KR102550715B1

KR102550715B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 PRRS2/Kor/GBGJ22/2011 바이러스주

Info

Publication number: KR102550715B1
Application number: KR1020210057543A
Authority: KR
Inventors: 이경기; 김성희; 정혜영; 고미경; 박지영; 소병재
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2021-05-03
Publication date: 2023-07-05
Also published as: KR20220150507A

Abstract

본 발명은 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주(수탁번호 KCTC14073BP) 및 이를 유효성분으로 포함하는 PRRS 예방용 백신 조성물, 및 상기 GBGJ22 바이러스주에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 PRRS 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 GBGJ22 바이러스주는 국내 계통에 속하면서, 저병원성의 특징을 보유한다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 관련 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 PRRS2/Kor/GBGJ22/2011 바이러스주{Novel Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRS/Kor/GBGJ22/2011 virus strain}

본 발명은 새로운 유전학적 특징을 가진 국내 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 관한 것이다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)은 1980년대에서 1990년대 사이부터 북미, 유럽 및 아시아 지역에서 유행했던 것으로 추정된다. 그 원인체인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)는 유전적으로 유럽형(EU, type I) 및 북미형(NA, type II)으로 나뉘어져 있고, 각 유전형은 명칭에서 알 수 있듯이, 유럽형은 유럽에서 북미형은 북미지역을 중심으로 유행하면서, 1991년에 유럽형인 Lelystad와 북미형인 VR2332 바이러스주가 분리되었다.

PRRS는 국내외적으로 양돈산업에 가장 크게 생산성 피해를 주는 전염성 질병 중의 하나이나, 정확한 경제적 피해 현황은 집계가 불가능하다. 다만, 미국에서 추산된 피해 액수와 국내 축산규모를 감안하여 추정한다면, 국내에서는 피해 규모가 대략 연간 1000억 원 정도로 예상되고 있다.

돼지 생식기 호흡기 증후군의 청정화(또는 안정화)를 위해 생독 및 사독 백신이 개발되어 사용되고 있음에도 불구하고 지속적인 바이러스 변이로 인해 질병 방제에 어려움을 겪고 있으며, 이로 인해 양돈산업에 막대한 경제적 손실을 입히고 있다.

한편, 국내에서는 1980년대 중후반부터 북미형 바이러스 감염이 밝혀졌고 2005년 처음 유럽형 바이러스의 감염 확인 이후, NA 및 EU 단독 감염 또는 두 개의 유전자형이 혼합된 복합 감염이 일어나고 있으며, 각각의 유전자형 내에서는 10% 이상의 상동성 차이를 보여 유전적으로 다양한 바이러스가 존재하고 있다.

이와 같이 유전적으로 다양한 PRRSV에 대한 병원성 및 면역학적 특성 변화를 지속적으로 분석하여야 하나, 현재 유행 PRRSV의 특성 평가가 명확하게 이루어지지 않고 있다.

전세계적으로 나라별 유전적 및 항원적으로 다양한 바이러스가 보고되고 있으며, 우리나라의 경우 외국과는 다른 우리나라에서만 유행하고 있는 유전적 특징을 보이는 PRRSV가 보고되고 있다. 이에, 국내 PRRSV에 대한 백신 및 진단에 관련된 연구가 매우 필요한 상황이다.

국내공개특허 10-2019-0089899호

본 발명자들은 국내에서만 나타나는 유전적 특징을 보이는 PRRSV를 동정하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 GBGJ22 바이러스주가 국내 계통(lineage)에 속하면서, 저병원성의 특징을 보유한다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 국내에서만 나타나는 유전적 특징을 보이는 PRRSV를 동정하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 GBGJ22 바이러스주가 국내 계통에 속하면서, 저병원성의 특징을 보유한다는 것을 규명하였다.

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주, 상기 바이러스주를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 예방용 백신 조성물 및 상기 바이러스주에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 진단용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주에 관한 것이다.

