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 16의 아미노산 서열에서 Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 글루타민(Q)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 14는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV A-Yeoncheon(A-YC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 15의 유전자를 포함하는 Korea strain A-type FMDV A-Yeoncheon(A-YC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

실시예 2. O-type 구제역 바이러스 유사입자(FMDV VLP) 유전자 클로닝

2-1. Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 17의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 17의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 17에 포함된 VP2는 Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 18의 아미노산 서열에서 Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 15는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-PanAsia2(O-PA2)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 17의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-PanAsia2(O-PA2) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-2. Global strain O-type FMDV O1manisa VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O1manisa의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 19의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 19의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O1manisa의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 19에 포함된 VP2는 Global strain O-type FMDV O1manisa의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 20의 아미노산 서열에서 Global strain O-type FMDV O1manisa의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 16은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O1manisa의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 19의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O1manisa VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-3. Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 21의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 21의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 21에 포함된 VP2는 Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 17은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Taiwan97(O-Twn97)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 21의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-Taiwan97(O-Twn97) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-4. Global strain O-type FMDV O-Campos VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Campos의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 23의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 23의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Campos의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 23에 포함된 VP2는 Global strain O-type FMDV O-Campos의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 24의 아미노산 서열에서 Global strain O-type FMDV O-Campos의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 18은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Campos의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 23의 유전자를 포함하는 Global strain O-type FMDV O-Campos VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-5. Korea strain O-type FMDV O-Boeun(O-BE) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Boeun(O-BE)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 25의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 25의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Boeun(O-BE)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 25에 포함된 VP2는 Korea strain O-type FMDV O-Boeun(O-BE)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 GGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 26의 아미노산 서열에서 Korea strain O-type FMDV O-Boeun(O-BE)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 글리신(G)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 19는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Boeun(O-BE)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 25의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Boeun(O-BE) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-6. Korea strain O-type FMDV O-Jincheon(O-JC) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Jincheon(O-JC)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 27의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 27의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Jincheon(O-JC)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 27에 포함된 VP2는 Korea strain strain O-type FMDV O-Jincheon(O-JC)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 28의 아미노산 서열에서 Korea strain strain O-type FMDV Jincheon(O-JC)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 20은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Jincheon(O-JC)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 27의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Jincheon(O-JC) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-7. Korea strain O-type FMDV O-Anseong(O-AS) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Anseong(O-AS)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 29의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 29의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Anseong(O-AS)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 29에 포함된 VP2는 Korea strain O-type FMDV O-Anseong(O-AS)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 30의 아미노산 서열에서 Korea strain O-type FMDV O-Anseong(O-AS)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 21은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Anseong(O-AS)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 29의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Anseong(O-AS) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

2-8. Korea strain O-type FMDV O-Gimje(O-GJ) VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV O-Gimje(O-GJ)의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 31의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 31의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV O-Anseong(O-AS)의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 31에 포함된 VP2는 Korea strain O-type FMDV O-Gimje(O-GJ)의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 32의 아미노산 서열에서 Korea strain O-type FMDV O-Gimje(O-GJ)의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 22는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV O-Gimje(O-GJ)의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 31의 유전자를 포함하는 Korea strain O-type O-Gimje(O-GJ) VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

실시예 3. Global strain Asia1-type 구제역 바이러스 유사입자(FMDV VLP) 유전자 클로닝

3-1. Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Shamir VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV Asia1-Shamir의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 33의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 33의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV Asia1-Shamir의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 33에 포함된 VP2는 Asia1-type FMDV Asia1-Shamir의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGT가 TGT로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 34의 아미노산 서열에서 Asia1-type FMDV Asia1-Shamir의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 23은 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV Asia1-Shamir의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 33의 유전자를 포함하는 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Shamir VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