본 발명의 "돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)"는 크게 유럽형(EU, type I) 및 북미형(NA, type II)으로 나뉘는데, 직경 25-35nm로 단쇄 RNA 유전자가 자리하고 있으며 본 바이러스는 Arterivirdae에 속한다. 임상 증상은 번식장애와 호흡기 질환이 복합적으로 나타나며, 번식장애는 대부분 감염 초기부터 6개월 정도가 경과하면 감염 이전 상태이고, 호흡기질환은 PRRS 단독감염의 경우보다는 세균성, 바이러스성 병원체의 2차 감염 및 복합감염이 많으며 그 경우 병원성이 훨씬 증폭된다.

본 발명의 "북미형"은 PRRSV 유전자의 차이에 따라 "유럽형" 및 "북미형"으로 나누어진 타입 중 하나로, 상기 두 유전자형 사이에는 대략 50~70%의 염기서열 상동성과 50~80%의 아미노산 상동성을 보이고 있으며, 각각의 유전자형 내에서 염기서열은 평균 12.5~15% 그리고 최대 21~30%의 유전적 차이가 있다.

본 발명의 PRRSV 게놈(genome)은 15.1kb이며, 주요 유전자 부위로는 복제 단백질(replicase protein)의 경우 ORF1a(2,397 aa) 및 ORF1ab(3,854 aa), 구조 단백질(Structural Proteins)의 경우 ORF2a(GP2, 249 aa), ORF2b(E, 70aa), ORF3(GP3, 265aa), ORF4(GP4, 183aa), ORF5(GP5, 201aa), ORF6(M, 173aa) 및 ORF7(N, 128aa)로 구성되어 있다.

본 발명의 PRRSV는 ORF5 유전자를 분석하여 그룹화(grouping)하며, 이 부위의 PRRSV type II(북미형, NA) 바이러스 간 유전학적 상동성은 78.11~100%에 이른다. 국내의 경우 계통 1, 계통 5 및 국내 계통(Korea lineage)이 주로 유행하는 것으로 보고되어 있다.

상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 대표적 북미형 공시 바이러스주인 VR2332와 86.64%의 상동성을 가지고, 양 바이러스주간 13.36%의 상이성이 인정되어 신규한 바이러스주로 판명되었다.

상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주는 ORF1a(open reading frame 1a) 영역에 다음과 같은 뉴클레오티드가 결실된 것이다:

- ORF1a nucleotide 2,116~2,448(706-816 aa), ORF1a nucleotide 2,597~2,599(867 aa), ORF1a nucleotide 2,664~2,720(885-903aa).

ORF1a는 복제 유전자 조절(특히, 단백질 분해 가공과정(Proteolytic processing)에 관여) 및 복제/전사 복합체(replication/transcription complex)의 막에 박힌 스캐폴드 형성에 주로 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이 부위의 유전자 소실은 바이러스 복제 및 형성에 주로 변화를 주어 돼지에 감염 시 생성되는 바이러스의 양에 변화를 주어, 병원성에도 관여할 것으로 추정되었다.

한편, 실제 미국에서 발생한 고병원성 PRRSV가 속한 계통 1 NADC30 그룹에서 ORF1a에 유사한 소실이 보고되어 있는 바, 본 발명의 GBGJ22 바이러스주는 국내 계통에 속하면서, 고병원성 NADC30의 특징을 보유하였으나, 저병원성의 특징을 가지는 새로운 바이러스주 타입임을 확인하였다.

상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주의 전장 유전체 염기서열은 Next Generation sequencing(NGS, Illumina iseq100)을 통해 확인되었다.

상기 수득된 신규한 바이러스주를 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주로 명명하고, 2019년 12월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14073BP를 부여 받았다.

상기 GBGJ22 바이러스주는 돼지 폐포 대식세포(Porcine alveolar macrophages, PAM)로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 상기 GBGJ22 바이러스주는 대조군에 비하여 저병원성에 해당하는 특징을 나타냄을 확인하여, PRRSV 북미형 바이러스와 관련된 실험에 손쉽게 제공할 수 있고, PRRSV 북미형 바이러스 진단뿐만 아니라, 백신 조성물로 이용 가능함을 확인하였다.