3-2. Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Mongol VLP의 재조합 벡터 제조

FMDV A22-Iraq의 VP4-VP2-VP3-VP1 유전자 대신, FMDV Asia1-Mongol의 VP4, VP2, VP3, VP1 유전자를 증폭하여 서열번호 35의 유전자 단편을 얻는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 서열번호 35의 유전자 단편은 FMDV의 3C-3D 절단부위-FMDV Asia1-Mongol의 VP4-VP2-VP3-VP1이 순차적으로 배열되도록 설계한 것으로, 상기 서열번호 35에 포함된 VP2는 Asia1-type FMDV Asia1-Mongol의 야생형 VP2의 염기서열 기준으로 277-279 위치의 염기서열 AGC가 TGC로 변형되도록 설계되었으며, 서열번호 36의 아미노산 서열에서 Asia1-type FMDV Asia1-Mongol의 야생형 VP2 아미노산 서열을 기준으로 93번째 위치한 세린(S)이 시스테인(C)으로 변형되도록 설계되었다.

도 24는 FMDV의 3C, 3D 절단부위와 FMDV Asia1-Mongol의 VP4, VP2, VP3, VP1의 염기 서열이 순서대로 위치하면서 벡터에 두 카피(COPY)가 삽입되도록 설계된 서열번호 35의 유전자를 포함하는 Global strain Asia1-type FMDV Asia1-Mongol VLP의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

실험예 1. FMDV VLP 재조합 단백질 발현 확인

FMDV VLP 단백질 발현을 위해 실시예 1 내지 3에서 제조된 재조합벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환한 후, VLP 단백질 발현을 유도하였다. 단백질이 발현된 E. coli는 Tris-KCl buffer를 첨가 후 sonication을 진행하여 대장균을 파쇄하였다. 상기 패쇄된 대장균을 원심분리 후 상층액을 회수한 후, 정제과정을 거쳐 구제역 바이러스 유사입자 단백질을 얻었다.

상기 실시예 1 내지 3에서 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE후 western blotting을 통하여 이들 FMDV에 대한 특이적 항체를 이용하여 단백질 발현 여부를 확인하였다.

도 25는 대장균에서 발현된 구제역 바이러스 유사입자 단백질을 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다. 그 결과, 도 25에서 실시예 1-1(A22-Iraq), 2-1(O-PanAsia2(O-PA2)), 2-2(O1manisa), 3-1(Asia1-Shamir), 1-5(A-Pocheon(A-PC)), 1-4(A-Gimpo(A-GP)), 2-5(O-Boeun(O-BE)), 2-6(O-Jincheon(O-JC))의 재조합 VLP의 경우, FMDV VLP의 유전자가 단백질로 발현되는 것을 확인하였다. 이외에 나머지 실시예들의 FMDV VLP 역시 대장균에서 발현이 되는 것을 확인하였다(미도시).

또한, 정제된 재조합 VLP 단백질을 FMDV 간이 진단키트에 떨어뜨리고 10~15분 후 구제역 바이러스 유사입자 재조합 단백질 발현 여부를 확인하였다.

도 26은 대장균에서 발현된 FMDV VLP을 FMDV 간이 진단키트를 이용하여 확인한 것이다. 본 검출에 사용된 간이 진단키트는 VDRG^® FMDV 3Diff/PAN Ag Rapid Kit(MEDIAN DIAGNOSTICS사)를 사용하였다. 그 결과 실시예 1-1, 1-4, 1-5, 2-1, 2-2, 2-5, 2-6, 3-1, 3-2의 재조합 VLP가 간이 진단 키트에서 양성으로 나타나서, FMDV VLP 즉, 구제역 외피 구조 단백질의 유전자가 단백질로 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, FMDV VLP 항원 발현 수준도 높은 편이었다.