상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주는 서열번호 2의 ORF1a 아미노산 서열, 서열번호 3의 ORF1b 아미노산 서열, 서열번호 4의 ORF2 아미노산 서열, 서열번호 5의 ORF3 아미노산 서열, 서열번호 6의 ORF4 아미노산 서열, 서열번호 7의 ORF5 아미노산 서열, 서열번호 8의 ORF6 아미노산 서열 및 서열번호 9의 ORF7 아미노산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1의 염기서열은 이를 구성하는 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 1의 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 2 내지 9의 아미노산 서열의 범위는 서열번호 2 내지 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2 내지 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2 내지 9로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 단백질을 말한다.

상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주는 이종(different species) 유래 세포주에 고정되어 연속적으로 계대배양하고, 상기 이종 유래 세포주는 원숭이, 마우스, 랫드, 햄스터, 저빌, 기니피그, 토끼 및 개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 세포주이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 양태는 상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 백신은 추가로 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

또한, 상기 백신 조성물은 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 애주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일, 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백신은 생백신, 약독화 백신 및 사독 백신으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 백신일 수 있다.

본 발명의 목적을 위한 백신 조성물은 일반적으로 10³~10¹⁰의 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물의 투여량은 체중 1kg 당 0.01ml 내지 1ml를 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신 조성물은 동결건조 형태로 제조될 수 있으며, 이 경우 안정화제를 첨가하는 것이 바람직하다. 적절한 안정화제로는, 예를 들어, SPGA(Bovarnik et al., J.Bacteriology 59, 509, 1950), 탄수화물(솔비톨, 만니톨, 트레할로즈, 전분, 슈크로즈, 덱스트란 또는 글루코즈등), 단백질(알부민 또는 카제인 등), 또는 이들의 분해산물, 및 완충액(알칼리 금속 포스페이트)이 포함된다.

본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌 내로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하여 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 PRRSV 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주의 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 및/또는 ORF7 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 구체적으로, 진단은 PRRS 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명은 프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프라이머"는 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌 (Sambook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

상기 본 발명의 PRRS 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

상기 바이러스주 및 이를 포함하는 각 조성물의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 PRRSV 계통 1~9 그룹과의 재조합(recombination) 비율을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(혈중 바이러스 역가)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(일당 증체율)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(체온)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(폐병변지수)를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(CTL 발현)를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석결과(IL-17 발현)를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험예 1: 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 국내 북미형 GBGJ22 바이러스주의 분리 및 동정

돼지 폐포 대식세포(Porcine alveolar macrophages, PAM)를 6-웰 플레이트에 웰당 1Х10⁶세포로 준비하고, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지(+ 10% Fetal Bovine Serum (FBS) + 1% Antibiotic-Antimycotic)에서 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터로 4-8시간 동안 배양하였다. 1 ml/웰의 PBS를 사용하여, 세포가 떨어지지 않도록 조심스럽게 2회 세척하였다. 그 다음, 200-500 μl/웰의 바이러스 부유액을 넣어준 후, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터로 90분 동안 배양하였다. 바이러스 부유액을 모두 제거한 후, 6.5 ml/웰의 배지를 넣고 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 매일 세포 병변(Cytopathic effect, CPE)을 확인하면서 3-5일 배양하였다. CPE가 확인되면, 동결-해빙(freeze-thawed)을 3회 진행하였다. 650g, 4℃ 20분 원심분리한 후, 상층액(바이러스 부유액)을 분리하여 보관하였다.

실험예 2: GBGJ22 바이러스주의 분자유전학적 특성

NGS(Illumina iseq100)을 통하여 본 발명의 PRRSV GBGJ22 바이러스주의 전장 유전체를 분석한 결과, 전체 유전체 길이는 15,033kb(ORF1a 7,119kb(2,372aa). ORF1b 4,374kb(1,457aa), ORF2 771kb(256aa), ORF3 765kb(254aa), ORF4 537kb(178aa), ORF5 603kb(200aa), ORF6 525kb(174aa), ORF7 372kb(123aa))로, NCBI에 등록된 여러 바이러스주와의 전장 유전체의 상동성은 80.0~86.7%, 국내 계통에 속하는 여러 바이러스주와의 전장 유전체의 상동성은 76.8~88.5%로 나타났다.