FMDV	종류		Level
A-Type	실시예 1-1	A22-Iraq	+++++
	실시예 1-4	A-Gimpo(A-GP)	+++
	실시예 1-5	A-Pocheon(A-PC)	++
O-Type	실시예 2-1	O-PanAsia2(O-PA2)	+++++
	실시예 2-2	O1manisa	+++
	실시예 2-5	O-Boeun(O-BE)	++++
	실시예 2-6	O-Jincheon(O-JC)	+++++
Asia1-type	실시예 3-1	Asia1-Shamir	++++
Asia1-type	실시예 3-2	Asia1-Mongol	+

실험예 2. 백신 내 FMDV VLP 항원 함량 측정

실험예 1에서 발현 및 정제된 구제역 외피 형성 단백질(VLP)에 대해 ELISA 방법을 이용하여 정량을 진행하였다. Standard control은 Asia1-type Asia1-Shamir VLP을 이용하였으며, ELISA 정량을 위한 표준 검량 곡선을 만들었다.

도 27은 FMDV VLP의 표준 검량 곡선을 나타낸다. 표준 검량 곡선을 확인한 결과

를 나타내어, R²은 0.996으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻었다(도 21).

표 5는 ELISA 정량법을 통한 구제역 VLP 항원량을 나타낸 것이다. Asia1-type의 Asia1-Shamir의 총 단백질을 BCA assay로 정량을 진행한 결과, 총 단백질 농도가 4.0 mg/ml로 확인되었으며, ELISA 정량법을 통해 확인한 결과 총 단백질 중 VLP 항원의 함량은 19.0±1 % 정도인 것으로 확인되었다. 이를 통해 총 단백질에 대한 VLP 항원량은 0.76±0.04 mg/ml인 것을 알 수 있었다. 또한, 백신에 들어가는 총 단백질 함량은 1.0 mg이므로, 백신 내 구제역 VLP 항원량은 190±10 ㎍에 해당하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 종래 구제역 백신의 항원량이 30~80 ㎍인 것에 비해 항원량이 현저히 높다는 것을 알 수 있다.

ELISA test 농도	ELISA test 흡광도	ELISA test 측정 농도	함량
0.2 mg/ml	0.4±0.02	38±2 ㎍/ml	19.0±1 %
백신에 들어가는 총 단백질량		백신 내 구제역 VLP 항원량
1 mg		190±10 ㎍

실험예 3. TEM을 이용한 FMDV VLP 항원 확인

유전자 재조합으로 제조한 FMDV VLP 항원의 확인을 위해 TEM 촬영 시험을 진행하였다. 실시예 1-1(A-type의 A22-Iraq), 실시예 2-1(O-type의 O-panasia2), 실시예 3-1(Asia1-type의 Asia1-Shamir)의 FMDV VLP를 대장균에서 발현시켰으며, 이후 대장균을 파쇄하고 한외여과(Ultra-filtration), PEG (Poly Ethylene Glycol) 농축, open column을 이용하여 정제를 진행하여 분획물(fraction)을 얻었다.

도 28은 정제된 FMDV VLP 항원을 TEM(Transmission electron microscopes)으로 확인한 것이다. 상기 얻은 fraction에 대해 western blot을 진행하였으며, western blot으로 확인된 분획물의 FMDV VLP 항원을 TEM으로 확인하였다(도 28). TEM 촬영은 한국기초과학연구원 춘천센터에서 시험을 진행하였다. 실시예 1-1(A-type의 A22-Iraq), 실시예 2-1(O-type의 O-panasia2), 실시예 3-1(Asia1-type의 Asia1-Shamir) VLP의 크기는 모두 25~35 nm인 것으로 확인되어, 구제역 바이러스와 동일한 크기를 보이는 것으로 확인하였다.

실험예 4. FMDV VLP 재조합 백신에 대한 마우스의 항체 생성 기간 확인

실시예 1 내지 3에서 제조한 FMDV VLP 항원을 이용하여 표 6과 같이 마우스에 접종하기 위한 백신을 제조하였다. 백신 제조에 사용한 FMDV VLP 항원은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), 실시예 2-3의 O-Taiwan97(OTwn97), 실시예 2-2의 O1manisa을 사용하였다. Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP), 실시예 1-5의 A-Pocheon(A-PC)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-7의 O-Anseong(O-AS), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 사용하였다. Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir를 사용하였다.