구체적으로, 각 분절별로 유전학적 상동성을 확인한 결과, ORF1a 70.9~88.1%(76.5~90.0%aa), ORF1b 81.9~96.1%(93.8~98.4%aa), ORF2 81.6~92.0%(83.2~91.9%aa), ORF3 68.9~91.7%(75.9~91.3%aa), ORF4 80.2~89.6%(84.3~93.7%aa), ORF5 86.4~95.4%(81.3~94.0%), ORF6 83.6~97.6%(90.6~99.4%aa), ORF7 80.2~92.3%(84.3~93.3%aa)로, ORF5가 국내 계통 사이에서 특히 낮은 상동성을 보였다.

한편, ORF5는 중화항체 유도에 관여하는 외피 단백질(envelope protein) GP5를 암호화(encode)하며, 기존의 한국에서 유행하는 PRRSV와 다른 면역학적 특성을 나타내며, 기존 백신 적용이나 숙주내 면역 회피 등의 변이를 보일 것으로 추정할 수 있다.

한국 내 최초 유입 PRRSV로 추정되는 프로토타입(Prototype) 계통 5 바이러스주인 ATCC-VR2332와의 유전학적 상동성은 ORF1a 77.7%(81%aa), ORF1b 95.9%(98.4%aa), ORF2 90.5%(91%aa), ORF3 91.8%(90.4%aa), ORF4 89.6%(94.2%aa), ORF5 84.5%(81.8%), ORF6 92.9%(97.7%aa), ORF7 86.6%(89.6%aa)로, 특히 ORF1a가 상동성이 낮게 나타났다.

SimPlot 분석을 통해 계통 1~9 그룹과의 재조합(recombination) 비율을 확인하였다.

도 1a 및 1b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 GBGJ22 바이러스주는 기존의 계통 그룹의 ORF1a의 상동성은 45~90% 정도로 매우 낮으며, ORF1b 부위는 계통 5와 95% 이상, ORF3 부위는 계통 5와 91% 이상 높은 상동성을 보이는 새로운 형태의 재조합된 바이러스로 추정되었다.

특히, 복제 단백질(replicase protein)을 생성하는 것으로 알려진 ORF1a 부위에 다른 국내 계통 PRRSV에서는 보고된 적 없는 새로운 소실(deletion) 부위를 확인하였다. 부위는 다음과 같다:

ORF1a nucleotide 2,116~2,448(706-816 aa), ORF1a nucleotide 2,597~2,599(867 aa), ORF1a nucleotide 2,664~2,720(885-903aa).

실험예 3: (in vivo) GBGJ22 바이러스주의 병원성 분석

4주령 PRRS 음성자돈 8두에 10^3.0 TCID50/ml의 바이러스를 근육(IM)으로 공격 접종하였다. 접종 후 0, 3, 7, 14, 28일에 채혈 및 비강 스왑을 실시하고, 접종 14일째, 28일째 각 그룹별 4마리씩 부검하였다. 14일째와 28일째 부검 시 각 장기(폐, 편도, 림프, BALF) 및 PBMC를 분리하여 분석을 실시하였다.

GBGJ22 바이러스주 외에 계통 1(accession number JN654459.1)과 현재 생백신으로 사용중인 계통 5(VR2332)의 바이러스를 포함하여 병원성 실험을 실시하였다.

계통(Lineage)	바이러스	혈중 바이러스 평균 역가(TCID₅₀/ml)	평균 체온 (℃)	평균 일당증체율 (kg/daY)	폐병변지수(28일)
1	JN654459.1	1.36	39.7	0.43	1.75-2.25
5	VR2332	2.65	39.5	0.47	1-1.4
Korea	GBGJ22	1.51	39.4	0.23	1.8-2

상기 표 1 및 도 2 내지 7에서 확인할 수 있듯이, 다른 계통의 그룹과 비교하여 낮은 일당증체율(도 3) 외에는, 프로토타입 VR2332와 유사한 저병원성(도 2, 4 및 5)을 나타내었다. 면역학적 부분에서도 CTL의 발현이 2~3배 정도 높은 비율로 증가하였고(도 6), 사이토카인 IL-17이 증가하는 특징을 나타내었다(도 7).

한국생명공학연구원

KCTC14073BP

20191212

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Novel Porcine reproductive and respiratory syndrome virus GBGJ22 strain <130> PN210062 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15003 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 tatgacgtat aggtgtgggc tctatgcctt ggcatttgta ttgtcaggag ctgtgaccac 60 cggcacagcc caaaacttgc tacgcagaaa cacccttctg tgatagcctt cttcaggggg 120 gcttagggtt tgtccctagc accttgcttc tggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180 ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgc acccccaatg ccagggtgtt 240 tatggcagag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tcctccccct 300 gaacctccaa gtttctgagc tcggggtgct aggcctattt tataggcccg aagagccact 360 ccggtggacg ttgccgcgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgctg gagcctgctg 420 gctttctgca atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag 480 attggtgcgg gtcgcagccg agctttacag agccggccag ctcacccagg cggttctgaa 540 ggctctacaa gtttatgaac gaggttgccg ctggtacccc attgtcggac ccgtccctgg 600 ggtggccgtt tatgccaatt ccctgcatgt gagtgataaa cctttcccag gggcaactca 660 cgtgttgacc aacttgccgc tcccgcagag acccaaacca gaagactttt gcccctttga 720 gtgcgccatg gctgccgtct atgacattgg tcatggcgcc gtcatgttcg tggccgaagg 780 gagagtctct tgggccccgc gtggtgaaga aaaagggaaa tttgaaacgg ttcccgagaa 840 gttgaggttg atcgcagagc aactttacac ctccttccca ccccaccacg cggtgaacat 900 atctgaatat accttcacag cccccgagtg cggtgcttcc atgcgggtcg aacgccagca 960 tggctgcctc cctgctggcg ctgtccctga cggcaactgc tggtggagct tgttcagcct 1020 gctcccattg gaagttcagt ataaagaaat tcgccgtgct acccaatttg gctatcaaac 1080 caagcacggc gttgctggca agtacctaca acggaggctg caaattaatg gtctccgagc 1140 tgtggttgac tcgggcggac ctttggtcat acagtacttc tccgttaagg agagctggat 1200 ccgccacgtg aggctggcgg aagagcccgg ctaccctggg tttgaggatc tcctcaggat 1260 aagagtcgag cccaacacgt tgccattatc caacaaggac gagaaaatct tccggtttgg 1320 tgggcacaag tggtacggtg ccgggaagag ggcaaggaga acacgtgcaa gtgcggttac 1380 cacggtcgcc ggtcgtactc cgcacaccgg cgaatctcaa caaaccgaaa agcacgaggt 1440 tgctagtgct aacggagccg agcttcctga gcgctattcc ccgcctgctg aagggaattg 1500 cggctggcac tgcatctccg ccatcgttaa ccggatggta aattccaaat ttgaaactgc 1560 ccttcccgaa agagtgagat ccccagaaga ctgggctact gatgaggatc ttgtgaatac 1620 catccaaatc ctaaggctac ctgcggcctt agacaggggc ggtgtctgcg cgagcgccaa 1680 gtacatcctt aagctggaga gtgagcactg gactgtttca gtgattcccg ggaagccccc 1740 ttctttgctc ccccttgaat gcatccaggg ttgttgtgag cacaagggca attttgatcc 1800 tccaaacacg gtcggggtta ccgggttcga ccctgccagc cttgaccgac ttgctggggt 1860 gatgcacatg cctagcagtg ccatccctgc cgctctggcc gagttgtctg gtgaccttga 1920 tcgtccaact tcctcggccg ccactgtgtg gactgtctcg cagttttatg ctcgtcatag 1980 tgggggagaa catcctgacc aaaagtgctt aagaaagatt atcaacctct gtgaggtgat 2040 tgagggttgc tgctgttctc agaataagac caaccgggcc accccggagg aggtcgcagc 2100 aaagattgat ctgtatcttc gtgatgcagc aaatcttgaa gagtgcttgg ccaggctcga 2160 gaaggcccgc ccgccaggcg tgttagatac ctcctttgat tgggatgttg tgctccctgg 2220 tgttggggca gccgctcaaa