조 성	비 율
항 원	5 %
Saponin	1 %
Al(OH)₃ gel	10 %
Adjuvant	10 %
KCl Buffer	24 %
ISA206	50 %

도 29는 표 6과 같이 제조한 백신을 7~8주령의 야생형 C57BL/6 마우스에 접종한 후 마우스 혈청을 분리하고 PrioCHECK^TM FMDV Type A, O, Asia1 Antibody ELISA Kit(Thermoscientific사) 또는 FMD Type O Ab ELISA kit(BIONOTE사)를 사용하여 ELISA test를 진행하는 과정을 나타낸 것이다. 마우스는 C57BL/6N 계통으로 7주령 암컷을 사용였으며 마우스당 200 ㎕씩 접종하였다. 마우스 접종 및 혈액 채혈은 도 29와 같이 진행을 하였다. 채혈한 혈액은 혈청과 분리하여 ELISA test를 진행하였다. 도 30은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 Global strain O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2, 실시예 2-3의 O-Taiwan97, 실시예 2-2의 O1manisa을 백신으로 접종한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다. 도 30A는 type A의 ELISA 결과, 도 30B는 Type O의 ELISA 결과이다.

양성 대조군(positive control)은 BIOAFTOGEN FMD Vaccine(Careside Co., Ltd)을 사용한 것이다.

A-type의 실시예 1-1의 A22-Iraq VLP 항원에 대한 항체 생성은 백신 접종 2주 후 시작되었으며, 4주 후 PI값이 30% 이상 되는 것으로 확인되었다. 또한, O-type의 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), O1manisa VLP 항원에 대한 항체 생성도 접종 2주 후 시작되었으며, 4주 후 PI값이 50% 이상 되었다. 또한, O-type의 실시예 2-3의 O-Taiwan97(OTwn97) VLP 항원에 대한 항체 생성도 2주 후 시작되었으며, 4주일 때 가장 높은 PI 값이 확인되었다.

또한, A-type의 실시예 1-1의 A22-Iraq, O-type의 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2) VLP 항원 2가 백신(A22/OPA2)에 대한 항체 생성도 백신 접종 2주 후 시작되었으며, PI값은 4주일 때 가장 높았으며, PI값은 A-type은 28%이고, O-type은 43%로 확인되었다(도 30).

도 31은 Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP), 실시예 1-5의 A-Pocheon(A-PC)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-7의 O-Anseong(O-AS), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 백신으로 접종한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.

A-type의 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP), 실시예 1-5의 A-Pocheon(A-PC)의 VLP 항원에 대한 항체 생성도 14일(2주) 후 시작되었으며, 42 day 후 PI값이 30% 이상 되었다. 그리고 O-type의 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE) VLP항원에 대한 항체 생성도 14 day(2주) 후 시작되었으며, 42 day 후 PI값이 50% 이상 되었다. 또한, O-type의 실시예 2-7의 O-Anseong(O-AS), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC) VLP 항원에 대한 항체 생성도 14 day (2주) 후 시작되었으며, 42 day 후 PI값이 50% 이상 되는 것으로 확인되었다(도 31).

도 32는 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir을 사용하여 백신으로 접종 한 후 마우스 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.

양성 대조군(positive control)은 Aftopor(Asia1 mono,Beringer Ingelheim)을 사용한 것이다.

Asia1-type의 실시예 3-1의 Asia1-shamir의 VLP 항원에 대한 항체 생성도 2주 후 시작되었으며, 4주 후 PI값이 50% 이상 되는 것으로 확인되었다(도 32).

실험예 5. FMDV VLP 재조합 백신에 대한 마우스의 몸무게 및 생존율 측정

Global strain 및 Korea strain FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 실험예 4와 같이 제조하였으며, 이를 마우스에 백신 접종하였다. 이후 마우스에 구제역 바이러스를 공격 접종 후 마우스의 몸무게 및 마우스 생존 여부를 확인하였다.

도 33은 상기 FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 접종하고, 마우스의 몸무게 및 생존율을 확인하는 실험과정을 나타낸 것이다.