caacaaaact gtccctcacc agccagtgtc acactccagt 2280 caccgttgcg gctcaagggt ctccgccgaa 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cgcgccttct ataggtgcag agagcgacat 3180 caccattggc tcagttgcta ctgaagaagt cccacgcctt cttggaaggg tagaaggtat 3240 tggtaaaacg accgaccagg aaccttcagc accctttgca gacgaactga caaatgatca 3300 acccgcaaaa ggacaccaag caccagctcc tcccgcaaac acgggtggtg cagacttatt 3360 tctgaattct ggggggtcgc cagagcttac cgacttgccg ccttcaaatg gcactgatgt 3420 gggcgggtgg agaccgttac acacggccaa gaagaaggca gaagggtact ttgaccgact 3480 gagccgccag gtttttaacc tcgtctccca tctccctgtt ttcttctcac gcctcttcag 3540 gtatgatggt ggttactctt caggtgattg gagttttgca gcttttactt tattgtgtct 3600 ccttctatgt tacagttacc cagctttcgg tatcgctccc ctcttgggtg tgttttctgg 3660 gtctcctcgg tgcgtgcgca tgggggtttt tggttgctgg ctggcttttg ctgttaacct 3720 gttcaaatct atgcctgacc cagtcggtgc tgcttgtgag tttgattcgc cagagtgtag 3780 agatatcctt cattcttttg agcttctgca accttgggac cctgttcgca gccttgtgtt 3840 gggccccgtc ggcctcggtc ttgccattat tggcaggtta ctgggcgggg cacgctacgt 3900 ctggctgttt ttgcttaggc ttggcatcgt ttcagactgt atcttggctg gagcttatgt 3960 gctttcgcaa ggtaggtgta aaaagtgctg 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ttgcaaggct gatgtgttgt gcgttctgct 4860 tgctattgcc agctatgttt gggcacccct cacctggttg ctctgcgtgt ttccttgctg 4920 gctgcactgg ttttccttgc atcccctcac cattttatgg ttagtgtttt tcttgatttc 4980 tgtaaacatg ccctcaggaa tcttggccct ggtgttgttg atctctctct ggctccttgg 5040 tcgctatacc aacgttgccg gccttgtcac tccttatgac attcaccatt acaccaacgg 5100 tcctcgtggc gttgccgcct tggccactgc accggacgga acctatttgg ctgctgtccg 5160 ccgcgctgca ttgactggcc gtactatgct gtttaccccg tctcaacttg gatcactcct 5220 tgagggcgcc tttagaaccc aaaagccttc actgaacacc gttaacgtgg ttgggtcctc 5280 catgggctcc ggcggggtat ttactattga tgggaaaatt aagtgtgtga ctgccgcaca 5340 tgtccttgcc ggcaactctg ctagagtctc cgggattggc tttaacaaaa tgcttgactt 5400 tgatgtaaac ggtgattttg ctatagccga ttgcccagat tggcaagggg ttgctcccaa 5460 gtcccagttc tgcaaggatg ggtggactgg ccgcgcttat tggctgacgt cctctggcgt 5520 cgaacccggc gtcattggtg acggatttgc cttctgcttc accgcgtgtg gcgattccgg 5580 gtccccagtg attaccgagg ctggggagct cgtcggcgtc cacacgggat caaacaagca 5640 aggaggaggc atcgttacgc gcccctcggg ccagttctgc aatgtgacac ccaccaagct 5700 aagtaaactg agtgaatttt ttgctggacc taaggtcccg cttggtgatg tgaaggttgg 5760 caaccacata atcaaagaca taagtgaggt gccctcagat ctctgcgccc tgctcgctgc 5820 caaacctgaa ttggaagggg gcctctccac tgtccaactc ctgtgtgtct tttttctcct 5880 gtggaggatg atgggccatg cctggacgcc cttggttgct gtgggttttt ttattttgaa 5940 tgaaattctg ccggctgtcc tggtccgggg tgttttctcc tttggaatgt ttgcgctatc 6000 ctggttcaca ccatggtccg cacaaatttt aatgatcagg cttctaacag cagcccttaa 6060 taggaacaga tggtcgcttg cctgttacag ccttggtgca gtgaccggat tcgtcgcaga 6120 ccttgcaact actaacgggc attcgttgca aacagccatg aatctgagca cctatgcatt 6180 cttgccccga atgatggtta tgacctcccc agttccagtg atcgcggttg gtgttgtgca 6240 cctacttgcc atcattttgt acttgttcaa ataccgcagc ctgcacaccg tcttggttgg 6300 cgatggggtg ttttctaccg ctttctttct tcgatacttt gctgaaggaa aattgaggga 6360 aggggtgtcg cagtcttgtg gaatgaatca tgagtcttta actggtgctc tcgctatgag 6420 acttaatgac gaggacttgg atttccttac gaaatggacc gattttaagt gctttgtctc 6480 cgcgtccaac atgagaaacg cagcaggtca atttattgaa gctgcctatg ctaaagcact 6540 tagagtggaa ttggcccagt tggtgcaggt tgacaaagtt cgaggtacta tggctaaact 6600 cgaagctttt gctgataccg tggcacccca gctctcgccc ggcgacattg ttgtcgctct 6660 tggccacacg cctgttggtg gagttttcga cctaaaggtt ggcagcacca ggcataccct 6720 ccaagccatt gagaccagag tccttgctgg gtccaaaatg accgtggcgc gcgtcgtcga 6780 cccgattccc gcgcccccac ccgaacccgt gcccatcccc cttccaccga aagttctgga 6840 gaatggcccc aacgcttggg gggatgagga ccgtttgaac aagaagaaga ggcgcaaaat 6900 ggaagctgtt ggcatttatg tcatgggcgg gaagaagtac caaaaatttt gggacaagaa 6960 ttctggtgac gtgttttacg aggaggtcca tgacaacaca gatgcgtggg agtgcctcag 7020 agttggtgac cccattgact ttgaccctga gaaaggaact ccctgtggac atgtcaccat 7080 tgagggaaag gcttaccacg tttatgcctc cccaaccggc aagaagttct tggtccccgt 7140 caacccagag aatgggacag cccaatggga agctgcaaag ctttccgtgg agcaggcctt 7200 aggcatgatg aatgtcgacg gcgaactgac tgccaaagaa atagagaagc tgaaaagaat 7260 aattgaaaaa ctccagggcc tgactaagga gcagtgttta aactgctagc cgccagcggc 7320 ttgacccgct gtggccgcgg cggcttggtt gttactgaga cagcggtgaa aatagtcaaa 7380 tttcacaacc ggaccttcac cttgggacct gtgaatttaa aattggccag tgaagtcgag 7440 ttaaaggacg cggtcgagca caaccaacat ccggttgcga gaccgatcga tggtggagtt 7500 gtgctcctgc gttctgcggt cccttcgctt atagacgtct taatctccgg tgctgatgca 7560 tctcccaagt tgcttgccca acacgggccg ggaaacactg ggatcgatgg cacgatctgg 7620 gattttgagt ctgaagccac taaagaggaa atcgcactca gtgcacaaat aatacaggct 7680 tgtgacatta ggcgcggcga cgctcctgaa attggtcttc cttacaggct gcaccctgtt 7740 aggggcaatc ctgagcggga aaaaggagtc ctgcggaata caaggtttgg agacatacct 7800 tacaaaaccc ccagtgacac cggaagccca gtgcacgcgg ctgcctgcct tacgcccaac 7860 gccactccgg taactgatgg gcgctccgtt ttggccacga ccatgccccc cgggttcgag 7920 ttgtatgtgc cgaccatacc agcgtctatc cttgattacc ttgattctag acctgactgc 7980 cccaaacagt tgacagagca cggctgcgag gatgccgcat tgaaagacct ctctaaatat 8040 gacttgtcta ctcagggctt tgttttgccc ggagttcttc gtcttgtgcg gaaatacctg 8100 tttgcccacg taggaaagtg cccacccatt catcggcctt ctacttaccc tgccaagaat 8160 tccatggctg gaataaatgg aaacaggttc 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Claims

수탁번호 KCTC 14073BP 로 수탁된, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 국내 북미형 type II PRRS2/Kor/GBGJ22/2011 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 2의 ORF1a(open reading frame 1a) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 3의 ORF1b 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 4의 ORF2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 5의 ORF3 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 6의 ORF4 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 7의 ORF5 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 8의 ORF6 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스주는 서열번호 9의 ORF7 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스주.
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