백신 접종에 이용된 항원으로는 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), 실시예 2-2의 O1manisa을 사용하였다. Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 사용하였다. Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir를 사용하였다. C57BL/6N 계통의 7주령 마우스에 200 ㎕씩 백신을 접종하였으며, 공격 접종은 A-type은 A22 strain 바이러스를 공격 접종하였고, O-type은 O-Vet strain 바이러스를 공격 접종하였고, Asia1-type은 Shamir strain 바이러스를 공격 접종하였다. 그 후, 몸무게 측정 및 생존 여부를 확인하였다.

도 34는 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 Global strain O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), 실시예 2-2의 O1manisa을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.

그 결과, A-type의 실시예 1-1의 A22-Iraq, O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2), 실시예 2-2의 O1manisa VLP 항원 모두에 대해 공격 접종 후 마우스의 몸무게 감소없이 증가하는 양상을 나타냈으며, 생존율도 100%인 것을 확인했다. 그러나, VPL 항원을 접종하지 않은 마우스는 1주일 후 모두 폐사하였다.

도 35는 Korea strain A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP)와 Korea strain O-type으로 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC)을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.

그 결과, A-type으로 실시예 1-4의 A-Gimpo(A-GP) VLP 항원에 대해 공격 접종 후 마우스의 몸무게 감소없이 증가하는 양상을 나타냈으며, 생존율도 85%인 것을 확인하였다. 그리고 O-type의 실시예 2-5의 O-Boeun(O-BE), 실시예 2-6의 O-Jincheon(O-JC) VLP 항원에 대해 공격 접종 후 마우스의 몸무게 감소없이 증가하는 양상을 나타냈으며, 생존율도 100%인 것을 확인했다. 그러나, VPL 항원을 접종하지 않은 마우스는 1주일 후 모두 폐사하였다.

도 36은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir을 백신으로 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존율을 나타낸 것이다.

그 결과, Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir VLP 항원에 대해 공격 접종 후 마우스의 몸무게 감소없이 증가하는 양상을 나타냈으며, 생존율도 100%인 것을 확인하였다.

실험예 6. FMDV VLP 재조합 백신에 대한 마우스의 중화항체 역가(VNT) 시험

Global strain Asia1-type FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 실험예 4와 같이 제조하였으며, 이를 마우스에 접종한 후 마우스의 혈청에 대한 중화항체 역가(VNT) 시험을 진행하였다. Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir VLP 항원을 이용하여 C57BL/6N 계통의 7주령 마우스에 200 ㎕씩 백신을 접종하였으며, VNT 측정을 위한 바이러스는 Asia1-type인 경우 Asia1-shamir strain 이용하였다. 그 후, 바이러스에 대한 VNT 값을 측정하였다.

도 37은 상기 FMDV VLP 항원을 포함하는 백신을 접종하고, 마우스의 혈액을 채취하여 중화항체 역가(VNT)을 측정하는 시험과정을 나타낸 것이다.

도 38은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir을 백신으로 접종한 후 중화항체 역가를 측정한 결과이다. 양성 대조군(positive control)은 Aftopor(Asia1 mono,Beringer Ingelheim)을 사용한 것이다.

그 결과, Asia1-type의 실시예 3-1의 Asia1-shamir VLP 항원에 대한 VNT 측정값은 252배(log 2.36)으로 확인되었다. 또한, 양성대조군(positive control) 백신에 대한 VNT 측정한 결과 log 2.44으로 확인되었으며, negative control은 log 1.2 이하인 것으로 확인되었다. 따라서, 실시예 3-1의 Asia1-shamir VLP 항원을 이용하여 제조된 백신은 positive control로 이용한 백신의 VNT 값과 비슷한 수치로 확인되었다.

실험예 7. FMDV VLP 재조합 백신에 대한 돼지의 항체 생성 기간 확인

실시예 1 내지 3에서 제조한 FMDV VLP 항원을 이용하여 표 7과 같이 돼지에 접종하기 위한 백신을 제조하였다. 백신 제조에 사용한 FMDV VLP 항원은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 Global strain O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2)을 사용하였다. Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-Shamir를 사용하였다.

조 성	비 율
항 원	10 %
Saponin	1 %
Al(OH)₃ gel	10 %
Adjuvant	10 %
KCl Buffer	19 %
ISA206	50 %

도 39는 표 7과 같이 제조한 백신을 돼지에 접종한 후 돼지 혈청을 분리하고 ELISA test를 진행하는 과정을 나타낸 것이다. 돼지는 10-12주령을 사용하였으며, 돼지당 2 ml 씩 접종하였다. 돼지 접종 및 혈액 채혈은 도 33과 같이 진행을 하였다. 채혈한 혈액은 혈청과 분리하여 ELISA test를 진행하였다. 도 40은 Global strain A-type으로 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type으로 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2)을 백신으로 접종한 후 돼지 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다. 왼쪽(A)은 Type A의 ELISA 결과, 오른쪽(B)은 Type O의 ELISA 결과를 나타낸다. 양성 대조군(positive control)은 BIOAFTOGEN FMD Vaccine(Careside Co., Ltd)을 사용한 것이다.

A-type의 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type의 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2) VLP 항원 2가 백신(O/A 백신)에 대한 Type A형의 항체 생성은 백신 접종 2주 후 시작되었으며, 6주 후 PI값이 50% 이상 되는 것으로 확인되었다. 또한, A-type의 실시예 1-1의 A22-Iraq와 O-type의 실시예 2-1의 O-Panasia2(OPA2) VLP 항원 2가 백신(O/A 백신)에 대한 Type O형의 항체 생성도 백신 접종 2주 후 시작되었으며, 6주 후 PI값이 50% 이상 되는 것으로 확인되었다.

또한, 양조 대조군(Positive) 백신에 대한 항체 생성은 2주 후 시작되었으며, 6주 후 PI값이 50% 이상 되었으며, 음성대조군인 Negative 백신에 대해서는 항체가 생성되지 않는 것으로 확인되었다.

도 41은 Global strain Asia1-type으로 실시예 3-1의 Asia1-shamir을 사용하여 백신으로 접종 한 후 돼지 혈청을 분리하여 ELISA test를 진행한 결과이다.

Asia1-type의 실시예 3-1의 Asia1-shamir VLP 항원에 대한 항체 생성도 2주 후 시작되었으며, 6주 후 PI값이 50% 이상 되는 것으로 확인되었다 또한, 양성 대조군(Positive) 백신에 대한 항체 생성은 2주 후 시작되었으며, 6주 후 PI값이 50% 이상 되었으며, 음성대조군인 Negative 백신에 대해서는 항체가 생성되지 않는 것으로 확인되었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

하기의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 하기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 백신 조성물:
상기 폴리뉴클레오티드는 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로서,
상기 3C는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 3D 절단부위는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 VP4의 N-말단 부위는 서열번호 135의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어짐.
제1항에 있어서,
상기 3C는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 구제역 바이러스의 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 3D 절단부위는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인, 구제역 바이러스의 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 구제역 바이러스의 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 것인, 구제역 바이러스의 백신 조성물.
하기의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 하기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 예방 또는 개선용 면역증강제 조성물:
상기 폴리뉴클레오티드는 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로서,
상기 3C는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 3D 절단부위는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 VP4의 N-말단 부위는 서열번호 135의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어짐.
하기의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 단백질, 하기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물:
상기 폴리뉴클레오티드는 구제역 바이러스(FMDV)의 3C, 3D 절단부위로 VP4의 N-말단 부위가 치환된 VP4, VP2, VP3, 및 VP1의 염기서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로서,
상기 3C는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 3D 절단부위는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어지며,
상기 VP4의 N-말단 부위는 서열번호 135의 아미노산을 코딩하는 염기서열로 이루어짐.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 구제역 바이러스를 예방 또는 치료하는 방법.